WO1998015639A1 - Procede de preparation de compositions pour le transfert d'acides nucleiques - Google Patents

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WO1998015639A1
WO1998015639A1 PCT/FR1997/001747 FR9701747W WO9815639A1 WO 1998015639 A1 WO1998015639 A1 WO 1998015639A1 FR 9701747 W FR9701747 W FR 9701747W WO 9815639 A1 WO9815639 A1 WO 9815639A1
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compaction
maturation
lipid
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cationic lipid
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PCT/FR1997/001747
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Tsiala Boukhnikachvili
Joël Vacus
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Rhone-Poulenc Rorer S.A.
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    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle

Definitions

  • the present invention relates to a process for the preparation of compositions for the transfer of nucleic acids.
  • the compositions obtained can be used for the transfer of nucleic acids into cells in vitro, ex vivo or in vivo.
  • viral vectors mention may be made, for example, of retroviruses, adenoviruses, AAVs, herpes viruses, baculoviruses, etc.
  • the transfer efficiency obtained with viral vectors is generally very good.
  • their construction and production are difficult, the cloning capacity of these vectors is sometimes limited, and their use can in certain cases have certain drawbacks inherent in the use of viruses (dissemination, pathogenicity, etc.).
  • Electroporation involves applying an electric field to a suspension of cells containing DNA.
  • this technique gives in some cases good results, it is difficult to optimize because of the risk of irreversible damage to the cell membrane.
  • particles gold, tungsten
  • This method is however promising mainly for walled cells, such as plant cells.
  • the coprecipitation of DNA with certain polymers (DEAE-dextran) or calcium phosphate has the drawback of being not very reproducible and sometimes cytotoxic.
  • cationic lipids have interesting properties. These vectors consist of a polar cationic part allowing the condensation of nucleic acids and a hydrophobic lipid part stabilizing the ionic interaction. An excess of lipid, due to the ionization of its polar part, would also promote interaction with the cell membrane.
  • cationic lipids are in particular lipopolylysine, monocationic lipids (DOTMA:
  • the lipid film thus obtained is taken up in deionized water [Hui 96], [Felgner 87].
  • the mixture is then vortexed to resuspend the lipid and sonicated in a sonication bath for 10 minutes until clarification of the suspension which can then be diluted.
  • the compaction is carried out immediately before addition to the cells and left for 4 hours at 37 ° C. in an F10 culture medium. Variants of this technique can be encountered. For example after dissolution with chloroform and drying, the film can be taken up in a 20 mM NaCl solution [Guershon 93] or 20 mM Hepes buffer [Gao 91].
  • the suspension is generally vortexed (immediately after resumption of the film or after a 24-hour hydration phase at 4 ° C [Gao 91]) and sonicated for variable times.
  • the sonication operation itself has variations since some authors use titanium sonication probes [Gustafsson 1995].
  • the method of preparation consisting of the formation of a film by dissolution with chloroform, evaporation, drying, recovery by an aqueous medium and sonication is also frequently encountered for the manufacture of liposomes composed of a neutral lipid associated with a cationic surfactant [ Pinnaduwage 89],
  • Another method of preparation consists in directly diluting the commercial lipids (in ethanolic solution, aqueous suspension or liposomal formulation) in MEM culture medium. After identical dilution of the DNA, the two components are mixed by inversion and the suspension is left at room temperature for 15 to 30 minutes. Then a further dilution is made before contacting the cells for 6 hours [Fasbender 95].
  • Commercial lipid and DNA can also be simply diluted separately in distilled water before placing in contact by simple shaking and possible incubation at room temperature for 15 minutes [Bringham 89].
  • the initial form of the lipid is an ethanolic solution of variable concentration which is diluted extemporaneously in culture medium just before contact with DNA [Behr 89].
  • the ethanolic solution can also be diluted in other media (water, NaCl at various concentrations) immediately or 10 minutes before compaction. At the end of the compaction and a possible wait of 10 minutes, a new dilution can take place in a medium of variable ionic composition. The transfection is carried out after a time of 0 or 10 minutes after the last dilution [Barthel 93].
  • the ethanolic solution can also be introduced directly into the aqueous suspension containing the DNA and the mixture can subsequently undergo sonication in a bath [Demeneix 91].
  • the preparation of cationic liposomes can also be carried out by rehydration of the lipid film followed by successive extrusions through polycarbonate membranes of calibrated porosity [Duzg ⁇ nes 89] or microfluidization [Sternberg 94].
  • This process derives more particularly from the characterization by the applicant of the physicochemical properties of the lipid vectors.
  • the Applicant has thus shown that, depending on the conditions, these vectors exist in different physicochemical states (micellar form, form of mature aggregates, etc.).
  • the Applicant has made it possible more particularly to characterize the different physicochemical states of the lipid vectors, it has also highlighted means making it possible to control the passage between these different states, and to stop maturation in defined states, conducive to complexation with l And cell transfection.
  • the present invention thus describes a reproducible process allowing the preparation at industrial level of characterized and calibrated transfecting compositions.
  • a first subject of the invention relates to a process for the preparation of a composition for the transfer of nucleic acids comprising bringing a nucleic acid into contact with a cationic lipid, characterized in that, prior to placing contact, the cationic lipid is subjected to a heating step.
  • the Applicant has studied the physicochemical characteristics of the various cationic lipids.
  • the results obtained show that, according to the ionic strength of the medium, depending on the pH of the medium or even depending on the temperature, cationic lipids exist in different physical states.
  • the examples presented below describe in particular phase diagrams of different cationic lipids (lipospermins, lipothermins) as well as a study of the optical density as a function of pH and temperature, which clearly show different physicochemical states depending on the conditions. .
  • the Applicant has now shown that these different states have different DNA compaction and cell transfection properties, and that it is advantageous to have a method allowing reproducible control of access to these different states.
  • the method according to the invention notably involving the heating of the lipid suspension, has the advantage of a simple method which is easily transposable to the constraints of industrial exploitation. It also allows, by controlling the organizational kinetics, the control of the structure adopted by the lipid before and after it is brought into contact with DNA.
  • the process of the invention also allows standardization of the preparation methodology, essential on an industrial scale.
  • the preliminary step consists in heating the cationic lipid until the formation of a micellar solution.
  • the lipid vector is heated to a temperature higher than its phase transition temperature.
  • the phase transition temperature corresponds to the temperature at which the lipid chains melt. This temperature can be determined, for each lipid vector, by techniques known to those skilled in the art. In particular, it is possible to use the Differential Thermal Analysis method (or DSC: "Differential Scanning Calorimetry") using for example the DSC4 device (Perkin Elmer) following the manufacturer's recommendations, as illustrated in the examples.
  • DSC Differential Thermal Analysis method
  • the process of the invention is applicable to any type of cationic lipid. It is particularly suitable for the preparation of lipopolyamines.
  • the lipopolyamines are amphiphilic molecules comprising at least one hydrophilic polyamine region and one lipophilic region covalently linked together by a chemical arm.
  • the polyamine region corresponds to the general formula H2N - (- (CH) m -NH-)
  • m is between 2 and 6 inclusive and I is between 1 and 5 inclusive.
  • the polyamine region is represented by spermine or by thermine, or by an analog having retained its DNA binding properties.
  • the lipophilic region can be one or more hydrocarbon chains, saturated or not, cholesterol, a natural lipid or a synthetic lipid capable of forming lamellar or hexagonal phases.
  • the lipophilic region comprises two hydrocarbon chains.
  • cationic lipid can be combined with lipid adjuvants, as indicated below.
  • cationic lipids are in particular lipospermins, in particular dioctadecylamidoglycyl spermine (DOGS) or 5-carboxyspermylamide of palmitoylphosphatidylethanolamine (DPPES), the preparation of which has been described, for example, in patent application EP 394 111.
  • DOGS dioctadecylamidoglycyl spermine
  • DPES 5-carboxyspermylamide of palmitoylphosphatidylethanolamine
  • Another preferred family consists of lipothermins, among which there may be mentioned more particularly RPR120531 and RPR120535 (FR95 / 13490, WO96 / 17823 incorporated herein by reference). The structure of these compounds is shown in Figure 1.
  • the lipid in the form of crystalline powder or film, is taken up in pure water or a saline medium whose pH is optionally adjusted.
  • the homogenization is carried out by heating above the transition temperature of the lipid, ie the temperature from which the aliphatic chains melt.
  • this phase transition temperature can be determined by differential thermal analysis. In the case of DOGS for example, it is 38 ° C in water at pH 7.5, and it is 44 ° C at a pH of 8.8. No transition is observed in pure water at acid pH: the lipid is in micellar form whatever the temperature.
  • the phase transition temperature is also a function of the ionic strength of the medium.
  • the temperature of DOGS in a NaCl solution is 44.4 ° C at acid pH, 42 ° C at pH 7.5 and 39.8 ° C at pH 9.9.
  • This transition temperature is of course variable from one lipid to another (see the examples).
  • the phase transition temperature as determined by DSC and turbidimetry is 51.5 ° C (powder) and 30 ° C (hydrated, pH 7.5).
  • RPR120535 it is around 43 ° C (hydrated, pH 7.5).
  • Heating can be obtained in a water bath, by direct heating, or by any means which makes it possible to raise the temperature. It allows the formation of a micellar solution characterized by the clarification of the suspension, if the pH conditions allow it.
  • the presence of micelles has been demonstrated by techniques such as turbidimetry, scattering / diffraction of X-rays at small angles and by transmission electron microscopy.
  • compositions obtained allow the transfection of cells independently of the presence of serum.
  • serum fetal calf serum for example
  • cationic lipids in vitro, ex vivo or in vivo.
  • results presented in the examples show that the process of the invention can make it possible, by prior heating of the lipid, to improve the transfection efficiency in the presence of serum.
  • the compositions according to the invention have also a good transfection efficiency in the presence and in the absence of serum.
  • the nucleic acid can be brought into contact with the lipid solution directly after obtaining the micellar solution, and the obtained nucleolipid complex used directly for cell transfection.
  • the advantage of such compositions lies in particular in their homogeneous, defined and reproducible nature.
  • the applicant has also shown that to further improve the properties of the compositions, in particular the transfection properties, it is advantageous to proceed with a maturation of the cationic lipid. before contacting with the nucleic acid (pre-compaction maturation) and / or of the nucleolipid complex after contacting (post-compaction maturation).
  • the maturation of the lipid / complex makes it possible to reorganize the cationic lipid in terms of its structure and in terms of its size.
  • the Applicant has indeed shown that a lipid in micellar solution as obtained during the first step of the process of the invention can evolve to form organized bodies of different size and structure.
  • the Applicant has also shown that the state of organization of the cationic lipid has an influence on its capacity to complex (or compact) nucleic acids, as well as on its transfection properties.
  • a method of the invention further comprises, between the heating step and the bringing into contact, a pre-compaction maturing step of the lipid vector.
  • a method of the invention further comprises, after contacting, a step of post-compaction maturation of the nucleolipid complex.
  • micellar solution it is possible, by promoting the interactions between the different lipid molecules and the supramolecular reorganization, to form different organized bodies.
  • the examples presented below show in particular that the cationic lipids pass through unexpected organized states of the lamellar, tubular or vermicular type. When the concentration is increased, states of size more important appear, such as columnar or hexagonal states. These different structures have different properties.
  • a pre-compaction maturation step is advantageously carried out.
  • This step is advantageously carried out until the appearance of organized aggregates of the lamellar, tubular, vermicular, columnar and / or hexagonal type. More preferably, this step is carried out until the appearance of organized aggregates of the lamellar, tubular and / or vermicular type.
  • This type of body has an original structure, which is particularly conducive to complexation with nucleic acids.
  • Maturation can be carried out by any means making it possible to increase the interactions between the cationic lipid molecules, or to promote intramolecular reorganization.
  • the maturation is advantageously carried out by decreasing the temperature, increasing the pH of the medium and / or increasing the ionic strength of the medium.
  • FIG. 2 show the clear evolution of the optical density of a lipid solution, reflecting the internal architecture of said lipid, as a function of the temperature of the medium.
  • the results presented in Figures 4 and 5 show the effect of pH and ionic strength on the state of organization of the lipid.
  • the photos presented in Figure 3 illustrate the different bodies highlighted.
  • the pre-compaction maturation is carried out by reducing the temperature. Even more preferably, it is carried out by incubation of the solution at room temperature. This allows a gradual and slow maturation (aggregation and reorganization) kinetics, conducive to compaction with nucleic acids. Maturation can be continued for a variable period depending on the lipid and according to the pH and ionic strength conditions. The examples below show that this maturation can be carried out over a period ranging from a few hours to 1 month.
  • the duration of the pre-compaction maturation is determined in particular by the appearance of structured bodies of the lamellar, tubular or vermicular type. However, if the pH and / or the ionic strength during the condensation stage are sufficiently high, and / or if a post-compaction maturation is carried out, it is advantageous not to carry out a pre-compaction maturation. .
  • the micellar form of the lipid makes it possible in this case to obtain nucleolipid complexes which are smaller and more homogeneous in size, more effective for transfection in the presence or in the absence of serum.
  • Maturation can also be carried out by increasing the ionic strength of the medium.
  • a solution close to isotonia is used (0.15 M), that is to say an ionic strength of between 0.05 and 0.2 M.
  • Different salts can be used (NaCl; KN03, Kl , etc).
  • the pH is of course adjusted by the skilled person as a function of the pK lipid vectors used and the lipid phase diagram.
  • An advantageous pH zone is that at which at least 30% of the amines of the cationic vector are deprotonated, preferably at least 40%.
  • the pre-compaction maturation is carried out by decreasing the temperature below the phase transition temperature of the lipid. This decrease may be accompanied by changes in pH and ionic strength, either during maturation or during the compaction itself.
  • a suspension of DOGS in 150 mM NaCl at pH 7.5 is composed: - essentially of spherical micelles, immediately after heating to approximately 50 ° C. (FIG. 3A),
  • the same suspension is composed of spherical micelles and vermicles one day after heating and cooling to room temperature.
  • a suspension of DOGS is composed: - only of spherical micelles, immediately after heating,
  • the lipid is brought into contact with the nucleic acid.
  • the nucleic acid can be DNA or RNA. It may be a linear or circular DNA, supercoiled or relaxed, of the plasmid type or not, carrying different genetic elements (coding phase, promoters, terminators, link sites, origins of replication, etc.).
  • the nucleic acid can be of various origins (human, animal, lower eukaryote, proceryote, plant, viral, phage, etc.). It can also be a synthetic or semi-synthetic nucleic acid.
  • the size of the nucleic acid can be very variable (from the oligonucleotide to the complete genome). The advantage of the compositions of the invention also lies in their application to the transfer of nucleic acids of any size.
  • the nucleic acid is DNA (for example a plasmid or a DNA fragment) carrying an expression cassette for a particular protein or RNA. It can be a therapeutic or food-processing protein (enzyme, amino acid, etc.), with a view to producing said protein or said RNA in vitro, ex vivo or in vivo.
  • the nucleic acid used can be a mixture of different nucleic acids, having different properties.
  • the nucleic acid can be prepared by all the techniques known to those skilled in the art (bank screening, artificial synthesis, mixed methods, etc.). For contacting (compaction), the nucleic acid (the nucleic acid composition) is dissolved in an aqueous medium.
  • composition, ionic strength and pH of this medium can be adjusted to improve the efficiency of the compaction and the transfer properties of the final compositions.
  • a compaction carried out in a medium where the lipid could be in the micellar state during its contact with DNA that is to say in a medium of very low ionic strength and / or low pH
  • the compaction is carried out in a saline medium, in a pH zone of between 4 and 10.
  • the optimal conditions depend on the lipid and in particular on its ability to adopt, in the presence of nucleic acid, phases lamellar type.
  • the compaction is carried out in a medium with a pH of between 6 and 9. Concerning the salinity of the medium, it is advantageously between 0 and 2M, preferably between 0.01 and 0.5M, even more preferably between 0.05 and 0 , 2M.
  • An advantageous medium for compaction is a medium close to isotonia (0.15 M), the pH of which is between 6 and 9. These conditions can be those of the lipid heating medium or those of the precompaction maturation. Under these conditions, compaction can take place without modifying the medium.
  • the composition of the medium is different, it is advantageous to adjust the composition of the medium as indicated above.
  • the results presented in the examples indeed show that, under these conditions, it is possible to obtain compositions having particularly unexpected and advantageous transfection properties.
  • compositions which are insensitive to the inhibitory effect by serum which is particularly advantageous for vitro (SVF) or vivo uses.
  • the respective amounts and concentrations of nucleic acid and lipid may vary. These quantities and concentrations are those described in the prior art for the use of these vectors.
  • the respective amounts of nucleic acid and lipid used are determined by the ratio of positive charges of the lipid and negative charges of the nucleic acid.
  • This charge ratio can vary within a range of 0.01 to 100, and can be adapted by those skilled in the art, depending on the lipid selected, the nucleic acid selected, and depending on whether the use is of the type in vitro or in vivo.
  • it is between 0.01 and 20.
  • the nucleolipid complex thus obtained can be used as it is for transfection. It can also be subjected to a so-called "post-compaction" maturation, making it possible to optimize the structural organization of the complex with a view to improving its transfer properties. Indeed, the states of organization of the lipids allowing a good compaction with the nucleic acid are not necessarily those giving the best levels of transfection. Thus, it is advantageous to carry out a post-compaction maturation until the appearance of organized aggregates of the lamellar, columnar and / or hexagonal type. When such aggregates are initiated during compaction, it may be advantageous to carry out post-compaction maturation to homogenize the composition.
  • the conditions and the means of post-compaction maturation are similar to those of pre-compaction maturation. The duration of this maturation is adapted by a person skilled in the art as a function of the pre-compaction maturation, and of the lipid vector.
  • compositions obtained can be used extemporaneously for the transfer of nucleic acids. They can also be stored and preserved, for example in lyophilized or frozen form, for later use. As indicated above, the compositions of the invention have numerous advantages for industrial use. They are calibrated, homogeneous, reproducible, stable and offer high transfer powers.
  • An object of the invention resides in particular in a composition for the transfer of nucleic acids comprising a nucleic acid complexed with a cationic lipid, characterized in that the transfer efficiency is practically not altered by the presence of serum and in that it can be obtained by the process described above.
  • the composition preferably comprises, as cationic lipid, a lipopolyamine. Even more preferably, it is a lipothermin or a lipospermin, preferably having 2 fatty chains. Furthermore, certain adjuvants can be added to the compositions, and in particular lipid adjuvants. More preferably, the lipid adjuvants are neutral lipids having 2 fatty chains.
  • natural or synthetic lipids are used, zwitterionic or devoid of ionic charge under physiological conditions. They can be chosen more particularly from dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), oleoyl-palmitoylphosphatidylethanolamine (POPE), di-stearoyl, -palmitoyl, -mirystoyl phosphatidylethanolamine as well as their N-methyl derivative 1 to 3 times; phosphatidylglycerols, diacylglycerols, glycosyldiacylglycerols, cerebrosides (such as in particular galactocerebrosides), sphingolipids (such as in particular sphingomyelins), cholesterol or also asialogangliosides (such as in particular asialoGMI and GM2).
  • DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
  • POPE oleoyl-palmitoylphosphatidy
  • lipids can be obtained either by synthesis or by extraction from organs (example: the brain) or eggs, by conventional techniques well known to those skilled in the art.
  • extraction of natural lipids can be carried out using organic solvents (see also Lehninger, Biochemistry).
  • compositions of the invention comprise, in addition to the cationic lipid, from 0.1 to 20 molar equivalents of neutral lipid per 1 molar equivalent of phosphate of the nucleic acid, and, more preferably, from 1 to 5.
  • the compositions of the present invention comprise a targeting element making it possible to direct the transfer of the nucleic acid.
  • This targeting element can be an extracellular targeting element, making it possible to direct the transfer of nucleic acid to certain cell types or certain desired tissues (tumor cells, hepatic cells, hematopoietic cells, etc.).
  • the targeting element can also be an intracellular targeting element, making it possible to direct the transfer of the nucleic acid towards certain privileged cellular compartments (mitochondria, nucleus, etc.). More preferably, the targeting element is linked, covalently or non-covalently, to the lipid.
  • the bond can in particular be obtained by ionic interaction with ammoniums, or by nucleophilic attack of the amines of the vector on targeting elements comprising a nucleofuge group (halogen, tosylate, etc.), an activated ester (hydroxysuccinimide, etc.) or an isothiocyanate .
  • the targeting element can also be linked to the nucleic acid.
  • sugars which can be used in the context of the invention, there may be mentioned sugars, peptides, oligonucleotides or lipids.
  • these are sugars and / or peptides such as antibodies or antibody fragments, ligands of cellular receptors or fragments thereof, receptors or fragments of receptors, etc.
  • they may be ligands for growth factor receptors, cytokine receptors, cellular lectin receptors or adhesion protein receptors. Mention may also be made of the receptor for transferin, HDL and LDL.
  • the targeting element can also be a sugar making it possible to target the asialoglycoprotein receptors, or alternatively a Fab fragment of antibodies making it possible to target the receptor for the Fc fragment of the immunoglobulins.
  • the transfecting compositions described can be used for the transfer of nucleic acids in vitro, ex vivo or in vivo.
  • they can be formulated for administration topically, skin, oral, rectal, vaginal, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc.
  • they Preferably, they contain a pharmaceutically acceptable vehicle for an injectable formulation, in particular for a direct injection into the desired organ, or for topical administration (on the skin and / or mucosa).
  • nucleic acid used for the injection may in particular be sterile, isotonic solutions, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition as appropriate of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
  • the doses of nucleic acid used for the injection as well as the number of administrations can be adapted according to different parameters, and in particular according to the mode of administration used, the pathology concerned, the gene to be expressed, or even the duration of the treatment sought.
  • another subject of the invention relates to a process for the transfer of nucleic acid into cells in vitro, in vivo or ex vivo comprising bringing said nucleic acid into contact with a suspension of cationic lipid previously heated, and incubating the cells with the resulting nucleolipid complex.
  • the cationic lipid suspension is previously heated and matured.
  • the nucleolipid complex is mature prior to incubation with the cells.
  • Incubation with cells can be done in vitro, on an appropriate support (culture dish, pouch, flask, etc.) possibly under sterile conditions.
  • the quantities of DNA incubated are known to a person skilled in the art (of the order of micrograms for 10 6 cells).
  • the incubation can be carried out by administration of the composition in vivo (local or systemic for example).
  • Figures 1 Chemical structures of cationic lipids.
  • 1A DOGS
  • 1 B RPR 120531
  • 1C RPR 120535.
  • Figure 2 Influence of temperature on the optical density at 400 nm of a suspension of DOGS at 1 mM in NaCl.
  • Figures 3 Cryo-microscopy images in transmission of a suspension of DOGS at 2 mM in NaCl at pH 7.5.
  • the sample preparation was carried out immediately after heating (3A), 3 hours (3B), 1 week (3C) and 1 month (3D) after heating the suspension and cooling to room temperature.
  • Figure 4 Influence of pH on the optical density at 400 nm of a suspension of DOGS at 0.6 mM in water or in NaCl at 150 mM. Study temperature: 50 ° C.
  • Figures 5 Phase diagrams of DOGS (5A: water; 5B: 150 mM NaCI), RPR120531 (5C: water; 5D: 150 mM NaCI) and RPR120535 (5E: water; 5F: 150 mM NaCI).
  • FIG. 6 Transfecting power of the compositions of Example 5
  • Figure 7 Transfecting power of the compositions of Example 6
  • Figure 8 Transfecting power of the compositions of Example 7
  • Figure 9 Transfecting power of the compositions of Example 8
  • Figure 10 Transfecting power of the compositions of Example 9
  • Figure 11 Transfecting power of the compositions of Example 10
  • Figure 12 Transfecting power of the compositions of Example 11
  • the plasmid used in the following examples is a ColE1 derivative carrying the Kanamycin resistance gene, and the cer fragment of CoIEL
  • the eukaryotic expression cassette contains the CMV promoter of the plasmid pCDNA3 controlling the gene coding for luciferase (Photinu Pyralis). It is understood that any other nucleic acid can be used.
  • the cationic lipids used in the following examples are DOGS, RPR120531 and RPR120535, the structure of which is shown in FIG. 1. It is understood that the same experiments can be carried out with other cationic lipids.
  • the cells used are murine NIH 3T3 fibroblasts, seeded the previous day in 24-well plates, at a density of 50,000 cells per well.
  • the culture medium used is DMEM medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium), containing 4.5 g / 1 of glucose, supplemented with 10% fetal calf serum, 1% L-glutamine (200 mM mother solution) , 1% sodium pyruvate, streptomycin (5000 IU / ml) and penicillin (5000 ⁇ g / ml) (Gibco). Prior to transfection, the cells are rinsed twice with DMEM not containing fetal calf serum.
  • the cells are transfected with 50 ⁇ l of a transfection suspension containing 0.5 ⁇ g of DNA and 3 nmoles of DOGS per well, in
  • Luciferase catalyzes the oxidation of luciferin, in the presence of ATP, Mg2 + and O2, with concomitant production of a photon.
  • the total light emission, measured by a luminometer, is proportional to the luciferase activity of the sample.
  • the reagents used are supplied by Promega (Luciferase assay System) and used according to a recommended protocol. After double rinsing the cells with PBS, the cells are lysed with 250 ⁇ l of lysis buffer and the insoluble fraction of each extract is removed by centrifugation. The assay is carried out on 5 ⁇ l of supernatant, diluted or not in the cell lysis buffer.
  • Example 1 Influence of temperature on the molecular organization of cationic lipids.
  • a colloidal solution of DOGS at 1 mM was prepared by dissolving the DOGS crystallized in chloroform, evaporation of the solvent and drying in a lyophilizer. The film was then taken up in a 0.9% NaCl solution (buffer 10 mM Hepes, pH 7.4). After heating to 50 ° C, the colloidal solution was placed at 4 ° C for one week. The optical density is continuously monitored (Lambda 2 spectrophotometer (Perkin Elmer) with thermostat-controlled cell holder), while the bath temperature (LAUDA RM6), itself connected to the spectrophotometer cells, varies at a determined and controlled speed. 1.25 ° C / min. The tank containing the sample is equipped with a stirring system.
  • a colloidal solution of DOGS at 1 mM was prepared by dissolving the DOGS crystallized in chloroform, evaporation of the solvent and drying in a lyophilizer. The film was then taken up in a 150 mM NaCl solution or in water, in a pH range from 3.0 to 11.0. After heating to 50 ° C, the suspensions are placed at room temperature (25 ° C) at least 3 hours before the start of the measurement. The optical density is determined under the conditions described in Example 1.
  • phase diagrams were drawn for different lipid vectors. These diagrams describe the physical state of the lipids according to the conditions of pH, ionic strength and temperature. They also highlight the phase transition temperatures and the aggregative behavior of the lipid as a function of its ionization state.
  • FIGS. 5A and 5B show that, in the case where the lipid is solubilized in pure water (pH ⁇ 6) the micellar solution obtained by heating according to the invention is stable. They allow also to define the ionic strength and pH conditions for which the micellar solution is stable over time.
  • Example 4 Study of different counterions in the background electrolyte.
  • the nanometric structures are of the micellar type and we observe some rare marked edges.
  • Submicron structures are fine filaments with a strong aggregative tendency.
  • the nanometric structures appear under the aspect of superposition of lamellae whose edges appear very marked.
  • the submicron structures also appear in the form of filaments but whose thickness is greater and with less strong aggregative tendency.
  • the lipid (DOGS) is presented to the DNA in the form of a 2 mM suspension in 150 mM NaCl at native pH (3.5) heated and left at room temperature 1 day before contact with the DNA (" 1 day pre-maturation ").
  • the lipid is introduced into a suspension containing the plasmid pXL2784 and composed of 150 mM NaCl adjusted to a pH of 5 - 6.6 or 8.2 (these pHs are measured values).
  • the "post-compaction maturation” is 0 or 3 hours at room temperature and the transfection was carried out in the presence (SVF) and in the absence of fetal calf serum.
  • the lipid is presented to the DNA either in the form of a suspension at 2 mM in 150 mM NaCl at native pH (3.5) heated and left at temperature. ambient 1 day before contact with DNA ("1 day pre-maturation") or in the form of a 2mM solution in ethanol (EtOH).
  • the lipid is introduced into a suspension containing the plasmid pXL2784 and composed of 150 mM NaCl adjusted to a pH of 4.2 - 6.2 - 7.2 or 8.2 (these pHs are measured values) or also in DMEM culture medium.
  • Protocol for the preparation of the complex and transfection The lipid (DOGS) is presented to the DNA in the form of a suspension at 2 mM in 150 mM NaCl at native pH (3.5) immediately heated (NM: for
  • the lipid is introduced into a suspension containing the plasmid PXL2784 and composed of 150 mM NaCl adjusted to a pH of 6.2 (this pH is a measured value).
  • the "post-compaction maturation” is 0 -
  • the lipid (DOGS) is presented to the DNA in the form of a suspension at 2 mM either in water at pH 7.5 and "pre-matured” 1 day before compaction (water 7.5), or under the form of a suspension in 150 mM NaCl at pH 7.5 also "pre-matured” for 1 day (NaCl 7.5).
  • the lipid is introduced into a suspension containing the plasmid pXL2784 and composed of 150 mM NaCl adjusted to a pH of 7.2 (this pH is a measured value).
  • the "post-compaction maturation” is 0 (0) or 3 hours (3H).
  • the transfection was carried out in the presence of fetal calf serum.
  • the lipid (DOGS) is presented to the DNA in the form of a suspension at 2 mM in 150 mM NaCl at native pH (3.5) and "pre-matured" 1 day before compaction (1 day) or 4 days before compaction (4 days).
  • the lipid is introduced into a suspension containing the plasmid pXL2784 and composed of 150 mM NaCl adjusted to a pH of 6.6 (this pH is a measured value).
  • the "post-compaction maturation” is 0 (0) or 3 hours (3H).
  • the transfection was carried out in the presence (SVF) and in the absence of fetal calf serum.
  • the lipid (DOGS) is presented to the DNA in the form of a suspension at 2 mM in 150 mM NaCl at pH 7.5 and either heated immediately (IM) or "pre-matured” 1 day (U), or "pre-matured” 1 month (1 M) before compaction.
  • the lipid is introduced into a suspension containing the plasmid pXL2784 and composed of 150 mM NaCl adjusted to a pH of 7.2 (this pH is a measured value).
  • the "post-compaction maturation” is 0 (0) or 3 hours (3H).
  • the transfection was carried out in the presence of fetal calf serum.
  • the lipid (DOGS) is presented to DNA in the form of a micellar solution at 2 mM in pure water (native pH 3.5).
  • the lipid is introduced into a suspension containing the plasmid pXL2784 and composed of 150 mM NaCl adjusted to a pH of 7.3 (this pH is a measured value).
  • the "post-compaction maturation” is 0 (0) - 0.5 hour (0.5H) - 3 hours (3H) - 1 day (U) or 1 week (1S).
  • the transfection was carried out in the presence of fetal calf serum.
  • N, N, N-trimethylammonium Induction by Multivalent Anions and Asymmetric

Abstract

La présente invention concerne un procédé de préparation d'une composition pour le transfert d'acides nucléiques comprenant la mise en contact d'un acide nucléique avec un lipide cationique, selon lequel, préalablement à la mise en contact, le lipide cationique est soumis à une étape de chauffage. L'invention concerne également les compositions obtenues et leur utilisation.

Description

PROCEDE DE PREPARATION DE COMPOSITIONS POUR LE TRANSFERT D'ACIDES NUCLEIQUES
La présente invention concerne un procédé pour la préparation de compositions pour le transfert d'acides nucléiques. Les compositions obtenues sont utilisables pour le transfert d'acides nucléiques dans les cellules in vitro, ex vivo ou in vivo.
La pénétration cellulaire d'un acide nucléique nu (généralement de haute masse moléculaire et chargé négativement) est un phénomène rare et qui, en général, ne conduit à la transfection de la cellule qu'avec une efficacité très limitée. Pour cette raison, différents types de vecteurs et de techniques ont été décrits dans l'art antérieur pour la réalisation de ce transfert. On peut distinguer à cet égard deux grandes familles : les vecteurs viraux et les techniques physiques.
Parmi les vecteurs viraux, on peut citer par exemple les rétrovirus, les adénovirus, les AAV, les virus de l'herpès, les baculovirus, etc. L'efficacité de transfert obtenue avec des vecteurs viraux est généralement très bonne. Cependant, leur construction et leur production sont difficiles, la capacité de clonage de ces vecteurs est parfois limitée, et leur utilisation peut dans certains cas présenter certains inconvénients inhérents à l'emploi de virus (dissémination, pathogénicité, etc).
Pour ces raisons, différentes techniques physiques de transfert d'acides nucléiques ont été développées. On peut citer par exemple l'électroporation, la coprécipitation ou l'emploi de canons à particules.
L'électroporation consiste à appliquer un champ électrique à une suspension de cellules contenant de l'ADN. Cependant, si cette technique donne dans certains cas de bons résultats, elle est difficile à optimiser en raison du risque de lésions irréversibles de la membrane cellulaire. Dans la technique du canons à particules, des particules (or, tungstène) sont recouvertes d'acide nucléique puis projetées sur les cellules. Cette méthode est cependant prometteuse essentiellement pour les cellules à paroi, telles que les cellules végétales. Par ailleurs, la coprécipitation de l'ADN avec certains polymères (DEAE-dextran) ou le phosphate de calcium présente l'inconvénient d'être peu reproductible et parfois cytotoxique.
Pour remédier à ces inconvénients, des vecteurs de transfert synthétiques ont été mis au point. Le rôle de ces vecteurs est essentiellement de présenter l'acide nucléique sous une forme propice à la pénétration cellulaire, de faciliter cette pénétration (dans le cytoplasme puis dans le noyau) ainsi que de le préserver des nucléases cytoplasmiques.
Parmi ces vecteurs, les lipides cationiques possèdent des propriétés intéressantes. Ces vecteurs sont constitués d'une partie cationique polaire permettant la condensation des acides nucléiques et d'une partie lipidique hydrophobe stabilisant l'interaction ionique. Un excès de lipide, en raison de l'ionisation de sa partie polaire, favoriserait également l'interaction avec la membrane cellulaire. Des exemples particuliers de lipides cationiques sont notamment la lipopolylysine, les lipides monocationiques (DOTMA :
® Lipofectin ); certains détergents cationiques (DDAB); les iipospermines
(DOGS, DPPES, etc), les lipothermines, etc.
L'utilisation de ce type de vecteur, éventuellement en association avec un lipide fusogène (DOPE, etc), a montré qu'ils possèdent de bonnes propriétés de transfert d'acides nucléiques in vitro, ex vivo et in vivo sur de nombreux types cellulaires. Ces vecteurs constituent donc une alternative avantageuse aux vecteurs viraux et aux techniques physiques de transfert d'acides nucléiques. Cependant, l'exploitation de ces vecteurs au niveau industriel est pour l'instant limitée. En particulier, les méthodes de préparation de ces vecteurs décrites dans l'art antérieur sont empiriques, peu industrialisables, peu reproductibles, et conduisent à des mélanges mal définis et dont la composition ne donne pas de propriétés optimales. Ainsi, il est connu de préparer des compositions par mélange des différents composants lipidiques dans le chloroforme, séchage sous flux d'azote pendant 20 minutes puis séchage sous vide. Le film lipidique ainsi obtenu est repris par de l'eau desionisée [Hui 96], [Felgner 87]. Le mélange est ensuite vortexé pour resuspendre le lipide et soniqué dans un bain à sonication 10 minutes jusqu'à clarification de la suspension qui peut être ensuite diluée. La compaction est réalisée immédiatement avant ajout sur les cellules et laissé 4 heures à 37°C dans un milieu de culture F10. Des variantes de cette technique peuvent être rencontrées. Par exemple après dissolution par le chloroforme et séchage, le film peut être repris par une solution de NaCI à 20 mM [Guershon 93] ou de tampon Hepes à 20 mM [Gao 91]. La suspension est en général vortexée (immédiatement après reprise du film ou après une phase d'hydratation de 24 heures à 4°C [Gao 91]) et soniquée pendant des temps variables. Parfois la force ionique et la nature des ions du complexe peuvent être modifiées après compaction [Xu 1996]. L'opération de sonication en elle-même comporte des variantes puisque certains auteurs utilisent des sondes de sonication en Titane [Gustafsson 1995]. Le mode de préparation consistant en la formation d'un film par dissolution par le chloroforme, évaporation, séchage, reprise par un milieu aqueux et sonication est également fréquemment rencontré pour la fabrication des liposomes composés d'un lipide neutre associé à un tensioactif cationique [Pinnaduwage 89],
Un autre mode de préparation consiste à diluer directement les lipides du commerce (en solution éthanolique, suspension aqueuse ou formulation liposomique) dans du milieu de culture MEM. Après une dilution identique de l'ADN, les deux composants sont mélangés par inversion et la suspension est laissée à température ambiante pendant 15 à 30 minutes. Ensuite une nouvelle dilution est effectuée avant mise en contact avec les cellules pendant 6 heures [Fasbender 95]. Le lipide du commerce et l'ADN peuvent également être simplement dilués séparément dans l'eau distillée avant mise en contact par simple agitation et une éventuelle incubation à température ambiante pendant 15 minutes [Bringham 89].
Selon d'autres méthodes, la forme initiale du lipide est une solution éthanolique de concentration variable qui est diluée extemporanément dans du milieu de culture juste avant contact avec l'ADN [Behr 89]. La solution éthanolique peut être diluée également dans d'autres milieux (eau, NaCI à diverses concentrations) immédiatement ou 10 minutes avant compaction. A l'issue de la compaction et d'une éventuelle attente de 10 minutes, une nouvelle dilution peut avoir lieu dans un milieu de composition ionique variable. La transfection est réalisée après un temps de 0 ou 10 minutes après la dernière dilution [Barthel 93]. La solution éthanolique peut aussi être introduite directement dans la suspension aqueuse contenant l'ADN et le mélange peut subir ultérieurement une sonication en bain [Demeneix 91].
Il est aussi connu de solubiliser des liposomes cationiques composés d'un mélange DOSPA/DOPE [Hofland 96] par une solution à 1 % d'Octylglucoside (OG) dans une solution à 10 mM de Tris (pH 7,4). Après contact avec l'ADN le complexe est dialyse trois fois (afin d'éliminer les micelles d'OG excédentaires) contre 2000 volumes de Tris 10 mM / 5% de dextrose (pH 7,4) pendant plus de 48 heures à une température de 4°C. La transfection est réalisée pendant 4 à 5 heures à 37°C dans le DMEM dénué de sérum.
La préparation des liposomes cationiques peut être également réalisée par réhydratation du film lipidique suivie d'extrusions successives à travers des membranes en polycarbonate de porosité calibrée [Duzgϋnes 89] ou d'une microfluidisation [Sternberg 94].
Tous ces modes de préparation présentent des inconvénients pour une extrapolation à une échelle industrielle. La sonication peut difficilement être utilisée à une telle échelle et la stabilité des vésicules ainsi formées s'avère souvent insuffisante. De plus, les sondes utilisées pour la sonication, d'origine métallique, peuvent libérer dans le milieu des particules gênantes pour des applications pharmaceutiques. De même la filtration ne donne que des liposomes de taille définie par la porosité de la membrane au sortir de la filtration et dont la stabilité dans le temps n'est pas assurée. L'utilisation de lipides sous la forme d'une solution éthanolique, outre le problème d'utilisation d'un solvant organique, s'avère induire la formation de particules très polydisperses.
La demanderesse a maintenant mis au point un nouveau procédé de préparation de compositions transfectantes.
Ce procédé découle plus particulièrement de la caractérisation par la demanderesse des propriétés physicochimiques des vecteurs lipidiques. La demanderesse a ainsi montré que, selon les conditions, ces vecteurs existent dans différents états physicochimiques (forme micellaire, forme d'agrégats matures, etc). La demanderesse a permis plus particulièrement de caractériser les différents états physicochimiques des vecteurs lipidiques, elle a également mis en évidence des moyens permettant de contrôler le passage entre ces différents états, et de stopper la maturation dans des états définis, propices à la complexation avec l'ADN et à la transfection cellulaire.
La présente invention décrit ainsi un procédé reproductible permettant la préparation au niveau industriel de compositions transfectantes caractérisées et calibrées.
Le procédé de l'invention repose plus particulièrement sur la réalisation d'un traitement préalable du lipide cationique, permettant l'obtention d'une suspension homogène micellaire. Ainsi, un premier objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'une composition pour le transfert d'acides nucléiques comprenant la mise en contact d'un acide nucléique avec un lipide cationique, caractérisé en ce que, préalablement à la mise en contact, le lipide cationique est soumis à une étape de chauffage.
La demanderesse a étudié les caractéristiques physicochimiques des différents lipides cationiques. Les résultats obtenus montrent que, selon la force ionique du milieu, selon le pH du milieu ou encore selon la température, les lipides cationiques existent sous différents états physiques. Les exemples présentés ci-après décrivent notamment des diagrammes de phases de différents lipides cationiques (lipospermines, lipothermines) ainsi qu'une étude de la densité optique en fonction du pH et de la température, qui font apparaître clairement des états physicochimiques différents selon les conditions. La demanderesse a maintenant montré que ces différents états avaient des propriétés de compaction avec l'ADN et de transfection cellulaire différentes, et qu'il était avantageux de disposer d'une méthode permettant de contrôler de manière reproductible l'accès à ces différents états.
Le procédé selon l'invention, impliquant notamment le chauffage de la suspension lipidique, présente l'avantage d'une méthode simple et facilement transposable aux contraintes de l'exploitation industrielle. Il permet en outre, par le contrôle de la cinétique d'organisation, la maîtrise de la structure adoptée par le lipide avant et après sa mise en contact avec l'ADN. Le procédé de l'invention permet en outre une standardisation de la méthodologie de préparation, indispensable à l'échelle industrielle.
Plus particulièrement, l'étape préalable consiste à chauffer le lipide cationique jusqu'à formation d'une solution micellaire. Encore plus préférentiellement, le vecteur lipidique est chauffé jusqu'à une température supérieure à sa température de transition de phase. La température de transition de phase correspond à la température à laquelle les chaînes lipidiques fondent. Cette température peut être déterminée, pour chaque vecteur lipidique, par les techniques connues de l'homme du métier. En particulier, il est possible d'utiliser la méthode d'Analyse Thermique Différentielle (ou DSC : "Differential Scanning Calorimetry") au moyen par exemple de l'appareil DSC4 (Perkin Elmer) en suivant les recommandations du fabricant, comme illustré dans les exemples.
Le procédé de l'invention est applicable à tout type de lipide cationique. Il est particulièrement adapté à la préparation de lipopolyamines. Les lipopolyamines sont des molécules amphiphiles comprenant au moins une région hydrophile polyamine et une région lipophile liées covalamment entre elles par un bras chimique. Avantageusement, la région polyamine répond à la formule générale H2N-(-(CH)m-NH-)|-H dans laquelle m est un nombre entier supérieur ou égal à 2 et I est un nombre entier supérieur ou égal à 1 , m pouvant varier entre les différents groupes de carbone compris entre deux aminés. Préférentiellement, m est compris entre 2 et 6 inclusivement et I est compris entre 1 et 5 inclusivement. Encore plus préférentiellement, la région polyamine est représentée par la spermine ou par la thermine, ou par un analogue ayant conservé ses propriétés de liaison à l'ADN.
La région lipophile peut être une ou plusieurs chaînes hydrocarbonées, saturées ou non, du cholestérol, un lipide naturel ou un lipide synthétique capables de former des phases lamellaires ou hexagonales. Avantageusement, la région lipophile comprend deux chaînes hydrocarbonées.
En outre, le lipide cationique peut être combiné à des adjuvants lipidiques, comme indiqué plus loin.
Des exemples préférés de lipides cationiques sont notamment les lipospermines, en particulier la dioctadécylamidoglycyl spermine (DOGS) ou la 5-carboxyspermylamide de la palmitoylphosphatidylethanolamine (DPPES), dont la préparation a été décrite par exemple dans la demande de brevet EP 394 111. Une autre famille préférée est constituée par les lipothermines, parmi lesquelles on peut mentionner plus particulièrement le RPR120531 et le RPR120535 (FR95/13490, W096/17823 incorporées à la présente par référence). La structure de ces composés est représentée sur la figure 1.
Pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, le lipide, sous forme de poudre cristalline ou de film, est repris par de l'eau pure ou un milieu salin dont le pH est éventuellement ajusté. L'homogénéisation est réalisée par chauffage au dessus de la température de transition du lipide, c'est à dire la température à partir de laquelle les chaînes aliphatiques fondent. Comme indiqué ci-avant, cette température de transition de phase peut être déterminée par analyse thermique différentielle. Dans le cas du DOGS par exemple, elle est de 38°C dans l'eau à pH 7,5, et elle est de 44°C à un pH de 8,8. Aucune transition n'est observée dans l'eau pure à pH acide : le lipide est sous forme micellaire quelle que soit la température. La température de transition de phase est également fonction de la force ionique du milieu. A titre d'exemple, la température du DOGS dans une solution de NaCI est de 44,4°C à pH acide, 42°C à pH 7,5 et 39,8°C à pH 9,9. Cette température de transition est bien entendu variable d'un lipide à un autre (Cf les exemples). En particulier, pour le RPR120531 , la température de transition de phase telle que déterminée par DSC et turbidimétrie est de 51 ,5°C (poudre) et 30°C (hydraté, pH 7,5). Pour le RPR120535, elle est de 43°C environ (hydraté, pH 7,5). Le chauffage peut être obtenu au bain-marie, par chauffage direct, ou encore par tout moyen permettant d'élever la température. Il permet la formation d'une solution micellaire caractérisée par la clarification de la suspension, si les conditions de pH le permettent. La présence de micelles a été mise en évidence par des techniques telles que la turbidimétrie, la diffusion/diffraction des rayons X aux petits angles et par Cryo-microscopie électronique en transmission.
Un autre avantage inattendu du procédé de l'invention réside dans l'efficacité de transfection des compositions. Ainsi, de manière particulièrement avantageuse, les compositions obtenues permettent la transfection de cellules indépendemment de la présence de sérum. Il est en effet connu que le sérum (sérum de veau fétal par exemple) exerce un effet inhibiteur de la transfection par les lipides cationiques {in vitro, ex vivo ou in vivo). Les résultats présentés dans les exemples montrent que le procédé de l'invention peut permettre, par chauffage préalable du lipide, d'améliorer l'efficacité de transfection en présence de sérum. Ainsi, les compositions selon l'invention possèdent une efficacité de transfection aussi bonnne en présence et en l'absence de sérum. L'acide nucléique peut être mis en contact avec la solution lipidique directement après obtention de la solution micellaire, et le complexe nucléolipidique obtenu utilisé directement pour la transfection cellulaire. L'avantage de telles compositions réside notamment dans leur caractère homogène, défini et reproductible.Toutefois, la demanderesse a également montré que pour améliorer encore les propriétés des compositions, notamment les propriétés de transfection, il est avantageux de procéder à une maturation du lipide cationique avant la mise en contact avec l'acide nucléique (maturation pré-compaction) et/ou du complexe nucléolipidique après la mise en contact (maturation post-compaction). La maturation du lipide/complexe permet de réorganiser le lipide cationique sur le plan de sa structure et sur le plan de sa taille. La demanderesse a en effet montré qu'un lipide en solution micellaire tel qu'obtenu au cours de la première étape du procédé de l'invention peut évoluer pour former des corps organisés de taille et de structure différentes. La demanderesse a également montré que l'état d'organisation du lipide cationique avait une influence sur sa capacité à complexer (ou compacter) les acides nucléiques, ainsi que sur ses propriétés de transfection.
Un procédé de l'invention comprend en outre, entre l'étape de chauffage et la mise en contact, un étape de maturation pré-compaction du vecteur lipidique.
Un procédé de l'invention comprend en outre, après la mise en contact, une étape de maturation post-compaction du complexe nucléolipidique.
En partant de la solution micellaire, il est possible, en favorisant les interactions entre les différentes molécules lipidiques et la réorganisation supramoléculaire, de former différents corps organisés. Les exemples présentés ci-après montrent en particulier que les lipides cationiques passent par des états organisés inattendus de type lamellaire, tubulaire ou vermiculaire. Lorsque la concentration est augmentée, des états de taille plus importante apparaissent, tels que des états colonnaires ou hexagonaux. Ces différentes structures présentent des propriétés différentes.
Pour la mise en oeuvre de l'invention, il est avantageusement procédé à une étape de maturation pré-compaction. Cette étape est avantageusement réalisée jusqu'à apparition d'agrégats organisés de type lamellaire, tubulaire, vermiculaire, colonnaires et/ou hexagonaux. Plus préférentiellement, cette étape est réalisée jusqu'à apparition d'agrégats organisés de type lamellaire, tubulaire et/ou vermiculaire. Ce type de corps présente en effet une structure originale, tout particulièrement propice à la complexation avec les acides nucléiques.
La maturation peut être réalisée par tout moyen permettant d'augmenter les interactions entre les molécules de lipide cationique, ou de favoriser la réorganisation intramoléculaire. Selon l'invention, la maturation est avantageusement réalisée par diminution de la température, augmentation du pH du milieu et/ou augmentation de la force ionique du milieu.
En diminuant la température, les chaînes aliphatiques grasses se réorganisent et permettent de restructurer le lipide cationique. Les résultats présentés sur la Figure 2 montrent l'évolution claire de la densité optique d'une solution de lipide, reflétant l'architecture interne dudit lipide, en fonction de la température du milieu. En augmentant le pH ou la force ionique du milieu, il est possible de modifier l'état des charges ioniques positives présentes sur la partie cationique du vecteur. Ainsi, en neutralisant (pH) ou en protégeant (écrantage, force ionique) progressivement les charges, la demanderesse a montré que l'on réduisait progressivement, de manière contrôlable, les forces de répulsion électrostatique entre les molécules de lipide, et qu'on favorisait les interactions et la réorganisation en agrégats structurés. Les résultats présentés sur les figures 4 et 5 montrent l'effet du pH et de la force ionique sur l'état d'organisation du lipide. Les photos présentées figure 3 illustrent les différents corps mis en évidence. Avantageusement, la maturation pré-compaction est réalisée par diminution de la température. Encore plus préférentiellement, elle est réalisée par incubation de la solution à température ambiante. Ceci permet une cinétique de maturation (d'agrégation et de réorganisation) progressive et lente, propice à la compaction avec les acides nucléiques. La maturation peut être poursuivie pour une durée variable selon le lipide et selon les conditions de pH et de force ionique. Les exemples ci-après montrent que cette maturation peut être effectuée sur une période allant de quelques heures à 1 mois. La durée de la maturation pré-compaction est déterminée notamment par l'apparition de corps structurés de type lamellaire, tubulaire ou vermiculaire. Toutefois, si le pH et/ou la force ionique lors de l'étape de condensation sont suffisamment élevés, et/ou si l'on procède à une maturation post-compaction, il est avantageux de ne pas procéder à une maturation pré-compaction. La forme micellaire du lipide permet en effet dans ce cas l'obtention de complexes nucléolipidiques plus petits et plus homogènes en taille, plus efficaces pour la transfection en présence ou en l'absence de sérum.
La maturation peut également être réalisée par augmentation de la force ionique du milieu. A cet égard, il est avantageux de se placer, soit lors de la solubilisation, soit lors de la maturation, soit lors de la mise en contact (compaction), dans une solution de force ionique comprise entre 0 et 0,5M. De préférence, on utilise une solution proche de l'isotonie (0,15M), c'est-à- dire une force ionique comprise entre 0,05 et 0,2 M. Différents sels peuvent être utilisés (NaCI; KN03, Kl, etc). Par ailleurs, il est également possible de jouer sur le pH lors de la phase de maturation. Il est avantageux, lors de la maturation ou lors de la compaction, de travailler dans une zone de pH comprise entre 3 et 9, de préférence entre 6 et 9. Le pH est bien entendu ajusté par l'homme du métier en fonction des pK des vecteurs lipidiques utilisés et du diagramme de phase du lipide. Une zone de pH avantageuse est celle à laquelle 30% au moins des aminés du vecteur cationique sont déprotonées, de préférence 40% au moins. D'une manière générale, indépendamment du pH et de la force ionique, la maturation pré-compaction est réalisée par diminution de la température en dessous de la température de transition de phase du lipide. Cette diminution peut être accompagnée de modifications de pH et de force ionique, soit lors de la maturation, soit lors de la compaction elle-même.
A titre illustratif, dans les conditions de pH et de force ionique intermédiaires (par exemple pour le DOGS dans NaCI 150 mM à un pH < 8), les états d'organisation suivants sont observés :
Une suspension de DOGS dans le NaCI 150 mM à pH 7,5 est composée : - essentiellement de micelles sphériques, immédiatement après chauffage à 50°C environ (figure 3A),
- de micelles sphériques de petits bâtonnets et de vermicules de longueur variable, trois heures après chauffage et refroidissement à température ambiante (figure 3B), - de plaquettes de structure lamellaire dont la taille est variable, une semaine après chauffage et refroidissement à température ambiante (figure 3C),
- uniquement de grandes plaques de structure lamellaire, un mois après chauffage et refroidissement à température ambiante (figure 3D).
A un pH natif (3,5 environ), la même suspension est composée de micelles sphériques et de vermicules un jour après chauffage et refroidissement à température ambiante.
Dans un milieu DMEM ajusté à pH 5 une suspension de DOGS est composée : - uniquement de micelles sphériques, immédiatement après chauffage,
- de micelles sphériques et de vermicules, 5 heures ou une semaine après chauffage et refroidissement à température ambiante.
Ces observations montrent comment le temps de maturation peut être adapté en fonction du lipide et des conditions de milieu pour former des agrégats organisés de type lamellaire ou vermiculaire. Dans la mesure où il est maintenant possible de connaître la structure adoptée par le lipide en fonction des conditions de milieu et de temps après chauffage, il est permis de contrôler la structure lipidique qui est mise ultérieurement en contact avec l'ADN. Par ailleurs, la réversibilité du procédé de chauffage/refroidissement/"maturation pré-compaction" est totale. Quel que soit le temps de maturation ayant été effectué, il est donc possible de rechauffer la suspension pour revenir à un état micellaire commun à toutes les conditions.
Après l'étape de chauffage et la maturation pré-compaction éventuelle, le lipide est mis en contact avec l'acide nucléique.
L'acide nucléique peut être un ADN ou un ARN. Il peut s'agir d'un ADN linéaire ou circulaire, superenroulé ou relâché, de type plasmidique ou pas, portant différents éléments génétiques (phase codante, promoteurs, terminateurs, sîtes de liaisons, origines de réplication, etc). L'acide nucléique peut être d'origines variées (humaine, animale, eucaryote inférieure, procéryote, végétale, virale, phagique, etc). Il peut également s'agir d'un acide nucléique synthétique ou semi-synthétique. La taille de l'acide nucléique peut être très variable (de l'oligonucléotide au génome complet). L'avantage des compositions de l'invention réside en outre dans leur application au transfert d'acides nucléiques de toute taille. Selon un mode de mise en oeuvre particulier, l'acide nucléique est un ADN (par exemple un plasmide ou un fragment d'ADN) portant une cassette d'expression d'une protéine ou d'un ARN particulier. Il peut s'agir d'une protéine thérapeutique ou agro-alimentaire (enzyme, acide aminé, etc), en vue de produire ladite protéine ou ledit ARN in vitro, ex vivo ou in vivo. En outre, l'acide nucléique utilisé peut être un mélange d'acides nucléiques différents, ayant des propriétés différentes. L'acide nucléique peut être préparé par toutes les techniques connues de l'homme du métier (criblage de banque, synthèse artificielle, méthodes mixtes, etc). Pour la mise en contact (compaction), l'acide nucléique (la composition d'acides nucléiques) est solubilisé dans un milieu aqueux. La composition, la force ionique et le pH de ce milieu peuvent être ajustés pour améliorer l'efficacité de la compaction et les propriétés de transfert des compositions finales. En particulier, il a été constaté dans les études réalisées avec le DOGS qu'une compaction réalisée dans un milieu où le lipide pouvait se trouver à l'état micellaire pendant son contact avec l'ADN (c'est à dire dans un milieu de très faible force ionique et /ou de faible pH), et ce, quel que soit son état précédent l'étape de mise en contact, ne permettait pas une bonne efficacité de transfection en présence de sérum de veau foetal. Il a été montré que la structure des complexes formés dans ces conditions de faible pH et force ionique n'est pas de type lamellaire. Ainsi, de manière avantageuse, la compaction est effectuée dans un milieu salin, dans une zone de pH comprise entre 4 et 10. Les conditions optimales dépendent du lipide et en particulier de son aptitude à adopter, en présence d'acide nucléique, des phases de type lamellaire. Avantageusement, la compaction est réalisée dans un milieu de pH compris entre 6 et 9. Concernant la salinité du milieu, elle est avantageusement comprise entre 0 et 2M, de préférence entre 0,01 et 0,5M, encore plus préférentiellement entre 0.05 et 0,2M. Un milieu avantageux pour la compaction est un milieu proche de l'isotonie (0,15M), dont le pH est compris entre 6 et 9. Ces conditions peuvent être celles du milieu de chauffage du lipide ou celles de la maturation pré- compaction. Dans ces conditions, la compaction peut avoir lieu sans modification du milieu. Si les conditions de la maturation pré-compaction sont différentes, il est avantageux d'ajuster la composition du milieu comme indiqué ci-dessus. Les résultats présentés dans les exemples montrent en effet que, dans ces conditions, il est possible d'obtenir des compositions ayant des propriétés de transfection particulièrement inattendues et avantageuses. En particulier, il est possible d'obtenir des compositions insensibles à l'effet inhibiteur par le sérum, ce qui est particulièrement avantageux pour des utilisations vitro (SVF) ou vivo. Pour la mise en contact, les quantités et concentrations respectives d'acide nucléique et de lipide peuvent varier. Ces quantités et concentrations sont celles décrites dans l'art antérieur pour l'utilisation de ces vecteurs. En particulier, les quantités respectives d'acide nucléique et de lipide utilisées sont déterminées par le rapport de charges positives du lipide et négatives de l'acide nucléique. Ce rapport de charge peut varier dans une fourchette de 0,01 à 100, et être adapté par l'homme de l'art, en fonction du lipide sélectionné, de l'acide nucléique sélectionné, et selon que l'utilisation est de type vitro ou vivo. Avantageusement, il est compris entre 0,01 et 20.
Le complexe nucléolipidique ainsi obtenu peut être utilisé tel quel pour la transfection. Il peut également être soumis une maturation dite de "post- compaction", permettant d'optimiser l'organisation structurale du complexe en vue d'améliorer ses propriétés de transfert. En effet, les états d'organisation des lipides permettant une bonne compaction avec l'acide nucléique ne sont pas nécessairement ceux donnant les meilleurs niveaux de transfection. Ainsi, il est avantageux de réaliser une maturation post- compaction jusqu'à l'apparition d'agrégats organisés de type lamellaires, colonnaires et/ou hexagonaux. Lorsque de tels agrégats sont initiés lors de la compaction, il peut être avantageux de réaliser une maturation post- compaction pour homogénéiser la composition. Les conditions et les moyens de la maturation post-compaction sont similaires à celles de la maturation pré-compaction. La durée de cette maturation est adaptée par l'homme du métier en fonction de la maturation pré-compaction, et du vecteur lipidique.
Les compositions obtenues peuvent être utilisées extemporanément pour le transfert d'acides nucléique. Elles peuvent également être stockées et conservées, par exemple sous forme lyophilisée ou congelée, en vue d'une utilisation ultérieure. Comme indiqué ci-avant, les compositions de l'invention présentent de nombreux avantages pour une utilisation industrielle. Elles sont calibrées, homogènes, reproductibles, stables et offrent des pouvoirs de transfert élevés. Un objet de l'invention réside en particulier dans une composition pour le transfert d'acides nucléiques comprenant un acide nucléique complexé à un lipide cationique, caractérisée en ce que l'efficacité de transfert n'est pratiquement pas altérée par la présence de sérum et en ce qu'elle peut être obtenue par le procédé décrit ci-avant.
La composition comprend préférentiellement, comme lipide cationique, une lipopolyamine. Encore plus préférentiellement, il s'agit d'une lipothermine ou d'une lipospermine, ayant de préférence 2 chaînes grasses. Par ailleurs, certains adjuvants peuvent être ajoutés aux compositions, et notamment des adjuvants lipidiques. Plus préférentiellement, les adjuvants lipidiques sont des lipides neutres ayant 2 chaînes grasses.
De manière particulièrement avantageuse, on utilise des lipides naturels ou synthétiques, zwitterioniques ou dépourvus de charge ionique dans les conditions physiologiques. Il peuvent être choisis plus particulièrement parmi la dioleoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), le oléoyl-palmitoylphosphatidyléthanolamine (POPE), le di-stéaroyl, -palmitoyl, -mirystoyl phosphatidyléthanolamine ainsi que leurs dérivé N-méthylés 1 à 3 fois; les phosphatidylglycérols, les diacylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyélines), le cholestérol ou encore les asialogangliosides (tels que notamment les asialoGMI et GM2).
Ces différents lipides peuvent être obtenus soit par synthèse, soit par extraction à partir d'organes (exemple : le cerveau) ou d'oeufs, par des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. En particulier, l'extraction des lipides naturels peut être réalisée au moyen de solvants organiques (voir également Lehninger, Biochemistry).
Préférentiellement, les compositions de l'invention comprennent, en plus du lipide cationique, de 0,1 à 20 équivalents molaires de lipide neutre pour 1 équivalent molaire de phosphate de l'acide nucléique, et, plus préférentiellement, de 1 à 5. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, les compositions de la présente invention comprennent un élément de ciblage permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique. Cet élément de ciblage peut être un élément de ciblage extracellulaire, permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique vers certains types cellulaires ou certains tissus souhaités (cellules tumorales, cellules hépatiques, cellules hématopoiétiques, etc). Il peut également s'agir d'un élément de ciblage intracellulaire, permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique vers certains compartiments cellulaires privilégiés (mitochondries, noyau, etc). Plus préférentiellement, l'élément de ciblage est lié, de manière covalente ou non covalente, au lipide. La liaison peut notamment être obtenue par interaction ionique avec les ammonium, ou par attaque nucléophile des aminés du vecteur sur des éléments de ciblage comportant un groupement nucléofuge (halogène, tosylate, etc), un ester activé (hydroxysuccinimide, etc) ou encore un isothiocyanate. L'élément de ciblage peut également être lié à l'acide nucléique.
Parmi les éléments de ciblage utilisables dans le cadre de l'invention, on peut citer les sucres, les peptides, les oligonucléotides ou les lipides. Préférentiellement, il s'agit de sucres et/ou peptides tels que des anticorps ou fragments d'anticorps, des ligands de récepteurs cellulaires ou des fragments de ceux-ci, des récepteurs ou fragments de récepteurs, etc. En particulier, il peut s'agir de ligands de récepteurs de facteurs de croissance, de récepteurs de cytokines, de récepteurs de lectines cellulaires ou de récepteurs de protéines d'adhésion. On peut également citer le récepteur de la transférine, des HDL et des LDL. L'élément de ciblage peut également être un sucre permettant de cibler les récepteurs asialoglycoprotéiques, ou encore un fragment Fab d'anticorps permettant de cibler le récepteur du fragment Fc des immunoglobulines.
Les compositions transfectantes décrites peuvent être utilisées pour le transfert d'acides nucléiques in vitro, ex vivo ou in vivo. Pour des applications in vivo, elles peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, cutanée, orale, rectale, vaginale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, elles contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour une administration par voie topique (sur peau et/ou muqueuse). Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les doses d'acide nucléique utilisées pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée.
A cet égard, un autre objet de l'invention concerne un procédé pour le transfert d'acide nucléique dans des cellules in vitro, in vivo ou ex vivo comprenant la mise en contact dudit acide nucléique avec une suspension de lipide cationique préalablement chauffée, et l'incubation des cellules avec le complexe nucléolipidique résultant.
Avantageusement, la suspension de lipide cationique est préalablement chauffée et maturée. Toujours selon un mode préféré, le complexe nucléolipidique est mature préalablement à l'incubation avec les cellules. L'incubation avec les cellules peut être faite in vitro, sur un support approprié (boite de culture, pochette, flasque, etc) éventuellement en conditions stériles. Les quantités d'ADN incubées sont connues de l'homme du métier (de l'ordre du microgramme pour 106 cellules). Pour une utilisation vivo, l'incubation peut être effectuée par administration de la composition in vivo (locale ou systémique par exemple).
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. Légende des figures :
Figures 1 : Structures chimiques de lipides cationiques. 1A : DOGS, 1 B : RPR 120531 , 1C : RPR 120535.
Figure 2 : Influence de la température sur la densité optique à 400 nm d'une suspension de DOGS à 1 mM dans le NaCI.
Figures 3 : Clichés de Cryo-microscopie en transmission d'une suspension de DOGS à 2 mM dans le NaCI à pH 7,5. La préparation de l'échantillon a été réalisée immédiatement après chauffage (3A), 3 heures (3B), 1 semaine (3C) et 1 mois (3D) après chauffage de la suspension et refroidissement à température ambiante.
Figure 4 : Influence du pH sur la densité optique à 400 nm d'une suspension de DOGS à 0,6 mM dans l'eau ou dans le NaCI à 150 mM. Température de l'étude : 50°C. Figures 5 : Diagrammes de Phases du DOGS (5A : eau; 5B : NaCI 150 mM), du RPR120531 (5C : eau; 5D : NaCI 150 mM) et du RPR120535 (5E : eau; 5F : NaCI 150 mM).
Figure 6 : Pouvoir transfectant des compositions de l'exemple 5 Figure 7 : Pouvoir transfectant des compositions de l'exemple 6 Figure 8 : Pouvoir transfectant des compositions de l'exemple 7 Figure 9 : Pouvoir transfectant des compositions de l'exemple 8 Figure 10 : Pouvoir transfectant des compositions de l'exemple 9 Figure 11 : Pouvoir transfectant des compositions de l'exemple 10 Figure 12 : Pouvoir transfectant des compositions de l'exemple 11
MATERIEL ET METHODES
1. Le plasmide utilisé dans les exemples suivants (pXL2784) est un dérivé ColE1 portant le gène de résistance à la Kanamycine, et le fragment cer de CoIEL La cassette d'expression eucaryote contient le promoteur CMV du plasmide pCDNA3 contrôlant le gène codant pour la luciférase (Photinu Pyralis). Il est entendu que tout autre acide nucléique peut être utilisé. 2. Les lipides cationiques utilisés dans les exemples suivants sont le DOGS, le RPR120531 et le RPR120535 dont la structure est représentée figure 1. Il est entendu que les même expériences peuvent être réalisées avec d'autres lipides cationiques.
3. Protocole de transfection. Le procédé décrit vaut pour les transfections in vitro, ex vivo et in vivo.
Les cellules utilisées sont des fibroblastes murins NIH 3T3, ensemencés le jour précédent en plaques 24 puits, à une densité de 50 000 cellules par puits. Le milieu de culture utilisé est le milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Médium), contenant 4,5 g/1 de glucose, complémenté avec 10% de sérum de veau foetal, de 1 % de L-glutamine (solution mère à 200 mM), de 1 % de pyruvate de sodium, de streptomycine (5000 Ul/ml) et de pénicilline (5000 μg/ml) (Gibco). Préalablement à la transfection les cellules sont rincées 2 fois avec du DMEM ne contenant pas de sérum de veau foetal.
La transfection des cellules est réalisée par 50 μl d'une suspension de transfection contenant 0,5 μg d'ADN et 3 nmoles de DOGS par puits, dans
200 μl de milieu de culture additionné ou non de 10% de sérum de veau foetal. Après une incubation de 4 heures à 37°C (dans un incubateur à CO2), le milieu de culture contenant le complexe nucléolipidique est éliminé et remplacé par 500 μl de DMEM complémenté à 10 % de sérum de veau foetal. Les cellules sont ensuite incubée pendant 48 heures.
4. Mesure de l'activité luciférase de cellules eucaryotes.
Elle est effectuée 48 heures après transfection. La luciférase catalyse l'oxydation de la luciférine, en présence d'ATP, de Mg2+ et d'02, avec production concomitante d'un photon. L'émission totale de lumière, mesurée par un luminomètre, est proportionnelle à l'activité luciférase de l'échantillon.
Les réactifs utilisés sont fournis par Promega (Luciférase assay System) et utilisés selon un protocole conseillé. Après un double rinçage des cellules par du PBS, les cellules sont lysées par 250 μl de tampon de lyse et la fraction insoluble de chaque extrait est éliminée par centrifugation. Le dosage est effectué sur 5μl de surnageant, dilué ou non dans le tampon de lyse des cellules.
EXEMPLES
Exemple 1 : Influence de la température sur l'organisation moléculaire des lipides cationiques.
Une solution colloïdale de DOGS à 1mM a été préparée par dissolution du DOGS cristallisé dans le chloroforme, évaporation du solvant et séchage au lyophilisateur. Le film a ensuite été repris par une solution de NaCI 0,9% tampon (Hépès 10mM, pH 7,4). Après chauffage à 50°C, la solution colloïdale a été placée à 4°C pendant une semaine. La densité optique est suivie en continu (Spectrophotomètre Lambda 2 (Perkin Elmer) avec porte- cuve thermostaté), tandis que la température du bain (LAUDA RM6), lui- même relié aux cuves de spectrophotomètre, varie à une vitesse déterminée et contrôlée de 1 ,25°C/mn. La cuve renfermant l'échantillon est munie d'un système d'agitation.
Les résultats obtenus sont présentés sur la Figure 2. Ils font apparaître une chute brutale de la densité optique autour de 40°C environ. Cette chute de DO traduit un réarrangement profond de la structure du lipide.
Parallèlement, l'état physique du DOGS au cours de ces variations de température a été étudié par cryomicroscopie en transmission. Pour cela, une suspension de DOGS à 2mM dans le NaCI à pH 7,5 a été chauffée à 50°. La nature physique des objets a été déterminée après chauffage au cours du temps, pendant la maturation par incubation à température ambiante. Les résultats obtenus sont présentés sur la Figure 3 : La préparation de l'échantillon a été réalisée immédiatement après chauffage (3A), 3 heures (3B), 1 semaine (3C) et 1 mois (3D) après chauffage de la suspension et refroidissement à température ambiante. Les résultats obtenus montrent une évolution de la structure du DOGS, depuis le stade micellaire jusqu'à la formation de corps lamellaires, en passant par des structures en bâtonnets et vermicules. Cet exemple permet de définir des conditions de maturation pré-compaction du lipide.
Exemple 2 : Influence du pH sur l'organisation moléculaire des lipides cationiques
Une solution colloïdale de DOGS à 1mM a été préparée par dissolution du DOGS cristallisé dans le chloroforme, évaporation du solvant et séchage au lyophilisateur. Le film a ensuite été repris par une solution de NaCI 150 mM ou par de l'eau, dans une gamme de pH allant de 3.0 à 11.0. Après chauffage à 50°C, les suspensions sont placées à température ambiante (25°C) 3 heures au moins avant le début de la mesure. La densité optique est déterminée dans les conditions décrites dans l'exemple 1.
Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 4. Ils font apparaître très nettement une augmentation de la densité optique en fonction du pH. Cette augmentation traduit une augmentation des interactions entre les molécules de lipides, par diminution des répulsions électrostatiques.
Exemple 3 : Diagrammes de Phases des lipides cationiques
Pour valider les observations faites dans les exemples 1 et 2, des diagrammes de phases ont été tracés pour différents vecteurs lipidiques. Ces diagrammes décrivent l'état physique des lipides selon les conditions de pH, de force ionique et de température. Ils mettent également en évidence les températures de transition de phase et le comportement agrégatif du lipide en fonction de son état d'ionisation.
Ces diagrammes sont présentés sur les Figures 5A et 5B pour le DOGS, 5C et 5D pour le RPR 120531 et 5E et 5F pour le RPR 120535. Ils montrent que, dans le cas où le lipide est solubilisé dans de l'eau pure (pH < 6) la solution micellaire obtenue par chauffage selon l'invention est stable. Ils permettent également de définir les conditions de force ionique et de pH pour lesquelles la solution micellaire est stable dans le temps.
Exemple 4 : Etude de différents contre-ions dans l'électrolyte de fond.
Différents contre-ions ont été testés dans l'étape de maturation. Pour cela, différentes suspensions de DOGS dans un milieu dont l'électrolyte de fond est présent à une concentration de 0.1 M et dont le pH n'est pas ajusté (pH natif : 3,5) ont été observées une semaine après chauffage et refroidissement à température ambiante:
- Dans KN03, les structures nanométriques sont de type micellaire et on observe quelques rares bords marqués. Les structures submicroniques sont des filaments fins à forte tendance agrégative.
- Dans Kl, les structures nanométriques se présentent sous l'aspect de superposition de lamelles dont les bords apparaissent très marqués. Les structures submicroniques se présentent également sous la forme de filaments mais dont l'épaisseur est supérieure et à moins forte tendance agrégative.
Exemple 5
A. Protocole de préparation du complexe et transfection :
Le lipide (DOGS) est présenté à l'ADN sous la forme d'une suspension à 2 mM dans le NaCI 150 mM à pH natif (3,5) chauffé et laissé à température ambiante 1 jour avant contact avec l'ADN ("pré-maturation de 1 jour"). Le lipide est introduit dans une suspension contenant le plasmide pXL2784 et composée de 150 mM NaCI ajusté à un pH de 5 - 6,6 ou 8,2 (ces pH sont des valeurs mesurées). La "maturation de post-compaction" est de 0 ou 3 heures à température ambiante et la transfection a été réalisée en présence (SVF) et en l'absence de sérum de veau foetal.
B. Résultats :
Les résultats de transfection exprimés en RLU (Relative Light Unit) pour 5 μl de lysat, soit 1/50ème de puits, sont présentés sur la Figure 6. Chaque valeur est une moyenne de mesure sur 4 puits. Les écarts types sont représentés par des barres horizontales.
Cette étude montre qu'en partant d'une solution de micelles vermiculaires, une compaction dans un milieu salin de fort pH (ici 8,2) permet de s'affranchir de l'effet inhibiteur du sérum, quel que soit la "maturation de post-compaction". Par ailleurs, lorsqu'un pH intermédiaire de compaction (toujours en milieu salin) est utilisé, "une maturation de post-compaction" permet également de s'affranchir de l'effet inhibiteur sur la transfection du sérum.
Une étude similaire a été réalisée sur les lipides RPR 120531 et RPR 120535 (voir figure 1 pour les structures du DOGS, RPR 120531 et RPR 120535). Elle montre un comportement similaire à celui de DOGS relativement à l'influence du pH de compaction et de la "maturation post- compaction" sur l'affranchissement de l'effet sérum.
Exemple 6
A. Protocole de préparation du complexe et transfection : Le lipide (DOGS) est présenté à l'ADN soit sous la forme d'une suspension à 2 mM dans le NaCI 150 mM à pH natif (3,5) chauffé et laissé à température ambiante 1 jour avant contact avec l'ADN ("pré-maturation de 1 jour") soit sous la forme d'une solution à 2mM dans l'éthanol (EtOH). Le lipide est introduit dans une suspension contenant le plasmide pXL2784 et composée de 150 mM NaCI ajusté à un pH de 4.2 - 6,2 - 7.2 ou 8,2 (ces pH sont des valeurs mesurées) ou encore dans du milieu de culture DMEM. Aucune "maturation de post-compaction" n'est réalisée sauf dans le cas où la compaction est effectuée à un pH de 6,2 (pH 6,2 + mat.). Dans ce cas la "maturation post compaction" est de 3 heures à température ambiante. La transfection a été réalisée en présence (SVF) et en l'absence de sérum de veau foetal (SS SVF). B. Résultats :
Les résultats de transfection exprimés en RLU (Relative Light Unit) pour 5 μl de lysat, soit 1/50ème de puits, sont présentés sur la Figure 7. Chaque valeur est une moyenne de mesure sur 4 puits. Les écarts types sont représentés par des barres horizontales.
Cette étude montre que le comportement des particules d'ADN compacté vis à vis de l'inhibition du sérum de veau foetal vu dans l'exemple 5 (en fonction du pH de compaction et de la "maturation post-compaction") est également valable que le DOGS se présente sous la forme d'une suspension en milieu salin ou sous la forme d'une solution éthanolique. Elle montre également que l'étape de "maturation post-compaction" permet de s'affranchir de l'inhibition par le sérum.
Exemple 7
A. Protocole de préparation du complexe et transfection : Le lipide (DOGS) est présenté à l'ADN sous la forme d'une suspension à 2 mM dans le NaCI 150 mM à pH natif (3,5) chauffé immédiatement (NM : pour
Non pré-Maturé) avant contact avec l'ADN ou "pré-maturé" 1jour avant compaction (U). Le lipide est introduit dans une suspension contenant le plasmide PXL2784 et composée de 150 mM NaCI ajusté à un pH de 6,2 (ce pH est une valeur mesurée). La "maturation de post-compaction" est de 0 -
0,5 heure - 3 heures - 1 jour lorsque le lipide n'a pas été "pré-maturé", elle est de 3 heures lorsque le lipide a été "pré-maturé 1 jour" à température ambiante (témoin). La transfection a été réalisée en présence et en l'absence de sérum de veau foetal. Les résultats obtenus en l'absence de sérum de veau foetal n'étant pas significativement différents selon les différents protocoles étudiés, seuls sont représentés les résultats des transfections réalisées en présence de sérum de veau foetal. B. Résultats :
Les résultats de transfection exprimés en RLU (Relative Light Unit) pour 5 μl de lysat, soit 1/50ème de puits, sont présentés sur la Figure 8. Chaque valeur est une moyenne de mesure sur 4 puits. Les écarts types sont représentés par des barres horizontales.
Cette étude montre qu'une absence de "pré-maturation" du DOGS (chauffage immédiatement avant mise en contact avec l'ADN) oblige à augmenter le temps de "maturation post-compaction" nécessaire à l'affranchissement de l'effet inhibiteur du sérum. La structure adoptée par le lipide avant sa mise en contact avec l'ADN semble donc permettre d'accélérer l'organisation du complexe lipide-ADN.
Il semble également qu'une compaction réalisée avec un lipide non prématuré mais suivi d'un temps de "maturation post-compaction" suffisant (IM - 1 J), permette la formation de particules plus efficaces sur la transfection que si le lipide a été prématuré (1J - 3H), peut-être parce que les particules formées sont plus petites et de taille plus régulière.
Exemple 8
A. Protocole de préparation du complexe et transfection :
Le lipide (DOGS) est présenté à l'ADN sous la forme d'une suspension à 2 mM soit dans l'eau à pH 7,5 et "pré-maturé" 1 jour avant compaction (eau 7,5), soit sous la forme d'une suspension dans le NaCI 150 mM à pH 7,5 également "pré-maturé" 1 jour (NaCI 7,5). Le lipide est introduit dans une suspension contenant le plasmide pXL2784 et composée de 150 mM NaCI ajusté à un pH de 7,2 (ce pH est une valeur mesurée). La "maturation de post-compaction" est de 0 (0) ou 3 heures (3H). La transfection a été réalisée en présence de sérum de veau foetal.
B. Résultats :
Les résultats de transfection exprimés en RLU (Relative Light Unit) pour 5 μl de lysat, soit 1/50ème de puits, sont présentés sur la Figure 9. Chaque valeur est une moyenne de mesure sur 4 puits. Les écarts types sont représentés par des barres horizontales.
Ces résultats montrent qu'il est possible de s'affranchir de l'effet inhibiteur du sérum ainsi que de la "maturation post-compaction" en permettant au lipide avant compaction d'être plus structuré : les conditions de pH et de force ionique supérieurs dans le cas NaCI 7,5 sont en effet favorables à un certain type d'organisation. Cette étude montre également que, lorsque la "maturation post-compaction" a lieu, il semble préférable pour une bonne efficacité de transfection de compacter l'ADN avec un lipide dont la taille particulaire n'est pas trop importante (eau 7,5). Pour une bonne efficacité de transfection en présence de sérum il semble donc qu'il faille réaliser un compromis entre structuration du lipide et taille des particules.
Exemple 9
A. Protocole de préparation du complexe et transfection : Le lipide (DOGS) est présenté à l'ADN sous la forme d'une suspension à 2 mM dans le NaCI 150 mM à pH natif (3,5) et "pré-maturé" 1jour avant compaction (1 J) ou 4 jours avant compaction (4J). Le lipide est introduit dans une suspension contenant le plasmide pXL2784 et composée de 150 mM NaCI ajusté à un pH de 6,6 (ce pH est une valeur mesurée). La "maturation de post-compaction" est de 0 (0) ou 3 heures (3H). La transfection a été réalisée en présence (SVF) et en l'absence de sérum de veau foetal.
B. Résultats :
Les résultats de transfection exprimés en RLU (Relative Light Unit) pour 5 μl de lysat, soit 1/50ème de puits, sont présentés sur la Figure 10. Chaque valeur est une moyenne de mesure sur 4 puits. Les écarts types sont représentés par des barres horizontales.
Cette étude ne montre pas de différence significative entre les différents protocoles lorsque la transfection est réalisée en l'absence de sérum de veau foetal. En revanche en présence de sérum, on constate qu'une "pré- maturation" longue (4 jours) peut permettre de s'affranchir en partie de l'effet inhibiteur du sérum lorsqu'il n'a pas été procédé à une "maturation post- compaction". Cette étude montre également que lorsqu'on procède à une "maturation post-compaction", une "pré-maturation" supplémentaire s'avère inutile mais non néfaste, tout du moins dans le cas d'une pré-maturation dans NaCI 150 mM à pH natif, et pour les temps de "pré-maturation" décrits ci-dessus.
Exemple 10
A. Protocole de préparation du complexe et transfection : Le lipide (DOGS) est présenté à l'ADN sous la forme d'une suspension à 2 mM dans le NaCI 150 mM à pH 7,5 et soit chauffé immédiatement (IM), soit "pré-maturé" 1jour (U), soit "pré-maturé" 1 mois (1 M) avant la compaction. Le lipide est introduit dans une suspension contenant le plasmide pXL2784 et composée de 150 mM NaCI ajusté à un pH de 7,2 (ce pH est une valeur mesurée). La "maturation de post-compaction" est de 0 (0) ou 3 heures (3H). La transfection a été réalisée en présence de sérum de veau foetal.
B. Résultats :
Les résultats de transfection exprimés en RLU (Relative Light Unit) pour 5 μl de lysat, soit 1/50ème de puits, sont présentés sur la Figure 11. Chaque valeur est une moyenne de mesure sur 4 puits. Les écarts types sont représentés par des barres horizontales.
Cette étude montre qu'une "pré-maturation" permet de s'affranchir en partie de l'effet inhibiteur du sérum sur la transfection lorsqu'on ne procède pas à une "maturation post-compaction". En revanche lorsqu'une maturation du complexe nucléolipidique est entreprise il est constaté que l'efficacité de transfection obtenue est meilleure lorsque le lipide a été chauffé immédiatement avant sa mise en contact avec l'ADN et donc qu'il se trouve sous la forme de petites particules lipidiques. Exemple 11
A. Protocole de préparation du complexe et transfection : Le lipide (DOGS) est présenté à l'ADN sous la forme d'une solution micellaire à 2 mM dans l'eau pure (pH natif de 3,5). Le lipide est introduit dans une suspension contenant le plasmide pXL2784 et composée de 150 mM NaCI ajusté à un pH de 7,3 (ce pH est une valeur mesurée). La "maturation de post-compaction" est de 0 (0) - 0.5 heure (0,5H) - 3 heures (3H) - 1 jour (U) ou 1 semaine (1S). La transfection a été réalisée en présence de sérum de veau foetal.
B. Résultats :
Les résultats de transfection exprimés en RLU (Relative Light Unit) pour 5 μl de lysat, soit 1/50ème de puits, sont présentés sur la Figure 12. Chaque valeur est une moyenne de mesure sur 4 puits. Les écarts types sont représentés par des barres horizontales.
Cette étude confirme que lorsque DOGS est présenté à l'ADN sous la forme d'une solution micellaire, une "maturation post-compaction" devient nécessaire pour s'affranchir de l'effet inhibiteur du sérum. On constate dans le cas présent qu'une maturation "post-compaction" de 3 heures s'avère suffisante.
L'ensemble de ces résultats montre que le procédé de l'invention, impliquant une étape préalable de chauffage et des étapes avantageuses de maturation, permet d'obtenir des compositions définies, homogènes, reproductibles, dont les propriétés transfectantes sont améliorées. BIBLIOGRAPHIE
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'une composition pour le transfert d'acides nucléiques comprenant la mise en contact d'un acide nucléique avec un lipide cationique, caractérisé en ce que, préalablement à la mise en contact, le lipide cationique est soumis à une étape de chauffage.
2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le lipide cationique est chauffé jusqu'à formation d'une solution micellaire.
3. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que le lipide cationique est chauffé jusqu'à une température supérieure à sa température de transition de phase.
4. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend en outre, entre l'étape de chauffage et l'étape de mise en contact, une étape de maturation pré-compaction du lipide cationique.
5. Procédé selon la revendication 1 ou 4 caractérisé en ce qu'il comprend en outre, après l'étape de mise en contact, une étape de maturation post- compaction du complexe nucléolipidique.
6. Procédé selon la revendication 1 ou 4 caractérisé en ce que la mise en contact est réalisée à pH compris entre 4 et 10, de préférence entre 6 et 9.
7. Procédé selon la revendication 1 ou 4 caractérisé en ce que la mise en contact est réalisée à force ionique comprise entre 0 et 2M, de préférence 0.01 et 0,5M, de préférence entre 0,05 et 0,2M.
8. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que la maturation pré- compaction est réalisée par refroidissement, modification de la force ionique du milieu et/ou modification du pH du milieu.
9. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que la maturation pré- compaction est réalisée par incubation à température ambiante.
10. Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que la maturation pré- compaction est réalisée par incubation à température ambiante pendant une période comprise entre 0,5 heure et 1 mois.
11. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que la maturation pré- compaction est réalisée jusqu'à formation d'agrégats organisés de type vermiculaires, tubulaires, lamellaires, hexagonaux et/ou colonnaires.
12. Procédé selon la revendication 11 caractérisé en ce que la maturation pré-compaction est réalisée jusqu'à l'apparition d'agrégats organisés de type vermiculaires et/ou tubulaires.
13. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que la maturation post-compaction est réalisée par refroidissement.
14. Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que le refroidissement est réalisé par incubation à température ambiante.
15. Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que la maturation post-compaction est réalisée jusqu'à formation d'agrégats organisés de type hexagonaux, lamellaires et/ou colonnaires, ou plus gros.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le lipide cationique est choisi parmi les lipopolyamines.
17. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que le lipide cationique est une lipospermine ou une lipothermine.
18. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'acide nucléique est un ADN.
19 Procédé selon la revendication 18 caractérisé en ce que l'ADN est un plasmide, vecteur, ou fragment linéaire.
20. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'acide nucléique est un ARN.
21. Procédé pour le transfert d'acide nucléique dans des cellules in vitro ou ex vivo comprenant la mise en contact dudit acide nucléique avec une suspension de lipide cationique préalablement chauffée, et l'incubation des cellules avec le complexe nucléolipidique résultant.
22. Procédé selon la revendication 21 catactérisé en ce qu'il comprend la mise en contact de l'acide nucléique avec une suspension de lipide cationique préalablement chauffée et maturée.
23. Procédé selon la revendication 21 ou 22 catactérisé en ce que le complexe nucléolipidique est mature préalablement à l'incubation avec les cellules.
24. Composition pour le transfert d'acides nucléiques caractérisée en ce qu'elle est essentiellement insensible à l'effet inhibiteur par le sérum et en ce qu'elle peut être obtenue par le procédé selon la revendication 1.
25. Composition selon la revendication 24 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un ou plusieurs adjuvants lipidiques.
26. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le lipide cationique comprend en outre des adjuvants lipidiques.
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