CN113908262A - 重组人源ⅰ型胶原蛋白在制备促进创面愈合材料中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组人源Ⅰ型胶原蛋白在制备促进创面愈合材料中的应用。所述的重组人源Ⅰ型胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ No.2所示，含有510个氨基酸，理论分子量约55.911kd，构建的重组人源Ⅰ型胶原蛋白表达菌株能够有效稳定和大量地表达重组人源Ⅰ型胶原蛋白。本发明的重组人源胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性，其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，应用于人体当中不会造成免疫排斥，作为促进创面愈合材料具有起效时间短、创面愈合速度快的优点，适用于生物医用材料和化妆品领域。

Description

重组人源Ⅰ型胶原蛋白在制备促进创面愈合材料中的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种重组人源Ⅰ型胶原蛋白((RHCⅠ))在制备促进创面愈合材料中的应用。
背景技术
创面的修复愈合是一个复杂、动态的生物学过程。愈合包括了止血、炎症反应、肉芽组织再生以及基质重塑四个步骤。愈合过程顺利进行是确保皮肤修复以及功能恢复的重要前提，其中肉芽组织和上皮再生在创面愈合中的作用至关重要。
胶原蛋白(Collagen)是脊椎动物体内最重要的结构蛋白，约占蛋白总量的25～30％。作为细胞外基质中含量最丰富的蛋白，胶原蛋白是结缔组织和几乎所有薄壁器官间隙组织中最主要的结构蛋白，起着稳定组织和器官并维持其结构完整的作用。研究表明，胶原蛋白应用于创面具有强效的抗感染能力，能够促进细胞生长、黏附、止血和伤口愈合。作为细胞外基质(ECM)主要结构成分，胶原蛋白含量最多并且相互聚合、连接，并参与组织器官形态发生、代谢更新、损伤修复。胶原蛋白应用于创面可通过促进ECM内细胞募集以及纤维蛋白的合成等加速创面愈合，因此胶原蛋白的表达和分解直接影响创面愈合速度。正常皮肤组织中的胶原蛋白分为Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白。Ⅰ型胶原蛋白主要分布于皮肤细胞外间质，具备引导上皮细胞迁入缺损区的功能，同时在细胞迁移过程中起到支持和润滑作用。另外，Ⅰ型胶原纤维相对粗大的特性，更决定了新生皮肤组织的抗拉性和创面愈合成熟程度。
目前，应用于创面修复的胶原蛋白主要来源于动物。但天然动物胶原蛋白分子量大小不等，性质非常复杂，存在的动物病毒隐患在应用过程中无法彻底消除。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组人源Ⅰ型胶原蛋白在制备促进创面愈合材料中的应用。本发明将重组人源胶原蛋白应用于创面愈合修复，克服了动物胶原蛋白的缺陷，具有无病毒隐患、无免疫原性和良好的水溶性以及生物相容性的优点。
本发明所述的重组人源Ⅰ型胶原蛋白在制备促进创面愈合材料中的应用，所述的促进创面愈合材料可以是促进创面愈合的组合物，如与抑菌材料等复配制成促进创面愈合的药物组合物；或促进创面愈合的敷料等。
在本发明的具体实施方式中，所述的促进创面愈合材料中，重组人源Ⅰ型胶原蛋白的浓度为0.1％(w/v，g/mL)。本发明所述的重组人源Ⅰ型胶原蛋白，氨基酸序列如SEQ No.2所示。
本发明所述的重组人源Ⅰ型胶原蛋白的编码基因Iα1 510aa，核苷酸序列如SEQNo.3所示。
本发明构建的重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1 510aa的核苷酸序列如SEQNo.4所示，通过将重组人源Ⅰ型胶原蛋白的编码基因Iα1 510aa双酶切连接至ppic9K载体的EcoR I和Not I间构建而成。
本发明构建的分泌表达重组人源Ⅰ型胶原蛋白的菌株为巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris JY0201，保藏编号为CGMCC No.16461，该菌种已于2018年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。所述的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris JY0201通过将Sac I酶切得到的线性化重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1 510aa诱导入巴斯德毕赤酵母中构建而成。
本发明从已知序列的人体胶原蛋白基因I型的螺旋区中选择水溶性、稳定性强的核苷酸序列，将优选基因片段插入毕赤酵母表达质粒中，转化毕赤酵母筛选得到高表达毕赤酵母基因工程菌，经过初步发酵及纯化步骤，得到高纯度的重组类人胶原蛋白。本发明的重组人源Ⅰ型胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性，其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，应用于人体当中不会造成免疫排斥。相同浓度下，重组人源Ⅰ型胶原蛋白的细胞修复能力更突出，孵育24h显示重组人源Ⅰ型胶原蛋白的细胞修复百分比分别比空白对照组和罗非鱼胶原蛋白组高出19.67％和15.69％，具有起效时间短、创面愈合速度快的优点，作为促进创面愈合材料适用于生物医用材料和化妆品领域。
附图说明
图1为人Ⅰ型α1链胶原蛋白氨基酸的疏水性分析图。
图2为重组人源Ⅰ型胶原蛋白氨基酸的疏水性分析图。
图3为重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1 510aa的构建示意图。
图4为重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1 510aa的Sac I酶切琼脂糖凝胶电泳图。
图5为电转后的毕赤酵母GS115平板图。
图6为阳性克隆菌株的凝胶电泳图。
图7为阳性克隆菌株的PCR凝胶电泳图。
图8为#3，#5，#7，#8阳性克隆菌株培养48和72小时的样品的蛋白表达分析图。
图9为#7阳性克隆菌株的蛋白表达的SDS-PAGE电泳图。
图10为对照组、罗非鱼胶原组和重组人源Ⅰ型胶原蛋白的人工伤口尺寸曲线。
图11为对照组0小时和24小时人工伤口的愈合程度图。
图12为罗非鱼胶原组0小时和24小时人工伤口的愈合程度图。
图13为重组人源Ⅰ型胶原蛋白组0小时和24小时人工伤口的愈合程度图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1
1.蛋白序列选择
对人Ⅰ型α1链胶原蛋白的氨基酸序列(SEQ No.1)进行疏水性分析，评价结果如图1所示。疏水性评价分值越低其亲水性越好。根据疏水性分析结果，选择评分低的氨基酸片段，将这些片段整合成新的蛋白，即本发明的重组人源Ⅰ型胶原蛋白(SEQ No.2)。对重组人源Ⅰ型胶原蛋白的氨基酸进行疏水性分析，结果如图2所示，该蛋白中所有氨基酸疏水性评价均低于零，表明该蛋白的亲水性很好。
2.质粒构建及线性化
将重组人源Ⅰ型胶原蛋白翻译成碱基序列(SEQ No.3)，采用基于PAS(PCR-basedAccurate Synthesis)的方法合成基因Iα1 510aa，双酶切连接至ppic9K载体的EcoR I和Not I之间，图3为重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1 510aa的构建示意图。将获得的重组质粒ppic9K-Iα1 510aa转入TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，测序结果拼接如SEQNo.4所示。SEQ No.4的第77-82碱基处及1625-1632碱基处区域为酶切位点。
提取质粒20μg，使用Sac I酶切线性化，冻干浓缩待用。37℃消化3h。取5μl，进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图4所示。其中M为DNA标准品，从下到上1000，2000，3000，4000，5000，6000，8000，10000bp；1为Sac I酶切；2为回收的目的片段。
表1酶切线性化体系配制表
Figure BDA0002576107770000041
3.电转毕赤酵母细胞GS115
冰浴电转杯，将10μL线性化质粒加入到装有80μL毕赤酵母GS115感受态细胞的1.5mL EP管内，混匀转移至直径为0.2cm电转化杯中，然后把电转杯冰浴5min。电击条件为：电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω，电击时间为4～10msec。电击完成后，将650uL冰上预冷的浓度为1M山梨醇溶液加入到电击转化杯里，用枪头轻轻地吹打溶液均匀。把电转杯中的全部液体转移到新的2ml EP管中，30℃静置培养2h。低速离心收集菌体，全部涂布于MD平板上，30℃恒温培养3-4d。图5为电转后的毕赤酵母GS115平板图。
4.PCR鉴定阳性克隆菌株
待平板长出菌落，用接种环挑取平板上生长的单菌，将它接入到装有500μL YPD液体培养基离心管，30℃，180r/min过夜培养。挑选10株克隆，分别提取基因组DNA，如图6所示。图中，M为DNA标准品，从下到上1000，2000，3000，4000，5000，6000，8000，10000bp；1-10：各克隆菌株提取的基因组。
使用载体上引物PCR鉴定，预期条带大小约2kb，2kb为扩增序列大小，结果如图7所示，其中，M：DNA标准品，从下到上100，200，500，750，1000，2000bp；1-10：各克隆菌株的PCR扩增片段。
5.小试表达
诱导表达：取鉴定的阳性菌株(3#，5#，7#，8#)50μl接入装有10mlBMGY的锥形瓶中，30℃，220r/min过夜培养，摇至OD600＝2-6(对数生长，大约16-18h)；室温离心5000r/min离心5min，收集细胞，去除上清，用10ml BMMY重悬细胞，进行诱导表达；每24h从培养基中取样1ml，并加甲醇至终浓度0.5％继续诱导；以下各时间点0，24，48，72，96hr样品10000r/min离心2min收集上清液待检测。
三氯乙酸沉淀法浓缩表达产物：
(1)在离心管中加入500μl培养液上清和1/9体积的100％的TCA，振荡混合，4℃沉淀过夜；
(2)12000r/min离心10min，沉淀为粘稠带黄褐色胶状物，弃上清，收集沉淀，另将EP管倒置于吸水纸上，37℃烘箱静置10～20min，使管壁无明显液体残留；
(3)加入200μl冷丙酮，振荡混匀，样品在室温下静置10min，洗去管壁和管底残留的TCA；
(4)12000r/min离心10min，弃上清，重复步骤(2)和(3)，重复2～3次；
(5)加入上样缓冲液30μl，37℃孵育1h，溶解沉淀；如果沉淀不溶解，可用100μl枪头吹打至沉淀溶解。
6.鉴定分析
Western Blotting检测：
(1)取样品上样10μl；
(2)上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90V跑完积层胶，再将电压升至200V直到电泳结束；
(3)电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100V转膜，约为1.5h，恒流250mA；
(4)电转结束后，取下膜后先用PBST洗涤4次，每次5min；
(5)将膜置于5％脱脂奶粉封闭液中封闭37℃1h；
(6)用封闭液稀释一抗(Rabbitanti-His)，膜在一抗稀释液(稀释比例1:1000)中4℃过夜；
(7)次日将膜取出后用PBST洗膜4次，每次5min；
(8)用含5％牛奶的封闭液稀释二抗(羊抗兔)，膜在二抗稀释液(稀释比例1:5000)中37℃反应1h；
(9)反应完毕后，把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次，每次5min；
(10)ECL显影，曝光。
将选择的#3，#5，#7，#8阳性克隆菌株培养48和72小时的样品，进行Western Blot初步检测。检测结果如图8所示，其中M：蛋白标准品；1：GS115菌株培养72小时上清样品；2：3#阳性菌株培养48小时上清样品；3：3#阳性菌株培养72小时上清样品；4：5#阳性菌株培养48小时上清样品；5：5#阳性菌株培养72小时上清样品；6：7#阳性菌株培养48小时上清样品；7：7#阳性菌株培养72小时上清样品；8：8#阳性菌株培养48小时上清样品；9：8#阳性菌株培养72小时上清样品。
表达分析：
SDS-PAGE电泳检测：选取7#阳性菌进行表达情况分析结果如图9所示。其中，M：蛋白标准品；1：GS115菌株培养72小时上清；2：7#阳性菌株培养0小时上清；3：7#阳性菌株培养24小时上清；4：7#阳性菌株培养48小时上清；5：7#阳性菌株培养72小时上清；6：7#阳性菌株培养96小时上清。7#阳性菌命名为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris JY0201，该菌种已于2018年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC No.16461。
实施例2
体外细胞划痕实验：
1.将人角质形成细胞铺板于12孔板，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液，置于5％CO2、37℃培养箱内培养，直至细胞贴壁并完全覆盖培养板形成单层细胞。
2.用10μL无菌移液枪头在单层细胞上划“一”字划痕，形成人工伤口，PBS清洗3次。
3.加药孵育，设置空白对照组、0.1％(w/v，g/mL，即1g/L)罗非鱼皮胶原组和0.1％重组人源Ⅰ型胶原蛋白组。
4.分别于0h，2h，8h，24h对细胞培养物拍照，每孔取三个伤口边缘数据，进行统计分析。
表2各组不同时间伤口边缘之间的宽度
Figure BDA0002576107770000061
Figure BDA0002576107770000071
表3不同检测时间，各组人工伤口边缘宽度的降低百分比
对照组 鱼胶原 RHC I
2h 1.97％ 2.9％ 9.29％
8h 12.28％ 18.23％ 21.86％
24h 52.88％ 56.86％ 72.55％
表4RHC I和鱼胶原组与对照组的对比统计分析P值
Figure BDA0002576107770000072
从表2～4以及图11～13可以看出，相同浓度下，重组人源Ⅰ型胶原蛋白的细胞修复能力更突出，明显优于对照组和罗非鱼胶原组，孵育24h显示重组人源Ⅰ型胶原蛋白的细胞修复百分比分别比空白对照组和罗非鱼皮胶原组高出19.67％和15.69％，表明重组人源Ⅰ型胶原蛋白具有优异的促进创面愈合效果。
本发明从已知序列的人体胶原蛋白基因I型的螺旋区中选择水溶性好、稳定性强的核苷酸序列，将优选基因片段插入毕赤酵母表达质粒中，转化毕赤酵母筛选得到高表达毕赤酵母基因工程菌，经过初步发酵及纯化步骤，得到高纯度的重组类人胶原蛋白。实验证明该法生产的重组类人胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性，由于其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，所以应用于人体当中不会造成免疫排斥，可以广泛应用于生物医用材料、化妆品等领域。本发明采用的是分泌型表达载体，成功实现了重组类人胶原蛋白的分泌型表达，表达产物分泌在上清液中，方便纯化，具有其他重组类人胶原蛋白生产所不具备的优势，便于规模化生产操作。由于载体电转入毕赤酵母之后，基因整合在毕赤酵母基因组上，所以重组菌的稳定性好，经过多次传代基因不容易发生流失并能保持高效表达的性状，能够很好的实现稳定生产，毕赤酵母生产方法为好氧发酵，菌体密度高，表达量还有很大的提升空间。并且，本发明的重组人源Ⅰ型胶原蛋白作为促进创面愈合材料，具有起效时间短、创面愈合速度快的优点，适用于生物医用材料和化妆品领域。
序列表
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<120> 重组人源Ⅰ型胶原蛋白在制备促进创面愈合材料中的应用
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<211> 1440
<212> PRT
<213> 人属(Homo sapiens)
<400> 1
Met Phe Ser Phe Val Asp Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Thr
1 5 10 15
Ala Leu Leu Thr His Gly Gln Glu Glu Gly Gln Val Glu Gly Gln Asp
20 25 30
Glu Asp Ile Pro Pro Ile Thr Cys Val Gln Asn Gly Leu Arg Tyr His
35 40 45
Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro Glu Pro Cys Arg Ile Cys Val Cys Asp
50 55 60
Asn Gly Lys Val Leu Cys Asp Asp Val Ile Cys Asp Glu Thr Lys Asn
65 70 75 80
Cys Pro Gly Ala Glu Val Pro Glu Gly Glu Cys Cys Pro Val Cys Pro
85 90 95
Asp Gly Ser Glu Ser Pro Thr Asp Gln Glu Thr Thr Gly Val Glu Gly
100 105 110
Pro Lys Gly Asp Thr Gly Pro Arg Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro
115 120 125
Pro Gly Arg Asp Gly Ile Pro Gly Gln Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro
130 135 140
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Gly Gly Asn Phe Ala
145 150 155 160
Pro Gln Leu Ser Tyr Gly Tyr Asp Glu Lys Ser Thr Gly Gly Ile Ser
165 170 175
Val Pro Gly Pro Met Gly Pro Ser Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Pro
180 185 190
Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Phe Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro
195 200 205
Gly Glu Pro Gly Ala Ser Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly
210 215 220
Pro Pro Gly Lys Asn Gly Asp Asp Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Arg
225 230 235 240
Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Leu Pro
245 250 255
Gly Thr Ala Gly Leu Pro Gly Met Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly
260 265 270
Leu Asp Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Glu
275 280 285
Pro Gly Ser Pro Gly Glu Asn Gly Ala Pro Gly Gln Met Gly Pro Arg
290 295 300
Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly
305 310 315 320
Ala Arg Gly Asn Asp Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro
325 330 335
Thr Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Phe Pro Gly Ala Val Gly Ala Lys
340 345 350
Gly Glu Ala Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Ser Glu Gly Pro Gln Gly
355 360 365
Val Arg Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Pro
370 375 380
Ala Gly Asn Pro Gly Ala Asp Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Ala Asn
385 390 395 400
Gly Ala Pro Gly Ile Ala Gly Ala Pro Gly Phe Pro Gly Ala Arg Gly
405 410 415
Pro Ser Gly Pro Gln Gly Pro Gly Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asn
420 425 430
Ser Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly Ser Lys Gly Asp Thr Gly Ala Lys
435 440 445
Gly Glu Pro Gly Pro Val Gly Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly
450 455 460
Glu Glu Gly Lys Arg Gly Ala Arg Gly Glu Pro Gly Pro Thr Gly Leu
465 470 475 480
Pro Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly Ser Arg Gly Phe Pro
485 490 495
Gly Ala Asp Gly Val Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly
500 505 510
Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Ser Pro Gly Glu Ala Gly Arg
515 520 525
Pro Gly Glu Ala Gly Leu Pro Gly Ala Lys Gly Leu Thr Gly Ser Pro
530 535 540
Gly Ser Pro Gly Pro Asp Gly Lys Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly
545 550 555 560
Gln Asp Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Arg Gly Gln
565 570 575
Ala Gly Val Met Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Ala Ala Gly Glu Pro
580 585 590
Gly Lys Ala Gly Glu Arg Gly Val Pro Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly
595 600 605
Pro Ala Gly Lys Asp Gly Glu Ala Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro
610 615 620
Ala Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Ser Pro
625 630 635 640
Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly
645 650 655
Lys Pro Gly Glu Gln Gly Val Pro Gly Asp Leu Gly Ala Pro Gly Pro
660 665 670
Ser Gly Ala Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln
675 680 685
Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly
690 695 700
Asn Asp Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser
705 710 715 720
Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala
725 730 735
Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly
740 745 750
Ala Asp Gly Ser Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Thr Gly Pro
755 760 765
Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Asp Lys Gly Glu Ser
770 775 780
Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly
785 790 795 800
Asp Arg Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Phe Ala Gly Pro
805 810 815
Pro Gly Ala Asp Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Asp Ala
820 825 830
Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly
835 840 845
Pro Pro Gly Pro Ile Gly Asn Val Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Ala
850 855 860
Arg Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly Ala Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala
865 870 875 880
Gly Arg Val Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Asn Ala Gly Pro Pro Gly
885 890 895
Pro Pro Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Gly Lys Gly Pro Arg Gly Glu
900 905 910
Thr Gly Pro Ala Gly Arg Pro Gly Glu Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro
915 920 925
Gly Pro Ala Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly
930 935 940
Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val
945 950 955 960
Val Gly Leu Pro Gly Gln Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro
965 970 975
Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly Lys Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly
980 985 990
Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Pro
995 1000 1005
Pro Gly Glu Ser Gly Arg Glu Gly Ala Pro Gly Ala Glu Gly Ser Pro
1010 1015 1020
Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly
1025 1030 1035 1040
Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro
1045 1050 1055
Val Gly Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala
1060 1065 1070
Gly Pro Ala Gly Pro Val Gly Pro Val Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly
1075 1080 1085
Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Gln Gly Asp
1090 1095 1100
Arg Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Gln Gly Pro Pro
1105 1110 1115 1120
Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Glu Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly
1125 1130 1135
Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Lys
1140 1145 1150
Asp Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg
1155 1160 1165
Gly Arg Thr Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
1170 1175 1180
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe
1185 1190 1195 1200
Leu Pro Gln Pro Pro Gln Glu Lys Ala His Asp Gly Gly Arg Tyr Tyr
1205 1210 1215
Arg Ala Asp Asp Ala Asn Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp
1220 1225 1230
Thr Thr Leu Lys Ser Leu Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro
1235 1240 1245
Glu Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met
1250 1255 1260
Cys His Ser Asp Trp Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln
1265 1270 1275 1280
Gly Cys Asn Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly
1285 1290 1295
Glu Thr Cys Val Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Val Ala Gln Lys Asn Trp
1300 1305 1310
Tyr Ile Ser Lys Asn Pro Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe Gly Glu
1315 1320 1325
Ser Met Thr Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser Asp
1330 1335 1340
Pro Ala Asp Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met Ser Thr
1345 1350 1355 1360
Glu Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Val Ala Tyr
1365 1370 1375
Met Asp Gln Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu Leu Gln Gly
1380 1385 1390
Ser Asn Glu Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr
1395 1400 1405
Ser Val Thr Val Asp Gly Cys Thr Ser His Thr Gly Ala Trp Gly Lys
1410 1415 1420
Thr Val Ile Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Thr Ser Arg Leu Arg Ile Ile
1425 1430 1435 1440
<210> 3
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Pro Ser Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly
1 5 10 15
Pro Gln Gly Phe Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Glu Pro Gly Ala
20 25 30
Ser Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Asn
35 40 45
Gly Asp Asp Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Arg Pro Gly Glu Arg Gly
50 55 60
Pro Pro Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly Met Lys Gly His
65 70 75 80
Arg Gly Phe Ser Gly Leu Asp Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Pro Ala
85 90 95
Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Ser Pro Gly Glu Asn Gly Ala Pro Gly
100 105 110
Gln Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Arg Pro Gly Ala
115 120 125
Pro Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Asn Asp Gly Ala Thr Gly Pro Pro
130 135 140
Gly Pro Thr Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Pro Gln Gly
145 150 155 160
Pro Gly Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser Gly Glu Pro Gly Ala
165 170 175
Pro Gly Ser Lys Gly Asp Thr Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Pro Val
180 185 190
Gly Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Glu Gly Lys Arg Gly
195 200 205
Ala Arg Gly Glu Pro Gly Pro Thr Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Glu
210 215 220
Arg Gly Gly Pro Gly Ser Arg Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly Lys Ala
225 230 235 240
Gly Glu Arg Gly Val Pro Gly Pro Ala Gly Lys Asp Gly Glu Ala Gly
245 250 255
Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Glu
260 265 270
Gln Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Phe Gln Gly Pro Ala Gly Pro Pro
275 280 285
Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Glu Gln Gly Val Pro Gly Ala Pro Gly
290 295 300
Pro Ser Gly Ala Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val
305 310 315 320
Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ala Asn Gly Ala Pro
325 330 335
Gly Asn Asp Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly
340 345 350
Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Lys Asp Gly Val
355 360 365
Arg Gly Arg Val Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Asn Ala Gly Pro Pro
370 375 380
Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Gly Lys Gly Pro Arg Gly
385 390 395 400
Glu Thr Gly Pro Ala Gly Arg Pro Gly Glu Val Gly Pro Pro Gly Pro
405 410 415
Pro Gly Pro Ala Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala
420 425 430
Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly
435 440 445
Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Gln Gly Asp Arg Gly Ile Lys Gly His
450 455 460
Arg Gly Phe Ser Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Pro
465 470 475 480
Gly Glu Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly
485 490 495
Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Leu Asn
500 505 510
<210> 3
<211> 1530
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtccatctg gtccaagagg tttaccaggt ccaccaggtg ctccaggtcc tcaaggtttt 60
caaggtcctc ctggtgaacc aggtgaacct ggtgcttctg gtcctatggg tcctagaggt 120
ccacctggac caccaggcaa aaatggtgat gatggtgaag ctggtaagcc aggtagacca 180
ggtgagagag gtcctccagg accacaaggt gctagaggat tgccaggtat gaagggtcac 240
agaggtttct ctggtttgga tggtgctaag ggtgatgctg gtcctgctgg acctaaaggt 300
gagccaggat ctccaggtga aaatggtgca cctggtcaaa tgggaccaag aggtctgcct 360
ggtgaaaggg gtagacccgg tgctcctgga cctgctggtg ccagaggtaa tgatggtgca 420
actggcccac caggtcctac tggtccagct ggccctcctg gtccatccgg acctcaaggc 480
ccaggcggac cacctggtcc aaagggtaat tctggtgagc ctggcgctcc aggttcaaaa 540
ggtgatactg gtgctaaagg cgaaccagga ccagttggtg ttcaaggacc tccaggtcca 600
gccggtgaag agggtaaaag aggtgctagg ggagaacctg gtcctacagg tttgcccgga 660
cctcctggcg aaagaggtgg tcccggtagt agaggtgctg ctggcgaacc tggaaaagct 720
ggtgaacgtg gtgtaccagg acctgccggt aaagacggtg aggctggtgc acaaggacca 780
cctggacctg caggacccgc tggtgaaaga ggcgaacaag gtcctgccgg ttctccaggt 840
ttccaaggac cagcaggccc acctggcgaa gccggtaaac ccggtgaaca aggtgttcca 900
ggcgctcccg gaccaagtgg tgcaagaggt gagaggggtt ttccaggcga aaggggtgtt 960
cagggtccac ctggtcctgc cggaccaagg ggtgctaatg gtgctcctgg taacgacggt 1020
gcaaaaggtg acgcaggacc aaaaggcgat aggggagatg caggtcctaa gggtgctgat 1080
ggatcaccag gtaaggacgg tgttagaggt agagttggtc ctcctggacc atctggtaat 1140
gctggccctc caggacctcc tggtcctgcc ggcaaagaag gtggtaaagg acctagaggc 1200
gaaactggac cagccggcag acctggtgaa gttggtccac ctggacctcc aggtcctgct 1260
ggcgagaaag gttctcctgg tgctgacggt ccagctggtg ccccaggtac tcctggtcca 1320
cagggtccac aaggtcccag aggtgataag ggtgaaactg gtgagcaagg tgacagaggt 1380
atcaagggac atagaggatt ttccggttta cagggaccac caggaccacc tggaagtcct 1440
ggtgaacaag gtccttctgg tgcttcagga cctgctggcc caagaggtcc accaggatct 1500
gctggtgctc ctggaaaaga tggtttgaac 1530
<210> 4
<211> 1623
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaatactact attgccagca ttgctgctaa agaagaaggg gtatctctcg agaaaagaga 60
ggctgaagct tacgtagaat tcggtccatc tggtccaaga ggtttaccag gtccaccagg 120
tgctccaggt cctcaaggtt ttcaaggtcc tcctggtgaa ccaggtgaac ctggtgcttc 180
tggtcctatg ggtcctagag gtccacctgg accaccaggc aaaaatggtg atgatggtga 240
agctggtaag ccaggtagac caggtgagag aggtcctcca ggaccacaag gtgctagagg 300
attgccaggt atgaagggtc acagaggttt ctctggtttg gatggtgcta agggtgatgc 360
tggtcctgct ggacctaaag gtgagccagg atctccaggt gaaaatggtg cacctggtca 420
aatgggacca agaggtctgc ctggtgaaag gggtagaccc ggtgctcctg gacctgctgg 480
tgccagaggt aatgatggtg caactggccc accaggtcct actggtccag ctggccctcc 540
tggtccatcc ggacctcaag gcccaggcgg accacctggt ccaaagggta attctggtga 600
gcctggcgct ccaggttcaa aaggtgatac tggtgctaaa ggcgaaccag gaccagttgg 660
tgttcaagga cctccaggtc cagccggtga agagggtaaa agaggtgcta ggggagaacc 720
tggtcctaca ggtttgcccg gacctcctgg cgaaagaggt ggtcccggta gtagaggtgc 780
tgctggcgaa cctggaaaag ctggtgaacg tggtgtacca ggacctgccg gtaaagacgg 840
tgaggctggt gcacaaggac cacctggacc tgcaggaccc gctggtgaaa gaggcgaaca 900
aggtcctgcc ggttctccag gtttccaagg accagcaggc ccacctggcg aagccggtaa 960
acccggtgaa caaggtgttc caggcgctcc cggaccaagt ggtgcaagag gtgagagggg 1020
ttttccaggc gaaaggggtg ttcagggtcc acctggtcct gccggaccaa ggggtgctaa 1080
tggtgctcct ggtaacgacg gtgcaaaagg tgacgcagga ccaaaaggcg ataggggaga 1140
tgcaggtcct aagggtgctg atggatcacc aggtaaggac ggtgttagag gtagagttgg 1200
tcctcctgga ccatctggta atgctggccc tccaggacct cctggtcctg ccggcaaaga 1260
aggtggtaaa ggacctagag gcgaaactgg accagccggc agacctggtg aagttggtcc 1320
acctggacct ccaggtcctg ctggcgagaa aggttctcct ggtgctgacg gtccagctgg 1380
tgccccaggt actcctggtc cacagggtcc acaaggtccc agaggtgata agggtgaaac 1440
tggtgagcaa ggtgacagag gtatcaaggg acatagagga ttttccggtt tacagggacc 1500
accaggacca cctggaagtc ctggtgaaca aggtccttct ggtgcttcag gacctgctgg 1560
cccaagaggt ccaccaggat ctgctggtgc tcctggaaaa gatggtttga actaagcggc 1620
cgc 1623

Claims (7)

1.重组人源Ⅰ型胶原蛋白在制备促进创面愈合材料中的应用，其特征在于，所述的重组人源Ⅰ型胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ No.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的促进创面愈合材料为促进创面愈合的组合物或促进创面愈合的敷料。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的促进创面愈合材料中，重组人源Ⅰ型胶原蛋白的浓度为0.1％w/v。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的重组人源Ⅰ型胶原蛋白的编码基因为Iα1 510aa，核苷酸序列如SEQ No.3所示。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的重组人源Ⅰ型胶原蛋白的表达质粒为ppic9K-Iα1 510aa，核苷酸序列如SEQ No.4所示。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1 510aa通过将重组人源Ⅰ型胶原蛋白的编码基因Iα1 510aa双酶切连接至ppic9K载体的EcoR I和Not I间构建而成。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的重组人源Ⅰ型胶原蛋白的表达菌株，为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris JY0201，保藏编号为CGMCC No.16461。
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