JP2001501641A

JP2001501641A - 核酸導入用組成物の製造方法

Info

Publication number: JP2001501641A
Application number: JP10517234A
Authority: JP
Inventors: ブクニカシユビリ，ツイアラ; バキユス，ジヨエル
Original assignee: ローヌ―プーラン・ロレ・エス・アー
Priority date: 1996-10-08
Filing date: 1997-10-03
Publication date: 2001-02-06
Also published as: HUP9904579A2; CA2267187A1; AU723371B2; NO991383L; IL129336A0; SK43199A3; NO991383D0; KR20000048958A; CZ119299A3; ZA979031B; US6156338A; EP0948638A1; HUP9904579A3; WO1998015639A1; FR2754272A1; FR2754272B1; AU4559197A; BR9712210A

Abstract

(57)【要約】本発明は、核酸とカチオン性脂質とを接触させる処理から成る核酸導入用組成物の製造方法に関する。本発明方法によれば、接触に先立ってカチオン性脂質を加熱段階で処理する。本発明はまた、本発明方法によって得られた組成物及びそれらの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】核酸導入用組成物の製造方法本発明は核酸導入用組成物の製造方法に関する。得られた組成物は試験管内（ｉｎｖｉｔｒｏ）、生体外（ｅｘｖｉｖｏ）または生体内（ｉｎｖｉｖｏ）の細胞に核酸を導入するために使用され得る。ヌード核酸（通常は高分子量であり負電荷を有している）の細胞浸透は希有な現象であり、ヌード核酸による細胞トランスフェクションの効率は極めて低い。このため従来技術でも、細胞に核酸を導入する様々な種類のベクター及び方法が研究され発表されてきた。従来技術はウイルスベクター及び物理的方法の２種類に大別できる。ウイルスベクターとしては例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、バキュロウイルスなどが使用される。一般にウイルスベクターは極めて優れた導入効率を示す。しかしながら、ウイルスベクターには、その構築及び産生が難しい、そのクローニング容量がしばしば小さい、などの難点がある。また場合によっては、ウイルスベクターの使用に伴って、ウイルスの使用に固有の幾つかの欠点（伝播、病原性、など）が生じる。このため、核酸導入を目的とする種々の物理的方法が開発された。例えば、電気穿孔、共沈、または、粒子銃の使用、などがある。電気穿孔では、ＤＮＡを含有する細胞懸濁液に電界を作用させる。しかしながら、この方法は幾つかの場合には好結果を与えるとしても、細胞膜に不可逆的な損傷を与える危険があるので最大限に利用することは難しい。粒子銃を使用する方法では、粒子（金、タングステン）を核酸で被覆し、次いで細胞に打込む。しかしながらこの方法は本質的に植物細胞のような外壁のある細胞を対象としている。また、ＤＮＡをある種のポリマー（ＤＥＡＥ−デキストラン）またはリン酸カルシウムと共沈させる方法は、再現性に乏しいという欠点、及び、ときには細胞毒性であるという欠点を有している。これらの欠点を解消するために、合成導入ベクターが開発されてきた。これらのベクターの本質的な役割は、細胞侵入に好適な形態の核酸を形成し、（細胞質内部、次いで核の内部への）核酸の侵入を促進し、しかも核酸を細胞質ヌクレアーゼから保護することである。これらのベクターのうちでも、カチオン性脂質が有利な特性を有している。カチオン性脂質から成るベクターは、核酸と縮合し得る極性カチオン部分と、イオン相互作用を安定させる疎水性脂質部分とから構成されている。カチオン性脂質の極性部分がイオン化するので、過剰量の脂質は細胞膜との相互作用にも有利である。カチオン性脂質の特定例としては特に、リポポリリシン、モノカチオン性脂質（ＤＯＴＭＡ；リポフェクチン(登録商標)）；ある種のカチオン性界面活性剤（ＤＤＡＢ）；リポスペルミン（ＤＯＧＳ、ＤＰＰＥＳなど）及びリポテルミンなどがある。任意に紡錘体形成性（ｆｕｓｏｇｅｎｅ）脂質（ＤＯＰＥなど）と組合せて使用されたこの種のベクターは、多くの種類の細胞に対してｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏ及びｉｎｖｉｖｏで優れた核酸導入特性を有することが証明された。従ってこれらのベクターは、ウイルスベクター及び物理的方法に代替する有利な核酸導入手段となり得る。しかしながら、これらのベクターは工業的規模であまり利用されていないのが現状である。特に、従来技術に記載されたこれらのベクターの作製方法は実験に基づく方法であって工業化適性及び再現性に乏しく、また、最適特性を与える組成をもたない不確定な組成の混合物が得られる。組成物の公知の製造方法では例えば、脂質の種々の構成成分をクロロホルム中で混合し、窒素流下で２０分間乾燥し、次いで真空下で乾燥する。このようにして得られた脂質フィルムを脱イオン水〔Ｈｕｉ９６〕，〔Ｆｅｌｇｎｅｒ８７〕で復元する。次に混合物を渦流によって撹拌して脂質を再懸濁させ、音波処理槽で懸濁液が清澄化するまで１０分間音波処理し、次いで希釈する。細胞に添加する直前に圧縮(ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ、複合体形成)を行って、Ｆ１０培養培地中で３７℃で４時間静置する。この方法には幾つかの変法が存在する。例えば、クロロホルムで溶解し乾燥した後、フィルムを２０ｍＭのＮａＣｌ溶液〔Ｇｕｅｒｓｈｏｎ９３〕または２０ｍＭのＨｅｐｅｓバッファ〔Ｇａｏ９１〕で復元してもよい。懸濁液を常法で渦流によって撹拌し（フィルムの復元直後または４℃で２４時間の水和段階後〔Ｇａｏ９１〕）、種々の時間の音波処理を行ってもよい。ときには圧縮後に複合体のイオン強度及びイオン符号を変化させてもよい〔Ｘｕ１９９６〕。研究者によってはチタン音波ゾンデを使用するので、音波処理自体にもいくつかの変法がある〔Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ１９９５〕。クロロホルムによる溶解、蒸発、乾燥によるフィルムの形成、水性媒体による復元及び音波処理から成る製造方法はまた、中性脂肪とカチオン性界面活性剤との組合せから成るリポソームの製造においても頻用されている〔Ｐｉｎｎａｄｕｗａｇｅ８９〕。別の製造方法では、（エタノール溶液、水性懸濁液またはリポソーム配合物の形態の）市販の脂質をＭＥＭ培養培地で直接希釈する。ＤＮＡを同じ希釈度に希釈し、両方の成分を倒置によって混合し、懸濁液を周囲温度で１５〜３０分間静置する。次いで、新たに希釈した後、細胞に６時間接触させる〔Ｆａｓｂｅｎｄｅｒ９５〕。また、市販の脂質とＤＮＡとを別々に蒸留水に希釈し、その後で単なる撹拌によって接触させ、任意に周囲温度で１５分間インキュベーションする簡単な方法も使用できる〔Ｂｒｉｎｇｈａｍ８９〕。別の方法では、脂質の初期形態が種々の濃度のエタノール溶液であり、これをＤＮＡに接触させる直前に培養培地で即時希釈する〔Ｂｅｈｒ８９〕。また、エタノール溶液を圧縮直前または圧縮１０分前に別の媒体（水、種々の濃度のＮａＣｌ）に希釈してもよい。圧縮後、任意に１０分間待機した後で、種々のイオン組成の媒体に再度希釈してもよい。最終希釈の０分後または１０分後にトランスフェクションを行う〔Ｂａｒｔｈｅｌ９３〕。また、ＤＮＡを含む水性懸濁液にエタノール溶液を直接導入し、次いで混合物を処理槽で音波処理してもよい〔Ｄｅｍｅｎｅｉｘ９１〕。また、ＤＯＳＰＡ／ＤＯＰＥ混合物から成るカチオン性リポソーム〔Ｈｏｆｌａｎｄ９６〕を１０ｍＭのトリス溶液（ｐＨ７．４）中の１％のオクチルグルコシド（ＯＧ）によって可溶化することも公知である。ＤＮＡに接触後、（余剰のＯＧミセルを除去するために）複合体を２，０００倍容量の１０ｍＭトリス／５％デキストロース(ｐＨ７．４)に温度４℃で４８時間透析する。この透析を３回繰返す。血清を除去したＤＭＥＭ中でトランスフェクションを３７℃で４〜５時間行う。カチオン性リポソームはまた、脂質フィルムを再水和し、所定の孔径の多孔性ポリカーボネート膜から連続的に押出す方法〔Ｄｕｚｇｕｎｅｓ８９〕または微粒流動化方法〔Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ９４〕によって製造できる。これらの製造方法はいすれも、工業的規模に応用するためには幾つかの欠点を有している。音波処理を工業的規模で行うことは難しく、また、音波処理によって形成された小胞の安定性がしばしば十分でない。更に、金属から得られたゾンデを音波処理に使用すると、医薬用途には有害な粒子が媒体中に放出される。また、濾過を用いた場合、最終濾過膜の孔径によって規定される粒度のリポソームしか得られない。また、リポソームの経時的安定性が保証されない。エタノール溶液の形態の脂質を使用する場合には、有機溶媒の使用という問題に加えて、極めて多分散性の粒子の形成が誘発されることが明らかになっている。出願人はここに、トランスフェクション用組成物の新規な製造方法を開発した。より詳細にはこの方法は、出願人が行った脂質ベクターの物理化学的特性のキャラクタリゼーションに基づく。このようなキャラクタリゼーションによって出願人は、これらのベクターが条件次第で種々の物理化学的状態（ミセル形態、成熟凝集体の形態、など）で存在することを証明した。出願人は特に、脂質ベクターの種々の物理化学的状態のキャラクタリゼーションに成功し、また、種々の状態間の転移を調節し、ＤＮＡとの複合体形成及び細胞トランスフェクションに好適な所定の状態で熟成を停止させ得る手段を発見した。従って本発明は、所定の特性及び所定の粒度のトランスフェクション用組成物を工業的規摸で製造し得る再現可能な方法を記載している。より特定的には本発明方法は、均質なミセル懸濁液を得るためのカチオン性脂質の予備処理に基づく。従って、本発明の第一の目的は、カチオン性脂質を核酸に接触させる段階から成る核酸導入用組成物の製造方法において、核酸に接触させる前にカチオン性脂質を加熱する段階を含むことを特徴とする方法を提供することである。出願人は、種々のカチオン性脂質の物理化学的特性を試験した。得られた結果は、媒体のイオン強度、媒体のｐＨまたは温度次第で、カチオン性脂質が複数の異なる物理的状態で存在することを示した。後述の実施例は特に、種々のカチオン性脂質（リポスペルミン、リポテルミン）の相図を示している。実施例はまた、光学密度をｐＨ及び温度の関数として測定することによって、ｐＨ及び温度の条件に従って複数の異なる物理化学的状態が明らかに出現することを示している。出願人はここに、複数の異なる物理的状態の脂質はＤＮＡとの圧縮及び細胞トランスフェクションにおいても異なる特性を示すこと、及び、脂質をこのような複数の異なる物理的状態にするための再現可能な調節方法の開発が有益であることを証明した。特に、脂質懸濁液の加熱処理を含む本発明の方法は、工業的利用の制約に容易に対応できる簡単な方法であるという利点を有している。本発明方法は更に、ＤＮＡに接触させる前または接触させた後の脂質の構造を編制速度の調節によって管理できるという利点を有している。本発明方法では更に、工業的規模で利用するために不可欠な要件である製造方法の標準化が可能である。より特定的には方法は、カチオン性脂質をミセル溶液が形成されるまで加熱する予備段階を含む。より好ましくは、脂質ベクターを相転移温度よりも高い温度まで加熱する。相転移温度は脂肪鎖の溶融温度に相当する。各脂質ベクターの相転移温度を当業者に公知の技術によって決定できる。特に、例えば実施例に示すようなＤＳＣ４装置（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を製造業者の指示通りに用いた示差熱分析法（またはＤＳＣ、ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＳｃａｎｎｉｎｇＣａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ（示差走査熱量測定））を利用し得る。本発明の方法は、任意の種類のカチオン性脂質に使用し得る。特に、リポポリアミンの製造に好適である。リポポリアミンは、化学的アームによって互いに共有結合された少なくとも１つの親水性ポリアミン領域と親油性領域とから成る両親媒性分子である。好ましくは、ポリアミン領域は、一般式Ｈ₂Ｎ−（（ＣＨ）_m −ＮＨ）₁−Ｈで示される。式中のｍは２以上の整数、ｌは１以上の整数であり、ｍは２つのアミン間に含まれる種々の炭素基によって異なる。好ましくは、ｍは２〜６（両端値を含む）であり、ｌは１〜５（両端値を含む）である。より好ましくは、ポリアミン領域はスペルミンもしくはテルミン、またはＤＮＡ結合特性を保存しているそれらの類似体から成る。親油性領域は、薄層構造または六方晶構造の相を形成し得るコレステロール、天然脂質または合成脂質の１つまたは複数の飽和もしくは不飽和の炭化水素鎖でよい。親油性領域が２つの炭化水素鎖を含むのが好ましい。更に、カチオン性脂質を後述するような脂質アジュバントと併用してもよい。カチオン性脂質の好ましい例は、特にリポスペルミン、より特定的にはジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）またはパルミトイルホスファチジルエタノールアミンの５−カルボキシスペルミルアミド（ＤＰＰＥＳ）である。その製造方法は例えば欧州特許出願ＥＰ３９４１１１に記載されている。別の好ましいファミリーはリポテルミンから成り、特にＲＰＲ１２０５３１及びＲＰＲ１２０５３５（フランス特許ＦＲ９５／１３４９０、国際特許ＷＯ９６／１７８２３；これらの特許の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする）が挙げられる。これらの化合物の構造を図１に示す。本発明方法を実施するために、結晶質粉末またはフィルムの形態の脂質を純水または任意にｐＨを調整した生理食塩水媒体で復元する。脂質の転移温度、即ち脂肪鎖の溶融温度よりも高温に加熱して均質化する。前述のように、この相転移温度は示差熱分析法によって決定できる。例えばＤＯＧＳの場合、この温度はｐＨ７．５の水中で３８℃であり、ｐＨ８．８で４４℃である。酸性ｐＨの純水中では転移は全く観察されない。即ち、酸性ｐＨの純水中では温度に関わりなく脂質はミセルの形態である。相転移温度はまた、媒体のイオン強度の関数である。例えば、ＮａＣｌ溶液中のＤＯＧＳの相転移温度は、酸性ｐＨで４４．４℃、ｐＨ７．５で４２℃及びｐＨ９．９で３９．８℃ である。この相転移温度は勿論、脂質毎に異なっている（実施例参照）。特にＲＰＲ１２０５３１の場合、ＤＳＣ及び混濁度測定によって測定した相転移温度は５１．５℃（粉末）及び３０℃（水和、ｐＨ７．５）である。ＲＰＲ１２０５３５の場合、相転移温度は約４３℃（水和、ｐＨ７．５）である。加熱には、湯煎、直接加熱、または、温度を上昇させ得る任意の手段を使用し得る。適当なｐＨ条件下では懸濁液の清澄化を特徴とするミセル溶液が形成される。ミセルの存在は混濁度測定、Ｘ線の小角散乱／回折のような技術、Ｃｒｙｏ透過型電子顕微鏡観察によって証明される。本発明方法の予想外の別の利点は、組成物のトランスフェクション効率が高いことである。即ち、得られた組成物は血清の存在に関わりなく細胞トランスフェクション可能であるという利点を有している。実際、カチオン性脂質によるトランスフェクション（ｉｎｖｉｔｒｏ，ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｖｏ）が血清（例えば、ウシ胎仔血清）によって阻害されることは公知である。実施例の結果は、本発明方法によれば脂質の予備加熱によって血清の存在下のトランスフェクション効率が改善されることを示している。従って、本発明の組成物は血清の存在下でも非存在下でも同様に優れたトランスフェクション効率を有している。ミセル溶液の形成後、脂質溶液を直接に核酸に接触させ、得られたヌクレオリピド複合体を直接使用して細胞トランスフェクションを惹起し得る。このような組成物の利点は特に、組成物の均質性、確定性及び再現可能性にある。しかしながら出願人はまた、組成物の特性、特にトランスフェクション特性を更に改善するために、核酸に接触させる前のカチオン性脂質の熟成処理（圧縮前熟成）及び／または核酸に接触させた後のヌクレオリピド複合体の熟成処理（圧縮後熟成）を行うのが有利であることを証明した。脂質／複合体の熟成処理によって、カチオン性脂質の構造及び粒度の再編制が生じる。出願人は実際、本発明方法の第一段階で得られたミセル溶液中の脂質が変化し、種々の粒度及び種々の構造の編制体を形成することを証明した。出願人はまた、核酸との複合体形成（圧縮）能力及びトランスフェクション特性の双方にカチオン性脂質の編制状態が影響を及ぼすことを証明した。本発明方法は更に、加熱段階と接触段階との間に脂質ベクターの圧縮前熟成段階を含む。本発明方法は更に、接触段階後に、ヌクレオリピド複合体の圧縮後熟成段階を含む。ミセル溶液を出発材料とし、種々の脂質分子間の相互作用及ひ超分子的再編制を促進することによって、種々の編制体を形成することが可能である。後述の実施例は特に、カチオン性脂質か層状、管状または毛髪状の予想外の編制状態に移行することを示す。濃度の増加に伴って、柱状または六方晶状のようなより大きい粒度の状態が出現する。これらの種々の構造は夫々に異なる特性を有している。本発明を実施するためには、圧縮前熟成を行うのが有利である。好ましくはこの段階を、層状、管状、毛髪状、柱状及び／または六方晶状の編制された凝集体が出現するまで行う。より好ましくはこの段階を、層状、管状及び／または毛髪状の編制された凝集体が出現するまで行う。この種の凝集体は実際、核酸との複合体を形成するために特に好適な初期構造を有している。熟成処理は、カチオン性脂質分子間の相互作用を増進するかまたは分子間の再編制を促進し得る任意の手段で行うことができる。本発明によれば、熟成処理は好ましくは、温度低下、媒体のｐＨ増加及び／または媒体のイオン強度の増加によって行う。温度を低下させることによって、脂質の脂肪鎖が再編制され、カチオン性脂質が再構成され得る。図２に示す結果は、脂質の内部構成を表す脂質溶液の光学密度が媒体の温度の関数として明らかに変化することを示している。媒体のｐＨまたはイオン強度を増加させることによって、ベクターのカチオン性部分に存在する陽ィオン電荷の状態を変化させることが可能である。出願人は、例えば媒体を徐々に中和（ｐＨ）するかまたは電荷を徐々に保護（遮蔽、イオン強度）することによって、脂質分子間の静電斥力を調節的に減少させ、相互作用及び構成化凝集体の再編制を促進し得ることを証明した。図４及び５に示す結果は、脂質の編制状態に対するｐＨ及びイオン強度の効果を示す。図３の写真は、観察された種々の凝集体を示す。好ましくは圧縮前熟成処理を温度低下によって行う。より好ましくは圧縮前熟成処理を周囲温度の溶液のインキュベーションによって行う。これによって熟成（凝集及び再編制）が緩徐に進行する。このような熟成速度は核酸との圧縮に好適である。熟成の継続期間は脂質の種類、ｐＨ及び温度条件次第で異なっている。後述の実施例は、数時間から１カ月間の熟成が可能であることを示す。圧縮前熟成期間は特に、層状、管状または毛髪状の構成体の出現によって決定される。しかしながら、縮合段階のｐＨ及び／またはイオン強度が十分に高いとき、及び／または、圧縮後熟成処理を行うときは、圧縮前熟成処理を削除できるという利点がある。即ちこれらの場合にはミセル形態の脂質からより小さく且つ均一な粒度のヌクレオリピド複合体が得られるが、このような複合体は血清の有無に関わりなくトランスフェクションに有効である。また、媒体のイオン強度の増加によって熟成処理を行ってもよい。この場合には、可溶化のとき、熟成のとき、または、接触（圧縮）のときに、０〜０．５Ｍの範囲のイオン強度をもつ溶液を用いるのが有利である。好ましくは、等張（０．１５Ｍ）に近い溶液、即ち、０．０５〜０．２Ｍの範囲のイオン強度をもつ溶液を使用する。種々の塩（ＮａＣｌ；ＫＮ０３，Ｋｌなど）を使用し得る。また、ｐＨを利用して熟成処理を行ってもよい。３〜９のｐＨ範囲、好ましくは６〜９のｐＨ範囲で熟成または圧縮を行うのが有利である。使用される脂質ベタターのｐＫ及び脂質の相図に従ってｐＨを調節することは当業者にもちろん可能である。カチオン性ベクターのアミンの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％が脱プロトン化しているｐＨ範囲が有利である。一般に圧縮前熟成処理は、ｐＨ及びイオン強度に関わりなく、脂質の相転移温度よりも低温まで温度を低下させることによって行う。熟成段階及び／または圧縮段階自体においてこの温度低下とｐＨ及びイオン強度の変化とを併用してもよい。例えば、中間的なｐＨ及びイオン強度の条件（例えばｐＨ８以下の１５０ｍＭのＮａＣｌ中のＤＯＧＳの場合）では、以下のような編制状態が観察される。ｐＨ７．５の１５０ｍＭのＮａＣｌ中のＤＯＧＳ懸濁液は、 −約５０℃に加熱直後にはほぼ球状のミセル（図３Ａ）から成り、 −加熱し周囲温度に冷却した３時間後には種々の長さの棒状及び毛髪状の球状ミセル（図３Ｂ）から成り、 −加熱し周囲温度に冷却した１週間後には種々の粒度の層状構造の小円板（図３Ｃ）から成り、 −加熱し周囲温度に冷却した１カ月後には層状構造の大円板（図３Ｄ）から成る。固有ｐＨ（約３．５）の場合には同じ懸濁液が、加熱し周囲温度に冷却した１日後に球状及び毛髪状のミセルから成る。ｐＨ５に調整したＤＭＥＭ媒体中のＤＯＧＳ懸濁液は、 −加熱直後には球状ミセル単独から成り、 −加熱し周囲温度に冷却した５時間後または１週間後には球状及び毛髪状のミセルから成る。これらの観察は、層状または毛髪状の編制凝集体を形成するために脂質の種類及び媒体の条件に応じて適当な熟成期間を選択できることを示す。媒体の条件及び加熱後の時間に基づいて脂質が有している構造を知ることができるので、以後にＤＮＡに接触させる脂質の構造を調節することが可能である。更に、加熱／冷却／“圧縮前熟成”の方法は完全に可逆的である。従って、熟成時間を超過した場合には、懸濁液を再加熱することによって全条件に共通のミセル状態に戻すことが可能である。加熱段階及び任意の圧縮前熟成段階後に脂質を核酸に接触させる。核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよい。ＤＮＡは、種々の遺伝要素（コーディングフェーズ、プロモーター、ターミネーター、結合部位、複製起点、など）を担持する直鎖状または環状の超コイル形または弛緩形のプラスミド型または非プラスミド型のＤＮＡでよい。核酸は種々の起原（ヒト、動物、下等真核生物、原核生物、植物、ウイルス、ファージなど）に由来し得る。核酸はまた、合成または半合成の核酸でもよい。核酸のサイズは(オリゴヌクレオチドから完全ゲノムまで)極めて多様である。本発明組成物の利点は更に、任意のサイズの核酸導入に適応できることである。特定の実施態様によれば、核酸は、特定のタンパク質またはＲＮＡの発現カセットを担持するＤＮＡ（例えはプラスミドまたはＤＮＡフラグメント）である。これらのタンパク質またはＲＮＡをｉｎｖｉｔｒｏ，ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｖｏで産生させる目的が、治療用または農産物加工用のタンパク質（酵素、アミノ酸など）を得るためであってもよい。更に、核酸は、異なる特性を有している種々の核酸の混合物であってもよい。核酸は当業者に公知の任意の技術（バンクスクリーニング、人工的合成、混成方法など）によって製造できる。接触（圧縮）処理に用いるために、核酸（核酸組成物）を水性媒体に易溶性にする。圧縮効率及び最終組成物の導入特性を改善するように水性媒体の組成、イオン強度及びｐＨを調節する。特にＤＯＧＳを用いて行った試験では、接触段階以前の脂質の状態に関わりなくＤＮＡと接触中に脂質がミセル状態で存在する媒体（即ち、極めて弱いイオン強度及び／または低いｐＨの媒体）中で圧縮させるとき、ウシ胎仔血清の存在下で良好なトランスフェクション効率が得られないことが確認された。このような低ｐＨ及び弱イオン強度の条件下で形成された複合体は層状の構造を有していないことが判明した。従って、好ましくはｐＨ範囲４〜１０の生理的食塩水媒体中で圧縮処理する。最適条件は脂質の種類に依存し、特に核酸の存在下で層状の相を形成する脂質の能力に依存する。好ましくは、ｐＨ６〜９の範囲の媒体中で圧縮処理する。媒体の有利な塩分濃度は０〜２Ｍの範囲、好ましくは０．０１〜０．５Ｍの範囲、より好ましくは０．０５〜０．２Ｍの範囲である。圧縮に有利な媒体は、ｐＨ６〜９の範囲をもつほぼ等張（０．１５Ｍ）の媒体である。これらの条件は、脂質の加熱媒体または圧縮前熟成に適用される。これらの条件下では媒体の変性を生じることなく圧縮が生じる。圧縮前熟成を異なる条件下で行う場合には、上記の値を指標として媒体の組成を調節するのが有利である。実施例に示した結果は、これらの条件下で特に有利な予想外のトランスフェクション特性を有する組成物が得られることを実証している。特に、血清による阻害作用に不感受性の組成物を得ることが可能であり、これはｖｉｔｒｏ（ＳＶＦ）またはｖｉｖｏで使用するために特に有利である。接触処理のために、核酸及び脂質の夫々の量及び濃度を変更し得る。これらの量及び濃度は、従来技術に記載された同様のベクターで使用される量及び濃度である。特に、核酸及び脂質のそれぞれの使用量は、脂質の正電荷と核酸の負電荷との比によって決定される。この電荷比は０．０１〜１００の範囲である。当業者は、使用目的がｖｉｔｒｏであるかｖｉｖｏであるかに基づき、選択された脂質及び選択された核酸の種類に従って適正な比を選択する。電荷比の好ましい範囲は０．０１〜２０である。このようにして得られたヌクレオリピド複合体をそのままでトランスフェクションに使用できる。また、複合体の導入特性の改善に最適な複合体の構造的編制が得られるように“圧縮後熟成”と呼ばれる熟成処理を行ってもよい。実際、核酸との圧縮に好適な脂質の編制状態は必ずしもトランスフェクションレベルの向上に最適な編制状態ではない。従って、層状、柱状及び／または六方晶状に編制された凝集体が出現するまで圧縮後熟成処理を行うのが有利である。圧縮の初期からこのような凝集体が出現するときも、組成物を均質化するために圧縮後熟成処理を行うのが有利である。圧縮後熟成の条件及び手段は圧縮前熟成の条件及び手段と同様である。当業者は、圧縮前熟成及び脂質ベクターの種類に従って適当な熟成処理期間を決定し得る。得られた組成物は、核酸導入のために即時に使用できる。また、組成物を後で使用するために例えば凍結乾燥形態または冷凍形態で貯蔵及び保存してもよい。前述のように本発明の組成物は工業利用に好適な多くの利点を有している。組成物は、所定の粒度を有しており、均質で再現可能で安定であり、高い導入能力を与える。より特定的には本発明の目的は、カチオン性脂質と核酸との複合体を含む核酸導入用組成物であって、導入効率が血清の存在によって実質的な影響を受けないこと及び組成物が上述の方法によって得られることを特徴とする組成物を提供することである。組成物は好ましくは、カチオン性脂質としてリポポリアミンを含んでいる。より好ましくは、リポポリアミンは、好ましくは２つの脂肪鎖をもつリポテルミンまたはリポスペルミンである。更に、組成物に幾つかのアジュバント、特に脂質アジュバントを添加し得る。より好ましくは、脂質アジュバントは２つの脂肪鎖を有する中性脂肪である。特に好ましくは、生理的条件下で両イオン性であるかまたはイオン電荷を失った天然または合成の脂質を使用する。より特定的には脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレオイル−パルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジーステアロイル、−パルミトイル、− ミリストイルホスファチジルエタノールアミン、及びそれらの１〜３回Ｎ−メチル化した誘導体；ホスファチジルグリセロール、ジアシルグリセロール、グリコシルジアシルグリセロール、セレブロシド(例えば、特にガラクトセレブロシド) 、スフィンゴリピド（例えば、特にスフィンゴミエリン）、コレステロールあるいはアシアロガングリオシド（例えば、特にアシアロＧＭ１及びＧＭ２）から選択される。これらの種々の脂質は、当業者に公知の慣用の技術で合成してもよく、または器官（例えば脳）もしくは卵から抽出してもよい。特に、天然脂質の抽出は、有機溶媒を用いて行うことができる（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙも参照）。好ましくは、本発明の組成物は、カチオン性脂質に加えて、核酸の燐酸塩１モル当量あたり０．１〜２０モル当量、より好ましくは１〜５モル当量の中性脂肪を含有している。特に有利な実施態様によれば、本発明の組成物は、核酸の導入方向を決めるターゲッティング要素を含む。このターゲッティング要素は、所望の幾つかの細胞型または幾つかの組織（腫瘍細胞、肝細胞、造血細胞など）に向かって核酸を誘導する細胞外ターゲッティング要素でもよい。また、幾つかの重要な細胞小器官（ミトコンドリア、核など）に向かって核酸を誘導する細胞内ターゲッティング要素でもよい。より好ましくは、ターゲッティング要素が共有結合または非共有結合によって脂質に結合される。結合は特に、アンモニウムとのイオン性相互作用によって得られてもよく、または、嫌核性の基（ハロゲン、トシレートなど）、活性エステル（ヒドロキシスクシンイミドなど）またはイソチオシアネートのようなターゲッティング要素に対するベクターのアミンの求核性攻撃によって得られてもよい。ターゲッティング要素はまた、核酸にも結合できる。本発明の範囲内で有用なターゲッティング要素としては、糖類、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは脂質がある。好ましい例としては、抗体、抗体フラグメント、細胞レセプターのリガンドまたはそれらのフラグメント、レセプターまたはそれらのフラグメントなどのような糖類及び／またはペプチドが挙げられる。特に、成長因子レセプターのリガンド、サイトカインレセプター、細胞性レタチンのレセプター、付着タンパク質のレセプターなどがある。また、トランスフェリン、ＨＤＬ及びＬＤＬのレセプターがある。ターゲッティング要素はまた、アシアロ糖タンパク質レセプターをターゲットとする糖でもよく、または、免疫グロブリンのＦｃフラグメントのレセプターをターゲットとする抗体のＦａｂフラグメントでもよい。記載のトランスフェクション用組成物は、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｖｏの核酸導入に使用され得る。ｉｎｖｉｖｏ使用の場合には、局所、経皮、経口、経直爛、膣内、非経口、鼻孔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経真皮などの経路で投与できる形態に調製し得る。好ましくは組成物は、注射可能製剤を得るため、特に所望の器官の処に直接注入するためまたは局所経路（皮膚及び／または粘膜）から投与するための医薬として許容される担体を含有している。等張性無菌溶液の形態でもよく、または、特に場合に応じて滅菌水または生理的血清の添加によって注射可能な溶質を復元し得る特に凍結乾燥された乾燥組成物の形態でもよい。注入に使用される核酸の用量及び投与回数は、種々のパラメーター、特に使用される投与モード、対象となる疾病、発現させるべき遺伝子または所望の治療期間に従って決定される。この観点から、本発明の別の目的は、予め加熱したカチオン性脂質の懸濁液を核酸に接触させ、形成されたヌクレオリピド複合体を細胞と共にインキュベーションする段階から成るｉｎｖｉｔｒｏ、ｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏで細胞に核酸を導入する方法に関する。好ましくは、カチオン性脂質の懸濁液を予め加熱し、熟成させる。同様に好ましい実施態様によれば、ヌクレオリピド複合体と細胞とのインキュベーションに先立ってヌクレオリピド複合体を熟成させる。ヌクレオリピド複合体と細胞とのインキュベーションは、任意に無菌条件の適当な支持体（培養皿、袋、フラスコなど）上で、ｉｎｖｉｔｒｏで行うことができる。インキュベートされるＤＮＡの量は当業者に公知である（１０６細胞あたり約１マイクログラム）。ｉｎｖｉｖｏ使用の場合には組成物のｉｎｖｉｖｏ投与（例えば、表在性投与または深在性投与）によってインキュベーションが行われる。以下の実施例を用いて本発明をより十分に説明する。これらの実施例は本発明の代表的な非限定的実施例であることを理解されたい。図面の簡単な説明図１は、カチオン性脂質の化学構造を示しており、１ＡはＤＯＧＳ、１ＢはＲＰＲ１２０５３１、１ＣはＲＰＲ１２０５３５の化学構造を示す。図２は、ＮａＣｌ中の１ｍＭのＤＯＧＳ懸濁液の４００ｎｍの光学密度に対する温度の影響を示す。図３は、ｐＨ７．５のＮａＣｌ中の２ｍＭのＤＯＧＳ懸濁液のＣｒｙｏ透過型電子顕微鏡写真である。サンプルは、加熱直後（３Ａ）、懸濁液の加熱及び周囲温度に冷却のそれぞれ３時間後（３Ｂ）、１週間後（３Ｃ）及び１カ月後（３Ｄ）に作製した。図４は、水中または１５０ｍＭのＮａＣｌ中の０．６ｍＭのＤＯＧＳ懸濁液の４００ｎｍの光学密度に対するｐＨの影響を示す。試験温度は５０℃である。図５は、ＤＯＧＳ（５Ａ：水；５Ｂ：１５０ｍＭのＮａＣｌ）、ＲＰＲ１２０５３１（５Ｃ：水；５Ｄ：１５０ｍＭのＮａＣｌ）、及び、ＲＰＲ１２０５３５（５Ｅ：水；５Ｆ：１５０ｍＭのＮａＣｌ）の相図である。図６は、実施例５の組成物のトランスフェクション能力を示す。図７は、実施例６の組成物のトランスフェクション能力を示す。図８は、実施例７の組成物のトランスフェクション能力を示す。図９は、実施例８の組成物のトランスフェクション能力を示す。図１０は、実施例９の組成物のトランスフェクション能力を示す。図１１は、実施例１０の組成物のトランスフェクション能力を示す。図１２は、実施例１１の組成物のトランスフェクション能力を示す。材料及び方法１．以下の実施例に使用したプラスミド（ｐＸＬ２７８４）は、カナマイシン耐性遺伝子とＣｏｌＥ１のｃｅｒフラグメントを担持するＣｏｌＥ１誘導体である。真核細胞発現カセットはルシフェラーゼをコードする遺伝子をコントロールするプラスミドｐＣＤＮＡ３のＣＭＶプロモーターを含む（ＰｈｏｔｉｎｕＰｙｒａｌｉｓ）。他の任意の核酸を使用し得ることは理解されよう。２．以下の実施例に使用したカチオン性脂質は、図１に示す構造をもつＤＯＧＳ、ＲＰＲ１２０５３１及びＲＰＲ１２０５３５である。他のカチオン性脂質を用いて同様の実験を実施し得ることは理解されよう。３．トランスフェクションプロトコル。記載の方法はｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏ及びｉｎｖｉｖｏのトランスフェクションのいずれにも有効である。使用した細胞はマウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３である。これを前日に２４ウェルのプレートにウェル当たり５０，０００細胞の密度で播種した。使用した培養培地は、１０％のウシ胎仔血清と１％のＬ−グルタミン（２００ｍＭの母液）と１％のピルビン酸ナトリウムとストレプトマイシン（５，０００ＵＩ／ｍｌ）とペニシリン（５，０００μｇ／ｍｌ）（Ｇｉｂｃｏ）とを補充した４．５ｇ／リットルのブドウ糖を含むＤＭＥＭ培地（ダルベッコの改質イーグル培地）である。トランスフェクションに先立って、ウシ胎仔血消を含まないＤＭＥＭで細胞を２回洗浄する。細胞のトランスフェクションには、１０％のウシ胎仔血消を添加または非添加の２００μｌの培養培地中で、ウェルあたり０．５μｇのＤＮＡと３ナノモルのＤＯＧＳとを含む５０μｌのトランスフェクション懸濁液を用いる。（ＣＯ₂インキュベータ内で）３７℃で４時間のインキュベーション後、ヌクレオリピド複合体を含む培養培地を除去し、１０％のウシ胎仔血清を補充した５００μｌのＤＭＥＭに入れ換える。次に細胞を４８時間インキュベートする。４．真核細胞のルシフェラーゼ活性を測定する。測定はトランスフェクションの４８時間後に行う。ルシフェラーゼは、ＡＴＰ、Ｍｇ²⁺及びＯ₂の存在下のルシフェリンの酸化を触媒し、同時に光子を発生する。光度計によって測定した総発光量はサンプルのルシフェラーゼ活性に比例する。反応体としては、Ｐｒｏｍｅｇａ（ルシフェラーセアッセイシステム）によって提供された製品を指示されたプロトコルに従って使用する。細胞をＰＢＳで２回洗浄後、２５０μｌの溶解バッファによって細胞を溶解させ、各抽出物の不溶性画分を遠心分離によって除去する。細胞溶解バッファに希釈または非希釈の５μｌの上清を用いたアッセイによって定量する。実施例実施例１：カチオン性脂質の分子編制に対する温度の影響結晶化したＤＯＧＳをクロロホルムに溶解することによってＤＯＧＳの１ｍＭコロイド溶液を調製し、溶媒を蒸発させ、凍結乾燥装置で乾燥した。次に、フィルムを０．９％ＮａＣｌバッファ（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）で復元した。５０℃に加熱後、コロイド溶液を４℃で１週間維持した。光学密度を連続的に追跡した（恒温槽ホルダーを備えたＬａｍｄａ２分光光度計（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ））。分光光度計の槽に接続された浴（ＬＡＵＤＡＲＭ６）の温度を、１．２５℃ ／分の所定速度で変化させる。サンプルを入れた槽は撹拌システムを備えている。得られた結果を図２に示す。結果は、約４０℃付近に光学密度の急激な低下を示す。このＯＤ低下は脂質構造の顕著な再編制が生じたことを意味する。同時に、これらの温度変化中のＤＯＧＳの物理的状態のＣｒｙｏ透過型電子顕微鏡写真を撮影した。このために、ｐＨ７．５のＮａＣｌ中の２ｍＭのＤＯＳＧの懸濁液を５０℃に加熱した。周囲温度でインキュベーションを行う熟成処理中のサンプルの物理的性質を加熱後の時間の関数として測定した。得られた結果を図３に示す。それぞれのサンプルを加熱直後（３Ａ）、懸濁液の加熱及び周囲温度に冷却の３時間後（３Ｂ）、１週間後（３Ｃ）及び１カ月後（３Ｄ）に調製した。得られた結果は、ＤＯＧＳの構造が、ミセル段階から棒状及び毛髪状の構造を経由して層状体の形成まで変化することを表す。この実施例は、脂質の圧縮前熟成条件を確定し得る。実施例２：カチオン性脂質の分子編制に対するｐＨの影響結晶化したＤＯＧＳをクロロホルムに溶解してＤＯＧＳの１ｍＭコロイド溶液を調製し、溶媒を蒸発させ、凍結乾燥装置で乾燥した。次に、ｐＨ範囲３．０〜１１．０の１５０ｍＭのＮａＣｌまたは水でフィルムを復元した。５０℃に加熱後、懸濁液を周囲温度（２５℃）に少なくとも３時間維持した後で測定を開始した。実施例１に記載の条件で光学密度を測定した。得られた結果を図４に示す。光学密度がｐＨの関数として増加することが極めて明らかである。光学密度の増加は、静電斥力の減少によって脂質の分子間の相互作用が増加したことを表している。実施例３：カチオン性脂質の相図実施例１及び２で得られた観察が正しいことを確認するために、種々の脂質ベクターの相図を作成した。これらの相図は、ｐＨ、イオン強度及び温度の条件に依存する脂質の物理的状態を表している。また、脂質の相転移温度及び凝集挙動を脂質のイオン化状態の関数として示している。ＤＯＧＳに関する相図は図５Ａ及び５Ｂ、ＲＰＲ１２０５３１に関する相図は図５Ｃ及び５Ｄ、ＲＰＲ１２０５３５に関する相図は図５Ｅ及び５Ｆに示されている。これらの相図は、脂質を純水（ｐＨ≦６）に溶解した場合には本発明の加熱によって得られたミセル溶液が安定であることを示している。これらの相図はまた、ミセル溶液が安定に維持されるイオン強度及びｐＨ条件を確定する。実施例４：基本電解質中の種々の対イオンの試験熟成段階で種々の対イオンを試験した。このために、０．１Ｍの濃度の基本電解質を含みｐＨを調製していない（固有ｐＨ：３．５）媒体中の種々のＤＯＧＳ懸濁液を加熱及び周囲温度に冷却した後で１週間観察した。 −ＫＮＯ₃中では、ナノメーター構造はミセル型であり、観察される鮮明な縁は少ない。サブミクロン構造は強し肩疑集傾向をもつ細いフィラメントである。 −ＫＩ中では、ナノメーター構造は積層型であり、極めて鮮明な縁が観察される。サブミクロン構造は同じくフィラメントの形態であるが、ＫＮＯ₃中に比べてより弱い凝集傾向をもつより太いフィラメントである。実施例５Ａ．複合体の調製及びトランスフェクションプロトコル固有ｐＨ（３．５）の１５０ｍＭのＮａＣｌ中の２ｍＭの懸濁液の形態を有しておりＤＮＡに接触させる前日に加熱し周囲温度に放冷した（“１日間の予備熟成”）脂質（ＤＯＧＳ）をＤＮＡに接触させる。ｐＨ５〜６．６または８．２（これらのｐＨは測定値である）に調節した１５０ｍＭのＮａＣｌから成りプラスミドｐＸＬ２８７４を含む懸濁液に脂質を導入する。“圧縮後熟成”は周囲温度で０または３時間である。ウシ胎仔血清の存在下（ＳＶＦ）または非存在下でトランスフェクションを行った。Ｂ．結果トランスフェクション結果を、５μｌの溶菌液、即ち１／５０のウェルあたりのＲＬＵ（ＲｅｌａｔｉｖｅＬｉｇｈｔＵｎｉｔ（相対光量））として図６に示す。各値は、４つのウェルの測定値の平均である。細い横線は偏差を表す。この試験は、毛髪状ミセル溶液を出発溶液とするとき、高ｐＨ（この場合８．２）の生理食塩水溶液媒体中の圧縮によって、どのような“圧縮後熟成”を行うかに関わりなく血清による阻害作用を解消し得ることを示す。更に、中間の圧縮ｐＨを使用するときも（同じく生理食塩水媒体中）、“圧縮後熟成”によって血清によるトランスフェクション阻害作用が解消される。脂質ＲＰＲ１２０５３１及びＲＰＲ１２０５３５に対しても同様の試験を実施した（ＤＯＧＳ、ＲＰＲ１２０５３１及びＲＰＲ１２０５３５の構造に関しては図１参照）。試験は、血清による阻害作用に対して圧縮ｐＨ及び“圧縮後熟成”がＤＯＧＳの場合と同様の阻害効果を与えたことを示す。実施例６Ａ．複合体の調製及びトランスフェクションプロトコル固有ｐＨ（３．５）の１５０ｍＭのＮａＣｌ中の２ｍＭの懸濁液の形態を有しておりＤＮＡと接触させる前日に加熱し周囲温度に放冷した脂質（ＤＯＧＳ）（ “１日間の予備熟成”）またはエタノール（ＥｔＯＨ）中の２ｍＭの溶液の形態の脂質（ＤＯＧＳ）をＤＮＡに接触させる。ｐＨ４．２、６．２、７．２もしくは８．２（これらのｐＨは測定値である）に調節した１５０ｍＭのＮａＣｌから成りプラスミドｐＸＬ２８７４を含む懸濁液またはＤＭＥＭ培養培地に脂質を導入する。ｐＨ６．２で圧縮を行う（ｐＨ６．２＋ｍａｔ．）以外は“圧縮後熟成 ”を全く行わない。圧縮を行う場合の“圧縮後熟成”は周囲温度で３時間である。ウシ胎仔血清の存在下（ＳＶＦ）または非存在下（ＳＳＳＶＦ）でトランスフェクションを行った。Ｂ．結果トランスフェクション結果を、５μｌの溶菌液、即ち１／５０のウェルあたりのＲＬＵ（ＲｅｌａｔｉｖｅＬｉｇｈｔＵｎｉｔ（相対光量））として図７に示す。各値は、４つのウェルの測定値の平均である。細い横線は偏差を表す。この試験は、実施例５で（圧縮ｐＨ及び“圧縮後熟成”の関数として）観察されたウシ胎仔血清による阻害に対する圧縮ＤＮＡ粒子の挙動はＤＯＧＳが生理食塩水媒体中の懸濁液の形態でもエタノール溶液の形態でも同様に有効であることを示す。この試験はまた、“圧縮後熟成”段階が血清による阻害を解消し得ることを示す。実施例７Ａ．複合体の調製及びトランスフェクションプロトコル固有ｐＨ（３．５）の１５０ｍＭのＮａＣｌ中の２ｍＭの懸濁液の形態を有しておりＤＮＡと接触させる直前（ＮＭ：予備熟成なし）または圧縮の前日に１日間“予備圧縮”（１Ｊ）した脂質（ＤＯＧＳ）をＤＮＡに接触させる。ｐＨ６．２（このｐＨは測定値である）に調節した１５０ｍＭのＮａＣｌから成りプラスミドｐＸＬ２８７４を含む懸濁液に脂質を導入する。脂質を“予備熟成”しなかったときは“圧縮後熟成”は０、０．５時間、３時間、１日であり、脂質を周囲温度で“１日間予備熟成”したときは（対照）“圧縮後熟成”は３時間である。ウシ胎仔血清の存在下または非存在下でトランスフェクションを行った。ウシ胎仔血清の非存在下で得られた結果は、試験した種々のプロトコル間で有意に違ってはいなかったので、ウシ胎仔血清の存在下で行ったトランスフェクションの結果だけを示す。Ｂ．結果トランスフェクション結果を、５μｌの溶菌液、即ち１／５０のウェルあたりのＲＬＵ（ＲｅｌａｔｉｖｅＬｉｇｈｔＵｎｉｔ（相対光量））として図８に示す。各値は、４つのウェルの測定値の平均である。細い横線は偏差を表す。この試験は、ＤＯＧＳの“予備熟成”（ＤＮＡに接触直前の加熱）を使用しないときは、血清による阻害作用を解消するために必要な“圧縮後熟成”期間を延長しなければならないことを示す。従ってＤＮＡに接触する前の脂質の構造か脂質−ＤＮＡ複合体の編制を促進し得ると考えられる。また、予備熟成をすることなく圧縮し次いで十分な期間の“圧縮後熟成”を行った脂質（ＮＭ−１Ｊ）は、予備熟成を行った脂質（１Ｊ−３Ｈ）よりも効率的なトランスフェクションを行う粒子を形成し得ると考えられる。その理由は恐らく、より小粒で均一の粒度をもつ粒子が形成されることにある。実施例８Ａ．複合体の調製及びトランスフェクションプロトコルｐＨ７．５の水中の２ｍＭの懸濁液の形態を有しており圧縮の１日前に“予備熟成”（水、ｐＨ７．５）させた脂質（ＤＯＧＳ）またはｐＨ７．５の１５０ｍＭのＮａＣｌ中の懸濁液の形態を有しており同様に１日間“予備熟成”（ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）させた脂質（ＤＯＧＳ）をＤＮＡに接触させる。ｐＨ７．２（このｐＨは測定値である）に調節した１５０ｍＭのＮａＣｌから成りプラスミドｐＸＬ２８７４を含む懸濁液に脂質を導入する。“圧縮後熟成”を０（０）または３時間（３Ｈ）行う。ウシ胎仔血清の存在下でトランスフェクションを行った。Ｂ．結果トランスフェクション結果を、５μｌの溶菌液、即ち１／５０のウェルあたりのＲＬＵ（ＲｅｌａｔｉｖｅＬｉｇｈｔＵｎｉｔ（相対光量））として図９に示す。各値は、４つのウェルの測定値の平均である。細い横線は偏差を表す。これらの結果は、圧縮以前に脂質の構造化を進めておくことによって血清による阻害作用及び“圧縮後熟成”による阻害作用を解消し得ることを示す。ｐＨ７．５のＮａＣｌのような高いｐＨ及びイオン強度の条件はある種の編制には実際に有利である。この試験はまた、“圧縮後熟成”を行うときは、粒度が過度に大きくない脂質（ｐＨ７．５）とＤＮＡとを圧縮することがトランスフェクション効率の改善に好ましいと考えられることを示す。従って、血清の存在下で高いトランスフェクション効率を得るためには、脂質の構造化と粒度との調整を図る必要があると思われる。実施例９Ａ．複合体の調製及びトランスフェクションプロトコル固有ｐＨ（３．５）の水中の１５０ｍＭのＮａＣｌ中の２ｍＭの懸濁液の形態を有しており圧縮の１日前（１Ｊ）または４日前（４Ｊ）に“予備熟成”させた脂質（ＤＯＧＳ）をＤＮＡに接触させる。ｐＨ６．６（このｐＨは測定値である）に調節した１５０ｍＭのＮａＣｌから成りプラスミドｐＸＬ２８７４を含む懸濁液に脂質を導入する。“圧縮後熟成”は０（０）または３時間（３Ｈ）である。ウシ胎仔血清の存在下（ＳＶＦ）及び非存在下でトランスフェクションを行った。Ｂ．結果トランスフェクション結果を、５μｌの溶菌液、即ち１／５０のウェルあたりのＲＬＵ（ＲｅｌａｔｉｖｅＬｉｇｈｔＵｎｉｔ（相対光量））として図１０に示す。各値は、４つのウェルの測定値の平均である。細い横線は偏差を表す。この試験は、ウシ胎仔血清の非存在下でトランスフェクションを行うときは種々のプロトコルの間に有意な違いがないことを示す。逆に血清の存在下では、“ 圧縮後熟成”処理をしなかったときは長期間（４日）の“予備熟成”が血清による阻害作用を部分的に解消し得ることを示す。この試験はまた、“圧縮後熟成” 処理をしたときは、少なくとも固有ｐＨの１５０ｍＭのＮａＣｌ中で上記の時間だけ予備熟成させる追加の“予備熟成”は無効であるが有害ではないことを示す。実施例１０Ａ．複合体の調製及びトランスフェクションプロトコルｐＨ７．５の１５０ｍＭのＮａＣｌ中の２ｍＭの懸濁液の形態を有しており、圧縮直前に加熱するか（ＮＭ）または圧縮の前日（１Ｊ）もしくは１月前（１Ｍ）に“予備熟成”させた脂質（ＤＯＧＳ）をＤＮＡに接触させる。ｐＨ７．２（このｐＨは測定値である）に調節した１５０ｍＭのＮａＣｌから成りプラスミドｐＸＬ２８７４を含む懸濁液に脂質を導入する。“圧縮後熟成”は０（０）または３時間（３Ｈ）である。ウシ胎仔血清（ＳＶＦ）の存在下でトランスフェクションを行った。Ｂ．結果トランスフェクション結果を、５μｌの溶菌液、即ち１／５０のウェルあたりのＲＬＵ（ＲｅｌａｔｉｖｅＬｉｇｈｔＵｎｉｔ（相対光量））として図１１に示す。各値は、４つのウェルの測定値の平均である。細い横線は偏差を表す。この試験は、“圧縮後熟成”処理をしないときは、“予備熟成”が血清によるトランスフェクション阻害作用の一部を解消し得ることを示す。逆に、ヌクレオリピド複合体を熟成処理するときは、ＤＮＡに接触させる直前に脂質を加熱して脂質が小粒の粒子の形態で存在するときにトランスフェクション効率の改善が得られることが確認された。実施例１１Ａ．複合体の調製及びトランスフェクションプロトコル純水（固有ｐＨ３．５）中の２ｍＭのミセル溶液の形態を有している脂質（ＤＯＧＳ）をＤＮＡに接触させる。ｐＨ７．３（このｐＨは測定値である）に調節した１５０ｍＭのＮａＣｌから成りプラスミドｐＸＬ２８７４を含む懸濁液に脂質を導入する。“圧縮後熟成”は０（０）、０．５時間（０．５Ｈ）、３時間（３Ｈ）、１日（１Ｊ）または１週間（１Ｓ）である。ウシ胎仔血清（ＳＶＦ）の存在下でトランスフェクションを行った。Ｂ．結果トランスフェクション結果を、５μｌの溶菌液、即ち１／５０のウェルあたりのＲＬＵ（ＲｅｌａｔｉｖｅＬｉｇｈｔＵｎｉｔ（相対光量））として図１１に示す。各値は、４つのウェルの測定値の平均である。細い横線は偏差を表す。この試験は、ＤＯＧＳをミセル溶液の形態でＤＮＡに接触させるときは、血清による阻害作用を解消するために“圧縮後熟成”が必要になることを示す。この実施例の場合、３時間の“圧縮後熟成”が十分であることが確認された。これらの結果は総合的に、予備加熱段階及び複数の有利な熟成段階を含む本発明のプロトコルによって、所定の組成をもつ均質な再現可能な組成物を得ることができ、組成物のトランスフェクション特性が改善されることを示す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年９月２４日（１９９８．９．２４）【補正内容】請求の範囲１．核酸をカチオン性脂質に接触させる段階を含み、接触に先立ってカチオン性脂質をミセル溶液が形成されるまで加熱することを特徴とする核酸導入用組成物の製造方法。２．カチオン性脂質を相転移温度よりも高い温度まで加熱することを特徴とする請求項１に記載の方法。３．更に、加熱段階と接触段階との間に、冷却、媒体のイオン強度の変更及び／またはｐＨの変更によって行うカチオン性脂質の圧縮前熟成段階を含むことを特徴とする請求頂１に記載の方法。４．更に、接触段階の後に、冷却、媒体のイオン強度の変更及び／またはｐＨの変更によって行うヌクレオリピド複合体の圧縮後熟成段階を含むことを特徴とする請求項１または３に記載の方法。５．接触をｐＨ４〜１０の範囲で行うことを特徴とする請求項１または３に記載の方法。６．接触をｐＨ６〜９の範囲で行うことを特徴とする請求項１または３に記載の方法。７．接触をイオン強度０〜２Ｍの範囲で行うことを特徴とする請求項１または３に記載の方法。８．接触をイオン強度０．０１〜０．５Ｍの範囲で行うことを特徴とする請求項１または３に記載の方法。９．接触をイオン強度０．０５Ｍ〜０．２Ｍの範囲で行うことを特徴とする請求項１または３に記載の方法。１０．圧縮前熟成を周囲温度のインキュベーションによって行うことを特徴とする請求項３に記載の方法。１１．圧縮前熟成を周囲温度で０．５時間〜１カ月の期間のインキュベーションによって行うことを特徴とする請求項１０に記載の方法。１２．圧縮前熟成を毛髪状、管状、層状、六方晶状及び／または柱状の編制された凝集体が形成されるまで行うことを特徴とする請求項３に記載の方法。１３．圧縮前熟成を毛髪状及び／または管状の編制された凝集体が出現するまで行うことを特徴とする請求項１２に記載の方法。１４．冷却を周囲温度のインキュベーションによって行うことを特徴とする請求項４に記載の方法。１５．圧縮後熟成を六方晶状、層状及び／または柱状またはより大粒の編制された凝集体が形成されるまで行うことを特徴とする請求項４に記載の方法。１６．カチオン性脂質がリポポリアミンから選択されることを特徴とする請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。１７．カチオン性脂質がリポスペルミンまたはリポテルミンであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。１８．核酸がＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の方法。１９．ＤＮＡがプラスミド、ベクターまたは直鎖状フラグメントであることを特徴とする請求項１８に記載の方法。２０．核酸がＲＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の方法。２１．予め加熱したカチオン性脂質の懸濁液に核酸を接触させ、形成されたヌクレオリピド複合体を細胞と共にインキュベーションする段階から成る試験管内（ｉｎｖｉｔｒｏ）または生体外（ｅｘｖｉｖｏ）で細胞に核酸を導入する方法。２２．請求項３に記載のように予め加熱し熟成させたカチオン性脂質の懸濁液に核酸を接触させることを特徴とする請求項２１に記載の方法。２３．ヌクレオリピド複合体を細胞と共にインキュベーションする前に請求項４に記載のように熟成させることを特徴とする請求項２１または２２に記載の方法。２４．血清による阻害作用に本質的に不感受性であること、及び、請求項１に記載の方法によって得られることを特徴とする核酸導入用組成物。２５．更に、１つまたは複数の脂質アジュバントを含むことを特徴とする請求項２４に記載の組成物。２６．カチオン性脂質が更に脂質アジュバントを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．核酸をカチオン性脂質に接触させる段階を含み、接触に先立ってカチオン性脂質を加熱段階で処理することを特徴とする核酸導入用組成物の製造方法。２．カチオン性脂質をミセル溶液が形成されるまで加熱することを特徴とする請求項１に記載の方法。３．カチオン性脂質を相転移温度よりも高い温度まで加熱することを特徴とする請求項２に記載の方法。４．更に、加熱段階と接触段階との間に、カチオン性脂質の圧縮前熟成段階を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。５．更に、接触段階後に、ヌクレオリピド複合体の圧縮後熟成段階を含むことを特徴とする請求項１または４に記載の方法。６．接触をｐＨ４〜１０、好ましくは６〜９の範囲で行うことを特徴とする請求項１または４に記載の方法。７．接触をイオン強度０〜２Ｍ、好ましくは０．０１〜０．５Ｍ、より好ましくは０．０５Ｍ〜０．２Ｍの範囲で行うことを特徴とする請求項１または４に記載の方法。８．圧縮前熟成を、冷却、媒体のイオン強度の変更、及び／または媒体のｐＨの変更によって行うことを特徴とする請求項４に記載の方法。９．圧縮前熟成を周囲温度のインキュベーションによって行うことを特徴とする請求項８に記載の方法。１０．圧縮前熟成を周囲温度で０．５時間〜１カ月の期間のインキュベーションによって行うことを特徴とする請求項９に記載の方法。１１．圧縮前熟成を毛髪状、管状、層状、六方晶状及び／または柱状の編制された凝集体が形成されるまで行うことを特徴とする請求項８に記載の方法。１２．圧縮前熟成を毛髪状及び／または管状の編制された凝集体が出現するまで行うことを特徴とする請求項１１に記載の方法。１３．圧縮後熟成を冷却によって行うことを特徴とする請求項５に記載の方法。１４．冷却を周囲温度のインキュベーションによって行うことを特徴とする請求項１３に記載の方法。１５．圧縮後熟成を六方晶状、層状及び／または柱状またはより大粒の編制された凝集体が形成されるまで行うことを特徴とする請求項１３に記載の方法。１６．カチオン性脂質がリポポリアミンから選択されることを特徴とする請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。１７．カチオン性脂質がリポスペルミンまたはリポテルミンであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。１８．核酸がＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の方法。１９．ＤＮＡがプラスミド、ベクターまたは直鎖状フラグメントであることを特徴とする請求項１８に記載の方法。２０．核酸がＲＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の方法。２１．予め加熱したカチオン性脂質の懸濁液に核酸を接触させ、形成されたヌクレオリピド複合体を細胞と共にインキュベーションする段階から成る試験管内（ｉｎｖｉｔｒｏ）または生体外（ｅｘｖｉｖｏ）で細胞に核酸を導入する方法。２２．予め加熱し熟成させた脂質の懸濁液に核酸を接触させることを特徴とする請求項２１に記載の方法。２３．細胞と共にインキュベーションする前にヌクレオリピド複合体を熟成させることを特徴とする請求項２１または２２に記載の方法。２４．血清による阻害作用に本質的に不感受性であること、及び、請求項１に記載の方法によって得られることを特徴とする核酸導入用組成物。２５．更に、１つまたは複数の脂質アジュバントを含むことを特徴とする請求項２４に記載の組成物。２６．カチオン性脂質が更に脂質アジュバントを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。