CN113174427B - 基于DNA分子检测ERGIC3 mRNA的方法 - Google Patents

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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Abstract

本发明公开了一种基于DNA分子检测ERGIC3 mRNA的方法，属于基因技术领域，包含以下步骤：针对靶ERGIC3 mRNA，程序化设计和合成检测探针H1、H2作为识别元件，底物探针sub作为报告元件；先将2.5μL体积的2μM探针H1、2.5μL体积的2μM探针H2和5μL体积的2μM底物探针sub移至扩增系统，再将10‑14至10‑8浓度的ERGIC3 mRNA加入扩增检测系统，整个反应系统在50μL 1×Nebuffer 2中进行，37℃孵育1小时；然后用M2光谱进行荧光检测，激发波长为645纳米，记录发射波长范围为655至725纳米；本发明的检测方法，可以实现对目标靶ERGIC3 mRNA进行简便、快速、灵敏、特异检测。

Description

基于DNA分子检测ERGIC3 mRNA的方法
技术领域
本发明涉及基因分子检测技术，具体为一种基于DNA分子检测靶ERGIC3 mRNA的方法。
背景技术
ERGIC3（内质性视网膜-高尔基中间舱3）是位于内质视网膜和高尔基体内的II型转膜蛋白。主要功能是参与蛋白质从内质网到高尔基体的早期运输和糖苷酶的糖基化。有研究发现ERGIC3是新的肺癌标志物，可能对肺癌早期诊断和治疗监测展现新的应用前景。
传统分析mRNA水平方法主要包括Northern 印记、微阵列和实时聚合酶链反应。其中，Northern 印记和微阵列技术由于缺乏灵敏度和多步操作而在实际应用中受阻。定量PCR在常规的miRNA检测方面有很大的帮助，但其信号扩增需要专门的仪器，也比较麻烦。
现有技术方法尚不能对ERGIC3 mRNA进行快速、有效的检测。
发明内容
本发明的目的在于克服上述背景技术困难，提供一种基于DNA分子检测靶ERGIC3mRNA的方法。
为达到上述目的，采用的技术方案为：
一种基于DNA分子检测ERGIC3 mRNA的方法，包含以下步骤：
针对靶ERGIC3 mRNA，程序化设计和合成检测探针H1、H2作为识别元件，底物探针sub作为报告元件；
先将2.5 μL体积的2μM探针H1、2.5 μL体积的2μM探针H2和5μL体积的2 μM底物探针sub移至扩增系统，再将10-14至10-8浓度的ERGIC3 mRNA加入扩增检测系统，整个反应系统在50μL 1×Nebuffer 2中进行，37℃孵育1小时；
然后用M2光谱进行荧光检测，激发波长为645纳米，记录发射波长范围为655至725纳米；
所述ERGIC3的序列为：GACCAGACAUGAGAAGGUUGCCA；
单碱基错配序列：GACCAUACAUGAGAAGGAUGCCA；
双碱基错配序列：GACCAUACAUGAGAAGGAUGCCA；
非完全错配序列：AAUCGUACUUGAUCCAAUAGUU；
所述探针H1的序列为：
GGAGACTAGTTGCTGGCAACCTTCTCATGTCTGGTCGCAACTAGTCTCCACAACGAAGGTGTTACAG，
所述探针H1的序列为：
GCACATCTTCAGGCTAGCTGGAGACTAGTTGCGACCAGACATGAGAAGGATTATTACCTTCTCATGTCTGGTC
所述底物探针sub的序列为：
QH1-CUGUAACACCUrGrUGAAGAUGUGC-Cy5。
进一步，所述底物探针sub包含荧光基团Cy5和淬灭基团QH1。
进一步，所述50μL 1×Nebuffer 2是指50mM氯化钠，10 mM TrisHCl，10 mM氯化镁，1 mM DTT，pH 7.9。
进一步，所述检测探针H2是用H1互补对应物设计。
进一步，所述探针H1包含两个功能区：一个环区识别元件，一个茎区包含催化核酸亚单位作为信号转导输出元件。
进一步，所述探针H2包含两个功能区：一个与H1互补构成链置换反应放大元件，另一个包含催化核酸亚单位作为信转导输出元件。
采用上述方案的有益效果为：这种基于DNA分子检测ERGIC3 mRNA的方法设计了检测探针H1、H2，在不存在ERGIC3 mRNA的情况下，由于其序列互补区域被各自发卡探针茎部双链封闭，两个亚稳态发夹探针保持折叠并共存，没有荧光信号泄漏；当存在ERGIC3 mRNA的情况下，环区与靶分子识别并进行杂交反应导致H1打开，暴露出与H2结合的互补序列和立足点，并释放出催化核酸一个亚单位；然后，H2通过立足点与H1互补序列逐步杂交并形成H1-H2双链体，该过程伴随导致ERGIC3 mRNA从H1链上释放；释放的ERGIC3 mRNA作为触发链引发了新一轮的链置换反应，形成的H1-H2双链体包含两个亚单位催化核酸，两个亚单位催化核酸在双链组装过程中进行“与”逻辑门运算，从而组装成完整催化核酸，激活切割活性；循环催化自组装反应可以级联激活大量催化核酸，然后脱氧核酶水解荧光标记的底物级联输出荧光信号，进而进行检测。
本发明的检测方法，可以实现对目标靶ERGIC3 mRNA进行简便、快速、灵敏、特异检测。
附图说明
图1为本发明基于DNA分子检测ERGIC3 mRNA的方法的原理设计图。
图2为本发明ERGIC3核酸适配体琼脂糖凝胶电泳图。
图3为本发明灵敏度和线性范围分析图。
图4为本发明检测平台对不同靶标的荧光响应。
具体实施方式
下面结合本发明的具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种基于DNA分子检测ERGIC3 mRNA的方法，包含以下步骤：针对靶ERGIC3 mRNA，程序化设计和合成检测探针H1、H2作为识别元件，底物探针sub作为报告元件；
先将2.5 μL体积的2μM探针H1、2.5 μL体积的2μM探针H2和5μL体积的2 μM底物探针sub移至扩增系统，再将10-14至10-8浓度的ERGIC3 mRNA加入扩增检测系统，整个反应系统在50μL 1×Nebuffer 2中进行，37℃孵育1小时；然后用M2光谱进行荧光检测，激发波长为645纳米，记录发射波长范围为655至725纳米。
所述ERGIC3的序列为：GACCAGACAUGAGAAGGUUGCCA；
单碱基错配序列：GACCAUACAUGAGAAGGAUGCCA；
双碱基错配序列：GACCAUACAUGAGAAGGAUGCCA；
非完全错配序列：AAUCGUACUUGAUCCAAUAGUU；
所述探针H1的序列为：
GGAGACTAGTTGCTGGCAACCTTCTCATGTCTGGTCGCAACTAGTCTCCACAACGAAGGTGTTACAG，
所述探针H1的序列为：
GCACATCTTCAGGCTAGCTGGAGACTAGTTGCGACCAGACATGAGAAGGATTATTACCTTCTCATGTCTGGTC
所述底物探针sub的序列为：
QH1-CUGUAACACCUrGrUGAAGAUGUGC-Cy5。
进一步，所述底物探针sub包含荧光基团Cy5和淬灭基团QH1。所述50μL 1×Nebuffer 2是指50mM氯化钠，10 mM TrisHCl，10 mM氯化镁，1 mM DTT，pH 7.9。所述检测探针H2是用H1互补对应物设计。所述探针H1包含两个功能区：一个环区识别元件，一个茎区包含催化核酸亚单位作为信号转导输出元件。所述探针H2包含两个功能区：一个与H1互补构成链置换反应放大元件，另一个包含催化核酸亚单位作为信转导输出元件。
这种基于DNA分子检测ERGIC3 mRNA的方法设计了检测探针H1、H2，在不存在ERGIC3 mRNA的情况下，由于其序列互补区域被各自发卡探针茎部双链封闭，两个亚稳态发夹探针保持折叠并共存，没有荧光信号泄漏；当存在ERGIC3 mRNA的情况下，环区与靶分子识别并进行杂交反应导致H1打开，暴露出与H2结合的互补序列和立足点，并释放出催化核酸一个亚单位；然后，H2通过立足点与H1互补序列逐步杂交并形成H1-H2双链体，该过程伴随导致ERGIC3 mRNA从H1链上释放；释放的ERGIC3 mRNA作为触发链引发了新一轮的链置换反应，形成的H1-H2双链体包含两个亚单位催化核酸，两个亚单位催化核酸在双链组装过程中进行“与”逻辑门运算，从而组装成完整催化核酸，激活切割活性；循环催化自组装反应可以级联激活大量催化核酸，然后脱氧核酶水解荧光标记的底物级联输出荧光信号，进而进行检测。可以实现对目标靶ERGIC3 mRNA进行简便、快速、灵敏、特异检测。
实施例1
如图1为本发明基于DNA分子检测ERGIC3 mRNA的方法的原理设计图。
（1）核酸检测的可行性验证结果：
琼脂糖凝胶（3%）电泳验证邻位催化发卡自组装反应，结果如图1所示。泳道8为500bp DNA marker（Takara），以作为电泳的分子量参考对照。泳道5、6和7分别为H1、H2探针和ERGIC3单独存在体系对应条带。泳道4为ERGIC3+H1反应体系电泳条带，可见一条相对于泳道6、7的一个滞后条带，这是由于ERGIC3+H1组装形成大分子量DNA杂交体，从而导致电泳移动速率减慢。但从泳道3可以看到ERGIC3和H2不能形成DNA杂交体即不反应。泳道2为组装链ERGIC3+H1+H2反应体系电泳条带，与ERGIC3+H1组装杂交体相比，条带进一步后置，这是由于ERGIC3+H1+H2组装形成更大分子量DNA杂交体，从而导致电泳移动速率进一步减慢。该结果提示，邻位触及催化发卡自组装程序化反应按照设计原理进行。
（2）灵敏度和线性范围结果：
ERGIC3的浓度分别在1×10-14、1×10-13、1×10-12、1×10-11、1×10-10、1×10-9、1×10-8 mol/L下的信号图谱。在645纳米的激发波长下，从655至725纳米获得荧光，发射峰在665纳米左右。在1×10-14 mol/L至1×10-8 mol/L间浓度值的对数与荧光信号值呈线性相关，荧光强度随着浓度的升高而相应地增加,方程为Y=97.3+5.7log10C (R2=0.9987)。根据6次空白实验信号值的均数+3倍标准差原则（MeanBlank+3δ），最低检测限计算为2.75 fM（图2）,结果表明该研究设计对ERGIC3浓度测量有很强的灵敏度。
（3）荧光传感检测新技术特异性结果：
ERCIG3（a）、单碱基配对（b）、双碱基配对（c）、非完全错配分别进行特异性分析（d）、空白（e），荧光信号值分别为a=38，b=18，c=14， d=13，e=13。与空白（e）电化学信号相比，不同靶序列所对应的c、d荧光信号值无显著变化，表明双碱基配对（c）同源序列和非完全错配（d）序列不能引发邻位触及催化发卡自组装，检测新技术具有高特异性。单碱基错配同源序列所对应信号（b）与空白信号（e）相比时，信号略有升高（e），但与靶ERGIC3所对应荧光信号（a）相比信号显著减小，表明检测新技术具有单碱基错配区分能力。图3结果表明本技术发明所设计构建电化学传感检测新技术具有单碱基错配区分能力，具有高特异性。
7. 实验方法
（1）生物探针，具体序列如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
（2）试剂及仪器
DNA琼脂糖凝胶电泳验证装配过程，进行凝胶电泳和琼脂糖凝胶(3%)在0.5×TBE缓冲液中(0.5×TBE是经过5×稀释10倍得到，其中5×TBE由54g Tris-HCl，27.5g硼酸，3.72gEDTA配制, pH值7.9)80 V 20分钟，然后用ChemiDoc MP成像系统对凝胶进行成像。
对于ERGIC3分析，首先将2.5 μL/μM发夹探针H1、2.5 μL/μM发夹探针H2和5μL/μM荧光底物移至扩增系统。然后，将10-14至10-8的不同浓度的mRNA加入到混合溶液中。整个反应系统在50μL 1×Nebuffer 2(50mM氯化钠，10 mM TrisHCl，10 mM氯化镁，1 mM DTT，pH7.9)中进行，并在37℃孵育1小时。该孵育过程产生大量脱氧核酶。然后脱氧核糖核酸酶水解荧光底物，实现信号转换。将所得溶液转移到石英比色皿中，然后用M2光谱进行荧光检测。光谱记录在655至725纳米范围内，激发波长为645纳米，光电倍增管设置在自动模式。测量在室温下进行。所有反应分6次进行，没有ERGIC3 mRNA的分析系统用作空白对照。
8. 实验结果
（1） ERGIC3核酸适配体琼脂糖凝胶电泳验证结果
琼脂糖凝胶（3%）电泳验证邻位催化发卡自组装反应，结果如图1所示。泳道8为500bp DNA marker（Takara），以作为电泳的分子量参考对照。泳道5、6和7分别为H1、H2探针和ERGIC3单独存在体系对应条带。泳道4为ERGIC3+H1反应体系电泳条带，可见一条相对于泳道6、7的一个滞后条带，这是由于ERGIC3+H1组装形成大分子量DNA杂交体，从而导致电泳移动速率减慢。但从泳道3可以看到ERGIC3和H2不能形成DNA杂交体即不反应。泳道2为组装链ERGIC3+H1+H2反应体系电泳条带，与ERGIC3+H1组装杂交体相比，条带进一步后置，这是由于ERGIC3+H1+H2组装形成更大分子量DNA杂交体，从而导致电泳移动速率进一步减慢。该结果提示，邻位触及催化发卡自组装程序化反应按照设计原理进行。
如图2为本发明ERGIC3核酸适配体琼脂糖凝胶电泳图。（泳道1：H1 + H2，泳道2：ERGIC3 + H1 + H2，泳道3：ERGIC3+H2，泳道4：ERGIC3+H1，泳道5 ：ERGIC3，泳道6 ：H2，泳道7：H1，泳道8：500bpDNA marker）
（2） ERGIC3浓度荧光检测灵敏度及线性范围分析结果
ERGIC3的浓度分别在1×10-14、1×10-13、1×10-12、1×10-11、1×10-10、1×10-9、1×10-8 mol/L下的信号图谱。在645纳米的激发波长下，从655至725纳米获得荧光，发射峰在665纳米左右。在1×10-14 mol/L至1×10-8 mol/L间浓度值的对数与荧光信号值呈线性相关，荧光强度随着浓度的升高而相应地增加,方程为Y=97.3+5.7log10C (R2=0.9987)。根据6次空白实验信号值的均数+3倍标准差原则（MeanBlank+3δ），最低检测限计算为2.75 fM（图2）,结果表明该研究设计对ERGIC3浓度测量有很强的灵敏度。
如图3为本发明灵敏度和线性范围分析图。
（3）ERGIC3特异性荧光电化学信号结果
ERCIG3（a）、单碱基错配（b）、双碱基错配（c）、非完全错配分别进行特异性分析（d）、空白（e），荧光信号值分别为a=38，b=18，c=14， d=13，e=13。与空白（e）荧光信号相比，不同靶序列所对应的电流曲线c、d荧光信号值无显著变化，表明双碱基配对（c）同源序列和非完全错配（d）序列不能引发邻位触及催化发卡自组装，检测新技术具有高特异性。单碱基错配同源序列所对应信号（b）与空白信号（e）相比时，信号略有升高（e），但与靶ERGIC3所对应电流信号（a）相比信号显著减小，表明检测新技术具有单碱基错配区分能力。图3结果表明本技术发明所设计构建荧光检测新技术具有单碱基错配区分能力，具有高特异性。
如图4为本发明检测平台对不同靶标的荧光响应。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (2)

1.一种基于DNA分子检测ERGIC3 mRNA的方法，所述方法为非疾病的诊断和治疗目的，其特征是，包含以下步骤：
针对靶ERGIC3 mRNA，程序化设计和合成检测探针H1、H2作为识别元件，底物探针sub作为报告元件；
先将2.5 μL体积的2μM探针H1、2.5 μL体积的2μM探针H2和5μL体积的2 μM底物探针sub移至扩增系统，再将10-14至10-8浓度的ERGIC3 mRNA加入扩增检测系统，整个反应系统在50μL 1×Nebuffer 2中进行，37℃孵育1小时；
然后用M2光谱进行荧光检测，激发波长为645纳米，记录发射波长范围为655至725纳米；
所述ERGIC3的序列为：GACCAGACAUGAGAAGGUUGCCA；
所述探针H1的序列为：
GGAGACTAGTTGCTGGCAACCTTCTCATGTCTGGTCGCAACTAGTCTCCACAACGAAGGTGTTACAG，
所述探针H2的序列为：
GCACATCTTCAGGCTAGCTGGAGACTAGTTGCGACCAGACATGAGAAGGATTATTACCTTCTCATGTCTGGTC
所述底物探针sub的序列为：
QH1-CUGUAACACCUrGrUGAAGAUGUGC-Cy5。
2.根据权利要求1所述的基于DNA分子检测ERGIC3 mRNA的方法，其特征是：所述50μL 1×Nebuffer 2的pH为7.9，由以下成分组成：50mM氯化钠，10 mMTrisHCl，10 mM氯化镁，1 mMDTT。
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