KR102226445B1

KR102226445B1 - Gaba 생산성이 향상된 대장균, 이의 제조방법 및 이를 이용한 gaba 생산방법

Info

Publication number: KR102226445B1
Application number: KR1020190112911A
Authority: KR
Inventors: 최종일; 박성호
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2019-09-11
Filing date: 2019-09-11
Publication date: 2021-03-11

Abstract

본 발명은 GABA 생산성이 향상된 대장균, 이의 제조방법 및 이를 이용한 GABA 생산방법에 관한 것으로서, GadB 유전자 및 dr1558 유전자로 형질전환한 대장균을 배양함으로써 낮은 pH에 대한 저항성을 부여하므로, 이로부터 생산되는 GABA의 생산량이 낮은 pH 조건하에서도 월등히 향상되어, 이를 효과적으로 GABA의 생산에 이용할 수 있다.

Description

GABA 생산성이 향상된 대장균, 이의 제조방법 및 이를 이용한 GABA 생산방법{Escherichia coli with improved GABA productivity, method for preparing thereof and method for producing GABA using the same}

본 발명은 GABA 생산성이 향상된 대장균, 이의 제조방법 및 이를 이용한 GABA 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) OR74A 유래 글루탐산탈탄산효소(glutamate decarboxylase; GadB) 유전자 및 데이노코커스 라디오듀란스(Deinococcus radiodurans) 유래 dr1558 유전자로 형질전환한 대장균으로부터 GABA를 생산하는 기술에 관한 것이다.

감마 아미노뷰티르산(Gamma-amicnobutyric acid; GABA)는 아미노산의 일종으로 동물뿐만 아니라 식물에도 널리 분포되어 있으며, 포유류의 중추신경계에 작용하는 신경전달물질로 알려져 있다.

GABA는 억제성 신경전달물질로서 뇌 혈류개선, 산소공급 증가, 뇌세포 대사기능을 촉진시켜 신경안정작용, 스트레스해소, 기억력 증진, 혈압강하작용, 우울증 완화, 중풍과 치매 예방 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 효능을 목적으로 한 제품 개발이 연이어 이루어지고 있으며 현재 전세계적으로 약 20여 개의 GABA 제조업체가 있다.

최근 GABA는 식품, 의약 분야뿐만 아니라 차세대바이오폴리머인 나일론 4(Nylon 4)의 전구체로서 새로운 관심을 얻고 있다. 나일론 4의 합성 전구체는 2-피롤리돈(2-pyrrolidone)이며 이는 GABA로부터 화학공정을 통하여 전환할 수 있으며 이를 이용하여 내열성 바이오플라스틱인 나일론 4를 합성할 수 있다.

바이오공정으로부터 생산되는 GABA는 주로 3가지 공정을 통해 생산될 수 있다. 첫번째로는 재조합 대장균 및 락토바실러스 등의 미생물을 이용하여 글루코스와 같은 탄소원으로부터 직접적으로 GABA를 생산하는 방법이다. 그러나 아직까지는 그 효율이 낮은 편이므로 두번째 방법인 글루탐산나트륨(Mono Sodium Glutamate; MSG)의 생물학적 전환을 통한 GABA의 생산 방법이 주로 이용되고 있다. 본 방법은 MSG의 탈탄산반응(decarboxylation)을 일으키는 글루탐산탈탄산효소(glutamate decarboxylase; GAD)를 미생물에 발현시켜 MSG를 GABA로 직접 전환시키는 방법이다.

하지만, 효소반응을 통한 GABA의 전환은 인산피리독살(Pyridoxal phosphate; PLP)와 같은 비싼 조효소가 필요하기 때문에 생산비용이 높아진다는 단점을 가지고 있다.

GABA 생산효소인 글루탐산탈탄산효소(GadB)는 일반적으로 약 pH 3 내지 4의 낮은 pH에서 최적 활성을 나타낸다. 그러나 일반적인 미생물은 중성(pH 7) 부근에서 최적 성장을 나타내므로 미생물을 통해 효율적으로 GABA를 생산하기 위해서는 낮은 pH 에서도 잘 성장할 수 있는 균주를 개발할 필요가 있다.

이에 따라서 본 발명에서는 글루코스로부터 직접적으로 GABA를 생산하기 위하여 GABA 합성의 전구체인 글루탐산(glutamic acid)을 생합성할 수 있는 대사 경로를 감마-아미노전이효소(gamma-aminotransferase; GabT) 유전자가 결실된 대장균에 도입하였고, 낮은 pH, 높은 삼투압, 산화와 같은 다양한 스트레스에 내성이 높은 균으로 알려진 데이노코커스 라디오듀란스 유래 dr1558 유전자와 뉴로스포라 크라사 OR74A 유래 글루탐산탈탄산효소(GadB)를 대장균에 함께 발현시켜 효율적으로 GABA를 생산하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명자들은 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) OR74A 유래 글루탐산탈탄산효소(glutamate decarboxylase; GadB) 유전자 및 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 데이노코커스 라디오듀란스(Deinococcus radiodurans) 유래 dr1558 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 대장균을 배양함으로써 이로부터 생산되는 GABA의 생산량이 월등히 향상된 것을 확인하였다.

이에, 본 발명의 목적은 뉴로스포라 크라사 OR74A 유래 GadB 유전자 및 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 데이노코커스 라디오듀란스 유래 dr1558 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 뉴로스포라 크라사 OR74A 유래 GadB 유전자 및 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 데이노코커스 라디오듀란스 유래 dr1558 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된, GABA 생산성이 향상된 대장균(Escherichia coli)을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 대장균에 뉴로스포라 크라사 OR74A 유래 GadB 유전자 및 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 데이노코커스 라디오듀란스 유래 dr1558 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하는 형질전환 단계를 포함하는 GABA 생산성이 향상된 대장균의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 뉴로스포라 크라사 OR74A 유래 GadB 유전자 및 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 데이노코커스 라디오듀란스 유래 dr1558 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환시킨 대장균을 배양하는 배양 단계를 포함하는, GABA 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 뉴로스포라 크라사 OR74A 유래 GadB 유전자 및 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 데이노코커스 라디오듀란스 유래 dr1558 유전자의 대장균에서의 GABA 생산성 향상 용도에 관한 것이다.

본 발명은 GABA 생산성이 향상된 대장균, 이의 제조방법 및 이를 이용한 GABA 생산방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 대장균을 이용하여 낮은 pH 조건하에서 GABA를 효과적으로 생산할 수 있다.

본 발명자들은 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) OR74A 유래 글루탐산탈탄산효소(glutamate decarboxylase; GadB) 유전자 및 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 데이노코커스 라디오듀란스(Deinococcus radiodurans) 유래 dr1558 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환한 대장균 균주로부터, 낮은 pH 조건하에서 GABA를 높은 효율로 생산하는 것을 확인하였다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 양태는 뉴로스포라 크라사 OR74A 유래 GadB 유전자 및 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 데이노코커스 라디오듀란스 유래 dr1558 유전자를 포함하는 재조합 벡터이다.

상기 재조합 벡터는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 글루탐산탈수소효소(Glutamate dehydrogenase; gdhA) 유전자 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 이소시트르산탈수소효소(isocitrate dehydrogenase; icdA) 유전자를 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 재조합 벡터가 포함하는 유전자에 있어서, 뉴로스포라 크라사 OR74A 유래 GadB 유전자, 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 데이노코커스 라디오듀란스 유래 dr1558 유전자, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 gdhA 유전자 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 icdA 유전자는, 하나의 재조합 벡터에 포함되어 형질전환될 수 있고, 각각 독립적인 재조합 벡터에 포함되어 형질전환될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λ△z1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 일 예에서, 재조합 벡터를 숙주세포에 삽입함으로써 형질전환체를 만들 수 있으며, 상기 형질전환체는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다.

상기 숙주세포는 상기 발현벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있다.

본 발명에서 사용된 숙주세포로는 대장균, 효모, 동물세포, 식물세포, 또는 곤충세포 등을 포함할 수 있으며, 원핵세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 뉴로스포라 크라사 OR74A 유래 GadB 유전자 및 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 데이노코커스 라디오듀란스 유래 dr1558 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된, GABA 생산성이 향상된 대장균이다.

상기 재조합 벡터는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 gdhA 유전자 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 icdA 유전자를 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 대장균은 감마-아미노전이효소(gamma-aminotransferase; GabT) 유전자를 불활성화된 상태로 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서상의 용어 "유전자의 불활성화된 상태"란 대상이 되는 유전자의 염기서열에서 하나 이상의 염기쌍의 삽입, 결실, 전이 또는 치환 등의 원인에 의하여 해당 유전자의 발현이 제대로 일어나지 않게 된 것을 의미한다.

본 발명의 또 다른 양태는 대장균(Escherichia coli)에 뉴로스포라 크라사 OR74A 유래 GadB 유전자 및 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 데이노코커스 라디오듀란스 유래 dr1558 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하는 형질전환 단계를 포함하는 GABA 생산성이 향상된 대장균의 제조방법이다.

상기 대장균은 GabT 유전자를 불활성화된 상태로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 뉴로스포라 크라사 OR74A 유래 GadB 유전자 및 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 데이노코커스 라디오듀란스 유래 dr1558 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환시킨 대장균을 배양하는 배양 단계를 포함하는, GABA 생산방법이다.

상기 배양 단계는 다음의 단계를 포함하는 것일 수 있다:

상기 대장균을 탄소원 및 질소원을 포함하는 pH 6.0 내지 8.0의 배지에서 배양하는 제1 배양 단계; 및

제1 배양 단계 이후, 탄소원 및 질소원을 포함하는 유입 용액을 첨가하고 배지의 pH를 3.0 내지 5.5로 조절하여 상기 대장균을 배양하는 제2 배양 단계.

상기 제1 배양 단계는 pH 6.0 내지 7.5, pH 6.0 내지 7.0 또는 pH 6.5 내지 7.5, 예를 들어, pH 6.8 내지 7.2의 배지에서 배양하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 탄소원은 20 내지 30 g/L의 글루코스, 상기 질소원은 0.1 내지 10.0 g/L, 1.0 내지 10.0 g/L, 5.0 내지 10.0 g/L 또는 8.0 내지 10.0 g/L의 암모늄 설페이트인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 유입 용액은 글루코스, 암모늄 설페이트, MgSO₄·7H₂0 및 효모 추출물을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 제2 배양 단계는 pH 3.0 내지 5.5, pH 3.5 내지 5.5, pH 4.0 내지 5.5 또는 pH 4.5 내지 5.5, 예를 들어, pH 4.8 내지 5.2에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

도 1은 데이노코커스 라디오듀란스(Deinococcus radiodurans) 유래 dr1558 유전자, 대장균 유래 이소시트르산탈수소효소(isocitrate dehydrogenase; icdA) 및 글루탐산탈수소효소(Glutamate dehydrogenase; gdhA) 유전자를 포함하는 pACYC 벡터 맵(vector map)을 나타낸 모식도이다.
도 2는 뉴로스포라 크라사 OR74A 유래 글루탐산탈탄산효소 유전자(glutamate decarboxylase; gadB)를 포함하는 pMAL-p4X 벡터맵(vector map){Le Vo, 2013 #375}을 나타내는 모식도이다.
도 3a는 배지내의 암모늄 설페이트(ammonium sulfate) 농도에 따른 세포의 성장을 나타낸 그래프이다.
도 3b는 배지내의 암모늄 설페이트 농도에 따른 세포의 글루코스 소모량을 나타낸 그래프이다.
도 3c는 배지내의 암모늄 설페이트 농도에 따른 세포의 GABA 생산량을 나타낸 그래프이다.
도 4a는 10 g/L 암모늄 설페이트 존재하의 배지에서 세포의 성장을 나타낸 그래프이다.
도 4b는 10 g/L 암모늄 설페이트 존재하의 배지에서 세포의 글루코스 소모량을 나타낸 그래프이다.
도 4c는 10 g/L 암모늄 설페이트 존재하의 배지에서 세포의 GABA 생산량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 균주 DGB203을 글루코스를 탄소원으로 하여 32시간 동안 유가식 배양한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.

실시예 1: GABA 생산용 재조합 대장균의 제조

1-1. 글루탐산탈수소효소(Glutamate dehydrogenase; gdhA) 유전자 클로닝

대장균 유래의 gdhA 유전자를 프라이머(primer)를 이용하여 클로닝하였다. gdhA 유전자의 염기서열 및 이용한 프라이머의 서열은 하기 표 1과 같다.

서열번호	명칭	서열
1	gdhA-F 프라이머	ATGGATCAGACATATTCTCTGGAGTC
2	gdhA-R 프라이머	ATTACGCTCGAGTTAAATCACACCCTGCGCCA
3	gdhA 염기서열	ATGGATCAGACATATTCTCTGGAGTCATTCCTCAACCATGTCCAAAAGCGCGACCCGAATCAAACCGAGTTCGCGCAAGCCGTTCGTGAAGTAATGACCACACTCTGGCCTTTTCTTGAACAAAATCCAAAATATCGCCAGATGTCATTACTGGAGCGTCTGGTTGAACCGGAGCGCGTGATCCAGTTTCGCGTGGTATGGGTTGATGATCGCAACCAGATACAGGTCAACCGTGCATGGCGTGTGCAGTTCAGCTCTGCCATCGGCCCGTACAAAGGCGGTATGCGCTTCCATCCGTCAGTTAACCTTTCCATTCTCAAATTCCTCGGCTTTGAACAAACCTTCAAAAATGCCCTGACTACTCTGCCGATGGGCGGTGGTAAAGGCGGCAGCGATTTCGATCCGAAAGGAAAAAGCGAAGGTGAAGTGATGCGTTTTTGCCAGGCGCTGATGACTGAACTGTATCGCCACCTGGGCGCGGATACCGACGTTCCGGCAGGTGATATCGGGGTTGGTGGTCGTGAAGTCGGCTTTATGGCGGGGATGATGAAAAAGCTCTCCAACAATACCGCCTGCGTCTTCACCGGTAAGGGCCTTTCATTTGGCGGCAGTCTTATTCGCCCGGAAGCTACCGGCTACGGTCTGGTTTATTTCACAGAAGCAATGCTAAAACGCCACGGTATGGGTTTTGAAGGGATGCGCGTTTCCGTTTCTGGCTCCGGCAACGTCGCCCAGTACGCTATCGAAAAAGCGATGGAATTTGGTGCTCGTGTGATCACTGCGTCAGACTCCAGCGGCACTGTAGTTGATGAAAGCGGATTCACGAAAGAGAAACTGGCACGTCTTATCGAAATCAAAGCCAGCCGCGATGGTCGAGTGGCAGATTACGCCAAAGAATTTGGTCTGGTCTATCTCGAAGGCCAACAGCCGTGGTCTCTACCGGTTGATATCGCCCTGCCTTGCGCCACCCAGAATGAACTGGATGTTGACGCCGCGCATCAGCTTATCGCTAATGGCGTTAAAGCCGTCGCCGAAGGGGCAAATATGCCGACCACCATCGAAGCGACTGAACTGTTCCAGCAGGCAGGCGTACTATTTGCACCGGGTAAAGCGGCTAATGCTGGTGGCGTCGCTACATCGGGCCTGGAAATGGCACAAAACGCTGCGCGCCTGGGCTGGAAAGCCGAGAAAGTTGACGCACGTTTGCATCACATCATGCTGGATATCCACCATGCCTGTGTTGAGCATGGTGGTGAAGGTGAGCAAACCAACTACGTGCAGGGCGCGAACATTGCCGGTTTTGTGAAGGTTGCCGATGCGATGCTGGCGCAGGGTGTGATTTAA

역방향 프라이머에서 ‘CTCGAG’는 XhoⅠ제한효소(NEB, Ipswithch, MA, USA) 가 인식하는 절단 부위이다. 준비한 프라이머 세트를 사용하여 대장균 게놈 DNA를 주형가닥으로 하고 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 유전자 증폭을 실시하였다.

증폭된 유전자를 pACYC-MCS 벡터에 라이게이션(ligation) 하기 위하여 플라스미드는 EcoRV 및 XhoⅠ제한효소로 절단하였고 gdhA 유전자는 XhoⅠ제한효소로 절단하여 리가아제(ligase)를 처리하였다. 이렇게 재조합한 플라스미드를 pGB101 라 명명하였고, 형질전환용 숙주인 대장균 XL1-Blue에 전기천공법의 형질전환 방법으로 형질전환을 수행하였다. 형질전환 유무는 LB (Luria Bertani, LB; BD, Franklin Lakes, NJ, New Jersey, USA) 배지에 35 ug/ml 클로람페니콜 항생제가 포함된 플레이트(plate)에서 선별하였다.

1-2. 이소시트르산탈수소효소(isocitrate dehydrogenase; icdA) 유전자의 클로닝

상기 1-1에서 제조된 벡터 pGB101에 대장균 유래의 icdA 유전자를 클로닝하였다. icdA 유전자의 염기서열 및 이용한 프라이머의 서열은 하기 표 2와 같다.

서열번호	명칭	서열
4	icdA-F 프라이머	ATTAGCATATGATGAAAGTAAAGTAGTTGTTCCG
5	icdA-R 프라이머	ATTACAGATCTTTACATGTTTTCGATGATCGCGT
6	icdA 염기서열	ATGATGGAAAGTAAAGTAGTTGTTCCGGCACAAGGCAAGAAGATCACCCTGCAAAACGGCAAACTCAACGTTCCTGAAAATCCGATTATCCCTTACATTGAAGGTGATGGAATCGGTGTAGATGTAACCCCAGCCATGCTGAAAGTGGTCGACGCTGCAGTCGAGAAAGCCTATAAAGGCGAGCGTAAAATCTCCTGGATGGAAATTTACACCGGTGAAAAATCCACACAGGTTTATGGTCAGGACGTCTGGCTGCCTGCTGAAACTCTTGATCTGATTCGTGAATATCGCGTTGCCATTAAAGGTCCGCTGACCACTCCGGTTGGTGGCGGTATTCGCTCTCTGAACGTTGCCCTGCGCCAGGAACTGGATCTCTACATCTGCCTGCGTCCGGTACGTTACTATCAGGGCACTCCAAGCCCGGTTAAACACCCTGAACTGACCGATATGGTTATCTTCCGTGAAAACTCGGAAGACATTTATGCGGGTATCGAATGGAAAGCAGACTCTGCCGACGCCGAGAAAGTGATTAAATTCCTGCGTGAAGAGATGGGGGTGAAGAAAATTCGCTTCCCGGAACATTGTGGTATCGGTATTAAGCCGTGTTCGGAAGAAGGCACCAAACGTCTGGTTCGTGCAGCGATCGAATACGCAATTGCTAACGATCGTGACTCTGTGACTCTGGTGCACAAAGGCAACATCATGAAGTTCACCGAAGGAGCGTTTAAAGACTGGGGCTACCAGCTGGCGCGTGAAGAGTTTGGCGGTGAACTGATCGACGGTGGCCCGTGGCTGAAAGTTAAAAACCCGAACACTGGCAAAGAGATCGTCATTAAAGACGTGATTGCTGATGCATTCCTGCAACAGATCCTGCTGCGTCCGGCTGAATATGATGTTATCGCCTGTATGAACCTGAACGGTGACTACATTTCTGACGCCCTGGCAGCGCAGGTTGGCGGTATCGGTATCGCCCCTGGTGCAAACATCGGTGACGAATGCGCCCTGTTTGAAGCCACCCACGGTACTGCGCCGAAATATGCCGGTCAGGACAAAGTAAATCCTGGCTCTATTATTCTCTCCGCTGAGATGATGCTGCGCCACATGGGTTGGACCGAAGCGGCTGACTTAATTGTTAAAGGTATGGAAGGCGCAATCAACGCGAAAACCGTAACCTATGACTTCGAGCGTCTGATGGATGGCGCTAAACTGCTGAAATGTTCAGAGTTTGGTGACGCGATCA TCGAAAACATGTAA

정방향 프라이머의 ‘CATATG’는 NdeⅠ제한효소(NEB, Ipswitch, MA, USA)가 인식하는 절단 부위이고, 역방향 프라이머에서 ‘AGATCT’는 BglⅡ 제한효소(NEB, Ipswitch, MA, USA) 가 인식하는 절단 부위이다. 준비한 프라이머 세트를 사용하여 대장균 게놈 DNA를 주형가닥으로 하여 PCR을 통해 유전자 증폭을 실시하였다.

증폭된 유전자를 상기 1-1에서 제조한 벡터에 라이게이션하기 위하여 플라스미드와 icdA 유전자를 각각 NdeⅠ 및 BglⅡ 제한효소로 절단한 후 리가아제를 처리하였다. 이렇게 재조합한 플라스미드를 pGB102 라 명명하였고, 형질전환용 숙주인 대장균 XL1-Blue에 전기천공법의 형질전환 방법으로 형질전환을 수행하였다. 형질전환 유무는 LB 배지에 35 ug/ml 클로람페니콜 항생제가 포함된 플레이트에서 선별하였다.

1-3. dr1558 유전자의 클로닝

상기 1-2에서 제조된 벡터 pGB102에 데이노코커스 라디오듀란스(Deinococcus radiodurans) 유래 dr1558 유전자를 클로닝하였다. dr1558 유전자의 염기서열 및 이용한 프라이머의 서열은 하기 표 3과 같다.

서열번호	명칭	서열
7	dr1558-F 프라이머	ATTATATACCATGGATGACTCTGCCTCAAGGAGAA
8	dr1558-R 프라이머	TATATAATGGATCCTCACAACTCCACGCCCTCCAG
9	dr1558 염기서열	ATGACTCTGCCTCAAGGAGAATCTATGACCACCCCCACTGTCCGTGTGCTGCTCGTTGACGACCACGCCGTCGTGCGCCAGGGTCTGCGCCTCTTTCTGGGGCTGGACGAAGGCATCGAAGTGGTGGGCGAGGCCGCCAACGGCGAAGAAGCCCTGCAAGAGGCCGAGCGCCTGCGCCCCGAAGTCGTCGTGATGGACCTGATGATGCCGGTGATGGATGGCATTACCGCCACCCGTGAGCTGCGCCGCCGCCTGCCCGACACCGAAGTCATCGCGCTGACCTCCACCCTGGAAGAAAACAAGGTGAACGGCGCGATTGAGGCCGGGGCCATCTCGTACATGCTCAAGGACGCCTCCAGCGACACCCTGGCCGACGCCATCCACGCGGCGGCGCGCGGCGAAGTGCGGCTGCATCCCGAAGCGGCGCGGCGGCTGGTGCGCGATTTCCGGTCGCCGGAGATGCGCGAGAGCCTGACCCCCAAGGAAACCGCCGTGCTGCAACTGCTGGCGCGCGGGCAGAGCAACAAGGACATCGCCGCCGAACAGGGCGTGAGCGAGGCGACGGTCAAGACCCACGTGTCGCGGCTGCTGAGCAAGCTGGGGCTGGACAGCCGGACGCAGGCGGCGCTCTACGCCCTCAAATACGGGATTGCCAGTCTGGAGGGCGTGGAGTTGTGA

정방향 프라이머의 ‘CCATGG’는 ncoⅠ 제한효소(NEB, Ipswitch, MA, USA)가 인식하는 절단 부위이고, 역방향 프라이머에서 ‘GGATCC’는 BamHⅠ 제한효소(NEB, Ipswitch, MA, USA) 가 인식하는 절단 부위이다. 준비한 프라이머 세트를 사용하여 데이노코커스 라디오듀란스 게놈 DNA를 주형가닥으로 하여 PCR을 통해 유전자 증폭을 실시하였다.

증폭된 유전자를 1-2에서 제조된 pGB102 벡터에 라이게이션하기 위하여 플라스미드와 dr1558 유전자를 각각 NcoⅠ 및 BamHⅠ 제한효소로 절단한 후 리가아제를 처리하였다. 이렇게 재조합한 플라스미드를 pGB103이라 명명하였고, 도 1에 나타내었다. 이를 형질전환용 숙주인 대장균 XL1-Blue에 전기천공법으로 형질전환을 수행하였다. 형질전환 유무는 LB 배지에 35 ug/ml 클로람페니콜 항생제가 포함된 플레이트에서 선별하였다.

1-4. 형질전환체의 제조

도 2로 나타낸 뉴로스포라 크라사 OR74A 유래 GadB 유전자를 포함한 pMAL-p4x 벡터{Le Vo, 2013 #375}를 분양받아 gabT 유전자가 결실된 대장균 BL21(DE3)에 전기천공법을 이용하여 형질전환하였고, 형질전환된 대장균은 LB 배지에 100 ug/ml 암피실린 항생제가 포함된 플레이트에서 선별하였다.

그런 다음, 선별된 재조합 대장균에 상기 1-1, 1-2 및 1-3의 재조합 벡터 pGB101, pGB102 및 pGB103을 각각 전기천공법을 이용하여 형질전환하였고 형질전환 여부는 LB 배지에 35 ug/ml 클로람페니콜과 100 ug/ml 암피실린 항생제가 포함된 플레이트에서 확인하였다. 이렇게 제조된 GABA 생산용 재조합 대장균을 각각 DGB201, DGB202 및 DGB203이라 명명하였다.

실시예 2: GABA의 생산 및 분석

2-1. GABA의 생산 조건 확립 및 분석

상기 형질전환된 대장균 DGB201와 DGB202를 이용하여 GABA를 생산하기 위해 LB 배지에 35 ug/ml 클로람페니콜과 100 ug/ml 암피실린 항생제가 포함된 배지에서 30℃에서 12시간 동안 전배양하였다. 그 후, 전배양한 재조합 대장균을 각각 50 ml MRY5 배지(pH 7.0, 6.67 g/L KH₂PO₄, 4 g/L (NH₄)₂HPO₄, 0.8 g/L MgSO_4·7H₂O, 0.8 g/L citric acid, 5 g/L Yeast Extract, 5 mL/L trace metal solution, (0.5 M HCl contained 10 g/L FeSO_4·7H₂O, 2 g/L CaCl₂, 2.2 g/L ZnSO_4·7H₂O, 0.5 g/L MnSO_4·4H₂O, 1 g/L CuSO_4·5H₂O, 0.1 g/L (NH₄)₆Mo₇O_24·4H₂O, 0.02 g/L Na₂B₄O_7·10H₂O)) 에 30 g/l 글루코스와 질소원인 암모늄 설페이트(ammonium sulfate)를 각각 0, 5 및 10 g/L 로 조절한 배지에 35 ug/ml 클로람페니콜 100 ug/ml 암피실린 항생제를 첨가하여 O.D= 1일때, IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 0.5 mM 로 처리하였다.

균주는 30℃에서 24시간 동안 배양하였으며, 배양 종료 후 세포의 성장, 글루코스 소모량 그리고 GABA 생산량을 분석하였다. 글루코스의 소모량은 일정량의 배양액을 취한 후 원심분리하여 얻은 상등액을 0.22 um 여과지로 거르고, 여과된 여과액을 고성능 액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 이용하여 분석하여 도 3b로 나타내었다. GABA의 농도는 일정량의 배양액을 취한 후 원심분리하여 얻은 상등액 100 ul를 DEEMM(diethyl ethoxymethylene malonate) 반응 분석법을 이용하여 HPLC를 이용하여 분석하였다.

도 3a 내지 3c 및 표 4에서 확인할 수 있듯이, 24시간 동안 배양 후 icdA 유전자가 포함된 벡터를 포함한 재조합 대장균에서 질소원인 암모늄 설페이트를 0, 5 및 10 g/L 로 각기 달리 처리하였을 때, 세포 성장과 글루코스 소모량은 대조군 대비 뚜렷한 차이를 나타내지 않았지만 GABA 생산량은 모든 실험군에서 증가하는 것을 확인하였다.

특히 10 g/L 암모늄 설페이트를 처리한 실험군에서 1.51 g/L 로 가장 높은 GABA의 생산량을 보였고, 이는 대조군 대비 1.7 배 이상 증가한 수치이다.

	암모늄 설페이트 0 g/L		암모늄 설페이트 5 g/L		암모늄 설페이트 10 g/L
균주	DGB201	DGB202	DGB201	DGB202	DGB201	DGB202
GABA (g/L)	0.19±0.1	0.4±0.05	0.76±0.2	1.03±0.15	0.88±0.1	1.51±0.2

상기 실험 결과에서 확립된 GABA 생산 조건을 바탕으로 하여 dr1558 유전자에 의한 GABA 생산의 영향을 조사하였다.

도 4에서 확인할 수 있듯이, 30 g/L 글루코스 및 10 g/L 암모늄 설페이트를 처리한 MRY5 배지에서 dr1558 유전자를 포함한 GABA 생산 재조합 대장균 균주 DGB203을 24시간 동안 배양한 결과, 세포 성장은 대조군인 DGB202 균주에 비해 감소하였지만 글루코스 소모량은 차이가 없었고, GABA 생산량은 2.56 g/L 로 대조군 대비 1.6 배 증가하였다.

2-2. 유가식 배양을 통한 GABA의 생산

일반적으로 대장균은 낮은 pH(4.0 내지 5.0) 부근에서 세포의 성장 및 대사 능력이 떨어지기 때문에 낮은 pH에서 GABA를 생산하기에는 적합하지 않다. 따라서 상기 플라스크 배양에서 확립된 배지를 통하여 dr1558 유전자가 포함된 GABA 생산 균주인 DGB203을 유가식 배양을 통해 낮은 pH에서 배양과 동시에 GABA를 생산할 수 있는지 실험하였다.

유가식 배양을 위한 배지 조성은 MRY5 배지에 20 g/L 글루코스(glucose)와 10 g/L 암모늄 설페이트를 첨가한 배지이며, 유입 용액(Feeding solution)의 조성은 500 g/L 글루코스, 500 g/L 암모늄 설페이트, 150 g/L MgSO₄_7H₂O, 400 g/L 효모 추출물(Yeast Extract)이다.

상기 배지의 조성을 이용하여 GABA 생산 균주인 DGB203을 O.D= 5일 때, IPTG(isopropylthio-β-galactoside)를 최종 농도 0.5 mM 로 처리하였고, 13시간 즉, 초기 배지 내의 글루코스가 모두 소모될 때까지 30℃에서 pH 7.0으로 발효를 진행하였다. 초기 글루코스가 모두 소모된 시점에서 5M HCl을 이용하여 발효배지의 pH를 5.0으로 낮춘 후 글루코오스가 모두 소모될 때 마다, 상기 유입 용액을 최종 농도 20 g/L 글루코스, 2.5 g/L 암모늄 설페이트, 0.375 g/L MgSO₄_7H₂0, 2.5 g/L 효모 추출물로 하여 첨가하였다.

도 5에서 확인할 수 있듯이, 32시간 동안 유가식 배양을 진행한 결과, GABA를 최종 농도 4.09 g/L를 얻을 수 있었다. 따라서 낮은 pH에서 대장균에 저항성을 부여한다고 알려진 dr1558 유전자를 도입함에 따라서 낮은 pH에서 유가식 배양을 통해 글루코스를 단일 탄소원으로 하여 GABA를 생산할 수 있는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명에서의 dr1558 유전자를 포함하는 GABA 생산 균주의 경우, 낮은 pH에서 세포 성장 및 GABA 생산을 할 수 있다는 측면에서 산업적으로 유용하게 이용될 수 있다.

<110> Escherichia coli with improved GABA productivity, method for preparing thereof and method for producing GABA using the same <120> Escherichia coli with improved GABA productivity, method for preparing thereof and method for producing GABA using the same <130> PN190245 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gdhA forward primer <400> 1 atggatcaga catattctct ggagtc 26 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gdhA reverse primer <400> 2 attacgctcg agttaaatca caccctgcgc ca 32 <210> 3 <211> 1344 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3 atggatcaga catattctct ggagtcattc ctcaaccatg tccaaaagcg cgacccgaat 60 caaaccgagt tcgcgcaagc cgttcgtgaa gtaatgacca cactctggcc ttttcttgaa 120 caaaatccaa aatatcgcca gatgtcatta ctggagcgtc tggttgaacc ggagcgcgtg 180 atccagtttc gcgtggtatg ggttgatgat cgcaaccaga tacaggtcaa ccgtgcatgg 240 cgtgtgcagt tcagctctgc catcggcccg tacaaaggcg gtatgcgctt ccatccgtca 300 gttaaccttt ccattctcaa attcctcggc tttgaacaaa ccttcaaaaa tgccctgact 360 actctgccga tgggcggtgg taaaggcggc agcgatttcg atccgaaagg aaaaagcgaa 420 ggtgaagtga tgcgtttttg ccaggcgctg atgactgaac tgtatcgcca cctgggcgcg 480 gataccgacg ttccggcagg tgatatcggg gttggtggtc gtgaagtcgg ctttatggcg 540 gggatgatga aaaagctctc caacaatacc gcctgcgtct tcaccggtaa gggcctttca 600 tttggcggca gtcttattcg cccggaagct accggctacg gtctggttta tttcacagaa 660 gcaatgctaa aacgccacgg tatgggtttt gaagggatgc gcgtttccgt ttctggctcc 720 ggcaacgtcg cccagtacgc tatcgaaaaa gcgatggaat ttggtgctcg tgtgatcact 780 gcgtcagact ccagcggcac tgtagttgat gaaagcggat tcacgaaaga gaaactggca 840 cgtcttatcg aaatcaaagc cagccgcgat ggtcgagtgg cagattacgc caaagaattt 900 ggtctggtct atctcgaagg ccaacagccg tggtctctac cggttgatat cgccctgcct 960 tgcgccaccc agaatgaact ggatgttgac gccgcgcatc agcttatcgc taatggcgtt 1020 aaagccgtcg ccgaaggggc aaatatgccg accaccatcg aagcgactga actgttccag 1080 caggcaggcg tactatttgc accgggtaaa gcggctaatg ctggtggcgt cgctacatcg 1140 ggcctggaaa tggcacaaaa cgctgcgcgc ctgggctgga aagccgagaa agttgacgca 1200 cgtttgcatc acatcatgct ggatatccac catgcctgtg ttgagcatgg tggtgaaggt 1260 gagcaaacca actacgtgca gggcgcgaac attgccggtt ttgtgaaggt tgccgatgcg 1320 atgctggcgc agggtgtgat ttaa 1344 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> icdA forward primer <400> 4 attagcatat gatgaaagta aagtagttgt tccg 34 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> icdA reverse primer <400> 5 attacagatc tttacatgtt ttcgatgatc gcgt 34 <210> 6 <211> 1254 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 6 atgatggaaa gtaaagtagt tgttccggca caaggcaaga agatcaccct gcaaaacggc 60 aaactcaacg ttcctgaaaa tccgattatc ccttacattg aaggtgatgg aatcggtgta 120 gatgtaaccc cagccatgct gaaagtggtc gacgctgcag tcgagaaagc ctataaaggc 180 gagcgtaaaa tctcctggat ggaaatttac accggtgaaa aatccacaca ggtttatggt 240 caggacgtct ggctgcctgc tgaaactctt gatctgattc gtgaatatcg cgttgccatt 300 aaaggtccgc tgaccactcc ggttggtggc ggtattcgct ctctgaacgt tgccctgcgc 360 caggaactgg atctctacat ctgcctgcgt ccggtacgtt actatcaggg cactccaagc 420 ccggttaaac accctgaact gaccgatatg gttatcttcc gtgaaaactc ggaagacatt 480 tatgcgggta tcgaatggaa agcagactct gccgacgccg agaaagtgat taaattcctg 540 cgtgaagaga tgggggtgaa gaaaattcgc ttcccggaac attgtggtat cggtattaag 600 ccgtgttcgg aagaaggcac caaacgtctg gttcgtgcag cgatcgaata cgcaattgct 660 aacgatcgtg actctgtgac tctggtgcac aaaggcaaca tcatgaagtt caccgaagga 720 gcgtttaaag actggggcta ccagctggcg cgtgaagagt ttggcggtga actgatcgac 780 ggtggcccgt ggctgaaagt taaaaacccg aacactggca aagagatcgt cattaaagac 840 gtgattgctg atgcattcct gcaacagatc ctgctgcgtc cggctgaata tgatgttatc 900 gcctgtatga acctgaacgg tgactacatt tctgacgccc tggcagcgca ggttggcggt 960 atcggtatcg cccctggtgc aaacatcggt gacgaatgcg ccctgtttga agccacccac 1020 ggtactgcgc cgaaatatgc cggtcaggac aaagtaaatc ctggctctat tattctctcc 1080 gctgagatga tgctgcgcca catgggttgg accgaagcgg ctgacttaat tgttaaaggt 1140 atggaaggcg caatcaacgc gaaaaccgta acctatgact tcgagcgtct gatggatggc 1200 gctaaactgc tgaaatgttc agagtttggt gacgcgatca tcgaaaacat gtaa 1254 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr1558 forward primer <400> 7 attatatacc atggatgact ctgcctcaag gagaa 35 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr1558 reverse primer <400> 8 tatataatgg atcctcacaa ctccacgccc tccag 35 <210> 9 <211> 678 <212> DNA <213> Deinococcus radiodurans <400> 9 atgactctgc ctcaaggaga atctatgacc acccccactg tccgtgtgct gctcgttgac 60 gaccacgccg tcgtgcgcca gggtctgcgc ctctttctgg ggctggacga aggcatcgaa 120 gtggtgggcg aggccgccaa cggcgaagaa gccctgcaag aggccgagcg cctgcgcccc 180 gaagtcgtcg tgatggacct gatgatgccg gtgatggatg gcattaccgc cacccgtgag 240 ctgcgccgcc gcctgcccga caccgaagtc atcgcgctga cctccaccct ggaagaaaac 300 aaggtgaacg gcgcgattga ggccggggcc atctcgtaca tgctcaagga cgcctccagc 360 gacaccctgg ccgacgccat ccacgcggcg gcgcgcggcg aagtgcggct gcatcccgaa 420 gcggcgcggc ggctggtgcg cgatttccgg tcgccggaga tgcgcgagag cctgaccccc 480 aaggaaaccg ccgtgctgca actgctggcg cgcgggcaga gcaacaagga catcgccgcc 540 gaacagggcg tgagcgaggc gacggtcaag acccacgtgt cgcggctgct gagcaagctg 600 gggctggaca gccggacgca ggcggcgctc tacgccctca aatacgggat tgccagtctg 660 gagggcgtgg agttgtga 678

Claims

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글루탐산탈탄산효소(glutamate decarboxylase; GadB) 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 데이노코커스 라디오듀란스(Deinococcus radiodurans) 유래 dr1558 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된, GABA 생산성이 향상된 대장균(Escherichia coli).
제3항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 글루탐산탈수소효소(Glutamate dehydrogenase; gdhA) 유전자 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 이소시트르산탈수소효소(isocitrate dehydrogenase; icdA) 유전자를 더 포함하는 것인, GABA 생산성이 향상된 대장균.
제3항에 있어서, 상기 대장균은 감마-아미노전이효소(gamma-aminotransferase; GabT) 유전자를 불활성화된 상태로 포함하는 것인, GABA 생산성이 향상된 대장균.
대장균(Escherichia coli)에 글루탐산탈탄산효소(glutamate decarboxylase; GadB) 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 데이노코커스 라디오듀란스(Deinococcus radiodurans) 유래 dr1558 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하는 형질전환 단계를 포함하는 GABA 생산성이 향상된 대장균의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 글루탐산탈수소효소(Glutamate dehydrogenase; gdhA) 유전자 또는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 이소시트르산탈수소효소(isocitrate dehydrogenase; icdA) 유전자를 더 포함하는 것인, GABA 생산성이 향상된 대장균의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 대장균은 감마-아미노전이효소(gamma-aminotransferase; GabT) 유전자를 불활성화된 상태로 포함하는 것인, GABA 생산성이 향상된 대장균의 제조방법.
글루탐산탈탄산효소(glutamate decarboxylase; GadB) 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 데이노코커스 라디오듀란스(Deinococcus radiodurans) 유래 dr1558 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환시킨 대장균(Escherichia coli)을 배양하는 배양 단계를 포함하는, GABA 생산방법.
제9항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 글루탐산탈수소효소(Glutamate dehydrogenase; gdhA) 유전자 또는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 이소시트르산탈수소효소(isocitrate dehydrogenase; icdA) 유전자를 더 포함하는 것인, GABA 생산방법.
제9항에 있어서, 상기 대장균은 감마-아미노전이효소(gamma-aminotransferase; GabT) 유전자를 불활성화된 상태로 포함하는 것인, GABA 생산방법.
제9항에 있어서, 상기 배양 단계는 다음의 단계를 포함하는 것인, GABA 생산방법:
상기 대장균을 탄소원 및 질소원을 포함하는 pH 6.0 내지 8.0의 배지에서 배양하는 제1 배양 단계; 및
제1 배양 단계 이후, 배지의 pH를 3.0 내지 5.5로 조절하여 상기 대장균을 배양하는 제2 배양 단계.