KR102408178B1

KR102408178B1 - 바실러스 종 pamc23412 유래 pamc23412_drh1601 유전자가 도입된 폴리하이드록시부티레이트 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용한 폴리하이드록시부티레이트의 생산 방법

Info

Publication number: KR102408178B1
Application number: KR1020200069133A
Authority: KR
Inventors: 최종일
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2020-06-08
Filing date: 2020-06-08
Publication date: 2022-06-13
Also published as: KR20210152262A

Abstract

본 발명은 바실러스 종 (Bacillus sp.) PAMC23412 유래 PAMC23412_DRH1601 유전자 및 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 (poly-hydroxyalkanoate, PHA) 생합성 유전자가 도입되어 형질전환된 폴리하이드록시부티레이트 (poly-3-hydoxybutirate, PHB) 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용한 폴리하이드록시부티레이트의 생산 방법에 관한 것으로, 상기 재조합 미생물은 목재 가수분해물의 존재 하에서 세포 성장율 및 폴리하이드록시부티레이트 생산 효율이 월등히 우수하므로, 바이오 플라스틱의 상업화에 있어서 바이오 플라스틱의 생산 효율 및 생산 경제성을 높일 수 있다.

Description

바실러스 종 PAMC23412 유래 PAMC23412_DRH1601 유전자가 도입된 폴리하이드록시부티레이트 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용한 폴리하이드록시부티레이트의 생산 방법{Recombinant microorganism for polyhydroxybutyrate production with PAMC23412_DRH1601 gene derived from Bacillus sp. PAMC23412_DRH1601 and method for production of polyhydroxybutyrate using the same}

바실러스 종 (Bacillus sp.) PAMC23412 유래 PAMC23412_DRH1601 유전자를 포함하는 벡터와 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 (poly-hydroxyalkanoates, PHA) 생합성 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 폴리하이드록시부티레이트 (poly-3-hydoxybutirate, PHB) 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용한 목재 가수분해물로부터 생분해성 고분자인 폴리하이드록시부티레이트를 생산하는 방법에 관한 것이다.

현대에서 석유 화학 기반의 플라스틱은 인류의 삶의 질을 향상시키는 중요한 필수품이 되었다. 플라스틱 (plastic)은 강도, 내구성, 가공성 및 경제성 등 우수한 특성을 가지고 있으므로 거의 모든 산업에서 활용되고 있다. 하지만 이러한 우수한 특성에도 불구하고 석유 화학 기반의 플라스틱은 자연적으로 분해가 되지 않아 환경에 축적되므로 전세계적으로 문제가 되고 있다.

플라스틱 폐기물 처리에 대한 해결 방안으로는 소각, 재활용 또는 생물학적 분해가 있으나, 이러한 방법들은 자연을 2차적으로 오염시키거나 근본적인 해결책이 될 수 없다는 잠재적인 문제점을 안고 있다. 이러한 석유 화학 기반의 플라스틱을 대체하기 위하여 생분해성이 용이한 바이오 플라스틱 (bio plastic)의 연구가 진행되어 왔으며, 현재 전분 (starch), 셀룰로오스 (cellulose), 락트산 (lactic acid) 또는 글리콜산 (glycolic acid)을 화학적으로 중합한 플라스틱과 미생물에 의해 합성되는 폴리하이드록시알카노에이트 (poly-hydroxyalkanoate, PHA)에 대하여 주로 연구되고 있다.

PHA는 100% 생분해성 고분자로서 다양한 미생물에 의해 탄소원 및 에너지 저장물질로서 세포내에 합성되고, 합성 플라스틱과 유사한 물성을 가지고 있으며, 호기성 조건에서 물과 이산화탄소로 완전히 분해되기 때문에 합성 플라스틱의 대체재로 각광받고 있다.

폴리하이드록시부티레이트 (poly-3-hydoxybutirate, PHB)는 최초로 발견된 PHA이며, 가장 광범위하게 연구되고 있는 바이오 플라스틱이다. 폴리하이드록시부티레이트는 다양한 미생물에 의해 탄소원 및 에너지원으로 축적되는 세포 저장 물질이며, 3-하이드록시부티레이트 (3-hydoxybutirate, 3-HB)로 구성된 폴리에스테르의 일종이다. 폴리하이드록시부티레이트는 기존의 석유 화학 플라스틱을 대체할 수 있는 생분해성 플라스틱으로 각광받고 있지만, 높은 생산 단가로 인하여 석유 화학 기반의 플라스틱보다 경제성이 낮다는 문제점이 있다. 따라서, 폴리하이드록시부티레이트의 생산 단가를 낮추기 위해서 많은 연구가 진행되어 왔지만 아직까지 상업화는 힘든 상황이다.

목재 가수분해물은 폐목재를 산 처리 등으로 가수분해한 것으로, 일정 농도의 포도당을 포함하는 복합 성분을 의미한다. 목재 가수분해물은 미생물이 필요로 하는 탄소원을 공급할 수 있는 저가 (low-cost)의 기질이 될 수 있다. 목재 가수분해물을 기질로 사용할 경우 탄소원의 비용이 낮아지기 때문에 폴리하이드록시부티레이트와 같은 발효 생산물의 경제적인 생산이 가능하지만, 목재 가수분해물 내에 존재하는 다양한 화학 성분으로 인하여 미생물의 생장이 저해되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이러한 목재 가수분해물을 이용할 수 있는 재조합 균주의 개발이 진행되고 있다.

본 발명자들은 바실러스 종 (Bacillus sp.) PAMC23412 유래 PAMC23412_DRH1601 유전자를 포함하는 벡터 및 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 (poly-hydroxyalkanoates, PHA) 생합성 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제조하기 위해 노력하여, 상기 형질전환된 미생물이 목재 가수분해물 존재 하에서 세포 성장율 및 폴리하이드록시부티레이트 (PHB, poly-3-hydoxybutirate)의 생산 효율이 월등히 우수한 것을 확인하였다.

이에, 본 발명의 목적은 바실러스 종 (Bacillus sp.) PAMC23412 유래 PAMC23412_DRH1601 유전자 및 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 생합성 유전자가 도입되어 형질전환된 폴리하이드록시부티레이트 생산용 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 다음의 단계를 포함하는 폴리하이드록시부티레이트의 생산 방법을 제공하는 것이다:

바실러스 종 PAMC23412 유래 PAMC23412_DRH1601 유전자 및 랄스토니아 유트로파 유래 폴리하이드록시알카노에이트 생합성 유전자가 도입되어 형질전환된 재조합 미생물을 준비하는 형질전환 단계; 및

재조합 미생물을 배지에서 배양하는 배양 단계.

본 발명은 바실러스 종 (Bacillus sp.) PAMC23412 유래 PAMC23412_DRH1601 유전자를 포함하는 벡터와 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 (poly-hydroxyalkanoates, PHA) 생합성 유전자를 포함하는 벡터를 도입하여 제조된 폴리하이드록시부티레이트 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용한 폴리하이드록시부티레이트 (poly-3-hydoxybutirate, PHB)의 생산 방법에 관한 것이다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 예는 바실러스 종 (Bacillus sp.) PAMC23412 유래 PAMC23412_DRH1601 유전자 및 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 생합성 유전자가 도입되어 형질전환된 폴리하이드록시부티레이트 생산용 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 랄스토니아 유트로파 균주는 R. eutropha H16, R. eutropha NCIMB11599, R. eutropha 437-540, R. eutropha ReC-540, R. eutropha ReCGK-540 및 R. eutropha 437-ReAB로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종인 것일 수 있으며, 예를 들어, R. eutropha H16일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 PHA 생합성 유전자는 phaA, phaB, phaC, phaC1_Ps6-19, pct_Cp 및 phaCGK로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, phaA, phaB 및 phaC를 포함하는 것 또는 이에 대해 실질적 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 랄스토니아 유트로파 유래 폴리하이드록시알카노에이트 생합성 유전자는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 뉴클레오타이드로 이루어진 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3을 포함하는 뉴클레오타이드 또는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바실러스 종 PAMC23412 유래 PAMC23412_DRH1601 유전자는 서열번호 4의 뉴클레오타이드로 이루어진 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 4를 포함하는 뉴클레오타이드 또는 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 용어 '실질적 동일성'은 각각의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 뉴클레오타이드 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 그 서열을 분석하여, 상기 임의의 다른 뉴클레오타이드 서열이 각각의 뉴클레오타이드 서열과 70% 이상, 90% 이상 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서 바실러스 종 PAMC23412 유래 PAMC23412_DRH1601 유전자는 서열번호 5로 이루어진 펩타이드를 코딩하는 유전자일 수 있으며, 상기 펩타이드는 산화성, 열성 또는 산성 스트레스 등과 같은 비생물적 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 역할을 하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 PHB 생산용 재조합 미생물은 바실러스 종 PAMC23412 유래 PAMC23412_DRH1601 유전자 및 랄스토니아 유트로파 유래 PHA 생합성 유전자가 하나의 벡터에 포함되어 숙주세포를 형질전환시킴으로써 제조되는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 PHB 생산용 재조합 미생물은 바실러스 종 PAMC23412 유래 PAMC23412_DRH1601 유전자 및 랄스토니아 유트로파 유래 PHA 생합성 유전자가 각각 별도의 벡터에 도입되어, 숙주세포인 대장균을 형질전환시킴으로써 제조되는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 용어 '벡터 (vector)'는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노 연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pRadgro, pKM212 시리즈, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λλB, λλΔ및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작되는 것일 수 있으며, 예를 들어, pRadgro 또는 pKM212를 조작하여 제작되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 발현을 위한 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있으며, 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로 티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노 바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토 메갈로 바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

재조합 벡터를 숙주 세포에 삽입함으로써 형질전환체를 만들 수 있으며, 상기 형질전환체는 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 숙주 세포는 상기 발현벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있다.

재조합 미생물을 제작하기 위해서 원핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, E. coli XL1-Blue와 같은 대장균 속 균주, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 슈도모나스 종과 같은 다양한 장내균과 균주 등이 이용되는 것일 수 있으며, 예를 들어, E. coli XL1-Blue가 이용되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

재조합 미생물을 제작하기 위해서 진핵 세포에 형질전환을 하는 경우에는 숙주 세포로서, 효모 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO (Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 숙주 세포 내로 운반 (도입)하기 위해서는 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, 바람직하게는 CaCl₂ 방법 또는 전기천공법 등의 방법을 사용하는 것일 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우, 바람직하게는 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀 매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등의 방법을 사용하는 것일 수 있으며, 숙주 세포가 원핵 세포인 본 발명에 있어서 더욱 바람직한 형질전환 방법으로는 전기 천공법을 사용하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

형질전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서 PHB 생산용 재조합 미생물은 바실러스 종 PAMC23412 유래 PAMC23412_DRH1601 유전자를 포함하는 pRadgro 벡터 및 랄스토니아 유트로파 유래 PHA 생합성 유전자를 포함하는 pKM212 벡터로 숙주세포인 E. coli XL1-Blue를 형질전환 시킴으로써 제조되는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 예는 다음의 단계를 포함하는 폴리하이드록시부티레이트의 생산 방법에 관한 것이다:

재조합 미생물을 배지에서 배양하는 배양 단계.

배지는 포도당, 효모 추출물, 목재 가수분해물 또는 이의 혼합물을 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, PHB를 높은 효율로 생산하기 위하여 목재 가수분해물에 함유된 포도당을 이용하는 방법이 제시되었다. 이에 따라 배지에 목재 가수분해물을 첨가함으로써 배지의 포도당 함량을 높일 수 있으나, 포도당의 농도는 PHB의 생산량과 유의한 관계가 있으므로 배지에 포도당을 추가적으로 첨가하여 농도를 조절할 수 있다.

배지는 포도당을 5 내지 35 g/L, 5 내지 25 g/L, 5 내지 15 g/L, 10 내지 35 g/L, 10 내지 25 g/L 또는 10 내지 15 g/L 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 10 내지 15 g/L 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

배지는 목재 가수분해물을 5 내지 30 %(v/v), 5 내지 25 %(v/v), 5 내지 20 %(v/v), 10 내지 30 %(v/v), 10 내지 25 %(v/v) 또는 10 내지 20 %(v/v) 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 10 내지 20 %(v/v) 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

목재 가수분해물은 목재를 옥살산 (oxalic acid), 숙신산 (succinic acid), 말레산 (maleic acid), 푸마르산 (fumaric acid), 포름산 (formic acid), 아세트산 (acetic acid), 황산 (sulfuric acid) 및 염산 (hydrochloric acid)으로부터 선택되는 1종 이상인 산으로 전처리 (pretreatment)한 것일 수 있으며, 예를 들어, 옥살산으로 전처리한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

목재는 낙엽송, 소나무, 참나무 및 잣나무로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, 낙엽송인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

목재 가수분해물은 목재를 산으로 전처리한 혼합물을 170 ℃까지 가열하여 가수분해 반응이 진행된 다음, 냉각한 혼합물로부터 고형의 바이오 매스 (biomass)를 여과하여 얻어지는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

목재 가수분해물은 포도당을 1 내지 50 g/L 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

목재 가수분해물에 포함되는 포도당은 목재 가수분해물에 Cellic CTec2, Cellic CTec3 및 Cellic HTec2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효소를 사용하여 함량을 증가시킬 수 있으나, 포도당의 함량이 50 g/L를 초과하는 경우, 대장균의 생장이 저해될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서 배지는 15 g/L 포도당을 포함한 MR 배지 [제1인산 칼륨 (potassium phosphate, KH₂PO₄) 6.67 g/L, 인산 암모늄 [ammonium phosphate, (NH₄)₂HPO₄] 4 g/L, 황산 마그네슘 (magnesium sulfate, MgSO₄ㆍ7H₂O) 0.8 g/L, 구연산 (citric acid) 0.8 g/L 및 미량 금속 용액 (trace metal solution) 5 ml]에 효모 추출물 5 g/L 및 목재 가수분해물 10 내지 20 %(v/v)을 포함하는 것일 수 있다.

미량 금속 용액은 5 M HCl 1 리터 당 황산 철(II) (iron(II) sulfate, FeSO₄ㆍ7H₂O) 10 g, 염화칼슘 (calcium chloride, CaCl₂) 2 g, 황산아연 (zinc sulfate, ZnSO₄ㆍ7H₂O) 2.2 g, 황산망간 (manganese sulfate, MnSO₄ㆍ4H₂O) 0.5 g, 황산구리 (copper(II) sulfate, CuSO₄ㆍ5H₂O) 1 g, 헵타몰리브덴산 암모늄 [ammonium heptamolybdate, (NH₄)₆Mo₇O₂₄ㆍ4H₂O] 0.1 g, 붕사 (borax Anhydrous, Na₂B₄O₇ㆍ10H₂O) 0.02 g을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

배양 단계는 20 내지 40 ℃, 20 내지 38 ℃, 20 내지 36 ℃, 20 내지 34 ℃, 24 내지 40 ℃, 24 내지 38 ℃, 24 내지 36 ℃, 24 내지 36 ℃, 28 내지 40 ℃, 28 내지 38 ℃, 28 내지 36 ℃, 또는 28 내지 34 ℃의 온도 조건에서 수행하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 30 ℃의 온도 조건에서 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

배양 단계는 1 내지 4일, 1 내지 3일, 1 내지 2일, 2 내지 4일, 2 내지 3일 동안 수행하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 2 내지 3일 동안 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 있어서 배양 단계는 호기성 조건 하에, 30 ℃의 온도 조건에서, 2 내지 3일 동안 배양하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 폴리하이드록시부티레이트의 생산 방법은 배양 단계 이후 배양액으로부터 폴리하이드록시부티레이트를 회수하는 회수 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

도 1은 CnCAB+pRadGro 및 CnCAB+DRH1601의 건조 균체의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 CnCAB+pRadGro 및 CnCAB+DRH1601의 전체 배양액 중의 폴리하이드록시부티레이트의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 CnCAB+pRadGro 및 CnCAB+DRH1601의 형질전환된 대장균 세포내 폴리하이드록시부티레이트의 함량을 나타낸 그래프이다.

이하, 제조예 및 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

제조예 1. 재조합 대장균의 제작

랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha) H16 유래 폴리하이드록시알카노에이트 (poly-hydroxyalkanoates, PHA) 생합성 유전자인 phaC (서열번호 1 참조), phaA (서열번호 2 참조) 및 phaB (서열번호 3 참조)를 포함한 pKM212 벡터는 선행 연구에서 제작된 재조합 벡터 (S.J. Park et al., Metabolic Engineering 20 (2013): 20-28)를 사용하였다.

서열번호	명명	서열	비고
1	phaC nucleotide sequence	ATGGCGACCGGCAAAGGCGCGGCAGCTTCCACTCAGGAAGGCAAGTCCCAACCATTCAAGTTCACGCCGGGGCCATTCGATCCAGCCACATGGCTGGAATGGTCCCGCCAGTGGCAGGGCACTGAAGGCAACGGCCACGCGGCCGCGTCCGGCATTCCGGGCCTGGATGCGCTGGCAGGCGTCAAGATCGAGCCGGCGCAGCTGGGTGATATCCAGCAGCGTTACATGAAGGACTTCTCAGCCCTGTGGCAGGCCATGGCCGAGGGCAAGGCCGAGGCCACCGGGCCGCTGCACGACCGGCGCTTCGCCGGCGACGCGTGGCGCACCAACCTGCCATACCGCTTCGCTGCCGCGTTCTACCTGCTCAATGCGCGCGCCTTGACCGAGCTGGCCGATGCTGTTGAGGCCGATGCCAAGACGCGCCAGCGCATCCGCTTTGCGATCTCGCAATGGGTCGATGCGATGTCGCCCGCCAACTTCCTCGCCACGAATCCCGAGGCGCAGCGCCTGCTGATCGAGTCGGGCGGCGAATCGCTGCGTGCCGGCGTGCGCAACATGATGGAAGACCTGACGCGCGGCAAGATCTCGCAGACCGACGAGAGCGCGTTTGAGGTCGGCCGCAATGTCGCGGTGAGCGAAGGCGCCGTAGTCTTCGAGAACGAATACTTCCAGCTGTTGCAGTACAAGCCGCTGACCGACAAGGTGCATGCGCGCCCGCTGCTGATGGTGCCGCCGTGCATCAACAAGTACTACATCCTGGACCTGCAGCCGGAGAGCTCGCTGGTGCGTCATGTGGTGGAGCAGGGGCATACGGTGTTCCTGGTGTCGTGGCGCAATCCGGACGCCAGCATGGCTGGCAGCACCTGGGACGACTACATCGAGCACGCGGCCATCCGCGCCATCGAAGTCGCGCGCGACATCAGCGGCCAGGACAAGATCAACGTGCTCGGCTTCTGCGTGGGCGGCACCATTGTGTCGACTGCGCTGGCGGTGATGGCCGCGCGCGGCCAGCACCCGGCTGCCAGCGTCACGCTGCTGACCACGCTGCTGGACTTTGCCGACACCGGCATCCTCGACGTCTTTGTCGACGAGGGCCATGTGCAGCTGCGCGAGGCCACGCTGGGCGGCGCCGCCGGCGCGCCGTGCGCGCTGCTGCGCGGCCTTGAGCTGGCCAATACCTTCTCGTTCCTGCGCCCGAACGACCTGGTGTGGAACTACGTGGTCGACAACTACCTGAAGGGCAACACGCCGGTGCCGTTCGACCTGCTGTTCTGGAACGGCGACGCCACCAACCTGCCGGGGCCTTGGTACTGCTGGTACCTGCGCCACACCTACCTGCAGGACGAGCTCAAGGTGCCGGGCAAGCTGACTGTGTGCGGCGTGCCCGTGGACCTGGCCAGCATCGACGTGCCGACCTACATCTACGGCTCGCGCGAAGACCATATCGTGCCATGGACCGCGGCCTATGCCTCGACCGCGCTGCTGGCGAACAAGCTGCGCTTCGTGCTGGGTGCGTCGGGCCATATCGCCGGTGTGATCAACCCGCCGGCCAAGAACAAGCGCAGCCACTGGACCAACGATGCGCTGCCGGAGTCGCCGCAGCAATGGCTGGCTGGCGCCACCGAGCATCACGGCAGCTGGTGGCCGGACTGGACCGCATGGCTGGCAGGCCAGGCCGGCGCGAAACGTGCCGCGCCCGCCAACTACGGCAATGCGCGCTATCCCGCGATCGAACCCGCGCCTGGGCGATACGTCAAAGCCAAGGCATGA	1770 nt
2	phaA nucleotide sequence	ATGACTGACGTTGTCATCGTATCCGCCGCCCGCACCGCGGTCGGCAAGTTTGGCGGCTCGCTGGCCAAGATCCCGGCACCGGAACTGGGTGCCGTGGTCATCAAGGCCGCGCTGGAGCGCGCCGGCGTCAAGCCGGAGCAGGTGAGCGAAGTCATCATGGGCCAGGTGCTGACCGCCGGTTCGGGCCAGAACCCCGCACGCCAGGCCGCGATCAAGGCCGGCCTGCCGGCGATGGTGCCGGCCATGACCATCAACAAGGTGTGCGGCTCGGGCCTGAAGGCCGTGATGCTGGCCGCCAACGCGATCATGGCGGGCGACGCCGAGATCGTGGTGGCCGGCGGCCAGGAAAACATGAGCGCCGCCCCGCACGTGCTGCCGGGCTCGCGCGATGGTTTCCGCATGGGCGATGCCAAGCTGGTCGACACCATGATCGTCGACGGCCTGTGGGACGTGTACAACCAGTACCACATGGGCATCACCGCCGAGAACGTGGCCAAGGAATACGGCATCACACGCGAGGCGCAGGATGAGTTCGCCGTCGGCTCGCAGAACAAGGCCGAAGCCGCGCAGAAGGCCGGCAAGTTTGACGAAGAGATCGTCCCGGTGCTGATCCCGCAGCGCAAGGGCGACCCGGTGGCCTTCAAGACCGACGAGTTCGTGCGCCAGGGCGCCACGCTGGACAGCATGTCCGGCCTCAAGCCCGCCTTCGACAAGGCCGGCACGGTGACCGCGGCCAACGCCTCGGGCCTGAACGACGGCGCCGCCGCGGTGGTGGTGATGTCGGCGGCCAAGGCCAAGGAACTGGGCCTGACCCCGCTGGCCACGATCAAGAGCTATGCCAACGCCGGTGTCGATCCCAAGGTGATGGGCATGGGCCCGGTGCCGGCCTCCAAGCGCGCCCTGTCGCGCGCCGAGTGGACCCCGCAAGACCTGGACCTGATGGAGATCAACGAGGCCTTTGCCGCGCAGGCGCTGGCGGTGCACCAGCAGATGGGCTGGGACACCTCCAAGGTCAATGTGAACGGCGGCGCCATCGCCATCGGCCACCCGATCGGCGCGTCGGGCTGCCGTATCCTGGTGACGCTGCTGCACGAGATGAAGCGCCGTGACGCGAAGAAGGGCCTGGCCTCGCTGTGCATCGGCGGCGGCATGGGCGTGGCGCTGGCAGTCGAGCGCAAATAA	1182 nt
3	phaB nucleotide sequence	ATGACTCAGCGCATTGCGTATGTGACCGGCGGCATGGGTGGTATCGGAACCGCCATTTGCCAGCGGCTGGCCAAGGATGGCTTTCGTGTGGTGGCCGGTTGCGGCCCCAACTCGCCGCGCCGCGAAAAGTGGCTGGAGCAGCAGAAGGCCCTGGGCTTCGATTTCATTGCCTCGGAAGGCAATGTGGCTGACTGGGACTCGACCAAGACCGCATTCGACAAGGTCAAGTCCGAGGTCGGCGAGGTTGATGTGCTGATCAACAACGCCGGTATCACCCGCGACGTGGTGTTCCGCAAGATGACCCGCGCCGACTGGGATGCGGTGATCGACACCAACCTGACCTCGCTGTTCAACGTCACCAAGCAGGTGATCGACGGCATGGCCGACCGTGGCTGGGGCCGCATCGTCAACATCTCGTCGGTGAACGGGCAGAAGGGCCAGTTCGGCCAGACCAACTACTCCACCGCCAAGGCCGGCCTGCATGGCTTCACCATGGCACTGGCGCAGGAAGTGGCGACCAAGGGCGTGACCGTCAACACGGTCTCTCCGGGCTATATCGCCACCGACATGGTCAAGGCGATCCGCCAGGACGTGCTCGACAAGATCGTCGCGACGATCCCGGTCAAGCGCCTGGGCCTGCCGGAAGAGATCGCCTCGATCTGCGCCTGGTTGTCGTCGGAGGAGTCCGGTTTCTCGACCGGCGCCGACTTCTCGCTCAACGGCGGCCTGCATATGGGCTGA	741 nt

PHA 생합성 유전자를 포함하는 pKM212 벡터를 전기천공법을 이용하여 E. coli XL1-Blue에 형질전환한 후, LB 배지에 50 ug/mL의 카나마이신 (kanamycin) 항생제를 포함하는 플레이트 (plate)에서 형질전환된 재조합 대장균을 선별하였다.

다음으로, 바실러스 종 (Bacillus sp.) PAMC23412 유래 PAMC23412_DRH1601 유전자 (서열번호 4 참조)를 포함한 pRadgro 벡터는 선행 연구에서 제작된 재조합 벡터 (S.J. Park et al., Microbiol. (2020) 58(2): 131-141)를 사용하였다.

PAMC23412_DRH1601 유전자로부터 합성되는 펩타이드 (서열번호 5 참조)는 산화적 스트레스에 대한 대장균의 내성을 개선하는 것일 수 있다.

서열번호	명명	서열	비고
4	PAMC23412_DRH1601 nucleotide sequence	ATGAGAGTCGTGATTGCAGATGATCATCATATTGTGAGAAAAGGGCTTGTGTTTTTCTTGCAGACACAGCCTGACGTCGAAATCGTTGGTGAGGCTTCTAATGGAGAAGAAGCATTAGAAGTTGTCAGACAAATGCGGCCTGACATTGTTCTAATGGATCTATCGATGCCTGTGATGAATGGTATTGAAGCCACGAAACAAATGATGCTTGAAATGCCCGATACCCGCATTGTGATTCTGACAAGCTATGCGGATAAAGATTATGTTATTCCCGCTATTCAAGCAGGGGCAAAAGCCTATCAGCTCAAGGATGTAGCGCCAGAAAAACTCCTTACGACAATGATTGACGTACAAAAGGGCACCTATCAATTAGATGCTCATATCACCAACTTTCTTGTGCAGCATTTGACCGAGCCAAAAGGGCAAAAATGGAAGTTAATGAAAGAGCTGACCAATAGAGAGCGAGATGTTTTATTCGAAATTGCAAAGGGGAAAAGCAATAAAGAAATTGCCTCATCACTGTTTATTTCTGAAAAGACTGTCAAAACACACGTATCTCATGTATTATCAAAACTAGAGCTGGCAGATCGTACACAAGCGGCTCTGTATGCAGTGGATTATCAAAAAAATCAGCCGAAAGAGCTGCTATGA	651nt
5	PAMC23412_DRH1601 amino acid sequence	MRVVIADDHHIVRKGLVFFLQTQPDVEIVGEASNGEEALEVVRQMRPDIVLMDLSMPVMNGIEATKQMMLEMPDTRIVILTSYADKDYVIPAIQAGAKAYQLKDVAPEKLLTTMIDVQKGTYQLDAHITNFLVQHLTEPKGQKWKLMKELTNRERDVLFEIAKGKSNKEIASSLFISEKTVKTHVSHVLSKLELADRTQAALYAVDYQKNQPKELL	216aa

PAMC23412_DRH1601 유전자를 포함하는 pRadgro 벡터를 전기천공법을 이용하여 선별된 재조합 대장균에 추가적으로 형질전환한 후, LB 배지에 50 ug/ml 카나마이신 및 100 ug/mL 암피실린 항생제를 포함하는 플레이트에서 최종적으로 형질전환된 재조합 대장균을 선별하였다.

제조예 2. 목재 가수분해물의 제조

낙엽송을 파쇄한 후 20 내지 80 메쉬 (mesh) 사이즈에 파쇄물을 얻었다. 파쇄물의 함수율 (moisture content)을 측정 후 전건 25 g을 기준으로 하여 고액비 (solid-liquid ratio) 1:8의 비율 (w/v)로 옥살산 (oxalic acid) 100 mM로 전처리 과정을 수행하였다.

전처리한 혼합물은 170 ℃까지 도달하는 승온 시간을 제외하고, 170 ℃에 도달한 후부터 10분 동안 150 rpm으로 교반하는 가수분해 과정을 수행하여 액상의 가수분해물을 제조하였다.

그 후, 10분 동안 냉각하고 액상의 가수분해물로부터 고형 바이오매스 (biomass)를 여과하여 최종적으로 포도당을 5 g/L 포함하는 목재 가수분해물을 얻었다.

실험예. 재조합 대장균을 이용한 PHB의 생산

PHA 생합성 유전자를 포함한 pKM212 벡터 및 PAMC23412_DRH1601 유전자를 포함한 pRadgro 벡터를 모두 포함한 재조합 대장균을 50 ug/mL 카나마이신과 100 ug/mL 암피실린 항생제가 포함된 LB 배지에서 30 ℃의 온도 조건으로 12시간 동안 전배양하였다.

전배양한 재조합 대장균을 15 g/L 포도당, 효모 추출물 5 g/L, 20 %(v/v) 목재 가수분해물, 50 ug/mL 카나마이신 및 100 ug/mL 암피실린 항생제, 인산 칼륨 (potassium phosphate, KH₂PO₄) 6.67 g/L, 인산이암모늄 [diammonium hydrogenphosphate, (NH₄)₂HPO₄] 4 g/L, 황산 마그네슘 (magnesium sulfate, MgSO₄ㆍ7H₂O) 0.8 g/L, 시트르산 0.8 g/L 및 미량 금속 용액 (the trace metal solution) 5 ml가 포함된 MR 배지 30 mL에서 250 rpm으로 교반하면서, 30 ℃의 온도 조건으로 72시간 동안 호기성 조건 하에 배양 후, 세포를 회수하여 건조 균체 농도, PHB의 농도 및 함량을 측정하였다.

대조군으로는 랄스토니아 유트로파 유래 PHA 생합성 유전자만을 포함한 재조합 대장균을 상기와 같은 조건에서 배양하였다.

건조 균체의 농도는 배양액 10 mL을 회수하여 원심 분리한 후 미리 무게를 잰 마이크로 튜브에 넣고 80 ℃로 설정된 드라이 오븐 (dry oven)에서 24시간 동안 건조한 후 무게를 측정하였다.

PHB의 농도는 상기 건조한 세포 침전물을 5 %(v/v) 황산 (sulfuric acid, H₂SO₄) 및 클로로포름 (chloroform, CHCl₃)을 이용하여 96 ℃ 중탕기에서 3시간 동안 반응시켜 PHB를 추출한 후, 가스 크로마토그래피 (gas chromatography)로 분석하여, 그 결과를 표 3 및 도 1 내지 도 3에 나타내었다.

도 1 내지 도 3의 범례에서 CnCAB+pRadGro는 랄스토니아 유트로파 유래 PHA 생합성 유전자를 포함하는 벡터만으로 형질전환된 재조합 대장균을 의미하고, CnCAB+DRH1601는 바실러스 종 PAMC23412 유래 PAMC23412_DRH1601 유전자를 포함하는 벡터 및 랄스토니아 유트로파 유래 PHA 생합성 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 재조합 대장균을 의미한다.

	CnCAB+DRH1601	CnCAB+pRadGro	증가율
건조 균체 농도 (g/L)	5.71	5.26	+8.55 %
PHB 농도 (g/L)	2.62	1.32	+98.48 %
PHB 함량 (%)	46	25	+84.00 %

표 3 및 도 1 내지 도 3에서 확인할 수 있듯이, 랄스토니아 유트로파 유래 PHA 생합성 유전자를 포함하는 벡터만으로 형질전환된 재조합 대장균은 5.26 g/L의 건조 균체 농도, 1.32 g/L의 BHA 농도 및 25 %의 PHB 함량을 갖는 것으로 측정된 반면, 바실러스 종 PAMC23412 유래 PAMC23412_DRH1601 유전자를 포함하는 벡터 및 랄스토니아 유트로파 유래 PHA 생합성 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 재조합 대장균은 5.71 g/L의 건조 균체 농도, 2.62 g/L의 폴리하이드록시부티레이트 농도 및 46 %의 폴리하이드록시부티레이트 함량을 갖는 것으로 측정되었다.

즉, 바실러스 종 PAMC23412 유래 PAMC23412_DRH1601 유전자가 및 랄스토니아 유트로파 유래 폴리하이드록시알카노에이트 생합성 유전자인 phaC, phaA 및 phaC에 의하여 형질 전환된 재조합 대장균은, 랄스토니아 유트로파 유래 PHA 생합성 유전자를 포함하는 벡터만으로 형질전환된 재조합 대장균에 비하여 건조 균체 농도는 +8.55 %, PHB 농도는 +98.48 % 및 폴리하이드록시부티레이트 함량은 +84.00 % 증가하였다.

이러한 결과로부터, 본 발명의 바실러스 종 PAMC23412 유래 PAMC23412_DRH1601 유전자를 포함하는 벡터 및 랄스토니아 유트로파 유래 PHA 생합성 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 폴리하이드록시부티레이트 생산용 재조합 대장균은 목재 가수분해물로부터 생분해성 고분자인 폴리하이드록시부티레이트를 높은 농도와 함량으로 생산할 수 있으므로, 폴리하이드록시부티레이트 생산 공정의 효율을 증대할 수 있으며, 이는 바이오 플라스틱 생산에 유용하게 이용될 수 있다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Recombinant microorganism for polyhydroxybutyrate production with PAMC23412_DRH1601 gene derived from Bacillus sp. PAMC23412_DRH1601 and method for production of polyhydroxybutyrate using the same <130> PN200131 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1770 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> phaC nucleotide sequence <400> 1 atggcgaccg gcaaaggcgc ggcagcttcc actcaggaag gcaagtccca accattcaag 60 ttcacgccgg ggccattcga tccagccaca tggctggaat ggtcccgcca gtggcagggc 120 actgaaggca acggccacgc ggccgcgtcc ggcattccgg gcctggatgc gctggcaggc 180 gtcaagatcg agccggcgca gctgggtgat atccagcagc gttacatgaa ggacttctca 240 gccctgtggc aggccatggc cgagggcaag gccgaggcca ccgggccgct gcacgaccgg 300 cgcttcgccg gcgacgcgtg gcgcaccaac ctgccatacc gcttcgctgc cgcgttctac 360 ctgctcaatg cgcgcgcctt gaccgagctg gccgatgctg ttgaggccga tgccaagacg 420 cgccagcgca tccgctttgc gatctcgcaa tgggtcgatg cgatgtcgcc cgccaacttc 480 ctcgccacga atcccgaggc gcagcgcctg ctgatcgagt cgggcggcga atcgctgcgt 540 gccggcgtgc gcaacatgat ggaagacctg acgcgcggca agatctcgca gaccgacgag 600 agcgcgtttg aggtcggccg caatgtcgcg gtgagcgaag gcgccgtagt cttcgagaac 660 gaatacttcc agctgttgca gtacaagccg ctgaccgaca aggtgcatgc gcgcccgctg 720 ctgatggtgc cgccgtgcat caacaagtac tacatcctgg acctgcagcc ggagagctcg 780 ctggtgcgtc atgtggtgga gcaggggcat acggtgttcc tggtgtcgtg gcgcaatccg 840 gacgccagca tggctggcag cacctgggac gactacatcg agcacgcggc catccgcgcc 900 atcgaagtcg cgcgcgacat cagcggccag gacaagatca acgtgctcgg cttctgcgtg 960 ggcggcacca ttgtgtcgac tgcgctggcg gtgatggccg cgcgcggcca gcacccggct 1020 gccagcgtca cgctgctgac cacgctgctg gactttgccg acaccggcat cctcgacgtc 1080 tttgtcgacg agggccatgt gcagctgcgc gaggccacgc tgggcggcgc cgccggcgcg 1140 ccgtgcgcgc tgctgcgcgg ccttgagctg gccaatacct tctcgttcct gcgcccgaac 1200 gacctggtgt ggaactacgt ggtcgacaac tacctgaagg gcaacacgcc ggtgccgttc 1260 gacctgctgt tctggaacgg cgacgccacc aacctgccgg ggccttggta ctgctggtac 1320 ctgcgccaca cctacctgca ggacgagctc aaggtgccgg gcaagctgac tgtgtgcggc 1380 gtgcccgtgg acctggccag catcgacgtg ccgacctaca tctacggctc gcgcgaagac 1440 catatcgtgc catggaccgc ggcctatgcc tcgaccgcgc tgctggcgaa caagctgcgc 1500 ttcgtgctgg gtgcgtcggg ccatatcgcc ggtgtgatca acccgccggc caagaacaag 1560 cgcagccact ggaccaacga tgcgctgccg gagtcgccgc agcaatggct ggctggcgcc 1620 accgagcatc acggcagctg gtggccggac tggaccgcat ggctggcagg ccaggccggc 1680 gcgaaacgtg ccgcgcccgc caactacggc aatgcgcgct atcccgcgat cgaacccgcg 1740 cctgggcgat acgtcaaagc caaggcatga 1770 <210> 2 <211> 1182 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> phaA nucleotide sequence <400> 2 atgactgacg ttgtcatcgt atccgccgcc cgcaccgcgg tcggcaagtt tggcggctcg 60 ctggccaaga tcccggcacc ggaactgggt gccgtggtca tcaaggccgc gctggagcgc 120 gccggcgtca agccggagca ggtgagcgaa gtcatcatgg gccaggtgct gaccgccggt 180 tcgggccaga accccgcacg ccaggccgcg atcaaggccg gcctgccggc gatggtgccg 240 gccatgacca tcaacaaggt gtgcggctcg ggcctgaagg ccgtgatgct ggccgccaac 300 gcgatcatgg cgggcgacgc cgagatcgtg gtggccggcg gccaggaaaa catgagcgcc 360 gccccgcacg tgctgccggg ctcgcgcgat ggtttccgca tgggcgatgc caagctggtc 420 gacaccatga tcgtcgacgg cctgtgggac gtgtacaacc agtaccacat gggcatcacc 480 gccgagaacg tggccaagga atacggcatc acacgcgagg cgcaggatga gttcgccgtc 540 ggctcgcaga acaaggccga agccgcgcag aaggccggca agtttgacga agagatcgtc 600 ccggtgctga tcccgcagcg caagggcgac ccggtggcct tcaagaccga cgagttcgtg 660 cgccagggcg ccacgctgga cagcatgtcc ggcctcaagc ccgccttcga caaggccggc 720 acggtgaccg cggccaacgc ctcgggcctg aacgacggcg ccgccgcggt ggtggtgatg 780 tcggcggcca aggccaagga actgggcctg accccgctgg ccacgatcaa gagctatgcc 840 aacgccggtg tcgatcccaa ggtgatgggc atgggcccgg tgccggcctc caagcgcgcc 900 ctgtcgcgcg ccgagtggac cccgcaagac ctggacctga tggagatcaa cgaggccttt 960 gccgcgcagg cgctggcggt gcaccagcag atgggctggg acacctccaa ggtcaatgtg 1020 aacggcggcg ccatcgccat cggccacccg atcggcgcgt cgggctgccg tatcctggtg 1080 acgctgctgc acgagatgaa gcgccgtgac gcgaagaagg gcctggcctc gctgtgcatc 1140 ggcggcggca tgggcgtggc gctggcagtc gagcgcaaat aa 1182 <210> 3 <211> 741 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> phaB nucleotide sequence <400> 3 atgactcagc gcattgcgta tgtgaccggc ggcatgggtg gtatcggaac cgccatttgc 60 cagcggctgg ccaaggatgg ctttcgtgtg gtggccggtt gcggccccaa ctcgccgcgc 120 cgcgaaaagt ggctggagca gcagaaggcc ctgggcttcg atttcattgc ctcggaaggc 180 aatgtggctg actgggactc gaccaagacc gcattcgaca aggtcaagtc cgaggtcggc 240 gaggttgatg tgctgatcaa caacgccggt atcacccgcg acgtggtgtt ccgcaagatg 300 acccgcgccg actgggatgc ggtgatcgac accaacctga cctcgctgtt caacgtcacc 360 aagcaggtga tcgacggcat ggccgaccgt ggctggggcc gcatcgtcaa catctcgtcg 420 gtgaacgggc agaagggcca gttcggccag accaactact ccaccgccaa ggccggcctg 480 catggcttca ccatggcact ggcgcaggaa gtggcgacca agggcgtgac cgtcaacacg 540 gtctctccgg gctatatcgc caccgacatg gtcaaggcga tccgccagga cgtgctcgac 600 aagatcgtcg cgacgatccc ggtcaagcgc ctgggcctgc cggaagagat cgcctcgatc 660 tgcgcctggt tgtcgtcgga ggagtccggt ttctcgaccg gcgccgactt ctcgctcaac 720 ggcggcctgc atatgggctg a 741 <210> 4 <211> 651 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> PAMC23412_DRH1601 nucleotide sequence <400> 4 atgagagtcg tgattgcaga tgatcatcat attgtgagaa aagggcttgt gtttttcttg 60 cagacacagc ctgacgtcga aatcgttggt gaggcttcta atggagaaga agcattagaa 120 gttgtcagac aaatgcggcc tgacattgtt ctaatggatc tatcgatgcc tgtgatgaat 180 ggtattgaag ccacgaaaca aatgatgctt gaaatgcccg atacccgcat tgtgattctg 240 acaagctatg cggataaaga ttatgttatt cccgctattc aagcaggggc aaaagcctat 300 cagctcaagg atgtagcgcc agaaaaactc cttacgacaa tgattgacgt acaaaagggc 360 acctatcaat tagatgctca tatcaccaac tttcttgtgc agcatttgac cgagccaaaa 420 gggcaaaaat ggaagttaat gaaagagctg accaatagag agcgagatgt tttattcgaa 480 attgcaaagg ggaaaagcaa taaagaaatt gcctcatcac tgtttatttc tgaaaagact 540 gtcaaaacac acgtatctca tgtattatca aaactagagc tggcagatcg tacacaagcg 600 gctctgtatg cagtggatta tcaaaaaaat cagccgaaag agctgctatg a 651 <210> 5 <211> 216 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> PAMC23412_DRH1601 amino acid sequence <400> 5 Met Arg Val Val Ile Ala Asp Asp His His Ile Val Arg Lys Gly Leu 1 5 10 15 Val Phe Phe Leu Gln Thr Gln Pro Asp Val Glu Ile Val Gly Glu Ala 20 25 30 Ser Asn Gly Glu Glu Ala Leu Glu Val Val Arg Gln Met Arg Pro Asp 35 40 45 Ile Val Leu Met Asp Leu Ser Met Pro Val Met Asn Gly Ile Glu Ala 50 55 60 Thr Lys Gln Met Met Leu Glu Met Pro Asp Thr Arg Ile Val Ile Leu 65 70 75 80 Thr Ser Tyr Ala Asp Lys Asp Tyr Val Ile Pro Ala Ile Gln Ala Gly 85 90 95 Ala Lys Ala Tyr Gln Leu Lys Asp Val Ala Pro Glu Lys Leu Leu Thr 100 105 110 Thr Met Ile Asp Val Gln Lys Gly Thr Tyr Gln Leu Asp Ala His Ile 115 120 125 Thr Asn Phe Leu Val Gln His Leu Thr Glu Pro Lys Gly Gln Lys Trp 130 135 140 Lys Leu Met Lys Glu Leu Thr Asn Arg Glu Arg Asp Val Leu Phe Glu 145 150 155 160 Ile Ala Lys Gly Lys Ser Asn Lys Glu Ile Ala Ser Ser Leu Phe Ile 165 170 175 Ser Glu Lys Thr Val Lys Thr His Val Ser His Val Leu Ser Lys Leu 180 185 190 Glu Leu Ala Asp Arg Thr Gln Ala Ala Leu Tyr Ala Val Asp Tyr Gln 195 200 205 Lys Asn Gln Pro Lys Glu Leu Leu 210 215

Claims

바실러스 종 (Bacillus sp.) PAMC23412 유래 PAMC23412_DRH1601 유전자는 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 바실러스 종 (Bacillus sp.) PAMC23412 유래 PAMC23412_DRH1601 유전자, 및 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상으로 이루어진 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 생합성 유전자가 도입되어 형질전환된 폴리하이드록시부티레이트 생산용 재조합 미생물.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 미생물은 대장균 (E.coli)인 것인, 폴리하이드록시부티레이트 생산용 재조합 미생물.
다음의 단계를 포함하는 폴리하이드록시부티레이트의 생산 방법:
바실러스 종 (Bacillus sp.) PAMC23412 유래 PAMC23412_DRH1601 유전자는 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 바실러스 종 (Bacillus sp.) PAMC23412 유래 PAMC23412_DRH1601 유전자, 및 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상으로 이루어진 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha) 유래 폴리하이드록시알카노에이트 생합성 유전자가 도입되어 형질전환된 재조합 미생물을 준비하는 형질전환 단계; 및
재조합 미생물을 기질을 포함하는 배지에서 배양하는 배양 단계.
제5항에 있어서, 상기 기질은 목재 가수분해물을 포함하는 것인, 폴리하이드록시부티레이트의 생산 방법.
제6항에 있어서, 상기 목재 가수분해물은 배지의 전체 부피를 기준으로 5 내지 30 %(v/v) 포함되는 것인, 폴리하이드록시부티레이트의 생산 방법.
제6항에 있어서, 상기 목재 가수분해물은 목재를 산으로 전처리하여 가수분해한 것인, 폴리하이드록시부티레이트의 생산 방법.
제8항에 있어서, 상기 산은 옥살산 (oxalic acid), 숙신산 (succinic acid), 말레산 (maleic acid), 푸마르산 (fumaric acid), 포름산 (formic acid), 아세트산 (acetic acid), 황산 (sulfuric acid) 및 염산 (hydrochloric acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 폴리하이드록시부티레이트의 생산 방법.
제6항에 있어서, 상기 목재 가수분해물은 포도당을 1 내지 50 g/L의 농도로 포함하는 것인, 폴리하이드록시부티레이트의 생산 방법.
제5항에 있어서, 상기 배양 단계는 20 내지 40 ℃의 온도 조건에서 수행되는 것인, 폴리하이드록시부티레이트의 생산 방법.
제5항에 있어서, 상기 배양 단계는 1 내지 4일 동안 수행되는 것인, 폴리하이드록시부티레이트의 생산 방법.