JP2010527239A - 組換えタンパク質を工業規模で製造する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)細菌発現宿主細胞の集団を培養し、
b)目的タンパク質を採取し、
c)それを分離及び精製する
工程を含む、目的組換えタンパク質を工業規模で製造する方法であって、
工程a)において、培養はフィード培地の添加を用いる方式で行われ、前記方式は流加培養方式、半連続方式または連続方式から選択され、かつ、前記発現宿主細胞は、前記タンパク質の発現を可能にするプロモーターの制御下にある、目的タンパク質をコードするDNA配列を有するDNA構築物を、ゲノム中に組み込まれて含む前記方法に関する。
目的タンパク質
目的タンパク質に関しては、制限はない。原則として、工業規模で製造される任意のタンパク質、例えば工業用タンパク質または治療用タンパク質であることができる。本発明の方法により製造できるタンパク質の例は、限定するものではないが、酵素、制御タンパク質、受容体、ペプチド、例えばペプチドホルモン、サイトカイン、膜または輸送タンパク質である。目的タンパク質はまた、予防接種に使用する抗原、ワクチン、抗原結合タンパク質、免疫刺激タンパク質、アレルゲン、完全長抗体または抗体フラグメントもしくは誘導体であることもできる。抗体誘導体は、一本鎖抗体、(scFV)、Fabフラグメント、FVフラグメント、単一ドメイン抗体(VHまたはVLフラグメント)、ドメイン抗体、例えばラクダ科動物単一ドメイン抗体(VHH、ナノボディ)または他の抗体フォーマット、例えばAndersenおよびReilly(2004年)またはHolligerおよびHudson(2005年)に記載されているものの群から選択することができる。目的タンパク質をコードするDNA分子を“目的遺伝子”とも呼ぶ。
本発明の意味において、“プロモーター”は、RNAポリメラーゼの結合および転写開始を可能にする発現調節因子である。本発明の一実施形態において、目的遺伝子は“強力な”プロモーターの制御下に有る。強力なプロモーターは、一方ではRNAポリメラーゼ、通例天然に存在する対応するRNAポリメラーゼに対するプロモーター配列の高い結合親和性を特徴とし、他方ではそのRNAポリメラーゼによるmRNAの高い産生速度を特徴とする。
次に、細菌ゲノムに組み込まれる直線状または環状DNA構築物は、“発現カートリッジ”または“カートリッジ”とも呼ばれる。組み込みの結果として、発現宿主細胞は組み込み“発現カセット”を有する。好ましくは、カートリッジは、本質的に、プロモーター、目的遺伝子、リボソーム結合部位およびゲノム領域に相同性を示し、相同組換えを可能にする、末端で隣接する2つの領域(図10に示す挿入カートリッジ参照)を含む直線状DNA構築物である。加えて、以下に詳しく述べるように、他の配列を含むことができる;例えば、抗生物質選択マーカー、原栄養性選択マーカーまたは蛍光マーカーをコードする配列、代謝遺伝子、タンパク質発現(例えばT7 RNAポリメラーゼ遺伝子など)を改善する遺伝子または、組み込み後に特定の配列(例えば抗生物質耐性遺伝子)を除去することを可能にする2つのフリッパーゼ認識標的部位(FRT)をコードするマーカー。
細菌宿主細胞に関しては、原則として制限はない。目的遺伝子の挿入のための遺伝子操作、好都合には部位特異的組み込みが可能であり、工業規模で培養することができる限り、細菌宿主細胞は真正細菌(グラム陽性またはグラム陰性)であることもできるし、古細菌であることもできる。好ましくは、宿主細胞は、高い細胞密度まで培養することが可能な性質を有する。
組み込み遺伝子座に関しては、本発明に用いられる発現系は、幅広いバリエーションが可能である。原則として、既知の配列を有する任意の遺伝子座を選択することができるが、ただし、その配列の機能が重要でないか、あるいは重要である場合、補完することができる(例えば栄養要求性の場合など)ことを条件とする。
前述のように、組み込み遺伝子座に関しては、既知の配列を有する任意の遺伝子座を選択することができる。ただし、その配列の機能が重要でないか、あるいは重要である場合、補完することができることを条件とする。好ましい実施形態において、直線状カートリッジの組み込みは、attB部位またはattTn7部位などの結合部位で行われ、これらはよく立証された組み込み部位である。しかしながら、前述のように、この系の順応性により、任意の事前選択された遺伝子座で目的遺伝子を挿入することができる。
陽性クローン、すなわち発現カセットを含むクローンは、マーカー遺伝子によって選択できる。
発現宿主細胞を得るための組み込み方法は、ゲノムの1つの部位に目的遺伝子を1つ組み込むことに限定されない。組み込み部位および発現カセットの両方に関して組み込み方法を変えることが可能である。一例として、2以上の目的遺伝子を挿入することができる。すなわち、同一または異なるプロモーターの制御下に有る2以上の同一または異なる配列を、ゲノムの1以上の種々の遺伝子座に組み込むことができる。一例として、ヘテロ二量体複合体を形成する2種の異なるタンパク質の発現が可能である。ヘテロ二量体タンパク質は、2つの個別に発現したタンパク質サブユニット、例えばモノクローナル抗体または抗体フラグメントのH鎖およびL鎖からなる(AndersenおよびReilly、2004年;HolligerおよびHudson、2005年)。他のヘテロ二量体タンパク質の例には、例えばCapZ(Remmertら、2000年)、Rasファルネシルトランスフェラーゼ(TsaoおよびWaugh、1997年)、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼIb(Sheffieldら、2001年)またはヒトDNAヘリカーゼII(Ochemら、1997年)がある。モノマーをコードするこれらの2つの配列は、1つの組み込み遺伝子座に挿入された1つの発現カートリッジに存在することができる。あるいは、これらの2つの配列は、2つの異なる組み込み遺伝子座に互いに独立して挿入された2つの異なる発現カートリッジに存在することもできる。いずれにせよ、プロモーターおよび誘導方法は、同一であることもできるし、異なることもできる。
本発明において、用語“培養すること”(または“培養”、“発酵”ともいう)は、当業界に公知の方法による制御されたバイオリアクターにおける細菌発現細胞の増殖に関する。
特定の実施形態において、本発明の方法は流加培養プロセスである。
他の実施形態において、本発明によるゲノムベースの発現カセットを含む細菌細胞は連続方式(ケモスタット)で培養される。連続発酵プロセスは、バイオリアクターへの定義された一定の連続速度の新鮮な培地のフィードを特徴とし、それによって、同じ定義された一定の連続除去速度でバイオリアクターから培養液が同時に除去される。培地、フィード速度および除去速度を同じ一定のレベルに保つことにより、バイオリアクターにおける培養パラメータおよび条件は一定のままである(いわゆる“定常状態”)。比増殖速度μはあらかじめ定義されたものであることができ、もっぱらバイオリアクターにおけるフィード速度および培地容量の結果である。1以上のゲノムベースの発現カセットを有する細胞は遺伝的に大変安定なため(構造不安定なおよび分離不安定なプラスミドベースの発現系またはゲノムに挿入されたカセットがゲノム増幅に依存する発現系とは対照的に)、本発明による細胞の世代数(細胞倍加数)は理論上は制限がなく、同様に、その結果として培養時間にも制限がない。連続方式で遺伝的に安定なゲノムベースの発現系を培養する利点は、遺伝的に不安定な先行技術システムと比較して、より高い、期間あたりの組換えタンパク質の総量を得ることができることである。加えて、理論上無期限の培養により、本発明による細胞の連続培養は、流加培養プロセスと比較してさえ、より高い、期間当たりの総タンパク質量をもたらすことができる。実施例7において、ゲノムベースの発現構築物の高い安定性および生産性を示す。
この発酵プロセスに用いられる培地の種類に関しては制限はない。培地は、半合成培地、すなわち複合培地化合物(例えば酵母抽出物、大豆ペプトン、カザミノ酸)を含む培地であることもでき、複合化合物を何も含まない化学的に定義された培地であることもできる。
前述のように、本発明の最も好ましい実施形態において、目的タンパク質は、“誘導性”または“制御性”プロモーターの制御下にある。
Novagen社により提供された大腸菌recA-K12株HMS174(DE3)またはB株BL21(DE3)のいずれかを用いて実験を行う。記号表示(DE3)は、宿主がlacUV5プロモーターの制御下にあるT7 RNAポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含むλ DE3プロファージの溶原菌であり、これらの株をT7またはT7lacプロモーターを用いるタンパク質発現に適したものにしたものであることを示している(StudierおよびMoffat、1986年;Studierら、1990年)。細菌染色体への直線状DNAカートリッジの組み込みは、DatsenkoおよびWanner(2000年)に記載されているように、RedヘルパープラスミドpKD46を含む大腸菌MG1655で行われる。直線状発現カートリッジは、大腸菌ゲノムのglmS遺伝子とpstS遺伝子の間にあるattTn7部位に組み込まれる。ゲノム上のカセットのPCRによる確認は、ゲノムにアニーリングする外部プライマーと内部プライマーを組み合わせて行う。P1形質導入(SternbergおよびHoess、1983年;およびLennox、1955年)により、組換え染色体部分が発現宿主HMS174(DE3)およびBL21(DE3)に導入される。レシピエントとしての機能を果たすために、RecAタンパク質をもたらす温度感受性pTSA29-recAヘルパープラスミドを含むrecA欠損株MS174(DE3)が用いられる(Phillips、1998年)。
標準的な制御装置を備えた、7L(正味容量5L、バッチ容量2.5L)または20L(正味容量12L、バッチ容量8L)のコンピュータ制御のバイオリアクター(MBR社;チューリッヒ・ヴェッツィコーン)のいずれかで細胞を増殖させる。25%アンモニア溶液(ACROS Organics社)の添加によりpHを設定値7.0±0.05に維持し、温度を37℃±0.5℃に調節する。酸素制限を避けるために、攪拌機速度および通気速度を制御することにより、溶存酸素濃度を飽和状態の30%以上に安定化させる。吹出空気におけるO2およびCO2含有量を、Hartmann andBraun AdvancedOptimaガス分析装置により測定する。Biomass monitorモデル214M(Aber Instruments社、英国アベリストウィス)セットで誘電容量および伝導率を測定する。産業環境におけるオンライン測定のために特別に設計された多波長蛍光分光光度計であるBioView(登録商標)(DELTA Light&Optics社、デンマーク・リンビー)を用いて蛍光測定を行う。消泡剤懸濁液(Glanapon 2000、Bussetti社、ウイーン)を1ml/フィード培地1lの濃度で添加することにより発泡を抑える。接種のために、強冷凍した(-80℃)ワーキングセルバンクバイアルを解凍し、1ml(吸光度OD600=1)を無菌でバイオリアクターに導入する。培養物が、バッチ培地2.5L中細菌乾燥物質12.5g(またはバッチ培地4L中細菌乾燥物質30g)に増殖して定常期に入ったときフィードを開始する。4倍加時間の間一定の増殖速度0.1h-1を得るために指数関数的基質フィードによる流加法を用いる。基質タンクにおける重量減少の重ねフィードバック制御を用い、対数増殖アルゴリズム、x=xo.eμt、に従ってポンプ速度を増加させることにより基質フィードを制御する(Cserjan-Puschmannら、1999年)。さらなる細菌乾燥物質202g(または450g)を得るために必要な成分をフィード培地は提供した。
バイオリアクターに直接に1回パルスする従来の方式で誘導を行う。完全誘導系を得るために、プロセスの終わりにIPTGの濃度が1μmolになるようにIPTGの供給量を算出する。
本研究に用いる最小培地は、1リットル当たりKH2PO4 3gおよびK2HPO4*3H2O 6gを含む。これらの濃度により必要な緩衝能が得られ、PおよびK源としても役立つ。産生されるグラム細菌乾燥物質に関連して他の成分が添加される:クエン酸ナトリウム(三ナトリウム塩*2H2O;ACROS organics社)0.25g、MgSO4*7H2O 0.10g、CaCl2*2H2O 0.02g、微量元素溶液50μlおよびグルコース*H2O 3g。発現系ES6、ES7およびES8を用いるすべての実験において、細菌乾燥物質1g当たりCuCl2*2H20 4mgおよびZnSO4*7H20 3.2mgを培地に添加する。集団の初期増殖を促進するために、複合成分である酵母抽出物0.15gを最小培地に加えてバッチ培地を得る。フィード段階に関して、フィード段階において、産生される生物学的乾燥物質量202g(または450g)に従って、1リットル当たりP塩をさらに加え、最小培地2.5Lを調製する。微量元素溶液:5N HCl溶液(g/L):FeSO4*7H2O 40.0、MnSO4*H2O 10.0、AlCl3*6H2O 10.0、CoCl2(Fluka社) 4.0、ZnSO4*7H2O 2.0、Na2MoO2*2H2O 2.0、CuCl2*2H2O 1.0、H3BO3 0.50。
600nmで吸光度(OD)を測定する。細胞浮遊液10mlを遠心分離し、蒸留水に再懸濁した後遠心分離し、再懸濁してあらかじめ計量したビーカーに移し、次いでこれを105℃で24時間乾燥して再計量して細菌乾燥物質を測定する。
不溶性標的タンパク質の製造(すなわち封入体として)に関する本発明の発現系(ES4)の行動を特徴づけ、プラスミドベースの発現系(ES1)と比較して経済性を評価するために、表1に記載した発現系ES1およびES4を用いる。本発明の発現系を用いる実験により、高いが生理学的に許容される遺伝子発現速度が示される。20時間を超えて産物生成を維持できる。完全誘導系を得るために、フィード開始後1回の倍加での1回のパルスによる誘導を行う(図1)。
本発明の発現系の一般適用性を証明するために、発現宿主として大腸菌株BL21(DE3)を用いる。前述の手順に従って、5L規模で表1のES5を培養する。この系の結果(図3;フィード後1回の倍加での1回のパルスにより誘導が行われる)は、K12株HMS174を用いた結果よりもよく、プラスミドベースのES2を用いて得られた結果(図4)と比較してもよい;フィード開始後3回の倍加での1回のパルスにより誘導が行われる)。本発明の系は、プラスミドベースの系よりも有意に高い産物収量およびプロセス安定性を示す(表3)。株BL21のプラスミドベースの系は、株HMS174について記載したものと同じ特性を示し、高すぎる産物生成速度により、系は崩壊し、プロセス制御は失われる。
可溶性標的タンパク質の製造のための本発明の発現系の行動を特徴づけるために、表1に記載した発現系ES3およびES6を用いる(表1の他の発現系は、不溶性タンパク質凝集体、すなわち封入体を形成する)。異なる細胞密度により引き起こされる影響を排除するために、フィード開始後1回の倍加での誘導による同じ培養を行うが、他の実験の結果から、プラスミドベースの系は引き起こされ発現速度が高すぎるので、この系では細胞活性を維持できないことが明らかとなった。要求される比較性に対処するために、表4には“プラスミドにコードされた(最適化後)”と呼ぶ第3列目が存在するが、これは、“プラスミドにコードされた発現系”ES2の結果が、フィード開始後1回の倍加での誘導をまねた実験設定に外挿されていることを意味する。図5および図6(フィード開始後3回の倍加での1回のパルスにより誘導が行われる)ならびに表4から導くことができるように、本発明の発現系はより効率的であることが明らかとなった。このことは、特に、組換えタンパク質のより高い比収量および容量収量ならびにバイオマスへの栄養素のより優れた転化率により明らかにされる(すなわちより高いBDM収量または理論値からの下限逸脱率)。
大腸菌HMS174(DE3)(ES7、ES8)を用いるプラスミドベースおよびゲノムベースの発現ならびに大腸菌BL21(DE3)(ES9)を用いるゲノムベースの発現により組換えヒトスーパーオキシドジスムターゼ(hSOD)を製造する。ヒトSODを3番目のモデルタンパク質として選択する。なぜなら、この酵素は細菌サイトゾル内で高度に相互作用的であることが記載されており、それによって、ゲノムベースの発現を用いる製造方法の頑健性および性能を研究するための適切なタンパク質候補を代表する。ES7を用いる実験(図12)において、製造される生物学的乾燥物質の量は、BDM 225gにあらかじめ定義され、誘導はフィード開始後2.5回の倍加で行われる。発現系ES8(図13)およびES9(図14)を用いる培養において、計画されるBDMはBDM 360gにあらかじめ定義され、誘導はフィード開始後1回の倍加で行われる。この実験は、より低い細胞密度とより低い容量で行うので、ES7とES8の適切な比較を可能にするために、ES7を用いる実験において得られる全収量および容量収量の全収量および容量収量の計算値を用いる。表5における結果は、ES8ベースのゲノムで得られる収量は約3倍高く、製造中での行動はより頑健で安定であることを示している(BDMの計算値とBDM実際の値との比較的小さな差異により示される)。計算過程とはわずかなBDM偏差値があるが、全プロセスを通じて増殖を維持でき、プラスミドにコードされたSODの発現と対照的に、ゲノムにコードされたhSODの発現は細胞の代謝能を超えないことを示している。ゲノムベースのES9を用いる実験により得られる結果(表5第4列目)は、おおよそ20%のさらなる収量増加を示しており、このことは、BL21(DE3)株が、K12株よりもhSODの製造により適していることを意味する。
ゲノムベース(すなわち無プラスミド)の発現系の遺伝的安定性を確認するために、発現系ES6を用いる連続培養実験(ケモスタット)を行う。希釈速度0.1h-1および1リットル当たりBDM 10gの細胞密度を設定し、実施例2記載の定義された培地を本培養に用いる。この培養の結果を図15に示す。実験の最初の部分で、非誘導状態で細胞を増殖させる。本培養の非誘導状態を、継代培養の行動になんら検出可能な変化なしに42回の倍加を超えて維持する。産生細胞の割合を75〜95%のおよそ一定に保つ((正方形図15)。続いて、フィード300時間近くで、IPTGを用いて培養物を完全に誘導し、誘導後約5時間で、オンラインでの蛍光はこの実験設定で得られる最高レベルに近づく。Reischerら(2004年)によれば、特異的GFP細胞含有量は、BDM 1g当たりGFPおおよそ140〜170mgと計算される。13.5回の倍加を超えて、この誘導状態で細胞を維持する。この期間中のオンラインでの蛍光の推移は、6000〜7000単位のrfu範囲を示す。ゲノムベースの発現宿主の系の安定性は、誘導状態で長期の世代数までも大変高いことをこれらの結果は示している。プラスミドベースの系と対照的に、ゲノム組み込みに基づく系を用いて大変高い発現速度を維持でき、このことは、連続製造工程の開発のための明確な利益を意味する。
組換え遺伝子発現の厳密な誘導制御は、バイオプロセス制御における大変重要な側面である。大変高く、さまざまな遺伝子量(プラスミドコピー数)を有するプラスミドベースのpET/T7系とは異なり、本発明の方法に用いられるゲノムベース(無プラスミド)のT7系は、厳密に、標的遺伝子の定義された遺伝子コピー数(1以上)を特徴とする。この事実により、ゲノムベースの系の発現速度は、より効率的に制御できる。この利益を明らかにするために、異なる誘導レベル(すなわち誘導物質濃度)を適用する、ES10を用いる一連の流加培養を行う。バイオリアクターへのIPTGの単回ボーラスにより誘導を行い、細胞乾燥重量(CDW)に対する誘導物質の最初の比率を設定し、次いでIPTGを連続的にフィードして、定義された濃度を一定のレベルに保つ。CDWに対するIPTGの比率は0.5、0.75、1.0、2.0μmol gCDW-1から、lacリプレッサー分子の完全滴定をもたらす20μmol gCDW-1のレベルまで(すなわち最大級の誘導レベル)である。誘導中の産物の蓄積をモニターし、比産物生成速度(qPF)を:
Claims (33)
- a)細菌発現宿主細胞の集団を培養し、
b)目的タンパク質を採取し、
c)それを分離及び精製する
工程を含む、目的組換えタンパク質を工業規模で製造する方法であって、
工程a)において、培養はフィード培地を添加する方式で行われ、前記方式は流加培養方式、半連続方式または連続方式から選択され、かつ、前記発現宿主細胞は、前記タンパク質の発現を可能にするプロモーターの制御下にある、目的タンパク質をコードするDNA配列を有するDNA構築物を、ゲノム中に組み込まれて含む前記方法。 - 前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項1記載の方法。
- 前記細菌発現宿主細胞が大腸菌細胞である、請求項1記載の方法。
- 前記大腸菌発現宿主細胞がそのゲノムにT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を含み、前記プロモーターがT7プロモーターである、請求項2または3記載の方法。
- 前記大腸菌発現宿主細胞が、既に生来的にゲノム中にT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を含む大腸菌宿主細胞の中に、前記DNA構築物を組み込むことにより得られたものである、請求項4記載の方法。
- 前記大腸菌発現宿主細胞が、ゲノム中にT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を含まない大腸菌宿主細胞の中に、さらなる因子としてT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を含むDNA構築物を組み込むことにより得られたものである、請求項4記載の方法。
- 既に生来的にゲノム中にT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を含む大腸菌宿主細胞が、BL21(DE3)株、HMS174(DE3)株またはそれらの派生株から選択される、請求項5記載の方法。
- ゲノム中にT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を含む大腸菌宿主細胞が非溶原性である、請求項5記載の方法。
- 前記誘導性プロモーターが、tacプロモーター、trcプロモーター、lacプロモーター、lacUV5プロモーター、trpプロモーター、λプロモーターpL、phoAプロモーターまたはPBADプロモーターから選択される、請求項2記載の方法。
- 前記プロモーターが構成的プロモーターである、請求項1記載の方法。
- 前記プロモーターがリーキープロモーターである、請求項2記載の方法。
- 前記発現宿主細胞が、結合部位に組み込まれた前記DNA構築物を含む、請求項1記載の方法。
- 前記結合部位がattTn7部位である、請求項12記載の方法。
- 前記発現宿主細胞が、細菌宿主細胞のゲノムに含まれるDNAマーカー配列部位に組み込まれた前記DNA構築物を含む、請求項1記載の方法。
- 前記マーカーDNA配列が、抗生物質耐性を与えるタンパク質をコードする、請求項14に記載の方法。
- 前記マーカーのマーカーDNA配列が蛍光タンパク質をコードする、請求項14記載の方法。
- 前記DNA構築物が、さらなる因子として、マーカータンパク質をコードするマーカー配列を含む、請求項1記載の方法。
- 前記マーカータンパク質が細菌宿主細胞の栄養要求変異を補完するタンパク質であり、それによって発現宿主細胞に原栄養性を与える、請求項17記載の方法。
- 前記マーカーDNA配列が、抗生物質耐性を与えるタンパク質をコードする、請求項17記載の方法。
- 前記マーカーDNA配列が蛍光タンパク質をコードする、請求項17記載の方法。
- あらかじめ定義されたフィード方式による流加培養方式で培養が行われる、請求項1記載の方法。
- あらかじめ定義されたフィード方式が指数関数に従って行われる、請求項21記載の方法。
- フィードバック制御されたフィード方式による流加培養方式で培養が行われる、請求項1記載の方法。
- 誘導原の存在により前記目的タンパク質の発現が誘導される、請求項2記載の方法。
- 誘導原が連続的に添加される、請求項24記載の方法。
- プロモーターが、T7プロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、lacプロモーター、lacUV5プロモーターから選択され、誘導原がIPTGである、請求項24または25記載の方法。
- プロモーターが、T7プロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、lacプロモーター、lacUV5プロモーターから選択され、誘導原がラクトースである、請求項24または25記載の方法。
- 誘導原とバイオマスの比率が一定になるように、バイオマスに比例した濃度で誘導原が添加される、請求項25記載の方法。
- IPTGの培地中濃度が細胞乾燥重量1g当たり0.1〜30μgの範囲内である、請求項26および28記載の方法。
- 前記範囲がCDW 1g当たり0.5〜20μgである、請求項29記載の方法。
- 培養の開始時から誘導原がバッチ段階に存在する、請求項24記載の方法。
- 細胞質から培地に目的タンパク質が分泌される、請求項23記載の方法。
- 目的組換えタンパク質がヘテロ二量体であり、2つのモノマーをコードするDNA分子が同一または異なるDNA構築物中に存在する、請求項1記載の方法。
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