KR102231333B1 - ldc 및 dr1558 유전자가 과발현된 카다베린 생산용 미생물 및 이를 이용한 카다베린 생산방법 - Google Patents

ldc 및 dr1558 유전자가 과발현된 카다베린 생산용 미생물 및 이를 이용한 카다베린 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대장균(Escherichia coli) 유래 ldc 유전자와 데이노코쿠스 라디오두란스(Deinococcus radiodurance) 유래 dr1558 유전자를 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)에 도입하여 높은 농도의 카다베린(cadaverine, 1,5-Diaminopentane)을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 이를 이용하여 다양한 산업분야에서 활용되고 있는 생물기반 나일론의 전구체 생산단가를 낮출 수 있다.

Description

ldc 및 dr1558 유전자가 과발현된 카다베린 생산용 미생물 및 이를 이용한 카다베린 생산방법{Microorganisms for producing cadaverine overexpressed with ldc and dr1558 genes and methods for producing cadaverine using the same}
본 발명은 ldc 및 dr1558 유전자가 과발현된 카다베린(cadaverine, 1,5-Diaminopentane) 생산용 미생물 및 이를 이용한 카다베린 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 대장균(Escherichia coli)에서 유래한 Ldc 단백질을 코딩하는 유전자 및 데이노코쿠스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans)에서 유래한 DR1558 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 및 이를 이용한 카다베린 생산방법에 관한 것이다.
최근 화학연료의 사용으로 인한 환경 문제, 기후 변화와 화학연료의 고갈 등으로 인한 문제의 해결방안으로서, 화학연료 기반 공정에서 생물기반 공정으로의 전환을 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 생물기반 공정은 재생 가능한 바이오매스를 이용하여 기존 화학연료 기반으로 생산되었던 폴리머나 연료 및 화학물질을 생산할 수 있는 공정이다.
생물기반 공정으로 생산되는 플랫폼(platform) 화학 물질 중 생물기반 나일론(nyolon 56, nylon 510, nylon 512)은 폴리아마이드의 중합체로써, 섬유 및 자동차 산업에서 널리 사용되어지는 물질이다. 카다베린은 이러한 생물기반 나일론의 전구체가 되는 유망한 물질로써, 리신 탈카복실화효소(lysine decarboxylase)의 반응에 의하여 미생물로부터 생산되는 물질이다.
리신 탈카복실화효소는 구조성 효소인 Ldc 및 유도성 효소인 CadA가 알려져 있다. 미생물을 이용한 대부분의 카다베린 생산은 Ldc 효소가 과발현된 재조합 균주를 이용하여 진행된다.
이에 본 발명자들은 대장균(Escherichia coli)에서 유래한 Ldc 단백질을 코딩하는 유전자 및 데이노코쿠스 라디오두란스(Deinococus radiodurans) 유래 DR1558 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)의 카다베린(cadaverine, 1,5-Diaminopentane) 생산 효율이 월등히 우수한 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 대장균에서 유래한 Ldc 단백질을 코딩하는 유전자 및 데이노코쿠스 라디오두란스에서 유래한 DR1558 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 대장균에서 유래한 Ldc 단백질을 코딩하는 유전자 및 데이노코쿠스 라디오두란스에서 유래한 DR1558 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 카다베린 생산용 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 대장균에서 유래한 Ldc 단백질을 코딩하는 유전자 및 데이노코쿠스 라디오두란스에서 유래한 DR1558 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 미생물을 형질전환하는 형질전환 단계를 포함하는 카다베린 생산용 미생물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 다음을 포함하는 카다베린 생산방법을 제공하는 것이다:
대장균에서 유래한 Ldc 단백질을 코딩하는 유전자 및 데이노코쿠스 라디오두란스에서 유래한 DR1558 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 미생물을 형질전환하는 형질전환 단계; 및
형질전환시킨 미생물을 배지에 배양하는 배양 단계.
본 발명의 또 다른 목적은 대장균에서 유래한 Ldc 단백질을 코딩하는 유전자 및 데이노코쿠스 라디오두란스에서 유래한 DR1558 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 카다베린 생산용 미생물의 카다베린 생산 용도에 관한 것이다.
본 발명은 대장균(Escherichia coli) 유래 ldc 유전자와 데이노코쿠스 라디오두란스(Deinococcus radiodurance) 유래 dr1558 유전자를 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)에 도입하여 높은 농도의 카다베린(cadaverine, 1,5-Diaminopentane)을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 이를 이용하여 다양한 산업분야에서 활용되고 있는 생물기반 나일론의 생산단가를 낮출 수 있다.
본 발명자들은 유도성 L-리신 탈카르복실화 효소인 Ldc와 함께 비생물학적 스트레스(abiotic stress)에 대한 내성을 부여하는 DR1558을 함께 발현함으로써 고농도의 카다베린을 생산하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 대장균에서 유래한 Ldc 단백질을 코딩하는 유전자 및 데이노코쿠스 라디오두란스에서 유래한 DR1558 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터이다.
상기 용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λ△1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다.
진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 일 예에서, 재조합 벡터를 숙주 세포에 삽입함으로써 형질전환체를 만들 수 있으며, 상기 형질전환체는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다.
상기 숙주 세포는 상기 발현벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있다.
본 발명에서 사용된 숙주세포로는 대장균, 효모, 동물세포, 식물세포, 또는 곤충세포 등을 포함할 수 있으며, 원핵세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 대장균에서 유래한 Ldc 단백질을 코딩하는 유전자 및 데이노코쿠스 라디오두란스에서 유래한 DR1558 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 카다베린 생산용 미생물이다.
상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미컴 또는 대장균인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태는 대장균에서 유래한 Ldc 단백질을 코딩하는 유전자 및 데이노코쿠스 라디오두란스에서 유래한 DR1558 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 미생물을 형질전환하는 형질전환 단계를 포함하는 카다베린 생산용 미생물의 제조방법이다.
상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미컴 또는 대장균인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태는 다음을 포함하는 카다베린 생산방법이다:
대장균에서 유래한 Ldc 단백질을 코딩하는 유전자 및 데이노코쿠스 라디오두란스에서 유래한 DR1558 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 미생물을 형질전환하는 형질전환 단계; 및
형질전환시킨 미생물을 배지에 배양하는 배양 단계.
상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미컴 또는 대장균인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
배양 단계는 20 내지 40℃, 20 내지 36℃, 20 내지 32℃, 24 내지 40℃, 24 내지 36℃ 또는 24 내지 32℃, 예를 들어, 30℃의 온도에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 30℃의 온도에서 수행할 경우 미생물의 성장 및 카다베린의 생산농도가 가장 높다.
배양 단계는 탄소원을 포함하는 배지에서 수행되는 것일 수 있고, 상기 탄소원은 포도당(glucose) 또는 과당일 수 있으나, 포도당을 사용하였을 경우 가장 성장 효율이 좋다. 상기 포도당은 10 내지 120 g/L, 20 내지 120 g/L, 50 내지 120 g/L 또는 80 내지 120 g/L, 예를 들어, 100 내지 120 g/L의 농도인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
배양 단계는 호기성 조건에서 회분식 발효 방법을 사용하여 24시간 내지 48시간 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
배양 단계는 RG 배지(per liter: 10 g glucose, 40 g Brain Heart Infusion, 10 g Beef Extract, 30 g D-sorbitol) 또는 CG 배지(per liter 100 g glucose, 30 g yeast extract, 30 g (NH4)2SO4·7H2O, 30 g CaCO3, 0.5 g KH2PO4, 0.5 g MgSO4·7H2O, 0.01 g MnSO4·H2O, 0.01 g FeSO4·7H2O, 0.5 mg biotin, 0.3 mg thiamine-HCl)에서 수행되는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법은 배지로부터 카다베린을 회수하는 회수 단계를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 대장균(Escherichia coli) 유래 ldc 유전자와 데이노코쿠스 라디오두란스(Deinococcus radiodurance) 유래 dr1558 유전자를 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)에 도입하여 높은 농도의 카다베린(cadaverine, 1,5-Diaminopentane)을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 이를 이용하여 다양한 산업분야에서 활용되고 있는 생물기반 나일론의 전구체 생산단가를 낮출 수 있다.
도 1은 대장균(Escherichia coli)에서 유래한 ldc 유전자 및 데이노코쿠스 라디오두란스(Deinococcus radiodurance) 유래 dr1558 유전자를 모두 포함하는 pCES208H30ldc_dr1558 벡터 맵(vector map)을 나타내는 모식도이다.
도 2a는 ldc 및 dr1558 유전자를 모두 포함하는 pCES208H30ldc_dr1558 벡터로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미컴 균주의 카다베린 및 라이신 농도를 나타낸 회분식 배양 결과 그래프이다.
도 2b는 ldc 및 dr1558 유전자를 모두 포함하는 pCES208H30ldc_dr1558 벡터로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미컴 균주의 세포성장률을 나타낸 회분식 배양 결과 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1: dr1558 및 ldc 유전자가 동시에 발현되는 재조합 균주의 제작
대장균 유래 ldc를 포함한 pCES208 벡터는 선행 연구에서 제작된 재조합 벡터(pCES208H30ldc)를 사용하였다(Oh, YH et al., Applied biochemistry and biotechnology. 176: 2065-2075 참조). 데이노코쿠스 라디오두란스(Deinococcus radiodurance)에서 유래한 dr1558 유전자는 기존에 제작된 pCES208H30dr1558 벡터 (Kim SM. et al., Microbiology and Biotechnology Letters, 45(3): 271-275 참조)를 주형으로 하였고, 다음과 같은 프라이머(primer)로 PCR을 수행하여 증폭하여 획득하였다.
서열번호 명칭 서열
1 ldc 유전자 atgaacatcattgccattatgggaccgcatggcgtcttttataaagatgagcccatcaaagaactggagtcggcgctggtggcgcaaggctttcagattatctggccacaaaacagcgttgatttgctgaaatttatcgagcataaccctcgaatttgcggcgtgatttttgactgggatgagtacagtctcgatttatgtagcgatatcaatcagcttaatgaatatctcccgctttatgccttcatcaacacccactcgacgatggatgtcagcgtgcaggatatgcggatggcgctctggttttttgaatatgcgctggggcaggcggaagatatcgccattcgtatgcgtcagtacaccgacgaatatcttgataacattacaccgccgttcacgaaagccttgtttacctacgtcaaagagcggaagtacaccttttgtacgccggggcatatgggcggcaccgcatatcaaaaaagcccggttggctgtctgttttatgattttttcggcgggaatactcttaaggctgatgtctctatttcggtcaccgagcttggttcgttgctcgaccacaccgggccacacctggaagcggaagagtacatcgcgcggacttttggcgcggaacagagttatatcgttaccaacggaacatcgacgtcgaacaaaattgtgggtatgtacgccgcgccatccggcagtacgctgttgatcgaccgcaattgtcataaatcgctggcgcatctgttgatgatgaacgatgtagtgccagtctggctgaaaccgacgcgtaatgcgttggggattcttggtgggatcccgcgccgtgaatttactcgcgacagcatcgaagagaaagtcgctgctaccacgcaagcacaatggccggttcatgcggtgatcaccaactccacctatgatggcttgctctacaacaccgactggatcaaacagacgctggatgtcccgtcgattcacttcgattctgcctgggtgccgtacacccattttcatccgatctaccagggtaaaagtggtatgagcggcgagcgtgttgcgggaaaagtgatcttcgaaacgcaatcgacccacaaaatgctggcggcgttatcgcaggcttcgctgatccacattaaaggcgagtatgacgaagaggcctttaacgaagcctttatgatgcataccaccacctcgcccagttatcccattgttgcttcggttgagacggcggcggcgatgctgcgtggtaatccgggcaaacggctgattaaccgttcagtagaacgagctctgcattttcgcaaagaggtccagcggctgcgggaagagtctgacggttggtttttcgatatctggcaaccgccgcaggtggatgaagccgaatgctggcccgttgcgcctggcgaacagtggcacggctttaacgatgcggatgccgatcatatgtttctcgatccggttaaagtcactattttgacaccggggatggacgagcagggcaatatgagcgaggaggggatcccggcggcgctggtagcaaaattcctcgacgaacgtgggatcgtagtagagaaaaccggcccttataacctgctgtttctctttagtattggcatcgataaaaccaaagcaatgggattattgcgtgggttgacggaattcaaacgctcttacgatctcaacctgcggatcaaaaatatgctacccgatctctatgcagaagatcccgatttctaccgcaatatgcgtattcaggatctggcacaagggatccataagctgattcgtaaacacgatcttcccggtttgatgttgcgggcattcgatactttgccggagatgatcatgacgccacatcaggcatggcaacgacaaattaaaggcgaagtagaaaccattgcgctggaacaactggtcggtagagtatcggcaaatatgatcctgccttatccaccgggcgtaccgctgttgatgcctggagaaatgctgaccaaagagagccgcacagtactcgattttctactgatgctttgttccgtcgggcaacattaccccggttttgaaacggatattcacggcgcgaaacaggacgaagacggcgtttaccgcgtacgagtcctaaaaatggcgggataa
2 dr1558 유전자 TCAAGGACGCCTCCAGCGACACCCTGGCCGACGCCATCCACGCGGCGGCGCGCGGCGAAGTGCGGCTGCATCCCGAAGCGGCGCGGCGGCTGGTGCGCGATTTCCGGTCGCCGGAGATGCGCGAGAGCCTGACCCCCAAGGAAACCGCCGTGCTGCAACTGCTGGCGCGCGGGCAGAGCAACAAGGACATCGCCGCCGAACAGGGCGTGAGCGAGGCGACGGTCAAGACCCACGTGTCGCGGCTGCTGAGCAAGCTGGGGCTGGACAGCCGGACGCAGGCGGCGCTCTACGCCCTCAAATACGGGATTGCCAGTCTGGAGGGCGTGGAGTTGTGAGTGACTCTGCCTCAAGGAGAATCTATGACCACCCCCACTGTCCGTGTGCTGCTCGTTGACGACCACGCCGTCGTGCGCCAGGGTCTGCGCCTCTTTCTGGGGCTGGACGAAGGCATCGAAGTGGTGGGCGAGGCCGCCAACGGCGAAGAAGCCCTGCAAGAGGCCGAGCGCCTGCGCCCCGAAGTCGTCGTGATGGACCTGATGATGCCGGTGATGGATGGCATTACCGCCACCCGTGAGCTGCGCCGCCGCCTGCCCGACACCGAAGTCATCGCGCTGACCTCCACCCTGGAAGAAAACAAGGTGAACGGCGCGATTGAGGCCGGGGCCATCTCGTACATGC
3 dr1558 forward primer attacccgggtaccaaagtaacttttcggt
4 dr1558 reverse primer gcacttcactgacaccctca
기존에 제작된 pCES208H30ldc를 BamHI 제한 효소로 절단한 후 klenow 효소 처리를 진행하고, PCR을 통하여 증폭된 dr1558 유전자를 라이게이즈(ligase)를 이용하여 pCES208H30ldc_dr1558 재조합 벡터를 제작하였다.
dr1558 유전자의 도입 여부는 DNA 시퀀싱(sequencing)을 통하여 확인하였으며, dr1558 유전자와 ldc 유전자가 크로닝된 재조합 벡터(pCES208H30ldc_dr1558)는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) KCTC 1857 균주에 전기천공법으로 형질전환하여 RG 배지(per liter: 10 g glucose, 40 g Brain Heart Infusion, 10 g Beef Extract, 30 g D-sorbitol)에 30 ug/ml 카나마이신 항생제가 포함된 고체배지에서 선별하였다.
실시예 2: 재조합 균주에 의한 카다베린 생산
상기 형질전환된 dr1558 유전자와 ldc 유전자가 과발현된 재조합 코리네박테리움 글루타미컴을 이용하여 카다베린(cadaverine, 1,5-Diaminopentane)을 생산하기 위한 배양을 진행하였다. 배양에 사용된 배지로는 RG 배지(per liter: 10 g/L glucose, 40 g/L Brain Heart Infusion, 10 g/L Beef Extract, 30 g/L D-sorbitol)에 30 ug/ml 카나마이신을 첨가하여 30℃에서 18시간 동안 전배양하였다.
전배양한 dr1558 유전자와 ldc 유전자가 동시에 과발현된 재조합 코리네박테리움 글루타미컴을 30 ml RG 배지에 20 ug/ml 카나마이신 항생제가 포함된 배지에 접종하여 배양하였다(30℃, 250 rpm, 10 hr).
구체적으로, 배양액을 2.5-L 자 발효기(jar fermentor, BioCNS, Daejeon, Republic of Korea)의 배양기에서 20 ug/ml의 카나마이신 항생제가 포함된 500 ml의 CG-50배지에 접종하여 회분식 발효를 수행하였다. Antifoam 204 (Sigma-Aldrich, USA)를 이용하여 배양 도중 폼(foam)의 생성을 방지하였다.
발효가 진행되는 동안 일정량의 세포를 회수하여 세포성장률(od), 카다베린 농도(cadaverine) 및 리신(lysine)의 농도를 시간 경과에 따라 측정하였다. 세포성장률은 UV 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정함으로써 확인하였다. 포도당의 소모량은 일정량의 배양액을 얻은 후 원심분리하여 얻은 상등액을 0.22 um 필터(filter)로 거르고, 여과된 여과액을 고성능 액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 이용하여 분석하였다.
카다베린 및 리신의 농도는 일정량의 배양액을 얻은 후 원심분리하여 얻은 상등액을 디에틸 에톡시메틸렌말로네이트(diethyl ethoxymethylenemalonate, DEEMM) 유도체화 반응을 시킨 후에 고성능 액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 이용하여 분석하였다.
표 2, 도 2a 및 2b에서 확인할 수 있듯이, 45시간 동안 배양한 후, dr1558 유전자와 ldc 유전자가 동시에 과발현된 재조합 코리네박테리움 글루타미컴(◇: 카다베린 농도, △: 라이신 농도, ○: 세포 농도)에서는 ldc만 과발현된 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 대조군(◆: 카다베린 농도, ▲: 라이신 농도, ●: 세포 농도) 대비 카다베린 생산량이 1.2배 이상 증가하였고, 세포성장 역시 1.2배 증가하는 것을 확인하였다.
45h 배양 후 cadaverine lysine od
dr1558, ldc 25 3.6 250
ldc 19 3.9 199
동일한 조건에서 dr1558 및 ldc 유전자가 과발현된 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주로부터, ldc 유전자만 과발현된 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 대조군 균주 대비 고농도의 카다베린을 생산하는 것을 확인하였으므로, 이를 생물기반 나일론 산업에서 유용한 균주로써 이용할 수 있을 것으로 판단할 수 있다.
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Claims (11)

  1. 대장균(Escherichia coli)에서 유래한 Ldc 단백질을 코딩하는 유전자 및 데이노코쿠스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans)에서 유래한 DR1558 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  2. 대장균(Escherichia coli)에서 유래한 Ldc 단백질을 코딩하는 유전자 및 데이노코쿠스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans)에서 유래한 DR1558 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 카다베린(cadaverine, 1,5-Diaminopentane) 생산용 미생물.
  3. 제2항에 있어서, 미생물은 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)인 것인, 카다베린 생산용 미생물.
  4. 대장균(Escherichia coli)에서 유래한 Ldc 단백질을 코딩하는 유전자 및 데이노코쿠스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans)에서 유래한 DR1558 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 미생물을 형질전환하는 형질전환 단계를 포함하는 카다베린(cadaverine, 1,5-Diaminopentane) 생산용 미생물의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 미생물은 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)인 것인, 카다베린 생산용 미생물의 제조방법.
  6. 다음을 포함하는 카다베린(cadaverine, 1,5-Diaminopentane) 생산방법:
    대장균(Escherichia coli)에서 유래한 Ldc 단백질을 코딩하는 유전자 및 데이노코쿠스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans)에서 유래한 DR1558 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 미생물을 형질전환하는 형질전환 단계; 및
    형질전환시킨 미생물을 배지에 배양하는 배양 단계.
  7. 제6항에 있어서, 미생물은 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)인 것인, 카다베린 생산방법.
  8. 제6항에 있어서, 배양 단계는 20 내지 40℃의 온도에서 수행되는 것인, 카다베린 생산방법.
  9. 제6항에 있어서, 배양 단계는 탄소원을 포함하는 배지에서 수행되는 것인, 카다베린 생산방법.
  10. 제9항에 있어서, 탄소원은 포도당(glucose)인 것인, 카다베린 생산방법.
  11. 제6항에 있어서, 상기 방법은 배지로부터 카다베린을 회수하는 회수 단계를 추가적으로 포함하는 것인, 카다베린 생산방법.
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