SK43199A3 - Method for preparing compositions for transferring nucleic acids - Google Patents

Description

Vynález sa týka spôsobu prípravy prostriedkov na prenos nukleových kyselín. Prostriedky získané spôsobom podľa predkladaného vynálezu sa môžu použiť na prenos nukleových kyselín do buniek a to in vitro, ex vi vo alebo in vi vo.

DoterajSi stav techniky

Prienik samotnej (neobalenej) nukleovej kyseliny (zvyčajne s vysokou molekulovou hmotnosťou a negatívne nabitou) do bunky je velmi vzácny jav, ktorý spôsobuje transfekciu bunky s velmi obmedzenou účinnosťou. Preto sa už skôr (v predchádzajúcom stave techniky) opísali rôzne typy vektorov a spôsoby na uskutočnenie takéhoto prenosu. Z tohto hladiska sa môžu rozlíšiť dve velké rodiny: vírusové vektory a fyzikálne spôsoby.

K vírusovým vektorom patria napr. retrovirusy, adenovírusy, vírusy AAV, herpetické vírusy, bakulovírusy a ďalšie. Účinnosť prenosu pomocou týchto vírusových vektorov je všeobecne velmi dobrá. Ale ich konštrukcia a výroba je pomerne ťažká, ich klonovacia kapacita je niekedy obmedzená a ich použitie prejavuje niektoré nevýhody vyplývajúce z podstaty vírusov (šírenie, patogenicita, a pod.).

To je tiež jeden z dôvodov, prečo sa vyvinuli rôzne fyzikálne spôsoby prenosu nukleových kyselín. Patria k nim napr. elektroporácia, koprecipitácia a bombardovanie alebo ostreľovanie mikročasticami (pomocou tzv. particle guns).

Elektroporácia spočíva v aplikácii poľa na bunkovú suspenziu obsahujúcu tiež DNA. Aj keď tento spôsob v niektorých prípadoch poskytuje dobré výsledky, je zložité ho optimalizovať vzhladom na možnosti výskytu ireverzibilných poškodení bunkovej membrány. V prípade použitia metódy ostreľovania mikročasticami sú častice (zlato, volfrám) pokryté nukleovou kyselinou a potom vstrelené do buniek. Táto metóda je vhodná predovšetkým u buniek so stenou, ako sú rastlinné bunky. Metóda koprecipitácie DNA s určitými polymérmi (DEAE-dextrán) alebo kalciumfosfátom na určité nevýhody v tom, že nie je dobre reprodukovatelná a niekedy je dokonca cytotoxická.

Aby sa zabránilo podobným problémom, vyvinuli sa syntetické vektory. Úlohou týchto vektorov je v podstate poskytnúť nukleovú kyselinu v takej forme, ktorá je vhodná na prienik do bunky (penetráciu), uľahčiť túto penetráciu (do cytoplazmy a až do jadra) a tiež ochrániť nukleovú kyselinu pre cytoplazmatickými nukleázami.

K takýmto vektorom patria katiónové lipidy, ktoré majú výhodné vlastnosti. Tieto vektory obsahujú polárnu katiónovú časť, ktorá umožňuje kondenzáciu nukleových kyselín a hydrofóbnu lipidovú časť, ktorá stabilizuje iónové interakcie. Nadbytok lipidov, vzhľadom na ionizáciu polárnej časti lipidu, tiež podporuje interakciu s bunkovou membránou.

Špecifickými príkladmi katiónových lipidov sú konkrétne lipopolylyzín, monokatiónové lipidy (DOTMA, Lipofectin®), určité katiónové detergenty (DDAB), lipospermíny (DOGS, DPPES, a pod.), lipotermíny a ďalšie.

Použitie vektorov takéhoto typu, prípadne ešte v kombinácii s fúzogénnym lipidom (DOPE alebo podobné) ukázalo, že majú dobré vlastnosti z hľadiska prenosu nukleových kyselín in vitro, in vivo a ex vivo do buniek rôznych typov. Tieto vektory teda predstavujú výhodnú alternatívu k vírusovým vektorom a k fyzikálnym metódam prenosu nukleových kyselín. Avšak použitie týchto vektorov v priemyslovom meradle bolo doteraz veľmi obmedzené. Osobitne preto, že spôsoby prípravy takýchto vektorov, ktoré sú známe v doterajšom stave techniky, sú empirické, zle reprodukovateľné a to, okrem iného znamená tiež ťažko priemyselne využiteľné a teda spôsobujú vznik zmesí, ktorých zloženie neposkytuje optimálne vlastnosti.

V súčasnosti je známe, ako pripraviť prostriedky zmiešaním rôznych lipidových zložiek v chloroforme, usušením v prúde dusíka počas 20 minút a potom dosušením vo vákuu. Takto získaný lipidový film sa potom nechá nasiaknuť deionizovanou vodou (Hui 1996, Felgner 1987). Zmes sa rozmixuje (vortexuje), aby sa lipidy resuspendovali a tiež sonifikuje v sonifikačnej vaničke 10 minút, pokial sa suspenzia nevyčerí, ktorá sa potom môže nariediť. Komplex sa vytvorí (komplexácia) bezprostredne pred nanesením na bunky, ktoré sa potom ponechajú 4 hodiny pri 37 °C v kultivačnom médiu F10.

Pritom existuje rad variácií tohto spôsobu. Napr. po rozpustení v chloroforme a usušení sa film nechá nasiaknuť roztokom 20mM NaCl (Guershon 1993) alebo 20mM Hepes pufrom (Gao 1991). Suspenzia sa zvyčajne vortexuje (bezprostredne po namočení filmu alebo po 24-hodinovej hydratačnej fáze pri 4 °C, pozri Gao 1991) a sonifikuje rôzne dlhé časy. Niekedy sa po komplexácii môže modifikovať iónová sila a povaha iónov v komplexe (Xu 1996). Procedúra sonifikácie má sama mnoho variantov a niektorí autori používajú sonifikačné sondy vytvorené z titanu (Gustafsson 1995).

Pri výrobe lipozómov obsahujúcich neutrálne lipidy kombinované s katiónovými surfaktantami (Pinnaduwage 1989) sa často dá stretnúť s procedúrou spočívajúcou v tom, že sa vytvorí film, rozpustí v chloroforme, odparí, usuší, nechá nasiaknuť vodným médiom a potom sonifikuje.

Iný spôsob prípravy spočíva v tom, že sa priamo rozpustia komerčne dostupné lipidy (v etanolovom roztoku, vo vodnej suspenzii alebo v lipozómovom prostriedku) v kultivačnom médiu MEM. Po rovnakom rozpustení DNA sa obidve zložky zmiešajú prevrátením a suspenzia sa ponechá pri teplote miestnosti 15 až 30 minút. Ďalšie nariedenie sa uskutočni ešte pred tým, ako sa pôsobí na bunky počas 6 hodín (Fasbender 1995). Komerčne dostupné lipidy a DNA tiež môžu byť, skôr ako sa aplikujú do buniek, jednoducho rozpustené oddelene v destilovanej vode a to miešaním, prípadne ešte s inkubáciou 15 minút pri teplote miestnosti (Bringham 1989).

Podlá iných metód sú napr. počiatočnou formou lipidu etanolové roztoky s rôznou koncentráciou, ktoré sa čerstvo nariedia kultivačným médiom práve pred tým, ako sa nechajú pôsobiť na DNA (Behr 1989). Etanolový roztok sa môže nariediť tiež iným médiom (vodou, roztokom NaCl s rôznymi koncentráciami a pod.) bezprostredne pred alebo 10 minút pred komplexáciou. Po komplexácii a prípadne ešte po ďalších 10 minútach sa môže uskutočniť ďalšie nariedenie médiom s rôznym iónovým zložením. Transfekcia sa potom uskutočňuje po 0 až 10 minútach po poslednom nariedení (Barthel 1993). Etanolový roztok sa tiež môže priamo vniesť do vodnej suspenzie obsahujúcej DNA a táto zmes sa potom sonifikuje v sonifikačnej vaničke (Demeniex 1991).

Je známy tiež spôsob solubilizácie katiónových lipidov zložených zo zmesi DOSPA/DOPE (Hofland 1996) pomocou 1% roztoku oktylglukozidu (OG) v lOmM roztoku Tris (pH 7,4). Po skontaktovaní s DNA sa komplex trikrát dialýzuje (aby sa odstránil nadbytok miciel OG) oproti 2000 násobku objemu roztoku lOmM Tris/5% dextróza (pH 7,4) po viac ako 48 hodín pri teplote 48 °C. Transfekcia sa potom uskutočňuje v médiu MEM bez séra počas 4 až 5 hodín pri 37 °C.

Príprava katiónových lipozómov sa tiež môže uskutočňovať rehydratáciou lipidového filmu, po ktorom nasleduje extrudovanie polykarbonátovou membránou s kalibrovanými pórmi (Duzgunes 1989) alebo mikrofluidizácia (Sternberg 1994).

Všetky uvedené spôsoby sú však nevýhodné z hľadiska zmeny meradla na priemyselné využitie. Sonifikácia sa iba ťažko dá uskutočňovať v takom meradle a tiež stabilita vezikúl (mechúrikov) takto vzniknutých je často nedostatočná. Okrem toho sondy používané na sonifikáciu, vyrobené z kovu, môžu do média uvoľňovať častice, ktoré sú nežiaduce či nebezpečné z hľadiska farmaceutického použitia. Podobne filtrácia poskytuje lipozómy, ktorých veľkosť je určená pórovitosťou membrány po filtrácii a ich dlhodobá stabilita nie je zaručená. Zistilo sa, že použitie lipidov vo forme etanolového roztoku, okrem problémov s použitím organického rozpúšťadla, indukuje tvorbu vysoko polydisperzných častíc.

Autor vyvinul nový spôsob na prípravu prostriedku vhodného na transfekcie.

Podstata vynálezu

Spôsob podlá predkladaného vynálezu je založený na charakterizácii fyzikálne chemických vlastností lipidových vektorov, ktorú uskutočnil autor. Autor dokázal, že v závislosti na podmienkach, tieto vektory existujú v rôznych fyzikálnochemických stavoch (micelárna forma, zrelá agregovaná forma a pod.). Autor osobitne umožnil charakterizovať rôzne fyzikálnochemické stavy lipidových vektorov a ukázal prostriedky, ktoré umožňujú riadiť prechody medzi rôznymi stavmi a zastaviť zrenie (maturáciu) v definovanom stave, čo je vhodné na prípravu komplexov s DNA a na transfekciu buniek. Predkladaný vynález teda opisuje reprodukovatelný spôsob, ktorý umožňuje pripraviť a to v priemyselnom meradle, dobre charakterizovatelný a kalibrovaný prostriedok vhodný na transfekciu (transfektant).

Spôsob podlá predkladaného vynálezu je založený na tom, že sa uskutoční predbežné opracovanie katiónových lipidov, ktoré umožnia získať homogénnu micelárnu suspenziu. Takže prvým predmetom predkladaného vynálezu je spôsob prípravy prostriedkov na prenos nukleových kyselín, spočívajúcu v tom, že sa nukleová kyselina skontaktuje s katiónovými lipidmi, ktoré sa pred tým zahriali.

Autor študoval fyzikálno-chemické vlastnosti rôznych katiónových lipidov. Získané výsledky ukázali, že v závislosti na iónovej sile média a závislosti na pH lipidy existujú v rôznych fyzikálnych stavoch. V príkladoch uvedených ďalej sa opisujú osobitne fázové diagramy rôznych katiónových lipidov (ako sú napr. lipospermíny, lipoterminy) a tiež štúdie závislosti optickej hustoty na pH a teplote, ktoré sa v závislosti na podmienkach zreteľne odlišujú pre rôzne fyzikálnochemické stavy. Autor ďalej ukázal, že tieto rôzne stavy majú rôzne vlastnosti z hladiska komplexácie s DNA a transfekcie a tiež to, že je výhodné mať k dispozícii spôsob, ktorý umožňuje reprodukovateľné riadiť prechod do týchto stavov.

Spôsob podľa predkladaného vynálezu, zahrňujúci konkrétne zahrievanie suspenzie lipidov, má tú výhodu, že je jednoduchý a môže byť ľahko aplikovaný aj v obmedzených, priemyselných podmienkach. Umožňuje navyše riadiť kinetiku usporiadania a regulovať štruktúru, ktorú lipidy zaujmú pred a po kontakte s DNA. Spôsob podľa predkladaného vynálezu okrem toho umožňuje štandardizovať prípravu, čo je nevyhnutné pre priemyselné využitie.

Konkrétne predbežný krok spôsobu podlá predkladaného vynálezu spočíva v tom, že sa katiónové lipidy zahrievajú pokial sa nevytvorí micelárny roztok. Výhodnejšie sa lipidový vektor zahrieva na teplotu vyššiu ako je teplota jeho fázového prechodu. Teplota fázového prechodu zodpovedá teplote, pri ktorej zakrýva lipidové reťazce. Pre každý lipidový vektor sa táto teplota môže určiť spôsobom odborníkovi známym. Osobitne sa môže použiť diferenčná kalorimetria (DSC) s využitím prístroja DSC4 (Perkin Elmer Cetus) podlá odporučenia výrobcu, ako je uvedené v príkladoch.

Spôsob podľa predkladaného vynálezu je použiteľný s ktorýmkoľvek typom katiónového lipidu. Je osobitne vhodný na prípravu lipopolyamínov. Lipopolyamíny sú amfifilné molekuly obsahujúce aspoň jedene hydrofilný polyamínový úsek a jeden lipofilný úsek navzájom kovalentne spojené s chemickou väzbou. Výhodne polyamínový úsek zodpovedá stavbou všeobecnému vzorcu:

H₂N- (- (CH)n-NH-) _k-H (D kde m je väčšie alebo rovné 2 a k je väčšie alebo rovné 1, pričom m sa líši pre rôzne uhlíkové skupiny ležiace medzi dvoma aminmi. Výhodne má m hodnotu 2 až 6 vrátane a k má hodnotu 1 až 5 vrátane. Ešte výhodnejšie je polyamínový úsek predstavovaný spermínom alebo termínom alebo ich analógom, ktorý zachováva väzbové vlastnosti k DNA.

Lipofilný úsek môže predstavovať jeden alebo niekoľko uhľovodíkových reťazcov, cholesterol, prirodzené alebo syntetické lipidy schopné vytvárať lamelárnu alebo hexagonálnu fázu. Výhodne je lipofilný úsek tvorený dvoma uhľovodíkovými reťazcami.

Okrem toho sa môže kombinovať katiónový lipid s lipidovým adjuvans, ako je uvedené ďalej.

Výhodnými príkladmi katiónových lipidov sú lipospermíny, osobitne dioktadecylamidoglycylspermín (DOGS) alebo palmitoylfosfatidyletanolamín-5-karboxyspermylamid (DPPES), ktorých príprava je opísaná napr. v patentovej prihláške EP 394 111. Ďalšiu výhodnú rodinu látok predstavujú lipotermíny, osobitne RPR120531 a RPR120535 (opísané v patentových prihláškach FR95/12490 a WO96/17823, na ktoré sa týmto plne odkazuje). Štruktúra týchto zlúčenín je uvedená na obr. 1.

Spôsob podľa predkladaného vynálezu sa uskutočňuje tak, že lipid vo forme kryštalického prášku alebo filmu je rozpustený v čistej vode alebo roztoku soli, ktorého pH sa prípadne nastaví na vhodnú hodnotu. Homogenizácia sa dosiahne zahriatím na teplotu vyššiu ako je teplota fázového prechodu lipidu, čiže teplotu, nad ktorou sa alifatický reťazec topí. Ako sa skôr uviedlo, táto teplota fázového prechodu sa môže stanoviť diferenčnou skenovacou kalorimetriou. Táto teplota je napr. pre DOGS 38 °C vo vode s pH 7,5 a 44 °C pri pH 8,8. K žiadnemu prechodu nedochádza v čistej vode pri kyslom pH, lipid je v micelárnej forme bez ohladu na teplotu. Teplota fázového prechodu tiež závisí na iónovej sile média. Tak napr. v roztoku NaCI pri kyslom pH je teplota pre DOGS 44 °C, pri pH 7,5 je 42 °C a pri pH 9,9 je 39,8 °C. Táto teplota prechodu je samozrejme rôzna pre rôzne lipidy (porovnaj príklady). Konkrétne pre RPR12051 je teplota fázového prechodu stanovená DSC a turbidimetriou 51,5 °C (prášok) a 30 ^eC (hydrát pH 7,5). Pre RPR120535 je približne 43 °C (hydrát pH 7,5). Zahrievanie sa môže uskutočňovať vo vodnom kúpeli alebo priamym zahrievaním, alebo alternatívne akýmkoľvek iným spôsobom zvyšujúcim teplotu. To umožňuje vytváranie micelárnych roztokov, čo sa prejaví vyčerením roztoku, pokial to dovolia podmienky pH. Prítomnosť miciel sa dokázala technikami ako je napr. turbidimetria, difrakcia/difúzia Rôntgenovho žiarenia a transmisná elektrónová kryomi kros kopia.

Neočakávaná výhoda spôsobu podlá predkladaného vynálezu spočíva v transfekčnej účinnosti prostriedku. Osobitne výhodný spôsob podlá predkladaného vynálezu poskytuje prostriedok, ktorý umožňuje transfekciu buniek úplne nezávisle na prítomnosti séra. Je skutočne známe, že sérum (napr. teľacie fetálne sérum) má inhibičné účinky na transfekciu katiónovými lipidmi (in vitro, in vivo a tiež ex vivo) . Výsledky uvedené tu v príkladoch ukazujú, že spôsob podľa predkladaného vynálezu umožňuje, a to predbežným zahriatím lipidu, zvýšiť transfekčnú účinnosť v prítomnosti séra. Takže prostriedok podľa predkladaného vynálezu má dobrú transfekčnú účinnosť tak v prítomnosti ako aj v neprítomnosti séra.

Nukleová kyselina sa skontaktuje s lipidovým roztokom priamo po získaní micelárneho roztoku a takto získaný nukleolipidový komplex sa priamo použije na transfekciu buniek. Výhoda takéhoto prostriedku spočíva hlavne v jeho homogénnosti a definovaných a reprodukovateľných vlastnostiach. Avšak pôvodca ďalej dokázal, že na ďalšie zlepšenie vlastností prostriedku, osobitne z hľadiska transfekcie, je výhodné uskutočniť zrenie (maturáciu) katiónového lipidu pred tým, ako sa skontaktuje s nukleovou kyselinou (predkomplexačné zrenie) alebo po vytvorení nukleolipidového komplexu (pokomplexačné zrenie). Zrenie lipidu/komplexu umožňuje reorganizovať katiónový lipid z hľadiska jeho štruktúry a veľkosti. Pôvodca skutočne ukázal, že lipid v micelárnom roztoku, ako sa získa v priebehu prvej fázy spôsobu podľa predkladaného vynálezu, sa môže vyvinúť do štruktúry organizovaných častíc rôznych veľkostí a štruktúry. Autor tiež ukázal, že stav usporiadania kat iónového lipidu má vplyv na jeho kapacitu vytvárať komplex s nukleovou kyselinou (komplexovať nukleovú kyselinu) a tiež na jeho transfekčné vlastnosti.

Spôsob podľa predkladaného vynálezu okrem toho obsahuje krok, medzi zahrievaním a skontaktovaním s nukleovou kyselinou, keď sa uskutočňuje predkomplexačné zrenie lipidového vektora.

Spôsob podľa predkladaného vynálezu okrem toho tiež obsahuje, po skontaktovaní s nukleovou kyselinou, krok, keď sa uskutočňuje pokomplexačné zrenie nukleolipidového komplexu.

Ak vyjdeme z micelárneho roztoku, je možné podporovaním interakcií medzi rôznymi lipidovými molekulami dosiahnuť nadmolekulovú reorganizáciu a vytvárať tak častice rôzne usporiadané. Ďalej uvedené príklady ukazujú, že katiónové lipidy prechádzajú radom neočakávaných organizovaných stavov typu miciel, trubičiek alebo červíkov. Pokial sa zvýši koncentrácia, vznikne štruktúra (stav) s väčšou veľkosťou ako napr. stĺpcovitá alebo hexagonálna štruktúra. Odlišné štruktúry pritom majú odlišné vlastnosti.

Pri uskutočňovaní spôsobu podľa predkladaného vynálezu je výhodné uskutočňovať krok predkomplexačného zrenia. Je výhodné uskutočniť tento krok pred tým, ako sa objavia usporiadané agregáty lamelárneho, tubulárneho. červovitého, stĺpcového alebo hexagonálneho typu. Výhodnejšie je uskutočniť tento krok pred tým, ako sa objavia usporiadané agregáty lamelárneho, tubulárneho alebo červovitého typu. Takýto typ častice má skutočne novú štruktúru osobitne vhodnú na vytváranie komplexov s nukleovými kyselinami.

Zrenie sa môže uskutočňovať akýmikoľvek prostriedkami, ktoré umožnia zosilniť interakcie medzi molekulami katiónového lipidu, alebo ktoré podporia intramolekulovú reorganizáciu.

Zrenie sa podlá predkladaného vynálezu výhodne uskutoční znížením teploty, zvýšením pH média alebo zvýšením iónovej sily média.

Znížením teploty sa alifatické reťazce mastných kyselín reorganizujú a umožňujú reštrukturalizáciu katiónového lipidu. Výsledky uvedené na obr. 2 jasne ukazujú rozdiely v optickej hustote roztoku lipidu, odrážajúce vnútornú architektúru daného lipidu, v závislosti na teplote média. Zvýšením hodnoty pH alebo iónovej sily média je možné modifikovať stav pozitívnych iónových nábojov prítomných katiónovej časti vektora. Autor ukázal, že progresívnou neutralizáciou (pH) alebo ochranou (odtienenie, iónová sila) nábojov sa elektrostatické sily odpudzovania medzi lipidovými molekulami progresívne a kontrolovateľné redukovali a že tak sa podporila interakcia a reorganizácia do štruktúrovaných agregátov. Výsledky uvedené na obr. 4 a 5 ukazujú vplyv pH a iónovej sily na stav reorganizácie lipidu. Fotografie uvedené na obr. 3 ukazujú rôzne častice.

Výhodne sa predkomplexačné zrenie uskutočňuje znížením teploty. Ešte výhodnejšie sa uskutočňuje inkubáciou roztoku pre teplote miestnosti. To umožní postupnú a pomalú kinetiku zrenia (agregácia a reorganizácia), vhodnú na komplexáciu lipidu s nukleovými kyselinami. Zrenie môže pokračovať rôzne dlhý čas v závislosti na lipide, na pH a podmienkach iónovej sily. Príklady nižšie ukazujú, že toto zrenie sa môže uskutočňovať v rozsahu od niekolko hodín po jeden mesiac. Doba predkomplexačného zrenia je určovaná predovšetkým výskytom štruktúrovaných častíc lamelárneho, tubulárneho alebo ^wčervovitého typu. Avšak, ak sú pH alebo iónová sila počas kondenzačného kroku dostatočne vysoké, alebo ak sa uskutočňuje pokomplexačné zrenie, je výhodné predkomplexačné zrenie neuskutočňovať. Micelárna forma lipidu v tomto prípade skutočne umožňuje tvorbu nukleolipidových komplexov, ktoré sú menšie a viac homogénne z hľadiska veľkosti a ktoré sú transfekčné účinnejšie v prítomnosti alebo pri absencii séra.

Zrenie sa môže tiež uskutočňovať zvýšením iónovej sily média. Z tohto hľadiska je výhodné pracovať, buď počas solubilizácie alebo počas zrenia alebo počas skontaktovania (komplexácie), v roztoku majúcim iónovú silu medzi 0 a 0,5M. Výhodnejšie je použiť roztok, ktorý je takmer izotonický (0,15M), čo je povedzme iónová sila medzi 0,05 a 0,2M. Môžu sa použiť rôzne soli (NaCl, KNO3, Kl a pod.).

Okrem toho je tiež možné meniť pH počas maturačnej fázy. Počas zrenia alebo počas komplexácie je výhodné pracovať v rozsahu pH medzi 3 a 9, výhodnejšie medzi 6 až 9. pH je nastavené odborníkom podlá hodnôt pK použitých lipidových vektorov a fázového diagramu pre lipid. Výhodný rozsah pH je taký rozsah, v ktorom je aspoň 30% amínov katiónového vektora deprotónovaných, výhodne aspoň 40%.

Všeobecne, bez závislosti na pH a iónovej sile, sa predkomplexačné zrenie uskutočňuje znižovaním teploty pod teplotu fázového prechodu lipidu. Toto zníženie sa môže sprevádzať modifikáciami pH a iónovej sily buď počas zrenia alebo počas samotnej komplexácie.

Ako názorný príklad sa pozorovali nasledujúce stavy organizácie, v podmienkach stredného pH a iónovej sily (napríklad DOGS v 150mM NaCl pri pH < B):

Suspenzia DOGS v 150mM NaCl pri pH 7,5 je zložená:

v podstate zo sférických miciel, bezprostredne po zahriatí na približne 50 °C (obrázok 3Ά)

- zo sférických miciel, malých tyčiniek a červíkov s rôznou dĺžkou, tri hodiny po zahriatí a schladení na teplotu miestnosti (obrázok 3B)

- z doštičiek s lamelárnou štruktúrou, ktorých veľkosť je rôzna, jeden týždeň po zahriatí a schladení na teplotu miestnosti (obrázok 3C),

- iba z velkých plátov s lamelárnou štruktúrou, jeden mesiac po zahriati a schladení na teplotu miestnosti (obrázok 3D)

V natívnom pH (približne 3,5) je tá istá suspenzia zložená zo sférických miciel a z červíkov jeden deň po zahriatí a ochladení na teplotu miestnosti.

V médiu DMEM nastavenom na pH 5 je suspenzia DOGS zložená:

- iba zo sférických miciel, bezprostredne po zahriatí,

- zo sférických miciel a z červíkov, 5 hodín alebo jeden týždeň po zahriatí na teplotu miestnosti.

Tieto pozorovania ukazujú, že čas zrenia sa môže upraviť podľa lipidu a podmienok média tak, aby sa tvorili organizované agregáty lamelárneho alebo červovitého typu. Pretože je teraz možné poznať štruktúru, ktorú zaujme lipid, podľa podmienok média a času po zahriatí, je prijateľné kontrolovať štruktúru lipidu, ktorý sa potom skontaktuje s DNA. Okrem toho reverzibilita procesu zahriatia/schladenia/predkomplexačného zrenia je úplná. Nehľadiac na čas potrebný na zrenie, je preto možné znovu zahriať suspenziu, aby sa vrátilo micelárne štádium spoločné pre všetky podmienky.

Po zahrievacom kroku a prípadne predkomplexačnom zreni je lipid skontaktovaný s nukleovou kyselinou.

Nukleová kyselina môže byť DNA alebo RNA. Môže to byť lineárna alebo cirkulárna, nadzávitnicovitá alebo relaxovaná DNA plazmidového typu alebo aj z iného typu, nesúca rôzne genetické prvky (kódujúcu oblasť, promótory, terminátory, väzbové miesta, počiatky replikácie a pod.). Nukleová kyselina môže byť rôzneho pôvodu (ľudského, zvieracieho, nižšieho eukaryotického, prokaryotického, rastlinného, vírusového, fágového a pod.). Môže to byt tiež syntetická alebo polosyntetická nukleová kyselina. Veľkosť nukleovej kyseliny môže značne kolísať (od oligonukleotidu až po kompletný genôm). Výhoda prípravkov podľa predkladaného vynálezu spočíva navyše v ich použití na prenos nukleových kyselín akejkoľvek velkostí. Podlá výhodného uskutočnenia je nukleová kyselina DNA (napríklad plazmid alebo fragment DNA) nesúci kazetu pre expresiu proteínu alebo špecifickej RNA. Môže to byť liečebný alebo potravinový proteín (enzým, aminokyselina a pod.), na produkciu uvedeného proteínu alebo uvedenej RNA in vitro, ex vivo alebo in vivo. Okrem toho použitá nukleová kyselina môže byť zmes rôznych nukleových kyselín, ktoré majú odlišné vlastnosti.

Nukleová kyselina sa môže pripraviť každou technikou odborníkovi známou (screening knižníc, umelá syntéza, zmiešané metódy a pod.).

Aby sa nukleová kyselina (prípravok nukleovej kyseliny) skontaktovala (komplexácia), rozpúšťa sa vo vodnom médiu. Prípravok, iónová sila a pH tohto média sa môže upraviť tak, aby sa zvýšila účinnosť komplexácie a vlastnosti prenosu konečného prípravku. Pozorovalo sa konkrétne v štúdiách uskutočňovaných s DOGS, že komplexácia uskutočňovaná v médiu, kde lipid mohol byť prítomný v micelárnom stave počas jeho kontaktu s DNA (teda v médiu s velmi nízkou iónovou silou alebo nízkym pH) a to bez ohladu na jeho stav predchádzajúci štádiu kontaktovania, neviedla k dobrej transfekčnej účinnosti v prítomnosti fetálneho teľacieho séra. Ukázalo sa, že štruktúra komplexov tvorených pri týchto podmienkach nízkeho pH a iónovej sily nie je lamelárneho typu. Výhodne sa teda komplexácia uskutočňuje vo fyziologickom roztoku, v rozsahu hodnôt pH medzi 4 až 10. Optimálne podmienky závisia na lipide a predovšetkým na jeho schopnosti zaujať v prítomnosti nukleovej kyseliny štruktúru lamelárneho typu. Výhodne sa komplexácia uskutočňuje v médiu, ktoré má pH medzi 6 až 9. Čo sa týka salinity média, je výhodne medzi 0 až 2M, výhodnejšie medzi 0,01 až 0,5M, ešte výhodnejšie medzi 0,05 až 0,2M. Výhodne médium pre komplexáciu je médium, ktoré je takmer izotonické (0,15M) a ktorého pH je medzi 6 až 9. Tieto podmienky môžu byť vhodné pre médium na zahrievanie lipidu alebo pre predkomplexačné zrenie. Pri týchto podmienkach môže komplexácia prebiehať bez modifikácie média. Ak sú podmienky predkomplexačného zrenia odlišné, je výhodné upraviť zloženie média tak, ako je uvedené vyššie. Výsledky uvedené v príkladoch naozaj ukazujú, že pri týchto podmienkach sa môžu získať prostriedky, ktoré majú mimoriadne neočakávané a výhodné transfekčné vlastnosti. Konkrétne je možné získať prostriedky necitlivé na inhibičný účinok séra, čo je výhodné predovšetkým na použitie in vitro (FCS) alebo in vivo. Po skontaktovaní môžu príslušné množstvá a koncentrácie nukleovej kyseliny a lipidov kolísať. Tieto množstvá a koncentrácie sú tie, ktoré sú opísané v stave techniky na použitie daných vektorov. Príslušné množstvá a koncentrácie použitej nukleovej kyseliny a lipidov sú určované konkrétne pomerom pozitívnych nábojov lipidu k negatívnym nábojom nukleovej kyseliny a závisia na tom, či ide o použitie typu in vitro alebo in vivo. Výhodne je tento pomer medzi 0,01 až 20.

Takto získaný nukleolipidový komplex sa môže samotný použiť na transfekciu. Môže byť tiež podrobený takzvanému pokomplexačnému zreniu (zrenie po vytvorení komplexu), ktoré umožňuje optimalizovať štrukturálnu organizáciu komplexu tak, aby sa zvýšili jeho prenosové vlastnosti. Stavy organizácie lipidov, ktoré umožňujú dobrú komplexáciu s nukleovými kyselinami, nie sú skutočne nutne tie, ktoré dávajú najlepšiu úroveň transfekcie. Teda je výhodné uskutočňovať pokomplexačné zrenie, pokial sa objavujú organizované agregáty lamelárneho, tubulárneho alebo hexagonálneho typu. Keď sú takéto agregáty iniciované počas komplexácie, môže byť výhodné, aby sa prípravok homogenizoval. Podmienky a prostriedky pokomplexačného zrenia sú podobné tým pre predkomplexačné zrenie. Čas tohto zrenia môže byť upravený odborníkom podľa predkomplexačného zrenia a typu lipidového vektora.

Získané prostriedky sa môžu ihneď po príprave použiť na prenos nukleových kyselín. Môžu sa tiež uskladniť a uchovávať napríklad v lyofilizovanej alebo zmrazenej forme na neskoršie použitie. Ako je už uvedené vyššie, majú prípravky vynálezu mnohé výhody na priemyselné použitie. Sú kalibrované, homogénne, reprodukovateľné, stabilné a poskytujú vysokú prenosovú kapacitu.

Jeden predmet vynálezu spočíva konkrétne v prípravku na prenos nukleových kyselín obsahujúcom nukleovú kyselinu spojenú v komplexe s katiónovým lipidom, vyznačujúcim sa tým, že účinnosť prenosu je prakticky nezmenená prítomnosťou séra a že sa môže získať postupom vyššie opísaným.

Prípravok výhodne obsahuje ako katiónový lipid lipolyamín. Ešte výhodnejšie je to lipotermin alebo lipospermín, ktorý má výhodne 2 reťazce mastných kyselín. Okrem toho sa môžu k prípravkom pridať isté adjuvans, konkrétne lipidové adjuvans. Výhodnejšie sú lipidové adjuvans neutrálne lipidy, ktoré majú 2 reťazce mastných kyselín.

Konkrétne sú výhodne použité prírodné alebo syntetické lipidy, ktoré sú vo forme zwitteriónu alebo ktoré pri fyziologických podmienkach nemajú iónový náboj. Môžu byť vybrané konkrétnejšie z dioleoylfofatidyletanolamínu (DOPE), oleylpalmitoylfosfatidyletanolamínu (POPE), distearoyl, -palmitoyl, -mirystoylfosfatidyletanolamínu a tiež z ich lx až 3x N-metylovaných derivátov, fosfatidylglycerolov, cerebrozidov (konkrétne galaktocerebrozidov), sfingolipidov (konkrétne sfingomyelínov), cholesterolu alebo asialogangliozidov (konkrétne asialoGMl a GM2).

Tieto rôzne lipidy sa môžu získať buď syntézou alebo extrakciou z orgánov (napríklad mozgu) alebo z vajec, zvyčajnými technikami odborníkovi známymi. Konkrétne extrakcia prirodzených lipidov sa môže uskutočňovať pomocou organických rozpúšťadiel (pozri Lehninger, Biochémia).

Výhodne prostriedky podlá vynálezu zahrňujú, okrem katiónových lipidov, od 0,1 do 20 molárnych ekvivalentov neutrálneho lipidu na 1 molárny ekvivalent fosforečnanu nukleových kyselín a výhodnejšie od 1 do 5.

V mimoriadne výhodnom uskutočnení obsahujú prostriedky podlá predkladaného vynálezu cieľový prvok, ktorý umožňuje orientovať prenos nukleových kyselín. Tento cieľový prvok môže byť extracelulárny cieľový prvok, ktorý umožňuje orientovať prenos nukleových kyselín k určitým bunkovým typom alebo určitým požadovaným tkanivám (nádorové bunky, pečeňové bunky, hematopoetické bunky a pod.). Môže to byť tiež intracelulárny cielový prvok, ktorý umožňuje orientovať prenos nukleovej kyseliny k určitým vybraným bunkovým kompartmentom (mitochondrie, jadro a pod.).

Výhodnejšie je cielový prvok spojený s lipidom kovalentne alebo nekovalentne. Väzba môže byť získaná predovšetkým iónovými interakciami s dusíkom alebo nukleofilnou väzbou amínov vektora na cieľové prvky obsahujúce nukleofúgnu skupinu (halogén, tosylát a pod.), aktivovaný ester (hydroxysukcínimid a pod.) alebo alternatívne izotiokyanát. Cielový prvok môže byť tiež spojený s nukleovou kyselinou.

Z delových prvkov, ktoré sa môžu použiť v rámci vynálezu, sa môžu uviesť cukry, peptidy, oligonukleotidy alebo lipidy. Výhodne sú to cukry alebo peptidy, ako sú protilátky alebo protilátkové fragmenty, ligandy bunkových receptorov alebo ich fragmenty, receptory alebo receptorové fragmenty a pod. Receptorovými ligandami môžu byť konkrétne rastové faktory, cytokínové receptory, bunkové lektínové receptory alebo adhezívne proteínové receptory. Môžu sa tiež uviesť receptory pre transferín, pre HDL a pre LDL. Cielový prvok môže byť tiež cukor, čo umožňuje zacieliť asialoglykoproteínové receptory alebo alternatívne fragment Fab protilátok, čo umožňuje zacieliť receptor pre fragment Fc imunoglobulínov.

Opísané transfekčné prostriedky (transfektanty) sa môžu použiť na prenos nukleových kyselín in vitro, ex vivo alebo in vivo. Na použitie in vivo sa môžu formulovať na podávanie topickou, kožnou, perorálnou, rektálnou, vaginálnou, parenterálnou, intranazálnou, intravenóznou, intramuskulárnou, subkutánnou, intraokulárnou alebo transdermálnou cestou a pod.. Výhodne obsahujú farmaceutický prijatelný nosič pre injekčný prípravok, konkrétne na priamu injekciu na úrovni požadovaného orgánu alebo na podávanie topickou cestou (na kožu alebo sliznicu). Môžu to byť konkrétne izotonické sterilné roztoky alebo suché, konkrétne lyofilizované prípravky, ktoré v závislosti od prípadu po pridaní sterilnej vody alebo fyziologického roztoku umožňujú prípravu roztokov na injekcie. Dávky nukleovej kyseliny použité na injekciu a tiež počet podávania sa môže upraviť v závislosti na rôznych parametroch a osobitne ako funkcia použitého spôsobu podávania, príslušnej patológie, génu, ktorý sa má exprimovať alebo alternatívne požadovaného času liečby.

Ďalší predmet vynálezu sa týka procesu prenosu nukleovej kyseliny do buniek in vitro, in vivo alebo ex vivo spočívajúceho v tom, že sa uvedená nukleová kyselina skontaktuje s dopredu zahriatou suspenziou katiónového lipidu a bunky sa inkubujú s výsledným nukleolipidovým komplexom.

Výhodne je suspenzia katiónového lipidu dopredu zahriata a ponechaná dozrieť. Podlá výhodného spôsobu je nukleolipidový komplex ponechaný dozrieť pred inkubáciou s bunkami. Inkubácia s bunkami sa môže uskutočniť in vivo, na príslušnom podklade (kultivačná miska, vrecko, fľaška a pod.) a prípadne pri sterilných podmienkach. Množstvá inkubovanej DNA sú odborníkom známe (v mikrogramovom rozsahu na 10⁶ buniek). Na použitie in vivo sa môže inkubácia uskutočňovať podávaním prípravku in vivo (napríklad lokálne alebo systémovo).

Predkladaný vynález bude podrobnejšie opísaný pomocou nasledujúcich príkladov, ktoré je treba považovať za ilustratívne a neobmedzujúce.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1: chemické štruktúry katiónových lipidov, IA: DOGS, 1B: RPR 120531, 1C: RPR 120535.

Obr. 2: vplyv teploty na optickú denzitu pri 400 nm lmM suspenzie DOGS v NaCl.

Obr. 3: transmisia mikrofotografie v kryomikroskope 2mM suspenzie DOGS v NaCl pri pH 7,5. Vzorka sa pripravila okamžite po zahriatí (3A), 3 hodiny (3B), 1 týždeň (3C) a 1 mesiac (3D) po zahriatí suspenzie a ochladení na teplotu miestnosti.

Obr. 4: vplyv pH na optickú denzitu pri 400 nm 0,6mM suspenzie DOGS vo vode alebo . v 150mM NaCl. Teplota štúdie: 50 “C.

Obr. 5: fázové diagramy pre DOGS (5A: voda; 5B: 150mM

NaCl), pre RPR120531 (5C: voda; 5D: 150mM NaCl) a pre RPR120535 (5E: voda; 5F: 150mM NaCl).

Obr. 6: schopnosť transfekcie prípravkov z príkladu 5

Obr. 7: schopnosť transfekcie prípravkov z príkladu 6

Obr. 8: schopnosť transfekcie prípravkov z príkladu 7

Obr. 9: schopnosť transfekcie prípravkov z príkladu 8

Obr. 10: schopnosť transfekcie pripravkov z príkladu 9

Obr. 11: schopnosť transfekcie prípravkov z príkladu 10

Obr. 12: schopnosť transfekcie prípravkov z príkladu 11

Prehlad materiálu a metód použitých v príkladoch:

1. Plazmid použitý v nasledujúcich príkladoch (pXL2784) je derivát ColEl nesúci gén kanamycínovej rezistencie a fragment cer z ColEl. Eukaryotická expresná kazeta obsahuje promótor CMV z plazmidu pcDNA3 riadiaci gén kódujúci luciferázu [Photinus pyralis). Je zrejmé, že sa môže použiť aj akákolvek iná nukleová kyselina.

2. Katiónové lipidy použité v nasledujúcich príkladoch sú DOGS, RPR120531 a RPR120535, ktorých štruktúra je znázornená na obr. 1. Je zrejmé, že tie isté pokusy sa môžu uskutočňovať aj s inými katiónmi.

3. Transfekčný protokol. Opísaný postup je použitelný na transfekcie in vitro, ex vivo a in vivo. Použité bunky sú myšacie fibroblasty NIH 3T3, inokulované deň odpredu na doštičky s 24 jamkami s hustotou 50000 buniek na jamku. Použité kultivačné médium je médium DMEM (Dulbecco Modified Eagle Médium), obsahujúce 4,5 g/1 glukózy, doplnené 10% fetálnym teľacím sérom, 1% L-glutamínom (200mM zásobný roztok), 1% pyruvátom sodným, streptomycínom (5000 IU/ml) a penicilínom (500 pg/ml) (Gibco). Pred transfekciou sú bunky dvakrát premyté s DMEM bez fetálneho teľacieho séra. Transfekcia buniek sa uskutočňuje s 50 μΐ transfekčnej suspenzie obsahujúcej 0,5 gg DNA a 3 nmol DOGS na jamku, v 200 μΐ kultivačného média doplneného okrem iného 10% fetálnym teľacím sérom. Po inkubácii 4 hodiny pri 37 ’C (v inkubátore CO₂), je kultivačné médium obsahujúce nukleolipidový komplex odstránené a nahradené s 500 μΐ DMEM doplneným s 10% fetálnym teľacím sérom. Bunky sú potom inkubované 48 hodín.

4. Meranie luciferázovej aktivity eukaryotických buniek. Uskutočňuje sa 48 hodín po transfekcii. Luciferáza katalyzuje oxidáciu luciferínu v prítomnosti ATP, Mg²⁺ a 0₂, ktorú sprevádza vznik fotónov. Celková emisia svetla, meraná luminometrom, je proporcionálna luciferázovej aktivite vzorky. Použité reagencie boli od firmy Promega (luciferázový test) a použili sa podľa odporučeného protokolu. Po dvojitom premytí buniek s PBS sa bunky lyžovali s 250 μΐ lyzovacieho pufru a nerozpustná časť každého extraktu sa odstránila stočením. Test sa uskutočňoval v 5 μΐ supernatantu, neriedeného alebo nenariedeného bunkovým lyzovacím pufrom.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Vplyv teploty na molekulovú organizáciu katiónových lipidov lmM koloidný roztok DOGS sa pripravil rozpustením kryštalického DOGS v chloroforme, odparením rozpúšťadla a sušením v lyofilizačnom prístroji. Film sa potom odobral do roztoku pufru obsahujúceho 0,9% NaCl (lOmM Hepes, pH 7,4). Po zahriatí na 50 °C sa koloidný roztok umiestnil na jeden týždeň do 4 °C. Optická denzita sa sledovala kontinuálne (spektrofotometer Lambda 2 Perkin Elmer s termostatickým držiakom kyvety), zatial čo teplota kúpela (LAUDA RM6), spojeného s kyvetami spektrofotometra sa menila definovanou a kontrolovanou rýchlosťou 1,25 °C/min. Kyveta obsahujúca vzorku mala pridaný miešací systém.

Získané výsledky sú uvedené na obr. 2. Ukazujú ostrý pokles optickej denzity (OD) približne okolo 40 ’C. Tento pokles OD odráža vážnu zmenu usporiadania štruktúry lipidu.

Paralelne sa fyzikálny stav DOGS počas týchto teplotných zmien študoval kryomikroskopiou. Kvôli tomu sa 2M suspenzia DOGS v NaCl pri pH 7,5 zahriala na 50 °C. Fyzikálna povaha objektov sa určovala po zahriatí v priebehu času, počas zrenia pri inkubácii pri teplote miestnosti. Získané výsledky sú uvedené na obr. 3: príprava vzoriek sa uskutočňovala bezprostredne po zahriatí (3A), 3 hodiny (3B), 1 týždeň (3C) a 1 mesiac (3D) po zahriati suspenzie a ochladení na teplotu miestnosti.

Získané výsledky ukazujú zmenu v štruktúre DOGS, od micelárneho stavu k vzniku lamelárnych častíc cez štruktúry vo forme tyčiniek a červíkov. Tento príklad umožňuje definovať podmienky pre predkomplexačné zrenie lipidu.

Príklad 2

Vplyv pH na molekulovú štruktúru katiónových lipidov lmM koloidný roztok DOGS sa pripravil rozpustením kryštalického DOGS v chloroforme, odparením a sušením rozpúšťadla v lyofilizačnom prístroji. Film sa potom odobral do 150mM roztoku NaCl alebo do vody, v rozsahu pH od 3,0 do 11,0.

Po zahriatí na 50 °C sa suspenzia ponechala pri teplote miestnosti (25 °C) aspoň 3 hodiny pred začiatkom merania. Optická denzita sa určovala v podmienkach opísaných v príklade 1.

Získané výsledky sú uvedené na obr. 4. Veľmi jasne ukazujú zvýšenie optickej denzity ako funkciu pH. Toto zvýšenie odráža zvýšenie interakcií medzi molekulami lipidu spôsobené znížením elektrostatického odpudzovania.

Príklad 3

Fázové diagramy pre katiónové lipidy

Aby sa potvrdili pozorovania uskutočnené v príkladoch 1 a 2, vyniesli sa fázové diagramy pre rôzne lipidové vektory. Tieto diagramy opisujú fyzikálny stav lipidov v závislosti na podmienkach pH, iónovej sily a teploty. Ukazujú tiež teploty fázového prechodu a agregačné správanie lipidu v závislosti na jeho ionizačnom stave.

Tieto diagramy sú uvedené na obr. 5Ά a 5B pre DOGS, 5C a 5D pre RPR120531 a 5E a 5F pre RPR120535. Ukazujú, že v prípade, keď je lipid solubilizovaný v čistej vode (pH - 6), je micelárny roztok získaný zahriatím podľa vynálezu stabilný. Umožňujú tiež definovať podmienky iónovej sily a pH, pri ktorých je micelárny roztok určitý čas stabilný.

Príklad 4

Štúdia rôznych protichodných iónov v základnom elektrolyte

Rôzne protichodne pôsobiace ióny sa testovali v štádiu zrenia. Na to sa pozorovali rôzne suspenzie DOGS v médiu, ktorého základný elektrolyt je prítomný v koncentrácii O,1M a ktorého pH nie je upravené (t.j. natívne pH: 3,5) jeden týždeň po zahriatí a schladení na teplotu miestnosti:

v KNO3 sa pozoroval výskyt nanometrových štruktúr micelárneho typu a iba riedky výskyt štruktúr s výraznými hranami. Submikrónové štruktúry boli jemné vlákna so značnou tendenciou agregácie.

- v KI mali nanometrové štruktúry vzhlad naskladaných lamiel, ktorých hrany boli veľmi výrazné. Submikrónové štruktúry tiež existovali vo forme vláken, ale ich hrúbka bola väčšia a mali menšiu tendenciu agregácie.

Príklad 5

A. Protokol na prípravu komplexu a transfekcie

Lipid (DOGS) je aplikovaný na DNA vo forme 2mM suspenzie v 150mM NaCl s natívnym pH (3,5), zahriaty a ponechaný pri teplote miestnosti 1 deň pred skontaktovaním s DNA (prematurácia, t.j. predbežné zrenie 1 deň). Lipid je vnesený so suspenzie obsahujúcej plazmid pXL2784 a 150mM NaCl, upravenej na pH 5-6,6 alebo 8,2 (tieto hodnoty pH sú namerané hodnoty). Pokomplexačné zrenie prebiehalo od 0 do 3 hodín pri teplote miestnosti a transfekcia sa uskutočňovala v prítomnosti a neprítomnosti fetálneho teľacieho séra (FCS).

B. Výsledky:

Výsledky transfekcie vyjadrené v RLU (relative light unit, relatívna svetlená jednotka) na 5 μΐ lyzátu, čo je 1/50 objemu jamky, sú uvedené na obrázku 6. Každá hodnota je priemer merania zo 4 jamiek. Štandardné odchýlky sú predstavované horizontálnymi úsečkami.

Táto štúdia ukazuje, že ak sa začne s roztokom červíkovitých miciel, komplexácia v slanom médiu s vysokým pH (tu pH 8,2) umožňuje eliminovať inhibičný účinok séra, bez ohľadu na pokomplexačné zrenie. Navyše, keď sa na komplexáciu použije stredné pH (stále v slanom médiu), pokomplexačné zrenie tiež umožňuje eliminovať účinok séra na transfekciu.

Podobná štúdia sa uskutočňovala na lipidoch RPR120531 a RPR120535 (pozri obr. 1 pre štruktúry DOGS, RPR120531, RPR120535). Ukazuje správanie podobné DOGS, čo sa týka vplyvu pH na komplexáciu a vplyvu pokomplexačného zrenia na elimináciu účinkov séra.

Príklad 6

A. Protokol na prípravu komplexu a transfekcie:

Lipid (DOGS) je aplikovaný na DNA buď vo forme 2mM suspenzie v 150mM NaCl s natívnym pH (3,5), zahriaty a ponechaný pri teplote miestnosti 1 deň pred kontaktom s DNA (predbežné zrenie 1 deň) alebo vo forme 2mM roztoku v etanole (EtOH). Lipid je vnesený do suspenzie obsahujúcej plazmid pXL2784 a 150mM NaCl, upravenej na pH 4,2-6,2-7,2 alebo 8,2 (tieto hodnoty pH sú namerané hodnoty) alebo alternatívne do kultivačného média DMEM. Pokomplexačné zrenie sa neuskutočňuje okrem prípadu, keď sa uskutočňuje komplexácia pri pH 6,2 (pH 6,2 + mat.). V tomto prípade pokomplexačné zrenie trvá 3 hodiny pri teplote miestnosti. Transfekcia sa uskutočňovala v prítomnosti (FCS) a neprítomnosti fetálneho teľacieho séra (AB FCS).

B. Výsledky:

Výsledky transfekcie vyjadrené v RLU (relatívna svetelná jednotka) na 5 μΐ lyzátu, čo je 1/50 jamky, sú uvedené na obr. 7. Každá hodnota je priemer merania zo 4 jamiek. Štandardné odchýlky sú predstavované horizontálnymi úsečkami.

Táto štúdia ukazuje, že správanie komplexovaných častíc DNA vo vzťahu k inhibícii fetálnym teľacím sérom uvedené v príklade 5 (v závislosti na komplexačnom pH a pokomplexačnom zreni) je tiež účinné, bez ohladu na to, či je DOGS prítomný vo forme suspenzie v slanom médiu alebo vo forme etanolového roztoku. Ukazuje tiež, že krok pokomplexačného zrenia umožňuje eliminovať inhibíciu sérom.

Príklad 7

A. Protokol na prípravu komplexu a transfekcie

Lipid (DOGS) je aplikovaný na DNA vo forme 2mM suspenzie v 150mM NaCI s natívnym pH (3,5), zahriaty bezprostredne bez predchádzajúceho zrenia (NM) pre kontaktom s DNA alebo podrobený prechádzajúcemu zreniu 1 deň pred komplexáciou (D) . Lipid je vnesený do suspenzie obsahujúcej plazmid pXL2784 a 150mM NaCI s pH 6,2 (táto hodnota pH je meraná hodnota). Pokomplexačné zrenie trvalo 0, 0,5 a 3 hodiny a 1 deň, keď sa lipid nevystavil prechádzajúcemu zreniu alebo trvala 3 hodiny, keď lipid sa predtým nechal dozrieť 1 deň pri teplote miestnosti. Transfekcia sa uskutočňovala v prítomnosti a v neprítomnosti fetálneho teľacieho séra. Výsledky získané v neprítomnosti fetálneho teľacieho séra neboli významne odlišné s použitím rôznych protokolov, sú preto uvádzané iba výsledky transfekcií uskutočňovaných v prítomnosti fetálneho teľacieho séra.

B. Výsledky:

Výsledky transfekcie vyjadrené v RLU (relatívna svetelná jednotka) na 5 μΐ lyzátu, čo je 1/50 jamky, sú uvedené na obrázku

8. Každá hodnota je priemer merania zo 4 jamiek. Štandardné odchýlky sú predstavované horizontálnymi úsečkami.

Táto štúdia ukazuje, že neprítomnosť predbežného zrenia DOGS (t.j. zahrievanie sa uskutočnilo bezprostredne pred skontaktovaním s DNA) vyžaduje zvýšenie času pokomplexačného zrenia nevyhnutného na elimináciu inhibičného účinku séra. Štruktúra vytvorená lipidmi ešte predtým ako sa skontaktovali s DNA, ako sa zdá urýchľuje vytvorenie komplexu lipid-DNA.

Tiež sa zdá, že komplexácia uskutočňovaná s lipidmi, ktoré nepreši predbežným zrením, ale boli vystavené dostatočný čas (IM-1D) pokomplexačnému zreniu, umožňujú vytvorenie častíc, ktoré sú účinnejšie pri transfekcii ako častice, keď lipid bol vystavený predbežnému zreniu (1D-3H), asi preto, že vytvorené častice sú menšie a majú pravidelnejší tvar.

Príklad 8

Ά. Protokol na prípravu komplexu a transfekcie:

Lipid (DOGS) je aplikovaný na DNA vo forme 2mM suspenzie buď vo vode s pH 7,5 a predbežným zrením 1 deň pred komplexáciou (voda pH 7,5) alebo vo forme 150mM suspenzie v NaCl s pH 7,5 a tiež predbežným zrením 1 deň pred komplexáciou (NaCl pH 7,5). Lipid je vnesený do suspenzie obsahujúcej plazmid pXL2784 a 150mM NaCl s pH upraveným na 7,2 (táto hodnota pH je meraná hodnota). Pokomplexačné zrenie trvá 0 (0) alebo 3 hodiny (3H) . Transfekcia sa uskutočňovala v prítomnosti fetálneho teľacieho séra.

B. Výsledky:

Výsledky transfekcie vyjadrené v RLU (relatívna svetelná jednotka) na 5 μΐ lyzátu, čo je 1/50 jamky, sú uvedené na obrázku

9. Každá hodnota je priemer merania zo 4 jamiek. Štandardné odchýlky sú predstavované horizontálnymi úsečkami.

Tieto výsledky ukazujú, že je možné odstrániť inhibičné pôsobenie séra rovnako pokomplexačným zrením ako aj tým, že sa umožní, aby lipid pred komplexáciou bol viac štruktúrovaný: podmienky vyššieho pH a vyššej iónovej sily, ako v prípade NaCl s pH 7,5, skutočne napomáhajú určitému typu organizácie. Táto štúdia ukazuje, že ak sa uskutoční pokomplexačné zrenie, je výhodné pre dobrú účinnosť transfekcie komplexovať DNA s lipidmi, ktorých častice nie sú príliš veľké (voda pH 7,5). Pre dobrú účinnosť transfekcie v prítomnosti séra sa zdá, že by mal byť uskutočnený kompromis medzi štruktúrovaním lipidu a veľkosťou častíc.

Príklad 9

A. Protokol na prípravu komplexu a transfekcie:

Lipid (DOGS) je aplikovaný na DNA vo forme 2mM suspenzie v 150mM NaCI s natívnym pH 3,5 a predbežným zrením 1 deň pred komplexáciou (ID) alebo 4 dni pred komplexáciou (4D). Lipid sa vniesol do suspenzie obsahujúcej plazmid pXL2784 a 150mM NaCI s pH upraveným na 6,6 (táto hodnota je meraná hodnota). Pokomplexačné zrenie trvalo 0 (0) alebo 3 hodiny (3H) .

Transfekcia sa uskutočňovala v prítomnosti fetálneho teľacieho séra (FCS) alebo bez neho.

B. Výsledky:

Výsledky transfekcie vyjadrené v RLU (relatívna svetelná jednotka) na 5 μΐ lyzátu, čo je 1/50 jamky, sú uvedené na obrázku

10. Každá hodnota je priemer merania zo 4 jamiek. Štandardné odchýlky sú predstavované horizontálnymi úsečkami.

Výsledky tejto štúdie ukazujú, že nie je významný rozdiel medzi rôznymi spôsobmi transfekcie, pokial sa transfekcia uskutoční v neprítomnosti telacieho fetálneho séra. Na druhej strane však, v prítomnosti séra sa pozorovalo, že dlhé predbežné zrenie (4 dni) umožní eliminovať aspoň čiastočne inhibičné pôsobenie séra, pokial sa neuskutočnilo pokomplexačné zrenie. Táto štúdia tiež ukazuje, že ak sa uskutoční pokomplexačné zrenie, nie je predbežné zrenie nutné, aj keď neškodí, aspoň ako to bolo v prípade predbežného zrenia v 150mM NaCI s natívnym pH počas doby opísanej vyššie.

Príklad 10

Ά. Protokol na prípravu komplexu a transfekcie:

Lipid (DOGS) je aplikovaný na DNA vo forme 2mM suspenzie v 150mM NaCl s pH 7,5 a to buď s okamžitým zahriatím (IM) alebo s predbežným zrením 1 deň (ID) alebo s predbežným zrením 1 mesiac (IM) pred komplexáciou. Lipid je vnesený do suspenzie obsahujúcej plazmid pXL2784 a 150mM NaCl s pH upraveným na 7,2 (táto hodnota je meraná hodnota) . Pokomplexačné zrenie trvá 0 (0) alebo 3 hodiny (3H). Transfekcia sa uskutočňovala v prítomnosti fetálneho teľacieho séra.

B. Výsledky

Výsledky transfekcie vyjadrené v RLU (relatívna svetelná jednotka) na 5 μΐ lyzátu, čo je 1/50 jamky, sú uvedené na obrázku

11. Každá hodnota je priemer merania zo 4 jamiek. Štandardné odchýlky sú predstavované horizontálnymi úsečkami.

Táto štúdia ukazuje, že je možné odstrániť aspoň čiastočne inhibičné pôsobenie séra na transfekciu, pokiaľ sa neuskutočňuje pokomplexačné zrenie. Na druhej strane však, pokiaľ sa uskutočňuje zrenie nukleolipidového komplexu, pozorovalo sa, že výsledná transfekčná účinnosť bola lepšia, ako v prípade, keď sa lipid zahrieval bezprostredne pred tým, ako sa skontaktoval s DNA a je teda vo forme malých lipidových častíc.

Príklad 11

A. Protokol na prípravu komplexu a transfekcie:

Lipid (DOGS) je aplikovaný na DNA vo forme 2mM micelárneho roztoku v čistej vode s natívnym pH 3,5. Lipid sa vnesie do suspenzie obsahujúcej plazmid pXL2784 a 150mM NaCl s pH upraveným na 7,3 (táto hodnota je meraná hodnota). Pokomplexačné zrenie trvalo 0 (0), 0,5 hodiny (0,5H), 3 hodiny (3H), 1 deň (ID) alebo 1 týždeň (1W). Transfekcia sa uskutočňovala v prítomnosti fetálneho telacieho séra.

B. Výsledky:

Výsledky transfekcie vyjadrené v RLU (relatívna svetelná jednotka) na 5 μΐ lyzátu, čo je 1/50 jamky, sú uvedené na obrázku

12. Každá hodnota je priemer merania zo 4 jamiek. Štandardné odchýlky sú predstavované horizontálnymi úsečkami.

Táto štúdia potvrdzuje, že pokial sa na DNA aplikuje DOGS v podobe micelárneho roztoku, pokomplexačné zrenie sa stáva nevyhnutným, aby sa odstránil inhibičný účinok séra. Pozorovalo sa, že v tomto prípade pokomplexačné zrenie v dĺžke 3 hodiny je dostatočné.

Všetky uvedené výsledky ukázali, že spôsob podľa predkladaného vynálezu, vrátane kroku predbežného zahrievania a príslušných krokov zrenia, umožňuje získať definovaný, homogénny a reprodukovateľný prostriedok so zlepšenými transfekčnými vlastnosťami.

Zoznam citovanej literatúry

Barzhel Remy J.S Transfer Cccimization wit Biol. 12, 533-560 (1993).

Lceffler J.?, and Eehr J.?., Gene Lipospemine-Coated DNA. DNA Celí äe

J. P., Demeneix

3., Loeffler J.P and

PerezMutul J., Efficient Gene Transfer into Mammalian Primary Er.docrine Cells with Lipocolvamine-Coated DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6982-6986 (1989).

Bringnam K.L., Meyrick B., Christman B., 3erry, Jr L.C. and Kine G. Expression of a Procaryotic Gene in Cultured Lune Endothelial Cells after Lipofectlon with a Plasmid Vector. Am. J. Respir. Celí Mol. Biol. 1: 95-100 (1989).

Demeneix B.A., Fredriksson G., Lezoual’ch F., DaugerasBernard N., Behr J.P. and Loeffler “J.P., Géne Transfer into Intact Vertebrate Embryos. Int. J. Dev. Biol. 35; 481-484 n qqi \

Díizgíines N., Goldstein J.A., Friend' D.S. and Felgner P.L., Eusion of Liposomes Containing a Novel Cationic Lipid, N- (2,3- (Dioieyloxv)propyl]-N,Ν,Ν-trimethyľammonium:

Induction by Multivalent Anions and Asymmetric Fusion with Acidic Phosphclipid Vesicles. Biochemistry 28: 9179-9184 (1989) .

Fasbender A.J., Zabner J. and Welsn M.J., Optimization of Cationic Lipid-Mediated Gene Transfer to Airway Epithelia. Am. J. Physiol. 269: 45-51 (1995).

Felgner P.L., Gadek T.R., Holm M., Roman R., Chán H.W., Wenz M., Northrop J.P., Ringold G. and Danielsen M., Lipofectlon:· A Kighly Efficient Lipid-Mediated DNATransfection Procedúre. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 74134717 (1987).

Gao X. and Huang L., A Novší Cationic Liposome Reagent for Efficient Transfection of Mammalian Cells. Siochem. Sicpnys. Res. Ccm. 179: 280-295 (1991).

Guershon K., Ghirlando R., Gutcman S.3. and Minsky A., Mede of Foroiaíion and Structural Features of DNA-Cationic Liposome Compiexes Used for Transfection. Biochemistry 32: 7143-7151 (1993).

Gustafsson J., Arvidson G., Karlsson G. and Almgren M. Complexes between Cationic Liposomes and DNA Visualized by Cryo-TEM. Biochim. Biophys. Acta 1235: 305-312 (1995).

Hui S.W., Langner M., Zhao Y.L., Ross P., Hurley E. and Chán K., The role of Helper Lipid Cationic Liposome-Mediated Gene Transfer. Biopnys. J. 71: 590-599 (1996).

Hofiand K.E.J., Shephard L. and Sullivan S.M., Formation of -stabie Cationic Lipid/DMA Compiexes for Gene Transfer. Proc. Natl. Acad. SCI. USA 93: 7305-7309 (1996).

Pinnaduwage P., Schmitt L. and Huang L._z Use o f a Quaternäŕy ' Ammonium ' Detergent in Liposome Mediated DNA Transfection of Mouse L-Cells. Biochim. Biophys. Acta 985: 33-37 (1989).

Sternberg B._z Sorgi F.L. and Huang L., New Structures in Complex Formation between DNA and Cationic Liposomes Visualized by Freeze-Fracture Electron Microscopy. FEBS Lett. 356: 361-366 (1994).

Xu Y. and Szoka, Jr F.C., Me cháni sm of DNA Release from Cationic Liposome/DNA Compiexes Used in Celí Transfection. Biochemistry 35: 5616-5623 (1996).

Claims (24)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob prípravy prostriedku na prenos nukleových kyselín, pri ktorom sa nukleová kyselina skontaktuje s katiónovým lipidom, vyznačujúci sa tým, že pred tým, ako sa skontaktuje, sa katiónový lipid zahrieva, pokial sa nevytvorí micelárny roztok.
2. 2. Spôsob podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že katiónový lipid sa zahreje na teplotu vyššiu ako je teplota fázového prechodu.
3. 3. Spôsob podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že obsahuje medzi krokom, keď sa zahreje a krokom, keď sa skontaktuje, navyše krok predkomplexačného zrenia, ktorý spočíva v tom, že sa médium ochladzuje, modifikuje sa jeho iónová sila a/alebo sa modifikuje jeho pH.
4. 4. Spôsob podlá nároku 1 alebo 3, vyznačujúci sa tým, že obsahuje po kroku, keď sa skontaktuje, navyše krok pokomlexačného zrenia nukleolipidového komplexu, ktorý spočíva v tom, že sa médium ochladzuje, modifikuje sa jeho iónová sila a/alebo sa modifikuje jeho pH.
5. 5. Spôsob podlá nároku 1 alebo 3, vyznačujúci sa tým, že krok skontaktovania sa uskutočňuje pri pH v rozsahu 4 až 10.
6. 6. Spôsob podlá nároku 1 alebo 3, vyznačujúci sa tým, že krok skontaktovania sa uskutočňuje pri pH v rozsahu 6 až 9.
7. 7. Spôsob podľa nároku 1 alebo 3, vyznačujúci sa tým, že krok skontaktovania sa uskutočňuje pri iónovej sile v rozsahu 0 až 2M.
8. 8. Spôsob podľa nároku 1 alebo 3, vyznačujúci sa tým, že krok skontaktovania sa uskutočňuje pri iónovej sile v rozsahu 0,01 až 0,5M.
9. 9. Spôsob podľa nároku 1 alebo 3, vyznačujúci sa tým, že krok skontaktovania sa uskutočňuje pri iónovej sile v rozsahu 0,05 až 0,2M.
10. 10. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že predkomplexačné zrenie sa uskutočňuje inkubovanim pri teplote miestnosti.
11. 11. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že predkomplexačné zrenie sa uskutočňuje inkubovanim pri teplote miestnosti v rozsahu 0,5 hodiny až 1 mesiac
12. 12. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že predkomplexačné zrenie sa uskutočňuje pokiaľ sa nevytvoria organizované agregáty červovitého, tubulárneho, lamelárneho, hexagonálneho a/alebo stĺpcovitého typu.
13. 13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že predkomplexačné zrenie sa uskutočňuje až kým sa neobjavia organizované agregáty červovitého alebo tubulárneho typu.

    14. Spôsob podlá nároku 4, vyznačuj ú c i s a tým, že ochladzovanie sa uskutočňuje inkubovaním pri teplote miestnosti. 15. Spôsob podľa nároku 4, vyznačuj ú c i s a tým, že pokomplexačné zrenie sa uskutočňuje až dokiaľ sa nevytvoria organizované agregáty hexagonálneho, lamelárneho alebo

    stĺpcovitého typu alebo väčšie agregáty.
14. 16. Spôsob podlá ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sa katiónový lipid vyberie z lipopolyamínov.
15. 17. Spôsob podlá nároku 16, vyznačujúci sa tým, že katiónový lipid je lipospermín alebo lipotermin.
16. 18. Spôsob podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že nukleová kyselina je DNA.
17. 19. Spôsob podlá nároku 18, vyznačujúci sa tým, že DNA je plazmid, vektor alebo lineárny fragment.
18. 20. Spôsob podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že nukleová kyselina je RNA.
19. 21. Spôsob prenosu nukleovej kyseliny do buniek in vitro alebo ex vivo, vyznačujúci sa tým, že nukleová kyselina sa skontaktuje s predtým zahriatou suspenziou katiónového lipidu a bunky sa inkubujú s výsledným nukleolipidovým komplexom.
20. 22. Spôsob podlá nároku 21, vyznačujúci sa tým, že sa nukleová kyselina skontaktuje so suspenziou katiónového lipidu predtým zahriatou a zrelou podľa nároku 3.
21. 23. Spôsob podľa nároku 21 alebo 23, vyznačujúci sa tým, nukleolipidový komplex dozrieva podľa nároku 4 pred tým, ako sa inkubuje s bunkami.
22. 24. Prostriedok na prenos nukleovej kyseliny, vyznačujúci sa tým, že je v podstate necitlivý voči inhibičnému pôsobeniu séra a že môže byť získaný spôsobom podľa nároku 1.
23. 25. Prostriedok podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že obsahuje navyše jedno alebo niekoľko lipidových adjuvans.
24. 26. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že katiónový lipid obsahuje navyše lipidové adjuvans.