WO2021241546A1 - 目的タンパク質の製造方法 - Google Patents

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WO2021241546A1
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昂文 野田
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Ｓｐｉｂｅｒ株式会社
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a target protein.
  • Non-Patent Document 1 a system for producing a recombinant protein using E. coli (E. coli, Escherichia coli) as a host cell is most commonly used.
  • the method of the present invention it is possible to provide a production method capable of efficiently producing the target protein on an industrial scale, and the production amount of the target protein is improved by the method.
  • the production method of the present invention is a method for producing a target protein, which comprises a step of culturing Escherichia coli (Escherichia coli) having a nucleic acid encoding the target protein and a step of inducing the expression of the nucleic acid encoding the target protein.
  • the culturing step comprises culturing Escherichia coli in the initial medium and further culturing in the medium to which glycine and / or alanine is added after the OD600 value of the culture solution reaches 5 or more. It was
  • the target protein in the present embodiment is processed into an artificial protein material, when artificially molded, amino acids having smaller side chains are more likely to have hydrogen bonds, and it is easier to obtain a high-strength molded product.
  • the alanine residue and the glycine residue are non-polar amino acids in the side chain, they are arranged so as to face inward in the folding process in polypeptide production, and easily form an ⁇ -helix structure or a ⁇ -sheet structure. Therefore, it is desirable that the proportion of amino acids such as glycine residue, alanine residue, and serine residue is high.
  • modified fibroin is preferable.
  • fibroin include naturally occurring fibroin.
  • naturally occurring fibroin include fibroin produced by insects or spiders. It was
  • Spiders belonging to the genus Arachnura spiders belonging to the genus Acusilas such as spiders, spiders belonging to the genus Cytophora, spiders belonging to the genus Cytophora, spiders belonging to the genus Cytophora, and spiders belonging to the genus Cytophora.
  • Examples include pider silk protein.
  • Examples of the spider silk protein include traction thread proteins such as MaSp (MaSp1 and MaSp2) and ADF (ADF3 and ADF4), MiSp (MiSp1 and MiSp2) and the like. It was
  • the modified fibroin may further have an amino acid sequence (N-terminal sequence and C-terminal sequence) added to either or both of the N-terminal side and the C-terminal side of the domain sequence.
  • the N-terminal sequence and the C-terminal sequence are not limited to this, but are typically regions that do not have the repetition of the amino acid motif characteristic of fibroin, and consist of about 100 residues of amino acids.
  • Artificial structural proteins also include collagen, elastin and resilin. It was
  • keratin-derived protein examples include Type I keratin of Capra hircus. It was
  • the method for producing the nucleic acid encoding the target protein is not particularly limited.
  • the desired nucleic acid can be produced by the method of synthesis.
  • the chemical synthesis method of nucleic acid is not particularly limited, and for example, AKTA oligonucleotide plus 10/100 (GE Healthcare Japan Co., Ltd.) based on the amino acid sequence information of the protein obtained from the NCBI web database or the like.
  • Genes can be chemically synthesized by ligating automatically synthesized oligonucleotides by PCR or the like. At this time, in order to facilitate purification and / or confirmation of the protein, a nucleic acid encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which an amino acid sequence consisting of a start codon and a His10 tag is added to the N-terminal of the above amino acid sequence is synthesized. May be good. It was
  • expression of the protein of interest may be inducible.
  • an inducible promoter that functions in a host cell and can induce the expression of the target protein as a promoter that controls the expression of the target protein
  • the expression of the target protein can be induced.
  • Inducible promoters include the presence of inducers (expression inducers) such as isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG), the absence of repressor molecules, or the increase or decrease in temperature, osmotic pressure or pH value. It is a promoter that can control transcription by physical factors. It was
  • sulfur source examples include inorganic sulfur compounds such as sulfate, thiosulfate and sulfite, and sulfur-containing amino acids such as cysteine, cystine and glutathione. It was
  • Both the carbon source concentration in the fed-batch medium and the flow acceleration of the fed-batch medium may or may not be constant throughout the period before the induction of expression. It was
  • It can be provided in the form of purified glycine and / and alanine, a yeast extract containing glycine and / and alanine, or tryptone. It is preferred to add purified glycine and / and alanine. It was
  • the concentration of alanine in the cell culture medium may be 1 ⁇ M or more, for example, 1 ⁇ M to 100 mM.
  • it may be 1 ⁇ M to 10 ⁇ M, 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, 1 ⁇ M to 250 ⁇ M, 1 ⁇ M to 500 ⁇ M, 1 ⁇ M to 1 mM, or 1 ⁇ M to 10 mM.
  • an inducible promoter activated by the presence of an inducer such as isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG)
  • the inducer can be added to the culture medium.
  • the expression of the target protein can be induced.
  • the inducer may be added to the culture broth at one time or in multiple batches, or may be added to the culture broth by continuous feed.
  • the fed-batch substrate solution may contain an inducer and be fed.
  • the amount of the inducing substance to be added can be set according to the type of the inducing substance and the inducible promoter, and can be, for example, in the range of 0.1 to 30 ⁇ g per 1 g of the dry weight of the recombinant cell, which is preferable. Is in the range of 0.5 to 20 ⁇ g. It was
  • the time to shift from the stage of proliferating the recombinant cell to the stage of inducing the expression of the target protein is not particularly limited, and can be appropriately set according to the configuration of the culture system and the design of the production process. From the viewpoint of efficient production of the target protein, it is preferable to start the induction of the expression of the target protein when the proliferation of the recombinant cells reaches the middle to late stages of the logarithmic growth phase.
  • the time when the induction of the expression of the target protein is started for example, in the case of recombinant cells in which the value of OD600 in the stationary phase reaches about 150, the time when the value of OD600 reaches 30 to 110 is preferable. , 40 to 90 is more preferable, and 50 to 80 is more preferable. It was
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 has an amino acid sequence in which amino acid residues have been substituted, inserted or deleted for the purpose of improving productivity with respect to the amino acid sequence of fibroin derived from Nephila clavipes, and further.
  • the amino acid sequence (tag sequence and hinge sequence) shown in SEQ ID NO: 2 is added to the N-terminal. It was
  • nucleic acid encoding PRT966 was synthesized. NdeI sites were added to the nucleic acid at the 5'end, and EcoRI sites were added downstream of the stop codon. This nucleic acid was cloned into a cloning vector (pUC118). Then, the nucleic acid was cut out by restriction enzyme treatment with NdeI and EcoRI, and then recombinant into a pET-22b (+) vector to obtain a pET-22 (+) / PRT966 vector. It was
  • Recombinant cells expressing the target protein were prepared in the same manner as in (1) to (5) above, and cultured and induced to be expressed. Elastin (PRT539) was purified from the recovered cells to obtain a freeze-dried powder, and the amount of elastin produced was evaluated. Relative to the production amount of rustin calculated from the weight of the lyophilized powder when the production amount (control) when culturing in the main culture medium to which the fed-batch substrate solution without glycine was added is 100%. Calculated as a value (Fig. 2). It was

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Abstract

【課題】本発明は、工業規模で目的タンパク質を効率的に生産できる製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明の目的タンパク質の製造方法は、目的タンパク質をコードする核酸を有する大腸菌（エシェリヒア・コリ）を培養する工程と、上記目的タンパク質をコードする核酸の発現を誘導する工程とを含み、上記培養工程は、初発培地で大腸菌を培養すること、及び、培養液のＯＤ６００値が５以上に達した後に、グリシン及び／又はアラニンが添加される培地でさらに培養することを含むことを特徴とする。

Description

目的タンパク質の製造方法
本発明は、目的タンパク質の製造方法に関する。
異種タンパク質生産系として、哺乳類細胞、酵母、カビ、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌等を宿主とする組換えタンパク質の発現システムが知られており、これらは工業生産にも利用されている（例えば、非特許文献１）。なかでも、大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ、エシェリヒア・コリ）を宿主細胞とする組換えタンパク質の生産系は最も一般的に用いられている。
組換えタンパク質の工業規模での生産においては、依然として生産レベルの向上が求められている。本発明は、工業規模で組換えタンパク質を効率的に生産できる製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、組換え大腸菌の培養の特定の段階において、グリシン又はアラニンが添加される培地で培養することで目的タンパク質の生産量が向上することを見出し、本発明の完成に至った。　
本発明は、例えば、以下の各発明に関する。　
［１］　目的タンパク質をコードする核酸を有する大腸菌（エシェリヒア・コリ）を培養する工程と、　上記目的タンパク質をコードする核酸の発現を誘導する工程とを含む、目的タンパク質の製造方法であって、　上記培養工程は、初発培地で大腸菌を培養すること、及び、培養液のＯＤ６００値が５以上に達した後に、グリシン及び／又はアラニンが添加される培地でさらに培養することを含む、製造方法。［２］　上記目的タンパク質におけるアラニン残基又はグリシン残基の含有量が１２％以上である、［１］に記載の製造方法。［３］　上記目的タンパク質におけるアラニン残基及びグリシン残基の合計含有量が３０％以上である、［１］に記載の製造方法。［４］　上記培養工程において、培養液のＯＤ６００値が５以上に達した後に、グリシン及び／又はアラニンを連続的に添加することを含む、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。［５］　上記培養工程において、培養液のＯＤ６００値が５以上に達した後に、グリシン及び／又はアラニンが添加される流加培地で流加培養する、［４］に記載の製造方法。［６］　上記目的タンパク質が構造タンパク質である、［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法。［７］　上記培養工程は、培養液のＯＤ６００値が５以上に達した後に、アラニンが添加される培地で培養することを含む、［１］～［６］のいずれかに記載の製造方法。［８］　上記培地において、アラニンの濃度が１μＭ以上である、［７］に記載の製造方法。［９］　上記培養工程は、培養液のＯＤ６００値が５以上に達した後に、グリシンが添加される培地で培養することを含む、［１］～［６］のいずれかに記載の製造方法。［１０］　上記培地において、グリシンの濃度が１μＭ以上である、［９］に記載の製造方法。
本発明の方法によれば、工業規模で目的タンパク質を効率的に生産できる製造方法を提供でき、該方法によって目的タンパク質の生産量が向上する。
コントロールに対する、グリシン又はアラニンを添加した場合のコラーゲン（ＰＲＴ５３７）の生産量の相対値を示す図である。 コントロールに対する、グリシンを添加した場合のエラスチン（ＰＲＴ５３９）の生産量の相対値を示す図である。
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。　
本発明の製造方法は、目的タンパク質をコードする核酸を有する大腸菌（エシェリヒア・コリ）を培養する工程と、目的タンパク質をコードする核酸の発現を誘導する工程とを含む、目的タンパク質の製造方法であって、培養工程は、初発培地で大腸菌を培養すること、及び、培養液のＯＤ６００値が５以上に達した後に、グリシン及び／又はアラニンが添加される培地でさらに培養することを含む。　
（目的タンパク質）　本発明の製造方法における目的タンパク質は、特に制限されず、エシェリヒア・コリを宿主として発現可能なものであれば特に制限されない。ここで、目的タンパク質とは、組換え細胞を用いて生産した後に回収等して利用することを目的とするタンパク質のことを意味し、組換えタンパク質ともいう。目的タンパク質は、エシェリヒア・コリ由来のタンパク質であってもよく、異種由来のタンパク質であってもよい。異種由来のタンパク質は、例えば、微生物由来のタンパク質であってもよく、植物由来のタンパク質であってもよく、動物由来のタンパク質であってもよく、ウィルス由来のタンパク質であってもよく、さらには人工的にアミノ酸配列をデザインしたタンパク質であってもよい。目的タンパク質は、単量体タンパク質であってもよく、多量体タンパク質であってもよい。目的タンパク質は、分泌性タンパク質であってもよく、非分泌性タンパク質であってもよい。なお、「タンパク質」には、オリゴペプチドやポリペプチド等の、ペプチドと呼ばれる態様も包含される。　
本実施形態における目的タンパク質を人工タンパク質素材へ加工するため、人工的に成形する際、側鎖の小さいアミノ酸ほど水素結合しやすく、強度の高い成形体を得やすい。また、アラニン残基及びグリシン残基は、側鎖が非極性のアミノ酸であるため、ポリペプチド生成における折りたたみの過程で内側に向くように配置され、αヘリックス構造又はβシート構造を取りやすい。よって、グリシン残基、アラニン残基、セリン残基等のアミノ酸の割合が高いことが望ましい。例えば、アラニン残基の含有量が１０％以上であればよく、１２％以上であればよく、１５％以上であればよく、２０％以上であればよく、２５％以上であればよく、３０％以上であればよく、１０～４０％であればよく、１１％～４０％であればよく、１２～４０％であればよく、１５～４０％であってよく、１８～４０％であってよく、２０～４０％であってよく、２２～４０％であってよい。例えば、グリシン残基の含有量が１０％以上であればよく、１２％以上であればよく、１５％以上であればよく、２０％以上であればよく、２５％以上であればよく、３０％以上であればよく、１０～５５％であればよく、１１％～５５％であってよく、１２％～５５％であってよく、１３％～５５％であってよく、１５％～５５％であってよく、１８％～５５％であってよく、２０％～５５％であってよく、２２％～５５％であってよく、２５％～５５％であってよい。また、アラニン残基及びグリシン残基の合計含有量が、２０％以上であってよく、２４％以上であればよく、３０％以上であればよく、４０％以上であればよく、５０％以上であればよく、６０％以上であればよく、２０～８０％であればよく、２２％～８０％であればよく、２４～８０％であればよく、３０～８０％であってよく、１８～４０％であってよく、２０～４０％であってよく、２２～４０％であってよい。なお、目的タンパク質におけるアミノ酸残基の含有量とは、目的タンパク質に含まれるアミノ酸残基の総数に対する、特定のアミノ酸残基の数の割合（％）を意味する。　
一実施形態に係る目的タンパク質は、セリン残基の含有量、スレオニン残基含有量及びチロシン残基含有量の合計が、４％以上であってよく、４．５％以上であってよく、５％以上であってよく、５．５％以上であってよく、６％以上であってよく、６．５％以上であってよく、７％以上であってよい。セリン残基含有量、スレオニン残基含有量及びチロシン残基含有量の合計は、例えば、３５％以下であってよく、３３％以下であってよく、３０％以下であってよく、２５％以下であってよく、２０％以下であってよい。　
目的タンパク質としては、工業規模での製造が好ましい任意のタンパク質を挙げることができ、例えば、工業用に利用できるタンパク質、医療用に利用できるタンパク質、及び構造タンパク質等を挙げることができる。工業用又は医療用に利用できるタンパク質の具体例としては、酵素、制御タンパク質、受容体、ペプチドホルモン、サイトカイン、膜又は輸送タンパク質、予防接種に使用する抗原、ワクチン、抗原結合タンパク質、免疫刺激54か月での審査請求タンパク質、アレルゲン、及び完全長抗体又は抗体フラグメント若しくは誘導体等を挙げることができる。構造タンパク質とは、生体の構造に関わるタンパク質、若しくは生体が作り出す構造体を構成するタンパク質、又はそれらに由来するタンパク質を意味する。構造タンパク質は、また、一定の条件下において自己凝集し繊維やフィルム、樹脂、ゲル、ミセル、ナノパーティクル等の構造体を形成するタンパク質のことを言い、天然においては例えば、フィブロイン、ケラチン、コラ－ゲン、エラスチン及びレシリンが挙げられる。　
構造タンパク質は、人工構造タンパク質であってもよい。本明細書において「人工構造タンパク質」とは、人為的に製造された構造タンパク質を意味する。人工構造タンパク質は、遺伝子組換えにより微生物生産した構造タンパク質であってよく、成形性や生産性の観点からアミノ酸の配列を改良したものも含み、天然由来構造タンパク質の配列に限定されない。　
一実施形態に係る人工構造タンパク質は、反復配列を有するものであってよい。すなわち、本実施形態に係るポリペプチドは、ポリペプチド内に配列同一性が高いアミノ酸配列（反復配列単位）が複数存在するものであってよい。反復配列単位のアミノ酸残基数は６～２００であることが好ましい。また、反復配列単位間の配列同一性は、例えば、８５％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよく、９６％以上であってよく、９７％以上であってよく、９８％以上であってよく、９９％以上であってよい。一実施形態に係る人工構造タンパク質は、（Ａ）ｎモチーフを含むものであってよい。本明細書において、（Ａ）ｎモチーフとは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を意味する。（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は２～２７であってよく、２～２０、２～１６、又は２～１２の整数であってよい。また、（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。　
人工構造タンパク質としては、改変フィブロインが好ましい。フィブロインとしては、例えば、天然由来のフィブロインが挙げられる。天然由来のフィブロインとしては、例えば、昆虫又はクモ類が産生するフィブロインが挙げられる。　
昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ　ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ　ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ　Ｃｙｎｔｈｉａ　ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ　ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、オオミノガ（Ｅｕｍｅｔａ　ｖａｒｉｅｇａｔａ）が産生する絹タンパク質、及びスズメバチ（Ｖｅｓｐａ　ｓｉｍｉｌｌｉｍａ　ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。　
昆虫が産
生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、及びＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。　
クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。　
クモ類が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ－３（ａｄｆ－３）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ－４（ａｄｆ－４）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｎｇｕ１１ａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ　ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｎｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ　ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）等が挙げられる。　
天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ　ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。　
本明細書において「改変フィブロイン」とは、人為的に製造されたフィブロイン（人造フィブロイン）を意味する。改変フィブロインは、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるフィブロインであってもよく、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列と同一であるフィブロインであってもよい。　
改変フィブロインは、天然由来フィブロインに準ずる構造を有する繊維状タンパク質であってよく、天然由来フィブロインが有する反復配列と同様の配列を有するフィブロインであってもよい。「フィブロインが有する反復配列と同様の配列」とは、実際に天然由来フィブロインが有する配列であってもよく、それと類似する配列であってもよい。　
「改変フィブロイン」は、本開示で特定されるアミノ酸配列を有するものであれば、天然由来のフィブロインに依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの（例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、また天然由来のフィブロインに依らず人工的にアミノ酸配列を設計したもの（例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの）であってもよい。なお、改変フィブロインのアミノ酸配列を改変したものも、そのアミノ酸配列が天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるものであれば、改変フィブロインに含まれる。改変フィブロインとしては、例えば、人工絹（シルク）フィブロイン（カイコが産生する絹タンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）、及び人工クモ糸フィブロイン（クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）などが挙げられる。改変フィブロインは、比較的にフィブリル化が容易で繊維形成能が高いことから、成形材料として好ましくは人工クモ糸フィブロインを含み、より好ましくは人工クモ糸フィブロインからなる。本実施形態に係る改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質であってよい。改変フィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。人工構造タンパク質としては、コラ－ゲン、エラスチン及びレシリンも挙げられる。　
ケラチン由来のタンパク質として、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ　ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等を挙げることができる。　
コラーゲン由来のタンパク質としては、例えば、式３：［ＲＥＰ２］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式３中、ｐは５～３００の整数を示す。ＲＥＰ２は、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ２は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。　
エラスチン由来のタンパク質としては、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。　
レシリン由来のタンパク質としては、例えば、式４：［ＲＥＰ３］ｑで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式４中、ｑは４～３００の整数を示す。ＲＥＰ３はＳｅｒ－Ｊ－Ｊ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｕ－Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意アミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するＲＥＰ４は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。　
目的タンパク質は、親水性タンパク質であってもよく、疎水性タンパク質であってもよい。目的タンパク質としては、目的タンパク質を構成する全てのアミノ酸残基の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、ＨＩ）の総和を求め、次にその総和を全アミノ酸残基数で除した値（平均ＨＩ、以下「疎水度」とも表す。）が－１．０以上であるものが好ましい。アミノ酸残基の疎水性指標については、公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ　Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ　Ｒ（１９８２）“Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ　ｏｆ　ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５－１３２）を使用する。具体的には、各アミノ酸の疎水性指標は、下記表１に示すとおりである。　　
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  　本発明の一実施形態において、目的タンパク質の疎水度は、－０．９以上、－０．８以上、－０．７以上、－０．６以上、－０．５以上、－０．４以上、－０．３以上、－０．２以上、－０．１以上、０以上、０．１以上、０．２以上、０．３以上、又は０．４以上であってよく、また、目的タンパク質の疎水度は、１．０以下、０．９以下、０．８以下、０．７以下、０．６以下、又は０．５以下であってよい。　
目的タンパク質の分子量は、特に限定されないが、例えば、１０ｋＤａ以上７００ｋＤａ以下であってよい。目的タンパク質の分子量は、例えば、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、又は１００ｋＤａ以上であってよく、例えば、６００ｋＤａ以下、５００ｋＤａ以下、４００ｋＤａ以下、３００ｋＤａ以下、又は２００ｋＤａ以下であってよい。一般にタンパク質の分
子量が大きくなる程凝集しやすくなる傾向にある。　
（宿主細胞）　本明細書において、目的タンパク質をコードする核酸を有する大腸菌（エシェリヒア・コリ）を宿主細胞又は組換え細胞という場合がある。なお、本明細書において、宿主細胞は目的タンパク質をコードする核酸によって組み換えられた組換え細胞を指すが、明らかに混同しない場合に限って、目的タンパク質遺伝子によって組み換えられる前の細胞も宿主細胞という場合がある。　
大腸菌（エシェリヒア・コリ）としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエシェリヒア・コリに分類されている細菌が挙げられる。エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ　ＢＬ２１（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ　ＢＬ２１（ＤＥ３）（ライフテクノロジーズ社）、エシェリヒア・コリ　ＢＬＲ（ＤＥ３）（メルクミリポア社）、エシェリヒア・コリ　ＤＨ１、エシェリヒア・コリ　ＧＩ６９８、エシェリヒア・コリ　ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリ　ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ　Ｋ５（ＡＴＣＣ　２３５０６）、エシェリヒア・コリ　ＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリ　ＭＣ１０００、エシェリヒア・コリ　ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ　４７０７６）、エシェリヒア・コリ　Ｎｏ．４９、エシェリヒア・コリ　Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ　ＴＢ１、エシェリヒア・コリ　Ｔｕｎｅｒ（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ　Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ　Ｗ１４８５、エシェリヒア・コリ　Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ　２７３２５）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ等を挙げることができる。それらの派生株も挙げられる。　
宿主細胞は、目的タンパク質の発現機構を備えていればよい。目的タンパク質の発現機構とは、目的タンパク質を選択的に発現させるための機構で、周知の組換えタンパク質発現機構を用いることができる。目的タンパク質発現機構を備えることで、目的タンパク質を大量に発現させることができる。目的タンパク質発現機構を備えるエシェリヒア・コリは、目的タンパク質をコードする核酸を有しており、例えば、目的タンパク質をコードする核酸を有する発現ベクターをエシェリヒア・コリに導入することにより得ることができる。　
目的タンパク質をコードする核酸の製造方法は、特に制限されない。例えば、改変フィブロインをコードする核酸の場合、天然のフィブロインをコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングし、遺伝子工学的手法により改変する方法、又は、化学的に合成する方法によって、所望の核酸を製造することができる。核酸の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手したタンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ　１０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製及び／又は確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸を合成してもよい。　
調節配列は、宿主細胞における目的タンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモータ、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。プロモータとして、宿主細胞中で機能し、目的タンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモータを用いてもよい。誘導性プロモータは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモータである。　
発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主細胞の染色体中への組込みが可能で、目的タンパク質をコードする核酸を転写できる位置にプロモータを含有しているものが好適に用いられる。　
大腸菌（エシェリヒア・コリ）等の原核生物を宿主細胞とする場合、タンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２－２３８５６９号公報）等を挙げることができる。　
本発明の一実施形態において、目的タンパク質の発現は誘導性であってよい。例えば、宿主細胞中で機能し、目的タンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモータを、目的タンパク質の発現を制御するプロモータとして用いることで、目的タンパク質の発現を誘導性にすることができる。誘導性プロモータは、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等の誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモータである。　
＜培養工程＞　培養工程は、目的タンパク質をコードする核酸を有する大腸菌（エシェリヒア・コリ）を培養する工程であり、培養工程は、初発培地で大腸菌を培養すること、及び、培養液のＯＤ６００値が５以上に達した後に、グリシン及び／又はアラニンが添加される培地でさらに培養することを含んでよい。本明細書において、「目的タンパク質をコードする核酸を有する大腸菌（エシェリヒア・コリ）」を組換え細胞という場合がある。　
（培地）　組換え細胞を培養するためのタンパク質生産培地は特に限定されず、組換え細胞の種類に応じて、公知の天然培地又は合成培地から選択することができる。タンパク質生産培地としては、例えば、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、ビタミン類、ミネラル、栄養要求性により要求される栄養素、及びその他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有する液体培地を用いることができる。培地成分の種類や濃度は、当業者が適宜設定してよい。　
タンパク質生産培地は、天然由来成分を含むことが好ましい。天然由来成分は、天然物（例えば、酵母）そのもの、天然物からの抽出物（例えば、Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ）等の成分を意味する。天然由来成分は、通常、含まれる成分の種類及びそれぞれの含有量は完全に特定されていないものである。天然由来成分は、例えば、ビタミン類、低分子のペプチド（例えば、アミノ酸残基数２～２０のペプチド）及びアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１種を含む。　
炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物等の糖類、グリセロール、ソルビトール等のアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類が挙げられる。　
炭素源としては、１種類であってもよく、２種類以上の炭素源を任意の比率で混合してもよい。タンパク質生産培地における炭素源の濃度は、０．１ｗ/ｖ％～５０ｗ/ｖ％程度、好ましくは０．５ｗ/ｖ％～４０ｗ/ｖ％程度、より好ましくは１ｗ/ｖ％～３０ｗ/ｖ％程度、特に好ましくは５ｗ/ｖ％～２０ｗ/ｖ％程度であってよい。本実施形態において、炭素源としてグルコース又はスクロースを用いることが好ましく、グルコース又はスクロースと他の炭素源とを任意の比率で混合してもよい。炭素源中のグルコース又はスクロースの比率は、好ましくは１０重量％以上、より好ましくは５０重量％以上、特に好ましくは７０重量％以上であることが望ましい。培養開始時の炭素源の好ましい初発濃度は上記のとおりであるが、培養中の炭素源の消費に応じて、炭素源を適宜に添加してもよい。　
窒素源としては、硝酸塩、アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水等の無機窒素塩、アミノ酸、ペプトン、エキス類、コーンスターチ製造工業における副産物であるコーンスティープリカー（ＣＳＬ）等の有機窒素源が挙げられる。ペプトン類としては、カゼインペプトン、獣肉ペプトン、心筋ペプトン、ゼラチンペプトン、又は大豆ペプトン等が挙げられる。エキス類としては、肉エキス、酵母エキス、心臓浸出液（ハートインフュージョン）等が挙げられる。アミノ酸又はペプチドを含む窒素源としては、より低分子のペプチド及びアミノ酸の含有量が高いほうが好ましい。　
リン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。　
硫黄源としては、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。　
ビタミン類としては、ビオチン、塩化コリン、シアノコバラミン、葉酸、イノシトール、ニコチン酸、４－アミノ安息香酸、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアンミン、チムジン等が挙げられる。ビタミン類の源としては、麦芽エキス、ポテトエキス、トマトジュース等の各種エキスが挙げられる。　
ミネラルとしては、リン（Ｐ）の他に、イオウ（Ｓ）、カリウム（Ｋ）、カルシウム（Ｃａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、鉄（Ｆｅ）、ナトリウム（Ｎａ）等が挙げられる。　
生産工程における培養は、例えば、通気培養又は振盪培養により、好気的に行うことができる。酸素濃度は、例えば、飽和溶存酸素濃度の５～５０％、好ましくは飽和溶存酸素濃度の２０～４０％となるように制御されてよい。培養は、回分培養（ｂａｔｃｈ　ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ　ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｃｕｌｔｕｒｅ）、又はそれらの組み合わせにより実施することができる。タンパク質生産培地のｐＨは、例えば、３．０～９．０であってよい。尚、pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、例えば、炭酸カルシウム、アンモニアガス、アンモニア水等、を使用することができる。培養温度は、例えば、１５～４０℃であってよい。培養時間は、例えば、１～６０時間であってよい。　
培養条件は、上記組換え細胞が増殖でき、かつ目的タンパク質を発現している組換え細胞において目的タンパク質を蓄積させることができる限り、特に制限されない。なお、目的タンパク質が発現している期間においては、組換え細胞は増殖してもよく、しなくてもよい。培養条件は、目的タンパク質が発現する前の期間と発現を開始した後の期間において同一であってもよく、同一でなくてもよい。　
培養温度は、通常、細胞の増殖に対して大きな影響を与える。一般的にいえば、増殖の下限の温度は細胞中の水分の凍結温度である０℃又はそれよりやや低い温度であり、上限の温度はタンパク質、核酸などの高分子化合物の変性温度で定まる。ある菌株について増殖可能な温度範囲は比較的せまく、例えば、大腸菌では増殖の下限温度は０～１５℃、上限は４６℃、増殖至適温度は３６～４２℃付近にある。ここで増殖至適温度とは、培養する微生物が最大の比増殖速度を得られる温度をいい、また、比増殖速度とは、単位微生物量あたりの増殖速度をいい、微生物に固有の値で、培養条件により変化する。　
本発明の一実施形態において、「増殖至適温度」とは、ｐＨ、溶存酸素濃度などの培養温度以外の条件が、培養開始時に一定の場合に、微生物が最大の比増殖速度を得ることができる温度をいう。本発明の一実施形態において、組換え細胞が目的タンパク質を発現している際（目的タンパク質の発現が誘導性の場合には発現誘導後）に、培養温度の調整等により、
組換え細胞の増殖至適温度よりも低い温度に上記組換え細胞を冷却又は維持することで、組換え細胞において目的タンパク質の発現量を増加させることができる。組換え細胞の増殖至適温度よりも低い温度とは、例えば、組換え細胞の増殖至適温度の下限値よりも３～２５℃低い温度であってよく、８～２０℃低い温度であってよく、１０～１８℃低い温度であってよく、１２℃～１８℃低い温度であってよく、１４℃～１７℃低い温度であってよく、３～１０℃低い温度であってよく、５～８℃低い温度であってよい。　
培養開始時の培地を、「初発培地」ともいう。また、流加培養又は連続培養において培養系（発酵槽）に供給する培地を、「流加培地」ともいう。また、流加培養又は連続培養において培養系に流加培地を供給することを、「流加」ともいう。また、培養は、前培養と本培養とに分けて行われてもよい。前培養は、例えば、平板培地や液体培地を用いて行ってよい。　
本発明において、各培地成分は、初発培地、流加培地、又はその両方に含有されていてよい。初発培地に含有される成分の種類は、流加培地に含有される成分の種類と、同一であってもよく、異なっていてもよい。また、初発培地に含有される各成分の濃度は、流加培地に含有される各成分の濃度と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、含有する成分の種類及び／又は濃度の異なる２種又はそれ以上の流加培地を用いてもよい。例えば、複数回の流加が間欠的に行われる場合、各流加培地に含有される成分の種類及び／又は濃度は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。　
流加培地中の炭素源濃度や流加培地の流加速度は、培養条件等の諸条件に応じて適宜設定できる。流加培地中の炭素源濃度や流加培地の流加速度は、例えば、炭素源の流加速度（流加培地中の炭素源濃度と流加培地の流加速度から決定される）が、培養開始時の培養液１Ｌに対し、１ｇ／ｈｒ～１００ｇ／ｈｒ、１ｇ／ｈｒ～７０ｇ／ｈｒ、１ｇ／ｈｒ～４０ｇ／ｈｒ、１ｇ／ｈｒ～３０ｇ／ｈｒ、又は１ｇ／ｈｒ～２０ｇ／ｈｒとなるように設定されてよい。流加培地中の炭素源濃度や流加培地の流加速度は、いずれも、発現誘導前の期間を通じて一定であってもよく、一定でなくてもよい。　
（グリシン及び／又はアラニンの添加）　組換え細胞は、まず初発培地で大腸菌を培養し、培養液のＯＤ６００値が５以上に達した後に、グリシン及び／又はアラニンが添加される培地でさらに培養する。初発培地としては、特に限定されず、例えば上記の各培地成分を含み、大腸菌の培養に適したものであればよい。初発培地は、意図的にグリシン及びアラニン、例えば、精製したグリシン及びアラニンが添加されていないものである。初発培地は、グリシン及びアラニンを含まないものであってよく、酵母エキスなどの窒素源にグリシン又は／及びアラニンが含まれる場合、窒素源としての含有量に限ってグリシン又は／及びアラニンが含まれていてもよい。グリシン又は／及びアラニンを添加する時期としては、目的タンパク質の生産を効率よく行う観点から、組換え細胞の増殖が対数増殖期の時点で、グリシン又は／及びアラニンを添加するのが好ましい。　
組換え細胞の増殖は、遅延期又は誘導期（培養初期の細胞数の増加が遅い時期）から始まり、対数増殖期（単位時間ごとに細胞数が２倍と対数的に増加する時期）を経て、定常期（細胞の正味の数に変動の見られない時期）に至る。対数増殖期の中期とは、遅延期における細胞数と定常期における細胞数の中間程度の細胞数になる時期をいい、対数増殖期の後期とは、中期から定常期までの時期をいう。グリシン又は／及びアラニンを添加する時期の具体例として、例えば、定常期におけるＯＤ６００の値が約１５０になる組換え細胞の場合、ＯＤ６００の値が５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上に達した時期であるのが好ましく、１５～１２０に達した時期であるのが好ましく、１５～１００に達した時期であるのがより好ましく、１５～８０に達した時期であるのが更に好ましく、１５～６０に達した時期であるのが更に好ましく、２０～６０に達した時期であるのが更に好ましく、２０～４０に達した時期であるのが更に好ましい。上記組換え細胞を培養し、対数増殖期に、グリシン又は／及びアラニンを添加することにより、組換え細胞において目的タンパク質の発現量を増大させることができる。　
グリシン又は／及びアラニンの添加はワンショット若しくはドロップインすることができる。又は、シャワー状噴射方式で添加してもよい。グリシン又は／及びアラニンを連続的に添加することが好ましい。　
本発明の一実施形態に係る目的タンパク質の製造方法は、目的タンパク質を発現している状態の組換え細胞をグリシン又は／及びアラニン存在下で培養してもよい。例えば、目的タンパク質を未だ発現していない状態の組換え細胞からグリシン又は／及びアラニン存在下で培養し続け、その後目的タンパク質が発現してもよく、組換え細胞が目的タンパク質を発現してからグリシン又は／及びアラニン下で培養してもよく、組換え細胞が目的タンパク質を発現すると同時にグリシン又は／及びアラニン下で培養してもよい。グリシン又は／及びアラニン存在下で組換え細胞を培養する前に、グリシン又は／及びアラニンの非存在下で組換え細胞を培養してもよい。発現誘導等により目的タンパク質を発現させる前に組換え細胞を所定の量まで増殖させておくことで、目的タンパク質をより効率的に生産することができる。また、グリシン又は／及びアラニン存在下で培養してもよいため、例えば、組換え細胞の培養のための流加培地にあらかじめグリシン又は／及びアラニンを含めていてもよく、培養時に培地にグリシン又は／及びアラニンを添加してもよい。　
また、目的タンパク質の発現が誘導性である場合には、例えば、目的タンパク質の発現誘導の前にグリシン又は／及びアラニンを培地に添加してもよく、発現誘導と同時にグリシン又は／及びアラニンを培地に添加してもよく、発現誘導とおよそ同時にグリシン又は／及びアラニンを培地に添加してもよく、発現誘導後にグリシン又は／及びアラニンを培地に添加してもよく、発現誘導の直前若しくは直後にグリシン又は／及びアラニンを培地に添加してもよい。なお、目的タンパク質の発現誘導と同時及び直前若しくは直後をまとめて「発現誘導時」と表すこともでき、培養開始から発現誘導までの期間を「発現誘導前の期間」、発現誘導から培養終了までの期間を「発現誘導後の期間」と表すこともできる。発現誘導の直前は、例えば、発現誘導の開始を基準として、例えば、６０分前、３０分前、又は１５分前であってもよい。発現誘導の直後とは、例えば、発現誘導の開始を基準として、例えば、１５分後、３０分後、又は６０分後であってもよい。発現誘導と同時又は直前若しくは直後とは、例えば、発現誘導の開始を基準として、６０分前～６０分後、３０分前～３０分後、１５分前～１５分後、１０分前～１０分後、又は５分前～５分後であってもよい。　
精製されたグリシン又は／及びアラニン、グリシン又は／及びアラニンを含有する酵母抽出物、又はトリプトンの形態で提供できる。精製されたグリシン又は／及びアラニンを添加することが好ましい。　
細胞培養培地中のグリシンの濃度は、１μＭ以上であってよく、例えば、１μＭ～１００ｍＭであってよい。例えば、１μＭ～１０μＭ、１μＭ～５０μＭ、１μＭ～２５０μＭ、１μＭ～５００μＭ、１μＭ～１ｍＭ、又は１μＭ～１０ｍＭであってもよい。また、１×１０－６～１×１０－２ｗ／ｖ％、１×１０－６～１×１０－３ｗ／ｖ％、１×１０－５～１×１０－３ｗ／ｖ％、又は１×１０－５～１×１０－４ｗ／ｖ％であってよい。　
細胞培養培地中のアラニンの濃度は、１μＭ以上であってよく、例えば、１μＭ～１００ｍＭであってよい。例えば、１μＭ～１０μＭ、１μＭ～５０μＭ、１μＭ～２５０μＭ、１μＭ～５００μＭ、１μＭ～１ｍＭ、又は１μＭ～１０ｍＭであってもよい。また、１×１０－６～１×１０－２ｗ／ｖ％、１×１０－６～１×１０－３ｗ／ｖ％、１×１０－５～１×１０－３ｗ／ｖ％、又は１×１０－５～１×１０－４ｗ／ｖ％であってよい。　
細胞培養培地中のグリシン及びアラニンの合計濃度は、１μＭ以上であってよく、例えば、１μＭ～１００ｍＭであってよい。例えば、１μＭ～１０μＭ、１μＭ～５０μＭ、１μＭ～２５０μＭ、１μＭ～５００μＭ、１μＭ～１ｍＭ、又は１μＭ～１０ｍＭであってもよい。また、１×１０－６～１×１０－２ｗ／ｖ％、１×１０－６～１×１０－３ｗ／ｖ％、１×１０－５～１×１０－３ｗ／ｖ％、又は１×１０－５～１×１０－４ｗ／ｖ％であってよい。　
本発明の一実施形態に係る目的タンパク質の製造方法は、グリシン又は／及びアラニンは連続的培養液に添加されて培養してもよい。グリシン又は／及びアラニンの添加速度は、培養条件等の諸条件に応じて適宜設定できる。例えば、グリシン又は／及びアラニンの供給速度（添加物中のグリシン又は／及びアラニン濃度と添加速度から決められる）が、培養開始時の培養液１Ｌに対し、５ｍｇ／ｈｒ～３００ｍｇ／ｈｒ、５ｍｇ／ｈｒ～２５０ｍｇ／ｈｒ、５ｍｇ／ｈｒ～２００ｍｇ／ｈｒ、７ｍｇ／ｈｒ～２５０ｍｇ／ｈｒ、７ｍｇ／ｈｒ～２００ｍｇ／ｈｒ、７ｍｇ／ｈｒ～１５０ｍｇ／ｈｒ、７ｍｇ／ｈｒ～１２０ｍｇ／ｈｒ、１０ｍｇ／ｈｒ～１２０ｍｇ／ｈｒ、又は１０ｍｇ／ｈｒ～１００ｍｇ／ｈｒとなるように設定されてよい。添加物中のグリシン又は／及びアラニン濃度と添加速度は、いずれも、発現誘導前の期間を通じて一定であってもよく、一定でなくてもよい。　
本発明の一実施形態に係る目的タンパク質の製造方法は、組換え細胞の培養のための流加培地にグリシン又は／及びアラニンを含めていてもよい。グリシン又は／及びアラニンの添加速度は、流加培地中の炭素源濃度や流加培地の流加速度から決められる。　
本発明の培養培地はグリシン又は／及びアラニンに加えて種々のアミノ酸を添加してもよい。例えば、培養培地は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンを含む他のアミノ酸を添加してもよい。　
＜誘導工程＞　誘導工程は、目的タンパク質をコードする核酸の発現を誘導する工程である目的タンパク質の発現の誘導は、誘導性プロモータによる転写（目的とするタンパク質をコードする核酸の転写）を活性化することにより行われる。誘導性プロモータの活性化は、誘導性プロモータの種類に応じて、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。　
例えば、イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等の誘導物質（発現誘導剤）の存在により活性化される誘導性プロモータを使用した場合、当該誘導物質を培養液に添加することにより、目的タンパク質の発現を誘導することができる。誘導物質は、１度に、又は複数回に分けて培養液に添加してもよく、また、連続フィードにより培養液に添加してもよい。流加基質溶液に誘導物質を含有させてフィードしてもよい。添加する誘導物質の量は、誘導物質及び誘導性プロモータの種類に応じて設定することができるが、例えば、組換え細胞の乾燥重量１ｇ当たり０．１～３０μｇの範囲とすることができ、好ましくは、０．５～２０μｇの範囲である。　
また例えば、温度の上昇又は低下により活性化される誘導性プロモータを使用した場合、培養液の温度を上昇又は低下させることにより、目的タ
ンパク質の発現を誘導することができる。例えば、温度上昇により活性化されるλファージのＰＲプロモータ又はＰＬプロモータを使用した場合、増殖時の培養液の温度を２０～３７℃の範囲とすることで増殖時の目的タンパク質の発現は抑えられ、次いで培養液の温度を３８～４４℃に上昇させることにより、目的タンパク質の発現を誘導させることができる。このときに熱ショックタンパク質による影響を緩和させるために、特開平６－２９２５６３号公報に記載のように増殖時の培養液のｐＨを６．５～７．５とし、目的タンパク質の発現誘導を開始する時点で培養液のｐＨを４．５～６．５と変動させることにより、より安定した発現誘導を行うことができる。　
組換え細胞の増殖を行う段階から、目的タンパク質の発現を誘導する段階へ移行する時期には、特に制限はなく、培養システムの構成、生産プロセスの設計に応じて適宜設定することができる。目的タンパク質の生産を効率よく行う観点からは、組換え細胞の増殖が対数増殖期の中期～後期に達した時に、目的タンパク質の発現の誘導を開始するのが好ましい。目的タンパク質の発現の誘導を開始する時期の具体例として、例えば、定常期におけるＯＤ６００の値が約１５０になる組換え細胞の場合、ＯＤ６００の値が３０～１１０に達した時期であるのが好ましく、４０～９０に達した時期であるのがより好ましく、５０～８０に達した時期であるのが更に好ましい。　
＜分離及び精製工程＞　本発明の製造方法の一実施形態は、さらに目的タンパク質の分離及び精製する工程をさらに含んでもよい。目的タンパク質の発現誘導を行った培養液について、下記目的タンパク質の分離及び精製に使用してもよい。　
目的タンパク質の分離及び精製は、通常用いられている方法で行うことができる。例えば、目的タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主（組換え細胞）を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により組換え細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、目的タンパク質の精製標品を得ることができる。　
また、目的タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主（組換え細胞）を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として目的タンパク質の不溶体を回収する。回収した目的タンパク質の不溶体はタンパク質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法により目的タンパク質の精製標品を得ることができる。　
目的タンパク質が細胞外に分泌された場合には、培養上清から目的タンパク質を回収することができる。すなわち、培養液を遠心分離等の手法により処理することにより、培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、目的タンパク質の精製標品を得ることができる。
以下、実施例等に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。〔フィブロインの製造方法〕（１）組換え細（フィブロインを発現する大腸菌株）の作製（目的タンパク質）　ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（以下、「ＰＲＴ９６６」ともいう。）を設計した。配列番号１で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラビペス由来のフィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列を有し、さらにＮ末端に配列番号２で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されている。　
次に、ＰＲＴ９６６をコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト、終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。この核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）ベクターに組み換えて、ｐＥＴ－２２（＋）／ＰＲＴ９６６ベクターを得た。　
上記ｐＥＴ－２２（＋）／ＰＲＴ９６６ベクターでエシェリヒア・コリＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換することにより、目的タンパク質である改変フィブロインＰＲＴ９６６を発現する大腸菌株を得ることができる。（２）シード培養　上記で作製した目的タンパク質発現株を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。その後、得られた培養液を１００ｍＬのシード培養用培地（表２）にＯＤ６００が０．００５となるように添加し、培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  （３）本培養用培地の調製　培養槽に１５００ｍＬの本培養用培地（表３）を加え、オートクレーブ（ＴＯＭＹ　ＬＳＸ－５００）で１２１℃、２０分間滅菌処理した。３７℃まで冷却後、２８～３０％アンモニア水（関東化学、０１２６６－８８）を用いてｐＨを６．１～６．３に調整した。　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  （４）流加基質溶液の調製　流加ポットに所定量の流加基質溶液（表４）を加え、オートクレーブ（ＴＯＭＹ　ＬＳＸ－５００）で１２１℃、２０分間滅菌処理し、２ｇ／Ｌグリシン（実施例１）又は４ｇ／Ｌアラニン（実施例２）をさらに加えした。　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  （５）培養及び発現誘導　（３）で調製した本培養用培地（初発培地量１．５Ｌ）を培養槽に張り込み、（２）で得られたシード培養液をＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液の温度を３７℃に保ち、３０％アンモニア水及び４Ｍリン酸溶液（和光純薬工業）を用いてｐＨを６．１～６．３で一定に制御して本培養した。また培養液中の溶存酸素濃度が、溶存酸素飽和濃度の３０～４０％に維持されるように、通気攪拌した。生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に（この際、ＯＤ６００値は約３０だった）、（４）で調製した流加基質溶液を１８ｇ／Ｌ／時間の定速でフィードした。　
培養液のＯＤ６００が約６０となるまで流加培養を継続した後、培養槽にＩＰＴＧ（発現誘導剤）を０．１ｍＭとなるように添加し、フィブロイン（ＰＲＴ９６６）の発現誘導を開始した。ＩＰＴＧ添加後２８時間経過するまで培養を行った。　
ＩＰＴＧ添加後２８時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。回収した菌体からフィブロイン（ＰＲＴ９６６）を精製し、凍結乾燥粉末を得て、フィブロインの生産量を評価した。凍結乾燥粉末の重量から計算したフィブロインの生産量を、グリシン又はアラニンを添加していない流加基質溶液を流加した本培養用培地で培養したときの生産量（比較例１）を１００％としたときの相対値として、算出した。（６）結果　結果を表５に示す。　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  　表５に示すとおり、グリシン又はアラニンを添加することによって、グリシン又はアラニンを添加しない場合（コントロール）と比べて、最終的なフィブロインの生産量が増加した（実施例１及び２，ＩＰＴＧ添加後２８時間の時点）。〔コラーゲン及びエラスチンの製造方法〕（目的タンパク質であるコラーゲン）　ヒト４型コラーゲンのパーシャル配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ５６３３５．１）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する改変コラーゲン（以下、「ＰＲＴ５３７」ともいう。）を設計した。配列番号３で示されるアミノ酸配列は、ヒト４型コラーゲンのパーシャル配列由来のアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列を有し、さらにＮ末端に配列番号２で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されている。　
（目的タンパク質であるエラスチン）　ヒトエラスチンのパーシャル配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＣ９８３９５．１）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する改変エラスチン（以下、「ＰＲＴ５３９」ともいう。）を設計した。配列番号４で示されるアミノ酸配列は、ヒトエラスチンのパーシャル配列由来のアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列を有し、さらにＮ末端に配列番号２で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されている。　
表６は、各目的タンパク質における各アミノ酸残基の含有量（総アミノ酸残基の数に対する各アミノ酸残基の数の割合（％））を示す。　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  　上記（１）～（５）と同様に目的タンパク質を発現する大腸菌株を作製し、培養及び発現誘導を行った。回収した菌体からコラーゲン（ＰＲＴ５３７）を精製し、凍結乾燥粉末を得て、コラーゲンの生産量を評価した。凍結乾燥粉末の重量から計算したコラーゲンの生産量を、グリシン又はアラニンを添加していない流加基質溶液を流加した本培養用培地で培養したときの生産量（コントロール）を１００％としたときの相対値として、算出した（図１）。　
図１に示すとおり、グリシン又はアラニンを添加することによって、グリシン又はアラニンを添加しない場合（コントロール）と比べて、最終的なコラーゲンの生産量が増加した。　
上記（１）～（５）と同様に目的タンパク質を発現する組換え細胞を作製し、培養及び発現誘導を行った。回収した菌体からエラスチン（ＰＲＴ５３９）を精製し、凍結乾燥粉末を得て、エラスチンの生産量を評価した。凍結乾燥粉末の重量から計算したラスチンの生産量を、グリシンを添加していない流加基質溶液を流加した本培養用培地で培養したときの生産量（コントロール）を１００％としたときの相対値として、算出した（図２）。　
図２に示すとおり、グリシンを添加することによって、グリシンを添加しない場合（コントロール）と比べて、最終的なエラスチンの生産量が増加した。

Claims (10)

  1. 目的タンパク質をコードする核酸を有する大腸菌（エシェリヒア・コリ）を培養する工程と、　前記目的タンパク質をコードする核酸の発現を誘導する工程とを含む、目的タンパク質の製造方法であって、　前記培養工程は、初発培地で大腸菌を培養すること、及び、培養液のＯＤ６００値が５以上に達した後に、グリシン及び／又はアラニンが添加される培地でさらに培養することを含む、製造方法。
  2. 前記目的タンパク質におけるアラニン残基又はグリシン残基の含有量が１２％以上である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 前記目的タンパク質におけるアラニン残基及びグリシン残基の合計含有量が３０％以上である、請求項１に記載の製造方法。
  4. 前記培養工程において、培養液のＯ
    Ｄ６００値が５以上に達した後に、グリシン及び／又はアラニンを連続的に添加することを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
  5. 前記培養工程において、培養液のＯＤ６００値が５以上に達した後に、グリシン及び／又はアラニンが添加される流加培地で流加培養する、請求項４に記載の製造方法。
  6. 前記目的タンパク質が構造タンパク質である、請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. 前記培養工程は、培養液のＯＤ６００値が５以上に達した後に、アラニンが添加される培地で培養することを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の製造方法。
  8. 前記培地において、アラニンの濃度が１μＭ以上である、請求項７に記載の製造方法。
  9. 前記培養工程は、培養液のＯＤ６００値が５以上に達した後に、グリシンが添加される培地で培養することを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の製造方法。
  10. 前記培地において、グリシンの濃度が１μＭ以上である、請求項９に記載の製造方法。
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