KR20000010780A

KR20000010780A - 유전자 물질을 전달용 양이온 비로좀

Info

Publication number: KR20000010780A
Application number: KR1019980708906A
Authority: KR
Inventors: 에른스트 루돌프 밸티; 라인하르트 글뤽크; 페터 클라인
Original assignee: 와이에키 피아세키; 니카 헬스 프로덕츠 리미티드
Priority date: 1996-05-08
Filing date: 1997-05-04
Publication date: 2000-02-25
Also published as: HUP9901790A2; ZA973885B; CN1225007A; US6210708B1; BR9709224A; ID17934A; NO985137D0; KR100536983B1; PL199201B1; HRP970234A2; CN1271992C; CZ299809B6; EA199800992A1; JP2000509404A; PE65198A1; GT199700058A; AR007054A1; CZ361498A3; CA2253561A1; AU710170B2

Abstract

본 발명은 in vitro 또는 in vivo에서 포유류 세포를 죽이거나 또는 증식시키기 위해 유전자 물질을 효과적으로 수송할 수 있는 양전하를 띈 비로좀에 관계한다. 비로좀 막에는 양이온 및 다가양이온 지질, 적어도 한 개의 바이러스성 융합 단백질 및 적어도 한 개의 세포-특이적인 표식을 포함하는데, 표식은 표적 세포의 선택 및 결합을 위해 단클론항체, 항체 단편 F(ab')₂, Fab', 사이토킨, 생장인자에서 선택된다. 본 발명은 또한 신규한 비로좀의 제조방법 및 이의 용도 특히, 암 또는 백혈병을 치료하기 위한 제약학적 조성물을 제조하는데 이용하는 것을 제공한다.

Description

유전자 물질을 전달용 양이온 비로좀

리포좀은 약물 수송용 담체로 이용되기도 하고, 체내 유체에 있는 생(화학)물질에 의한 공격으로부터 반감기가 짧은 제약학적 물질을 보호하는 보호 벽으로 널리 이용되어 왔다. 바이러스 외피의 일부 또는 재구성된 막 단백질을 포함하는 리포좀은 "비로좀"이라 한다(Sizer et al., Biochemistry 26:5106-5113, 1987). 이와 같은 비로좀은 다양한 약물 및 DNA 분자의 비-특이적인 수송에 이용되어 왔다(Vainstein et al., Methods Enzymol. 101:492-512, 1983). 이들 비로좀은 표적 세포의 세포 막과 융합하여 표적 세포의 세포질 안으로 수송되는 물질을 비-제어방식으로 전달하게 되고, 보호 안된 물질은 분해성 세포내 공장에 의해 공격을 받게 된다.

WO 92/13525에서는 인플루엔자 바이러스의 바이러스성 스파이크 단백질과 단클론성 항체와 같은 세포-특이적인 표식으로 표적화된 인지질 이중층막으로 된 비로좀은 수용체-중개된 엔도사이토시스(endocytosis)에 의한 바이러스와 유사한 침투 방식으로 인하여 모델 막과 동물 세포와 효과적으로 융합할 수 있다고 보고하고 있다. 이들 비로좀은 표적 위치로 화학물질 및 원하는 약물을 성공적으로 공급하하나 음전하를 가지는 핵산과 같은 전하를 가진 분자가 안정적으로 결합되고 수송되는데에는 단점이 있다.

최근에, 리포좀에 결합된 유전 물질의 세포-특이적인 수송이 점점 더 많은 관심을 받았으며, 항암 및 유전자 치료법에 이용하는데 특히 중요하다. 세포로 DNA 또는 RNA을 수송하는데에는 몇 가지 방법을 현재 이용하는데; 바이러스 중개된 방법, 지질이 중개된 방법 및 마이크로인젝션 또는 전기천공과 같은 다른 방법 등이 포함된다. 현재 이용할 수 있는 유전자 전달 기술의 장점 및 단점은 다음과 같이 요약할 수 있다.

a) 바이러스 중개된 유전자 전달; 레트로 바이러스 벡터에 의해 포유류 세포내로 유전자를 효과적이고 안정적으로 유입시킬 수 있다. 그러나, 비-복제 세포로 유전자를 전달하는 효율은 매우 낮고, 그 이유는 레트로바이러스는 분할하는 세포에만 감염되기 때문이다. 또한, 일반적인 안정성에 대해서 레트로바이러스를 이용하면, 온코젠(oncogene)이 활성화될 수 있다. 대부분의 연구자들이 유전자 전달 벡터로 복제-결합이 있는 아데노바이러스를 선택하여왔다. 아데노바이러스 중개된 유전자 전달은 원하는 유전자를 결손된 아데노바이러스 입자에 삽입하거나 또는 삽입될 DNA와 아데노바이러스의 바이러스 피복사이에 트란스페린-폴리리신 다리에 의해 복합체를 형성하여 이에 원하는 유전자를 삽입하는 것이다. in vivo에서 이와 같이 매우 효과적인 시스템의 단점은 막연한 감염 또는 염증의 위험이 있다는 것이다; 바이러스에 복제 능력을 없애는 E1 유전자가 결손되어도 남아있는 바이러스 게놈에는 바이러스성 단백질을 인코드하는 다수의 오픈 리딩 프레임을 포함한다(Yang et al., 1994; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4407-4411). 형질 변환된 세포에 의해 바이러스성 단백질이 발현되면 동물 및 사람의 신체에서 체액 및 세포 면역 반응을 유도하게 되고 따라서 염증 및 증식을 야기할 수 있다.

HVJ(Sendai virus) 중개된 방법에서, 외부 DNA는 리포좀과 복합체를 이룬다. 그 다음 리포좀은 비활성화된 센다이 바이러스(Sendai virus)에 얹는다. 이 방법은 다양한 조직으로 in vivo에서 유전자를 전달하는데 이미 이용된 것이다. 또한, HVJ-리포좀에 의한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 세포 수용에 대해서도 이미 보고되었다(Morishita et al., 1993; J. Cell. Biochem. 17E, 239). 그러나, 단점은 HVJ-리포좀이 적혈구세포에 비-특이적으로 결합하는 경향이 있다는 것이다.

b) 지질-중개된 유전자 전달; 양이온 지질로 구성된 양전하를 뛴 리포좀은 in vitro에서 유전자 및 안티센스 올리고뉴클레오티드를 전달하는데 용이하고, 안전하고, 효과적인 것으로 나타났다. 높은 음전하를 뛴 핵산은 양전하 리포좀과 자발적으로 상호작용을 한다. 미리 형성된 양전자를 뛴 리포좀과 폴리뉴클레오티드를 단순히 혼합하면, DNA-리포좀 복합체가 형성된다. 그러나, 리포좀 막에서 융합 펩티드와 세포-특이적인 표식이 부족하기 때문에 in vivo 트랜스펙션의 효율은 상당히 낮고, 배양 시간은 길어지고 따라서, 원하는 효과를 얻기 위해서는 상당량의 약량을 투여해야 한다. 결과적으로 원치 않는 부작용이 발생할 수 있는데, in vivo에서 상당량의 양이온 지질이 독성 효과를 가진다는 증거도 있다.

항암 치료에 치료제로써 그리고 항-바이러스제로써 현재 작은 올리고뉴클레오티드를 테스트하고 있다. 두 개의 DNA 가닥 중에 하나만이 전사되어 mRNA를 합성한다. RNA로 전사되는 DNA는 코딩 가닥 또는 센스 가닥이라 부른다. 상보적인, 비-코딩 또는 안티센스 가닥은 mRNA와 동일한 서열을 가진다. 비-코딩 가닥이 전사되었을 경우에, 표적(센스) mRNA에 결합을 할 수 있는 안티센스 분자를 만든다. 일단, 안티센스 RNA가 센스 RNA에 결합을 하면, 생성된 이중 RNA 분자는 번역되지 않고, 단백질의 생산이 차단된다. 항상, 18 내지 22개의 염기로 된 짧은 안티센스 올리고뉴클레오티드는 mRNA에 효과적으로 결합을 하여 mRNA의 해독을 방해한다. 이와 같은 기작에 의해, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 사람 암 세포에서 증식을 중단한다. 암에 연관된 유전자는 이들의 정상적인 구조 단백질의 과발현을 통하여 이들의 효과를 나타낸다. c-fos, c-myc, L-myc, N-myc, c-myb, abl, bcr-abl, c-raf, c-erb-2, K-ras와 같은 유전자는 안티센스 암 치료에 잠재적인 표적이 될 수 있다. 또한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 약물에 대체할 수 있는 가능성이 있는데 가령, 사람 면역결핍 바이러스(HIV)의 tat와 gag 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 항-바이러스제로 이용할 수 있다.

Stegmann et al., EMBO J. 6:2651-2659, 1987에서 상술하는 것과 같이 재구성된 바이러스 외피로 구성된 리포좀 막은 비로좀이라 한다. 이들은 항상 포스파티딜콜린(PC)와 포스파티딜에탄올아민(PE)를 포함하는 인지질 이중층과 막에 끼어 있는 스파이크 단백질와 같은 바이러스 외피로 구성된다. PC, PE-비로좀에 유전자 물질을 결합시키는 통상적인 방법은 핵산 결합 효율이 상당히 낮은 단점이 있다.

발명의 요약

따라서 본 발명은 신규한 양전하를 뛴 비로좀에 관계하는데 이와 같은 비로좀은 특정한 막 조성물로 인하여 긴 사슬 또는 짧은 사슬의 DNA 또는 RNA, 올리고데옥시뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 펩티드 핵산(PNA), 리보자임(효소활성이 있는 RNA 분자), 유전자, 플라스미드, 벡터 등으로 구성된 임의 원하는 유전자 물질을 매우 효과적으로 포집시킬 수 있어 선행기술의 단점을 극복할 수 있다.

본 발명은 또한, 인플루엔자 바이러스 A 특히, 균주 A/Singapore의 헤마글루티닌을 단층의 양이온 지질 소포에 재구성시켜 평균 직경이 약 120-180nm인 의 효과적인 양이온 비로좀을 만드는 방법에 관계하는데, 이와 같은 비로좀의 연속 이중 지질 층은 많은 통상적인 비로좀을 만드는 과정에서 볼 수 있는 단점인 누출이 없다. 단층의 양이온 이중 막의 구조는 지질의 친수성, 양전하를 띈 머리는 수용상으로 향하고, 소수성 지방산 꼬리는 이중층의 중앙을 향하도록 한다. 전자 현미경으로 보았을 때, 재구성된 바이러스성 스파이크 단백질(헤마글루티닌)은 지질 이중층에 결합되고, 양이온 소포의 표면으로부터 연장된다(도 1).

소포 막의 지질 조성은 양이온 또는 폴리양이온 지질 및 포스파티딜에탄올아민과 포스파티딜콜린과 같은 선택적인 인지질로 구성된다. 대부분의 경우에 옻 지질에 근거하여 다음과 같은 지질 막 성분을 선택하면 유익한 것으로 나타났다;

1) 양이온 또는 다가 양이온 지질이 100wt%;

2) 양이온 또는 다가 양이온 지질이 90 내지 95wt%와 포스파티딜에탄올아민이 5 내지 10wt%; 또는

3) 양이온 또는 다가 양이온 지질이 45 내지 90wt%와 포스파티딜에탄올아민이 5 내지 10wt%; 포스파티딜콜린이 5 내지 50wt%.

적절한 구체예에서, 본 발명은 양이온 비로좀에 표적 세포에 선택적인 감지 및 결합에 유용한 단클론항체, F(ab'₂)와 Fab' 단편과 같은 항체 단편, 사이토킨, 또는 생장 인자를 포함하나 이에 국한되지 않는 세포-특이적인 표식을 비공유적으로 결합시키는 것에 관계한다. 이들은 소포막에 연결되어 수용체의 감지 및 결합에 대해 외부의 필수적인 활성을 연장한다.

Martin et al.,(J.Biol.Chem. 257:286-288, 1982)에서 설명하는 미리 형성된 소포에 활성 단편과 같은 세포-특이적인 표식을 결합시키면 재생할 수 없는 결합을 만드는데-이는 표적화 전략에 상당한 제한을 한다. 따라서, 본 발명의 적절한 구체예에 따르면, 표식은 계면활성제 존재 하에 N-[4-(p-말레이미도=페닐부티릴)-포스파티딜에탄올아민(MPB.PE)와 같은 미리 형성된 포스파티딜에탄올아민-교차 결합 분자에 결합된다.

최상의 결과를 얻기 위해서는 단백질 분해성 절단에 의한 비활성화 또는 분자내 S-S 결합의 환원을 피하기 위하여 재구성하기 전에 조심스레 바이러스성 당단백질을 분리 정제한다. 따라서, 공액된 표식 가령, 표식-MPB.PE를 활성화된 아가로즈 매트릭스 적절하게는 환원된 티오프로필 세파로즈 6B를 이용한 친화력 크로마토그래피에 의해 공액안된 포스파티딜에탄올아민-교차결합 분자(MPB.PE)로부터 분리하는 것이 바람직하다. 그 다음 정제된 공액 표식(포스파티딜에탄올아민-교차결합제-표식 분자 복합체) 몇 방울을 양이온 비로좀이 형성되기 전인 용해된 막 지질, 융합 펩티드 및 다른 원하는 성분 혼합물을 포함하는 계면활성제 용액에 첨가한다.

비로좀을 준비하기 전에 별도 공정에서 인지질과 세포-특이적 표식의 이가 기능성 교차결합기로 결합하는 공정을 실행하는 것이 유익한 것으로 증명되었다. 이와 같은 과정으로 비로좀 막의 표면 밀도를 더 잘 조절하고 최적화시킬 수 있는데 특히 이에 결합된 세포-특이적인 표식의 수에 대해 더 잘 조절할 수 있다. 막에 결합된 또는 끼워져 있는 단백질 분자의 농도를 조절하는 개선된 방법은 비로좀에 있는 융합 펩티드(헤마글루티닌)과 세포-특정 표식(항체 Fab'단편)의 비균형 비율로 인하여 이들의 선택성을 감소시키거나 또는 파괴시켜 극단적인 경우에는 소포가 응기거나 침전하기 때문에 상당히 중요하다.

세포-특정 표식으로 전체 항체를 사용하는 대신에 항체 단편 F(ab')₂와 Fab'를 이용하면 이와 같은 단편이 전체 항체보다는 면역원성이 적기 때문에 특히 유익하다. 또한, Fc 도메인이 없으면 전통적인 경로를 통한 상보 활성 및 급성 체액 반응과 같은 바람직하지 못한 Fc-중개된 생물학적 및 면역학적 활성 범위를 제거하여 표적 세포에서 항체와 이의 Fc-수용체간에 상호작용을 통하여 표적 세포 표면으로부터 부착된 비로좀을 제거하게 된다.

핵산 수송에 대한 공지의 리포좀성 조성물과는 달리, 본 발명의 양이온성 비로좀은 세포질로 들어가기 위해 혈장 세포 막과 융합하거나 이를 분해할 필요가 없다. 이들은 1. 흡착; 2. 침투의 두 단계 메카니즘을 통하여 숙주 세포로 들어갈 수 있다. 제 1 단계에서, 이들은 융합 펩티드(헤마글루티닌) 또는 세포-특정 표식을 통하여 세포 수용체 특히, 단부 시알산이 있는 막의 당단백질 또는 당지질에 결합을 하고, 그 다음 수용체-중개된 엔도사이토시스를 통하여 매우 효과적으로 결합을 한다. 항체 단편과 같은 세포-특이적인 표식을 가지는 비로좀의 경우에 이와 같은 표식은 표적 세포 표면에서 항원성 구조를 추가 인지하여 두 가지 다른 결합 메카니즘을 통하여 결합하게 된다. 따라서, 본 발명의 세포-특이적인 비로좀은 막에 있는 세포-특이적인 표식으로 인한 다양한 세포 형에 대한 선택성과 동시에 헤마글루티닌과 같은 바이러스성 융합 펩티드로 인한 엔도사이토시스에 의해 세포 침투능이 매우 크다. TAG72, CEA, 17-1A, CA19-9와 같은 종양과 연관된 항원 또는 CD10(CALLA=Common Acute Lympocytic Leukaemia Antigen)과 같은 백혈병과 연관된 항원을 인지하는 Fab' 단편이 있는 비로좀은 세포 표면에 전술한 항원을 가지는 종양 또는 백혈병 세포에 선택적으로 결합한다.

제 2 단계에서, 수용체-중개된 엔도사이토시스를 통하여 숙주 세포로 들어갈 때 비로좀은 엔도좀(endosome)에 포집된다. 결과적으로 엔도좀내의 pH는 약 5-6으로 감소하여 헤마글루티닌 융합 단백질을 활성화시키고, 비로좀 막과 엔도좀 막의 융합을 촉진시킨다. 막 융합 반응이 비로좀의 지질 외피를 개방하고, 포집된 유전자 물질을 세포질로 방출하게 된다. 이와 같은 기작은 온침성 분해 또는 엑소사이토시스에 의해 제거되기 전에 전달하고자 하는 유전자 물질을 핵에 도달하는 기회를 상당히 개선시킨 것으로 간주된다.

본 발명은 유전자 생체 공학 및 유전자 치료요법분야에서 표적 위치로 유전자 물질을 효과적으로 전달하기 위해 막에 있는 바이러스성 당단백질을 포함하는 양전하를 띈 리포좀성 소포로 된 신규한 비로좀(virosome)과, 이를 제조하는 방법 및 이를 이용하는 것에 관계한다. 본 발명의 양전하 비로좀은 특히 in vitro 또는 in vivo에서 표적 세포로 유전자를 특이적 그리고 비-특이적 비-감염성 수송에 적합하다.

도 1은 바이러스성 스파이크 단백질이 있는 DOTAP 비로좀의 현미경 사진이다.

도 2는 모델 리포좀과 옥타데실 로다민 B가 라벨된 DOTAP-비로좀의 pH 유도된 융합 활성을 나타낸다.

도 3은 사람의 소세포 폐암세포에 결합된 안티센스가 포집된 FITC-OPT가 잇는 DOTAP-비로좀을 나타낸다.

도 4와 5는 사람 소세포 폐 암세포로 안티센스-L-myc-DOTAP-비로좀의 상당한 수용 및 형질전이 효율을 나타낸다.

도 6은 안티센스-L-myc 비로좀과 상이한 사람 소세포 폐암세포의 배양을 나타낸다.

도 7a 와 7b는 Jurkat 세포에 대해 pRSVcat-DOTAP 비로좀의 형질감염 효율을 나타낸다.

도 8은 인지질-리포좀과 DOTAP-비로좀의 융합을 나타낸다. 융합은 37℃에서 R18 검사로 측정하였다.

도 9는 비로좀-처리된 NCI-H209 세포에 티미딘의 결합을 나타낸다. 안티센스, 센스 또는 msc FITC-OPT 200picomole을 포함하는 비로좀 75㎕와 0.5μCi₁₄C-티미딘을 포함하는 새로운 배지 625㎕를 웰 ㎖당 5×10⁴세포에 첨가한다.

도 10은 안티센스-L-myc-OPT를 포함하는 비로좀 추가 시에 NCI-H209 세포로 티미딘의 결합을 약량에 따른 저해를 나타내었다. NCI-H209 세포는 초기 농도를 웰당, ㎖당 1×10⁵세포로 하여 배양하였다.

도 11은 75㎕의 안티센스-L-myc 비로좀과 상이한 사람 소세포 폐암세포를 배양한 것이다. L-myc 온코겐 발현은 H82 < H510A < H209의 순서로 세포 주에서 감소되었다. lot 1의 비로좀에는 lot 2의 것보다 더 적은 양의 안티센스-L-myc를 포함한다.

도 12는 두 가지 다른 방법으로 생산한 물질을 이용한 Sp2 세포의 형질도입을 나타낸 것이다.

도 13은 두 가지 다른 방법으로 생산한 물질을 이용한 P3/NS1 세포의 형질도입을 나타낸 것이다.

도 14는 두 가지 다른 방법으로 생산한 물질을 이용한 NIH/3T3 세포의 형질도입을 나타낸 것이다.

도 15, 16, 17에서는 센스와 안티센스 c-myb-DOTAP 비로좀으로 처리할 때 KG1 세포의 생장을 나타낸 것이다. 18, 36, 72pmol OPT를 포함하는 25, 50, 100㎕ 비로좀을 첨가한다. 값은 평균 ±세 가지 실험의 표준 편차를 나타낸다.

도 18은 50㎕ 센스와 안티센스 c-myb 비로좀을 추가하였을 때 DOTAP-비로좀으로 처리 시에 CEM-C3 세포의 세포 생장을 나타낸 것이다.

본 발명의 주요 목적은 양전하를 띈 지질 소포를 제공하는 것인데 이때, 소포는 양이온 또는 다가 양이온 지질과 내부-통상 수용성-공간으로 구성되고, 또한 소포 막에 끼워져 있는 또는 결합된 또는 공유 결합된 적어도 한 개의 바이러스성 융합 펩티드가 추가로 포함된다. 소포는 적절하게는 또한 막에 적어도 한 개의 세포-특이적인 표식을 가진다. 본 발명의 목적은 또한 고유 인플루엔자 바이러스와 같은 동일한 융합 활성을 기본적으로 가지는 완전한 생물학적 융합 활성을 가진 소포를 제공한다. 융합 펩티드는 헤마글루티닌 또는 이의 단편과 같은 바이러스성 당단백질이거나 엔도사이토시스후에 표적 세포의 엔도좀 막과 소포의 신속한 융합을 유도할 수 있는 합성 융합 펩티드가 될 수 있다.

신규한 소포 또는 비로좀은 특히 in vitro 및 in vivo에서 동물 및 사람 세포 및 조직과 같은 표적 위치로 임의 원하는 유전자 물질을 전달하는데 유용하다. 신규한 비로좀은 복제할 수 있는 세포와 같은 증식하는 세포뿐만 아니라 휴지 세포 즉 비-증식 세포로도 침투할 수 있어 생명공학, 제약 및 의약 등의 분야에 광범위하게 이용될 수 있다. 약물로 이용하기 위해서는 본 발명의 비로좀은 제약학적 조성물의 일부가 되어 통상적인 첨가제와 제약학적 수용 가능한 담체가 추가로 포함된다. 적절하게는 제약학적 조성물은 주사액형태로 만드는 것이 바람직하나 다른 형태 가령, 국소 및 전신 투여를 위한 유제, 크림, 겔, 연 고등으로 만들어도 된다.

따라서, 본 발명의 목적은 이와 같은 치료로 잇점을 얻을 수 있는 동물 또는 사람의 치료 및 예방에 적합한 제약학적 조성물을 제조하는데 본 발명의 비로좀을 이용하도록 하는 것이다. 또한 본 발명의 다른 목적은 in vivo 및 in vitro에서 이용할 수 있도록 진단 키트를 제조하는데 본 발명의 비로좀을 이용하는 것이다.

한 구체예에서, 본 발명의 소포는 인플루렌자 바이러스 A의 효과적인 헤마글루티닌(HA) 재구성 공정으로 수득된다. 따라서, 본 발명의 목적은 이와 같은 양이온 비로좀을 준비하는 방법을 제공한다. 적절한 구체예에서, 방법은 양이온 지질 소포에 유전자 물질을 결합시키는 단계로 구성된다. 기본적으로 이와 같은 제조 방법은 다음의 단계로 구성된다;

1) 옥타에틸렌글리콜 모노-n-도데실에테르(OEG, C₁₂E₈)와 같은 비-이온성 계면활성제에 양이온 지질과 바이러스성 스파이크 당단백질, 운반을 원하는 유전자 물질, 선택적으로 포스파티딜에탄올아민으로 만들어진 복합체 분자, 교차결합제 및 세포-특이적인 표식을 함께 용해시키고; 그리고

2) 계면활성제를 흡수하는 마이크로-캐리어 비드, 적절하게는 메쉬 크기가 20-50(0.84-0.30㎜)의 SM-2 바이오비드형의 폴리스티렌 비드로 계면활성제를 제거하여-적절하게는 반복적으로-소포를 형성한다.

본 발명의 적절한 구체예에서, 적절한 이가 기능기 교차 결합제를 소포 막에 있는 세포-특이적인 표식에 비가역적으로 연결시킨다. 세포에 비로좀의 선택적인 결합을 담당하는 세포-수용체에 대한 세포-특이적인 표식은 완전한 생물학적 활성을 가지는 방식으로 교차결합제에 결합된다. 미리 형성된 분자-복합제를 만드는데 교차결합제를 이용하는 것이 바람직한데, 이때 교차결합제는 포스파티딜에탄올아민 또는 포스파티딜에탄올아민과 세포-특이적인 표식에 공유결합된다.

본 발명의 비로좀이 기능적으로 활성이 있는 융합 펩티드이기 때문에 엔도좀 pH(전술한 기준)를 감소시킴에 따라 표적 세포의 세포질로 포집된 물질이 방출된다. 이와 같은 조절된 방출은 표적 세포에 수송되는 물질의 표적 세포 내에 수송되는 잔류 시간을 연장시키고, 다른 한편으로는 엔도좀 내에 비로좀이 바람직하지 못하게 장시간 체류하는 것을 방지하여 비로좀에 의해 수송된 물질의 비-특이적으로 분해될 위험을 감소시킨다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 소포에 관계하는데, 막 지질은 포스파티딜에탄올아민과 포스파티딜콜린으로 구성되는데 이는 특정 비로좀 고안을 개선시키고 융합 펩티드와 세포-특이적인 표식이 막에 고정되도록 한다.

"융합 펩티드"란 비로좀 막과 표적 세포의 지질 막 사이에 융합 작용을 유도하여 촉진시킬 수 있는 펩티드 또는 단백질을 말한다. 대부분의 구체예에서, 이는 융합 펩티드를 포함하는 바이러스성 스파이크 당단백질을 말하는데 특히, 융합 단백질 특히, 바이러스성 표면 스파이크의 헤마글루티닌 삼량체, 이의 단량체, 또는 하나 또는 두 개의 절단된 서브유닛, 기능성 융합 펩티드를 포함하는 글리코펩티드 HA1와 HA2를 포함하는 바이러스성 스파이크 당단백질을 말한다. 또 다른 본 발명의 구체예에서, 이 용어는 순수한 융합 펩티드 자체 또는 자연 원으로부터 분리한 또는 합성으로 만들 것을 말한다. 본 발명의 특히 적절한 구체예에서, 융합 펩티드를 포함하는 이와 같은 폴리펩티드는 인플루엔자 헤마글루티닌 특히, A-H₁N₁서브타입을 말한다. 합성 융합 펩티드는 하기 표 1에 나타낸 아미노산 서열에서 선택하는데 이때 아미노산은 한문자 코드로 나타내었다(WO92/13525의 실시예 6과 도2를 참조).

"교차 결합제"는 본 발명에 따라 준비된 소포의 표면에 결합할 수 있고, 폴리펩티드에 결합을 할 수 있는 유기 이형성 이기능기 분자를 말한다. 본 발명의 적절한 구체예에서, 이 분자에는 포스파티딜에탄올아민에 결합을 할 수 있는 N-하이드록시숙시니미드기, 단클론항체 단편에 공액할 수 있는 말레이미드기 가령, 숙시니미딜 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카르복실레이트, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙시니미드 에스테르, m-말레이미드벤조일-N-하이드록시-설포숙시니미드 에스테르, 숙시니미딜 4-(p-말레이미도페닐)-부티레이트, 설포숙시니미딜 4(p-말레이미도페닐)부티레이트를 포함하고; 또는 사이토킨에 결합을 할 수 있는 N-하이드록시숙시니미드 기와 광활성 아지도 기를 포함하는데 예를 들면, N-하이드록시숙시니미딜슈베레이트(NHS-SA), N-하이드록시숙시니미딜-4-아지도벤조에이트(HASAB), N-숙시니미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(SANPAH), N-설포숙시니미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트등이 있다.

교차결합제와 지질로 된 미리 형성된 분자 복합체에 이용하는 교차결합제는 적절하게는 교차결합제와 포스파티딜에탄올아민 또는 지질과 교차결합제 및 세포-특이적 표식을 이용하는 것이 바람직하다.

"세포-특이적인" 단백질 또는 표식이란 교차결합제 또는 교차결합제-지질 복합체에 결합을 할 수 있는 단백질을 말하고 또한 표적 세포의 수용체에 결합을 할 수 있는 것을 말한다. 본 발명의 적절한 구체예에서, 이와 같은 분자는 단클론항체, 항체 단편, 사이토킨 또는 생장인자와 같은 세포-수용체 특이적인 화합물을 말한다. 세포-특이적인 표식은 표적 세포에 선택적인 감지 및 결합을 제공하여 비로좀 막에 있는 융합 펩티드의 작용을 개선시킨다. 적절한 항체 단편에는 F(ab'₂)와 Fab' 단편으로 구성되는데, 세포 특이적인 표식에는 추가 인터루킨 및 다른 사이토킨을 포함하는데 이는 하기 표 2에 나타낸 것과 같다.

사이토킨(국제 표준 약어)

BDNF	IFNα	MIP-1α	PDGF
CNTF	IFNβ	MIP-1β	PF-4
EGF	IFNγ	MIP-2	RANTES
Epo	IL-1 to IL-15	NGF	SCF
FGF	LIF	NT-3	TGFα
G-CSF	LT (TNFβ)	NT-4	TGFβ
GM-CSF	MCP-1 to MCP-3	OSM	TNFα
1-309/TCA-3	M-CSF	PBP	Tpo
γIP-10	MIF	PBSF	jVEGF

여기에서 말하는 "양성 지질"은 양성 성분, 비극성 꼬리로 구성된 소위 미리-꼬리-양쪽성(head-to tail amphiphile)을 말하는데 가령, N-[(1,2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모니움 클로라이드(DOTMA)(Felgner, er al; Proc. Natl. Acad. USA 84;7413-7417, 1987), N-[(1,2,3-디올레일옥시-프로필]-N,N,N-트리메틸암모니움메틸-설페이트(DOTAP), N-t-부틸-N'-테트라데실-3-테트라데실아미노프로피온아미딘(Ruysschaert et al., Biochem, Biophys. Res. Commun. 203:1622-1628, 1994) 등을 예로 들 수 있다. 다른 설명이 없는 한, 이 용어에는 하기에서 정의하는 다가양이온 지질을 포함한다.

"다가양이온 지질"이란 리포스페르민(lipospermine)과 같은 다가 양이온과 비극성 꼬리를 포함하는 유기분자를 말한다; 1,3-디팔미토일-2-포스파티딜에탄올아미도-스페르민(DPPES)와 디옥타데실-아미도글리실 스페르민(DOGS)(Behr et al.,; Proc. Natl. Acad. USA 86:6982-6986, 1989); 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카르복사미드)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미니움 트리플로로아세테이트(DOSPA); 1,3-디올레일옥시-2-(6-카르복시-스페르밀)-프로필아미드(DOSPER); N,N,N',N'-테르라메틸-N,N'-비스(2-하이드록시에틸)-2,3-디올레일옥시-1,4-부텐디암모니움 이오다이드(THDOB) 등을 예로 들 수 있다.

여기에서 사용하고 있는 "핵산" 또는 "유전자 물질"은 짧은 사슬의 DNA 또는 RNA, 데옥시리보뉴클레오티드, 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 올리고데옥시리보뉴클레오티드 셀레노에이트, 올리고데옥시리보뉴클레오티드 포스포로도티오에이트(OPTs), 올리고데옥시리보뉴클레오티드 포스포라미데이트, 올리고데옥시리보뉴클레오티드 메틸포스포네이트, 펩티드 핵산(PNAs), 리보뉴클레오티드, 올리고리보뉴클레오티드, 올리고리보뉴클레오티드 포스포로티오에이트, 2'-OMe-올리고리보뉴클레오티드 포스페이트, 2'-OMe-올리고리보뉴클레오티드 포스포로티오에이트, 리보자임(효소 활성이 있는 RNA), 유전자, 플라스미드 및 벡터(클로닝 비클)로 구성된다.

여기에서 말하는 "비로좀"은 가장 간단한 형으로 양성 지질, 내부-적절하게는 수용성-공간으로 구성된 이중층 막이 있는 리포좀성 소포를 말하는데, 막에는 추가로 바이러스성 단백질 특히 바이러스성 당단백질을 포함한다. 적절한 구체예에서, 바이러스성 단백질에는 완전한 생물학적 활성을 가지는 적어도 하나의 융합 펩티드 또는 단백질을 포함하는데 특히, 인플루엔자 A(A/Singapore)의 스파이크 당단백질 헤마글루티닌 또는 뉴로아미니다제를 포함한다. 바이러스성 단백질에는 또한 여기에서 설명을 하고 있는 인플루엔자 바이러스의 융합 펩티드에 상응하는 또는 동일한 합성에 의해 생산된 아미노산 서열을 포함한다. 막 지질은 전술한 양이온 지직로 구성되나 선택적으로는 다른 천연 또는 합성 지질, 적절하게는 포스파티딜콜린(PC)과 포스파티딜에탄올아민(PE)와 같은 인지질을 포함한다.

많은 경우에 본 발명의 양이온성 비로좀은 in vivo 또는 in vitro 세포 배양 실험을 위한 것인데, 막에 세포-특이적인 표식 없이도 성공적으로 사용을 할 수 있고, 특히, in vivo에서 사용을 하는 것이 바람직한데, 또한 여기에서 설명을 하는 것과 같이 막에는 적어도 한 개의 세포-특이적인 표식이 추가로 포함될 수 있다. 소포의 평균 직경은 전자 현미경 및 동적 광-분산으로 측정을 하면 120-180㎚정도가 된다.

여기에서 설명을 하고 있는 "완전한(생물학적) 융합 활성"이란 본 발명의 재구성된 바이러스성 단백질로 구성된 비로좀은 이들이 재구성된 고유 바이러스와 동일한 표적 세포에 대한 융합 활성을 기본적으로 가진다는 것을 말한다. 적절하게는 양이온 비로좀의 융합성은 고유 인플루엔자 바이러스 A의 것과 비교한다. 융합 활성은 공지의 방법 특히, Hoekstra et al., Biochemistry 23:5675-5681, 1984, 또는 Luscher et al., Arch. Virol. 130:317-326, 1993에 기술된 방법에 준하여 측정을 한다.

안티센스 기술이 치료를 요하는 환자에게 치료요법적으로 또는 예방차원에서 적용을 하기 전에, 다수의 기술적인 문제, 특히 적절한 담체 시스템의 개발에 대해 미리 해결해야할 문제가 있다. 예를 들면, 안티센스 뉴클레오티드와 같은 유전자 물질은 불안정하여, 이들이 표적 세포에 도달하기 전에 분해되거나 또는 활성이 약해지거나 비활성화되어 통상적인 양이온 리포좀에는 상당한 양의 물질을 포집해야한다. 이와 같은 많은 양이 사람 또는 동물 체내에 독성을 야기시킬 잠재적인 가능성에 대해 문제가 있다.

유전자 물질을 전달하는데 담체로써 본 발명의 양이온 비로좀을 이용하면, 이와 같은 문제점을 극복을 하고, 독성으로 인한 부작용을 방지하거나 적어도 감소시킬 수는 있다. 이와 같은 유익한 효과는 본 발명의 양이온성 비로좀이 공지의 리포좀 또는 비로좀과 비교를 하였을 때, 표적 세포로 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 포집된 유전자 물질의 수송을 최고 1,000 내지 2,000배 효과적으로 할 수 있기 때문이다. 결과적으로 본 발명의 양이온성 비로좀의 성능과 통상적인 비로좀 또는 양이온 리포좀의 성능을 비교하는 것은 실제 불가능하다.

본 발명은 다음의 실시예를 통하여 이해를 완전하게 할 수 있을 것이다. 실시예는 설명을 위함이고, 본 발명은 이에 한정하고자 함은 아니다.

실시예 1

안티센스 L-myc-FITC(=형광라벨됨)-올리고데옥시뉴클레오티드가 포집된 인플루엔자 바이러스로부터 완전한 융합 활성을 가지는 바이러스성 헤마글루티닌이 있는 양이온 지질 소포를 준비

DOTAP 비로좀과 DOTAP-포스파티딜콜린(PC)-비로좀의 준비

인플루엔자 바이러스 A/Singapore/6/86 균주로부터 헤마글루티닌(HA)를 분리하는 것은 Skehel and Schild(1971), Proc. Natl. Acad.Sci. USA 79:968-972에 상술되어 있다. 간략하면, 암탁의 알 요막 공동에 바이러스를 생장시키고, 슈크로즈 농도차를 이용한 한외원심분리를 2회 실시하여 정제한다. 정제된 바이러스는 7.9㎎/㎖ NaCl, 4.4㎎/㎖ 트리소듐시트레이트·2H₂O, 2.1㎎/㎖ 2-모르폴린에탄올 설폰산 pH 7.3,포함하는 완충액에 안정화시킨다. ㎖당 HA를 345㎕을 포함하는 바이러스 현탁액 53㎖을 10분간 100,000Xg 한외원심분리를 이용하여 펠렛화시킨다. 145mM NaCl,, 2.5mM HEPES를 포함하는 완충액 계면활성제 용액 7.7㎖과 비-이온성 계면활성제 옥타에틸렌글리콜 모노도데실에테르(OEG=C₁₂E₈) 54㎎/㎖을 인플루엔자 바이러스 펠렛에 참가한다. 펠렛은 실온에서 2분간 초음파분쇄를 이용하여 완전하게 용해시킨다. 용액은 1시간동안 100,000에서 한외 여과시킨다. 수득된 상청액에는 용해된 HA 삼량체(1.635㎎ HA/㎖)와 뉴라미다제 미량을 포함한다. 6㎎ DOTAP를 3.7㎖ 상청액(6㎎ HA)에 첨가하고 용해시킨다. 용액은 0.2㎛ 필터를 통과시켜 멸균시키고 그 다음 1.15g 멸균 마이크로캐리어 비드 적절하게는 Biobeads SM-2를 포함하는 유리 용기로 옮긴다. 용기는 Heidolph(Kelheim, Germany)의 교반기 REAX2를 이용하여 1시간동안 교반시킨다. 필요에 따라, 이와 같은 과정은 0.58㎎ Biobeads를 이용하여 최고 3회 반복실시한다. 이 과정을 종료한 후에 약간 투명한 DOTAP 비로좀 용액을 수득한다. DOTAP-PC 비로좀을 생산하기 위해서는 6㎎ HA를 포함하는 상청액에 3㎎ DOTAP와 3㎎ PC를 첨가하고 용해시킨다. 연속적으로 DOTAP 비로좀의 것과 동일한 과정을 거친다.

합성 융합 펩티드를 가진 비로좀의 준비

막에 합성 융합 펩티드를 가지는 양이온 비로좀을 준비하는 한 가지 방법은 다음과 같다;

1. Martin et al., Irreversible coupling of Immunoglobulin fragments to preformed vesicles; J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)에서 상술하고 있는 것과 같이 PE + GMBS →MBS-PE + N-하이드록시숙시니미드 반응에서 교차결합제 N-[γ-말레이미도부티릴옥시]숙시니미드 에스테르(GMBS)에 의한 포스파티딜에탄올아민(PE)의 활성화;

2. 활성화된 PE와 지질 소포(GMB-PE)의 제조, 이때 20% 포스파티딜콜린, 70% DOTAP, 10% GMB-PE를 HA를 포함하는 DOTAP 비로좀에서 설명한 것과 같이 완충된 계면활성제 용액에 용해시킨다. 지질 소포를 만드는 연속 단계는 DOTAP 비로좀을 만들 때 이용한 것과 동일하다.

3. 지질 소포에 합성 융합 펩티드의 결합, 이때, 하기 아미노산 서열로 된 20개 아미노산을 포함하는 펩티드를 이용하는데;

이 펩티드에는 또한 N-단부와 C-단부 또한 포함하고 있다. C-단부 아미노산은 시스테인이기 때문에 지질 소포의 막에 있는 GMP-PE에 펩티드가 결합을 하는데 이용할 수 있는 자유 티올기가 있다.

다음과 같은 결합 반응을 실행하기 위해서는

PE-GMB_membrane+ HS-Cys-Peptide →PE-GMB_membrane-S-Cys-Peptide

완충액(40mM 시트르산, 35mM 이인산나트륨, 100mM NaCl, 2mM EDA, pH 5.5)에 새로 준비한 지질 소포 용액을 동일한 완충액에 있는 펩티드 용액과 혼합을 한다. 혼합물은 4℃에서 질소하에 부드럽게 교반한다. 지질 소포는 High Load Superdex 200 칼럼에서 겔 여과에 의해 결합 안된 펩티드로부터 분리한다.

또는, 융합 펩티드는 실시예의 Fab'단편에 대해 하기에서 상술하는 것과 같이 미리형성된 PE-교차결합제-펩티드 복합제를 이용하여 지질 소포에 결합시킬 수 있다.

DOTAP 비로좀내에 포스포로티에이트 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 결합

L-myc 유전자의 안티센스와 센스 올리고데옥시리보뉴클레오티드 포스포로티에이트(OPTs)를 이용하여 형질감염에서 양이온 비로좀의 높은 효율을 설명하고자 한다. 5'-FITC-OPTs는 포스포라미데이트 화학(Microsynth GmbH, Balgach, Switzerland)을 통하여 합성하였다. OPT의 안티센스(서열 2)와 센스(서열 3)로는 5량체를 이용하는데 이는 다음과 같다;

안티센스와 센스 OPTs와 마찬가지로 동일한 길이의 뉴클레오티드로 구성된 혼합 기준 서열(msc)을 합성하였다.

1㎖ DOTAP 비로좀 또는 DOTAP-PC 비로좀을 각각 다음에 첨가하였다;

a) 2㎎ 안티센스 FITC-OPT(1.3μmol);

b) 3.4㎎ 센스 FITC-OPT(1.3μmol); 그리고

c) 3.1㎎ msc FITC-OPT(1.3μmol)

FITC-OPTs는 용해하고, 용액은 그 다음 26℃에서 2분간 초음파파쇄를 한다. 포집된 것이 없는 FITC-OPTs는 High Load Superdex 200 칼럼(Pharmacia, Sweden)에서 겔 여과에 의해 비로좀으로부터 분리해낸다. 칼럼은 멸균 PBS를 이용하여 균형을 맞춘다. 포집된 FITC-OPT가 있는 DOTAP를 포함하는 공(void)용적 분취물은 PBS로 용출시키고, 수집한다. 비로좀에 포집된 FITC-OPT 농도는 0.1%(v/v) 트리톤 X-100을 포함하는 0.1M NaOH에 완전히 용해시킨 후에 형광측정을 하여 결정을 한다.

미리 형성된 포스파티딜에탄올아민-이가기능기 교차결합제 분자 복합체를 이용하여 비로좀에 Fab' 단편의 결합

2.8㎖ 시트르산 완충용액(100mM NaCl, 40mM 시트르산, 35mM Na₂HPO₄·2H₂O, 2mM EDTA, pH 5.5)에 용해된 쥐 단클론 항-CD10-(항-CALLA)에서 유도된 새로 환원된 Fab' 단편 3㎎을 0.5% n-옥틸-올리고-옥시에틸렌을 포함하는 215㎕ 시트르산 완충액에 0.524㎎ N-[4-(p-말레이미도-페닐)-부티릴]포스파티딜에탄올아민(MPB.PE) 용액에 첨가한다. 혼합물은 그 다음 부드럽게 교반시키면서 4℃에서 16시간동안 질소하에 배양한다. 배양 후에 결합이 안된 MPB.PE는 새로 환원된 젖은 Thiopropyl Sepharose 6B(Pharmacia, Sweden) 400㎕ 배치에서 제거한다. 혼합물은 실온에서 4시간동안 배양한다. Thiopropyl Sepharose 6B는 원심분리에 의해 제거하고 생성된 용액은 pH 7.0으로 중화시킨다. 중화된 용액에는 OEG(54㎎/㎖)을 보충한다.

전술한 것과 같이 준비된 용액은 DOTAP 비로좀을 준비하기 위해 용액을 첨가한다. Fab'-MPB.PE 분자는 비로좀이 형성하는 동안에 지질 이중층으로 삽입된다.

전자 현미경 관찰

DOTAP 비로좀을 전자 현미경으로 관찰을 하면, 레이져 광 스캐닝으로 결정한 결과 120 내지 180㎚의 평균 직경을 가지는 적절한 단층라멜라 구조의 소포를 확인할 수 있다. 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질 스파이크를 분명하게 볼 수 있다(도 1).

DOTAP 비로좀의 융합 활성을 결정

본 발명의 DOTAP 비로좀의 융합 활성은 Hoekstra et al., Biochemistry 23:5675-5681과 Luscher et al.,(1993), Arch. Virol. 130:317-326에서 설명을 하고 있는 것과 같이 형광 발생을 기초로하여 정량적으로 측정을 할 수 있다. 형광 프로브의 얇은 박막에 DOTAP와 HA를 포함하는 완충된 OEG(C₁₂E₈)를 첨가하고, 프로브를 용해시키기 위해 5 내지 10분간 교반을 하고, 그 다음 "양이온 지질 소포를 준비하는 과정"에서 언급한 바와 같이 카운트하여, 고밀도에서 DOTAP 막으로 형광 프로브 옥타데실 로다민 B 클로라이드(R18)(Molecular Probes Inc., Eugene, USA에서 수득함)를 삽입을 할 수 있다. 모델 리포좀과 로다민 라벨된 DOTAP 비로좀(DOTAP:리포좀성 지질의 비율은 1:20임)을 배양하면 퀸칭(quenching) 로다민이 희석되는 것을 볼 수 있다. 560㎚와 590㎚의 각 여기 및 방출 파장에서 Perkin-Elmer 1000 분광형광측정계를 이용하여 형광을 측정할 수 있다. 도 2에서는 DOTAP 비로좀의 pH-유도된 융합 반응을 형광이 나타나는 비율(%FDQ)로 나타내었다.

포집된 안티센스-L-myc-FITC-OPT의 세포 수용

DOTAP 비로좀의 세포 수용 메카니즘을 연구하기 위해 형광물질로 OPT를 라벨링하는 것이 매우 유용하다는 것이 증명되었다. 다량의 L-myc 유전자를 발현하는(Nau et al., 1985; Nature 318, 69-83) 사람 소세포 폐 암 세포(ATCC-NCL-H209)를 2-well 조직 배양 쳄버 슬라이드(Nunc, Naperville, IL 60566, USA)에 생장시킨다. 50㎕ FITC-OPT-비로좀을 각 세포에 첨가한다. 이들을 37℃에서 5, 15, 30분간 배양시키고, PBS로 2회 세척하고 그 다음 형광 현미경으로 검사를 하였다. 포집된 안티센스 FITC-OPT가 있는 DOTAP 비로좀은 도 3에서 볼 수 있는 것과 같이 세포로 신속하게 결합된다.

티미딘 결합 방법으로 측정된 안티센스-L-myc-FITC-OPT-DOTAP 비로좀의 생물학적 효과의 검사

사람 소세포 폐암 세포(ATCC-NCI-H209 American Type Culture Collection, Rockville, USA)를 초기 농도를 웰, ㎖당 1X10⁵으로 하여 24-well Costar 플레이트에 배양시켰다. 24시간 배양 후에, 배지는 제거하고, 0.5μCi¹⁴C-티미딘([2-14C]티미딘, 52.0mCi/mmol; Amersham, England)을 포함하는 새로운 배지 625㎕와 안티센스, 센스 또는 msc FITC-OPTs 0.2nmol을 포함하는 DOTAP 비로좀 75㎕를 첨가한다. 배양물은 37℃에서 1시간동안 매우 서서히 교반시키면서 부드럽게 흔든 다음 배양기로 옮긴다. 48시간후에, 세포 현탁액을 제거하고, 원심분리 바이알에 옮기고, 원심분리한다. 수득된 세포 펠렛은 2회 씻는다. 세포가 단일 세포 현탁액으로 충분하게 분산되지 않으면, 이들은 간단하게 트립신/EDTA 용액에 노출시킨다. 세포 펠렛은 0.1M NaOH/Triton-X-100(0.1%) 용액 1.5㎖에 용해시킨다. 1㎖ 용액에 3㎖ 액체 신틸레이션 칵테일(Ready Protein +, Beckman, Fullerton, CA, USA)을 첨가한다.¹⁴C-방사능 활성은 액체 신틸레이션 카운터(Beckman, Fullerton, CA, USA)에서 헤아린다.

도 4와 5에는 안티센스-L-myc-DOTAP 비로좀의 이상(extraordinary) 수용 및 형질감염 효율을 분명하게 설명을 하고 있다.

도 6에서는 L-myc를 발현을 하지 않는 세포는 안티센스-L-myc 비로좀에 의해 방해를 받지 않거나 영향을 받지 않는다는 것을 설명을 하고 있다. 또한, 빈 비로좀은 암 세포와 정상 세포에 임의 영향을 나타내지 않았다. 따라서, 특히, 통상적인 양이온 리포좀의 전술한 단점이 없기 때문에 본 발명의 비로좀에 포집된 안티센스 OPT를 이용한 항암 치료는 상당한 가능성을 가진다.

실시예 2

폴리링커부위에 클론된 사람 IL-6 유전자와 포집된 벡터 pcDNA3(=pcDNA3-IL6)을 포함하는 인플루엔자 바이러스의 완전한 융합 활성이 있는 바이러스 헤마글루티닌으로 양이온 지질 소포를 만듬.

DOTAP 비로좀의 준비와 pcDNA3-IL-6에 결합

pcDNA3(Invitrogen Corporation, San Diego, USA)는 진핵 숙주에 안정하게 다량 발현할 수 있도록 만들어진 5.4kb 벡터이다. HA는 실시예 1에서 상술한 것과 같이 분리 및 정제한다. 4㎎ DOTAP를 145mM NaCl, 2.5mM HEPES, 54㎎/㎖ OEG(C₁₂E₈), pH 7.4를 포함하는 완충 계면활성제 용액 0.5㎖에 용해시킨 다음 4㎎ HA를 포함하는 2㎖ 계면활성제를 첨가한다. 생성된 혼합물에 100㎍ pcDNA3-IL-6을 첨가하고 용해시킨다. 용액은 30초간 초음파분쇄시킨다. OEG는 실시예 1에서 설명한 것과 같이 Biobeads에서 제거한다.

쥐 골수종 세포로 pcDNA-IL-6가 적하된 DOTAP 비로좀의 형질도입

pcDNA-IL-6이 적하된 DOTAP 비로좀으로 구성된 수득 용액은 PBS로 1:1000으로 희석한다. 각 1ng과 2.5ng pcDNA-IL-6을 포함하는 용액 20㎕와 50㎕ 요액을 2X106 골수종 세포(P3/NSI/1-Ag4-1; Amerincan Type Culture Collection, Rockville, USA)에 첨가하였다. 48시간 배양 후에, 세포 배양물의 상청액을 ELISA 검사를 하여 사람 IL-6을 테스트하였다. ㎖당 20 내지 45pg IL-6이 포함된 것으로 나타났다.

pcDNA-IL-6 적하된 DOTAP 리포좀과 pcDNA-IL-6 비로좀의 형질감염의 효과를 비교

DOTAP 비로좀에 포함된 동량의 pcDNA-IL-6를 가지는 통상의 DOTAP 리포좀(바이러스성 융합 펩티드는 없음)을 골수종 세포 배양물에 형질 감염시켰을 때 IL-6은 세포 배양물에서 발견되지 않았다. pcDNA-IL-6 적하된 DOTAP 비로좀을 이용하였을 때와 동일한 형질감염의 결과를 얻기 위해서는, 약 1000배 정도 pcDNA-IL-6의 적하된 DOTAP 리포좀의 량을 증가시켜야 한다.

실시예 3

포집된 pSRVcat를 포함하는 인플루엔자 바이러스로부터 완전한 융합 활성을 가진 바이러스성 헤마글루티닌 삼량체를 가진 양이온성 지질 소포를 준비

DOTAP 비로좀을 준비하고 pRSVcat를 결합

발현 벡터 pRSVcat(ATCC, Rockville, USA)는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)를 코드하는 CAT 유전자를 가진다. 효소는 아세틸-CoA의 아세틸기를 클로람페니콜의 3'-하이드록시 위치로 전달하는 것을 촉매한다. CAT 벡터는 일반적으로 형질감염 효과를 모니터할 때 유용하다. pRSVcat는 실시예 2에서 설명한 조건하에서 DOTAP 비로좀에 포집한다.

Jurkat 세포로 pRSVcat를 적하한 DOTAP 비로좀의 형질감염

Jurkat 세포(106 세포/㎖)는 pRSVcat-적하된 DOTAP 비로좀(0.0001㎕-25㎕)를 다른 양으로 하여 배양한다. 37℃에서 48시간 배양한 후에, Jurkat 세포는 CAT-ELISA 검사(Boehringer Mannheim, Germany)로 측정한다. 도 7a와 7b에서는 0.01㎕ DOTAP 비로좀을 첨가하여 최대 형질감염이 이루어진다는 것을 설명한다. 전술한 것과는 상반되게, Jurkat 세포로 0.01㎕ pRSVcat-적하된 DOTAP 리포좀은 동일한 조건하에서 임의 감지할만한 CAT 활성이 나타나지 않는다.

실시예 4

세포에 의한 비로좀을 수용

표적 세포로 비로좀이 들어가는 것은 다음과 같이 별도의 두 단계로 나누어 진다;

1. 흡착;

2. 침투;

흡착은 HA를 통하여 단부에 시알산이 있는 막의 당단백질 또는 당지질인 세포 수용체에 비로좀이 결합하는 것이다. 특정 비로좀의 경우에 Fab' 단편은 추가로 표적 세포 표면에 있는 항원 구조를 인지하여 두 가지 상이한 결합 메카니즘에의해 표적 세포에 결합을 하게 된다. 따라서, 특정 비로좀은 특정 세포형에 대해 선택성을 발휘하게 된다. TAG72, CEA, 17-1A, CA19-9와 같은 종양과 연관이 있는 항원 또는 CD10(CALLA)와 CD20과 같은 백혈병과 연관이 있는 항원을 인지하는 Fab' 단편이 있는 비로좀은 세포 표면에 전술한 항원을 가지는 종양 또는 백혈병 세포에 선택적으로 결합을 할 수 있다. 헤마글루티닌 당단백질을 조심스럽게 분리 및 정제를 한다. 단백질 분해 또는 분자내 이황화결합(-S-S-)을 환원시켜도 이들을 비활성화되지 않는다.

침투는 수용체-중개된 엔도사이토시스에 의해 비로좀이 세포로 들어가는 것이다. 비로좀은 엔도좀에 포집된다. 엔도좀내의 산성 pH(5-6)는 엔도좀 막과 비로좀막의 융합을 촉진시킨다. 융합은 바이러스성 스파이크 당단백질 헤마글루티닌(HA)에 의해 중개된다. 엔도좀내에 막 융합반응으로 지질 외피로부터 비로좀을 자유롭게하고, 세포질로 포집된 약물을 제공하기 위한 입구를 제공한다. 이와 같은 비로좀-준비물의 융합 활성은 형광 발생으로 테스트한다. 비로좀은 형광 프로브 옥타데실 로다민 B(R18)로 라벨링하고, HA의 융합 활성은 비로좀으로 부터 리포좀 표적 막으로 프로브가 희석됨으로 인한 형광 발생으로 모니터한다. 도 8에서는 인지질-리포좀에 R18이 라벨링된 DOTAP-ql을 첨가하였을 때 관찰되는 형광을 나타낸다. 형광은 신속하게 증가되는데 이는 고유 HA가 융합을 중개한다는 것을 나타낸다.

시간에 따른 세포에 의해 이루어지는 수용

¹⁴C-라벨된 비로좀을 세포와 배양하여 세포가 비로좀을 수용하는 것을 관찰하였다. 1X10⁵/㎖ 농도에서 P3/NS1 세포는 5, 10, 15, 20, 30분간 37℃에서 40㎕ 비로좀과 배양하였다. 세척을 한 후에, 세포를 용해시키고,¹⁴C-라벨된 비로좀의 양을 측정하였다. 표 3에서 볼 수 있는 것과 같이, 세포 수용이 매우 빠르다; 처음 5분동안에 비로좀의 10%가 결합하였다. 배양시간이 더 길어진다고 해서 수용이 더 강화되지는 않는다. 약 10¹¹-10¹²비로좀을 포함하는 1㎖ 비로좀 용액, 즉 세포당 4,000 내지 40,000 비로좀이 5분 이내에 결합이 된다.

배양시간(분)	dpm
5	6414
10	6832
15	6096
20	6610
30	6626

실시예 5

암을 치료하는데 있어 안티센스를 이용하는 전략

소위 "안티센스" 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)은 원하는 mRNA의 표적 뉴클레오티드 서열의 역 상보적인 것으로 합성된 짧은 뉴클레오티드 DNA 서열이다. RNA-DNA 이중나선이 형성되면, 메시지의 해독이 방해를 받고, RNase H에 의해 분자의 파괴가 촉진된다. 암 세포로 온코겐-인코드된 mRNA를 표적으로하는 ODN을 전달하는 것은 일부환경에서는 세포 증식을 방해하여 세포를 죽게한다.

안티센스 ODN은 치료제로 잠재성을 가진다. 많은 동물 임상 연구와 상-I-III 시도에서 볼 수 있는 것과 같이 온코진과 바이러스 유전자에 대한 안티센스 ODN은 치료제로 활성이 있는 것으로 나타났다.

DNA-적하된 리포좀 또는 통상적인 비로좀에 의해 세포내로 기능을 가진 DNA 분자를 전달하는 것은 효과가 없다. 따라서, 유전자 물질을 전달하기 위해 양전하를 띈 지질 이중층(양이온)이 있는 비로좀이 개발되었다. 양전하를 띈 지질 이중층은 핵산과 반응을 하여 형성된 소포내에 이를 집중시키게 된다.

안티센스-L-myc-비로좀

소세포 폐암(SCLC) 세포주에서 가장 먼저 발견되 L-myc는 빈번하게 증폭하여 SCLC에서 과발현된다. 포스포르아미다이트 화학물질(Microsynth GmbH, Balgach, Switzerland)를 통하여 5'-FITC-포스포로티오에이트 올리고데옥시리보뉴클레오티드(OPT)를 합성하였다. 안티센스 OPT(서열 4)와 센스 OPT(서열 5)로 다음의 15량체를 이용하였다.

안티센스와 센스 OPT로 동일한 길이로 구성된 혼합형 서열(msc) OPT도 합성하였다. 해독 개시 부위를 덮는 안티센스 OPT는 표적 mRNA의 리보좀 해독을 방해함으로써 작용을 한다. 안티센스-L-myc-포스포르티오에이트 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 비로좀에 포집된다. SCLC 세포주 H209, H510, H82에서 비로좀에 포집된 L-myc-안티센스 DNA의 항증식성 효과를 평가하였다. 안티센스-L-myc 비로좀을 사람 소세포 폐암 세포주의 세포로 첨가하였다. 센스-L-myc 비로좀과 msc(혼합형 조절 서열)-비로좀을 기준으로 이용하였다(도 9).

안티센스-L-myc 비로좀은 포집안된 안티센스 OPT보다는 약 20,000배 활성을 가진다. 도 10에서 볼 수 있는 동일한 효과를 유도하기 위해, 세포 배양물에 마이크로몰범위에서 포집안된 L-myc-안티센스 OPT를 세포 배양물에 첨가하였다. 포집안된 ODN의 세포 수용보다 양이온 비로좀이 ODN 수송에 더 효과가 있고, 양이온 리포좀보다도 효과가 있었다.

안티센스-L-myc 비로좀의 성장-저해 효과는 세 가지 SCLC 세포주, H209, H510, H82에서 발현되는 L-myc 수준과 연관이 있다. 도 11로부터, L-myc 유전자를 발현시키지 않는 이들 세포는 안티센스-L-myc 비로좀에 영향을 받지 않는다는 결론을 내렸다. 비 양이온 비로좀은 정상 세포와 암세포에 임의 최소한의 효과도 나타내지 않았다. L-myc 유전자는 SCLC에서 자주 증폭되고, 과발현되고, 사람 성인 조직에서 매우 제한되고, 발현정도가 낮기 때문에, L-myc는 안티센스 비로좀 치료요법에 유효한 표적이 될 수 있을 것이다.

실시예 6

유전자 치료를 위한 플라스미드계 벡터의 비-감염성 전달; 양이온 비로좀에 의해 포유류에서 발현될 수 있도록 벡터의 형질감염

암 유전자 치료법으로 현재 이용되는 시도는 ex vivo 또는 in vivo에서 사람 암 세포에 적절한 표적 유전자를 발현시키는 플라스미드계 벡터를 이용하는 것이다. 다음과 같은 치료 유전자 표적을 평가할 수 있다; 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 카이나제(HSV-TK) 유전자와 같은 민감성 유전자(Moolten FL; Cancer Res.46:5276-5281, 1986); 사이토킨 유전자와 같은 암세포를 제거하는 면역계를 표적으로 하는 유전자(Tepper RI et al., Cell 57;503-512, 1989); costimulatory 유전자를 코딩하는 유전자(Townsend SE et al.,; Science 259;368-370, 1993); 외부 조직적합성 유전자(Plautz GE et al.,; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90; 4645-4649, 1993); p53과 같은 야생형 종양 억제 유전자 대체(Chen PL et al.,; Science 250;1576-1580, 1990).

유전자 치료를 위한 현재 이용되는 바이러스계 벡터의 제한 가령, 유전자 전달을 할 표적이 되는 종양 세포에 특이성이 부족하고, 복제 컴피턴스 바이러스를 형성하기 위해 재조합 가능성, 2차적인 종양 유도 가능성과 연관된 안정성 문제 때문에, in vivo에서 플라스미드계 발현 벡터를 이용한 비-감염성 유전자 전달 기술을 개발할 필요가 있다. 여기에서 이용하는 양이온성 비로좀은 또 다른 비-감염성, 수용체-중개된 유전자 전달 기술을 촉진시키는 것이다.

통상적으로 이용할 수 있는 지질을 이용하여 일반적인 형질감염 효율은 5-50%정도이다. 상업적으로 이용할 수 있는 리포좀보다 효율이 휠씬 큰 비로좀을 제공하고, 비로좀으로 DNA의 포집시켜 안정한 형질변환 세포를 제공한다.

사람의 인터루킨 6(IL-6) 유전자를 pcDNA3의 폴리링커부위로 클론시키는데, 이때 pcDNA3은 진핵숙주에서 매우 안정한 발현을 하는 5.4kb 벡터이다. 벡터에는 G418 존재하에 안정한 형질변환체를 선택하기 위한 SV40 초기 프로모터로부터 발현하는 네오마이신 저항성 표식을 포함한다.

다음과 같은 별개의 3가지 방법으로 벡터를 포집시킬 수 있다;

1. 투석; 비로좀을 형성하는 동안에 플라스미드를 포집시킨다. 계면활성제 옥틸-POE(Alexis Corp., Laeufelfinger, Switzerland)는 투석을 통하여 제거한다.

2. 바이오비드; 플라스미드는 비로좀을 만드는 동안에 포집된다. 계면활성제 OEG는 바이오비드에의해 제거된다.

3. 초음파파쇄; 플라스미드는 DOTAP에 의해 포집되는데 수득된 DOTAP-리포좀은 초음파에 의해 DOTAP-비로좀과 융합된다.

포집된 플라스미드의 영을 측정하기 위해¹⁴C-티미딘-라벨된 pcDNA3-cIL-6-DNA를 만든다.

포집 방법 포집된 플라스미드의 양

투석(1) 비로좀 ㎕당 0.02㎍

바이오비드(2) 비로좀 ㎕당 0.009㎍

초음파파쇄(3) 비로좀 ㎕당 0.04㎍

비로좀 준비물(1)-(3)을 이용하여, 1㎖ 배지, 세포 농도가 1X10⁵에서, Sp2/0-Ag14 세포(하이브리드, 비-분비성, 쥐; ID-No; ATCC CRL-1581; 여기에서는 Sp2로 칭함); P3/NSI/1-Ag4-1세포(비-분비성, 쥐; ID-No; ATCC TIB-18; 여기에서는 P3/NSI로 칭함); NIH/3T3세포(배; 접촉저해성, NIH Swiss 쥐; ID-No;ATCC CRL-1638)에 형질감염시켰다. 형질감염후 10에 발현된 IL-6의 양은 ELISA로 측정한다(도 12, 13, 14). 모든 세포주는 ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA에서 구할 수 있다.

형질감염된 Sp2와 P3/NS1 세포는 G418에 의해 2회 선택되었다. 배양 2개월후에, IL-6 생산을 다시 측정하였다. 그 값은 하기 표 4에 나타내었다.

G418로 재-선택한 후에 형질감염된 세포에 의한 IL-6의 생산

세포주		준비방법	㎖당세포수	총세포수	IL-6[pg/㎖]	총IL-6양[pg]	IL-6[pg/10⁶/세포]
P3/NS1	세포펠렛	투석	1.2×10⁶	6.0×10⁶3㎖ 완충액	277	831	138
		바이오비드	1.6×10⁶	7.8×10⁶4㎖ 완충액	32	128	16
		초음파	1.54×10⁶	8.0×10⁶4㎖ 완충액	289	1156	144
P3/NS1	상청액	투석		5㎖상청액	8	40	6.7
		바이오비드		4.9㎖상청액	4	20	2.5
		초음파		5.2㎖상청액	25	130	16.2
Sp2	세포펠렛	투석	2.25×10⁶	1.13×10⁷5.5㎖완충액	>1200	>6600	>584
		바이오비드	1.8×10⁶	9.5×10⁶4.5㎖완충액	232	1044	110
		초음파	2.8×10⁶	1.37×10⁷7㎖ 완충액	680	4760	347
Sp2		투석		5㎖상청액	268	1340	119
		바이오비드		5.2㎖상청액	8	42	4.4
		초음파		4.9㎖상청액	651	3190	233

세포 펠렛에 첨가되는 용해 완충액의 용적을 조절하여 ㎖당 ca.2X10⁶세포 수를 얻는다.

실시예 7

백혈병 치료에서 안티센스 전략

사람 백혈병에서 가장 흔한 유전성 이상은 필라델피아 염색체(Ph¹) 전치이다. 염색체 9의 프로토온코젠(protooncogene) abl이 염색체 22의 절단점 덩어리 부분(bcr; breakpoint cluster region)으로 전치하여 bcr-abl 하이브리드 유전자가 형성되었다. abl 프로토온코젠은 정상적으로는 bcr-abl 하이브리드 유전자를 가지는 세포에서 증대된 티로신 카이나제 활성이 있는 단백질을 인코드한다. bcr-abl 전사체는 만성 골수성 백혈병(CML) 환자와 Ph1 급성 임파구성 백혈병 환자의 대부분에서 발견되었다. CML에서 bcr-abl 유전자의 표적화는 가장 이상적인 치료 과정임이 분명하다. bcr 유전자의 두 번째 또는 세 번째 엑손을 절단하여 만들어진 bcr-abl 전사체를 c-abl의 두 번째 엑손에 접하는 부분에 상보적인 합성 ODN은 in vitro에서 필라델피아 1 백혈병을 억제하고, 정상 골수 선조세포의 생장은 허용한 것으로 나타났다(Szczylik C et al.,; Science 253:562-565, 1991). 그러나,bcr-abl 안티센스 치료는 CML 환자에 제한한다.

안티센스 치료의 또 다른 표적 분자는 myb 유전자이다. Myb는 DNA 결합 특이적 전사 인자로 기능을 하는 프로토온코젠 c-myb의 엔코드 산물이다. 적절하게는 조혈성 세포에서 발현되어 조혈성 세포 증식에 요구된다. c-myb의 코돈 2-7에 표적이 되는 18-mer 안티센스 ODN은 T-세포 백혈병 세포주(CCRF-CEM)의 클론성 생장을 강하게 방해하거나 또는 완전하게 제거하였고, 뿐만 아니라 검사한 1차 급성 골수성 백혈병의 78%와 고비에 있는 5가지 1차 만성 골수성 백혈병(CML)중 4가지 경우를 강하게 방해하거나 완전하게 제거하였다(Calabretta B et al.,; Proc. Natl. Acd. Sci. USA 88:2351-2355, 1991).

골수를 제거하여 급성 및 만성 백혈병을 포함한 몇 가지 신형성증을 치료하는 성분으로 이용한다. 현재, 면역학적 시약 및 화학요법제와 같은 다양한 물질에의해 골수에서 백혈구 세포를 제거한다. 백혈병 세포에 생장 장점을 제공하는 한 개 온코젠을 표적으로 하는 ODN이 포집된 비로좀은 치료요법적으로 유용하고, 중요한 것은 정상적인 선조 세포의 생장을 허용하면서, 백혈구 세포는 제거하는데 있어서 통상적인 화학요법제보다 선택성이 더 크다는 것이다.

안티센스-c-myb 비로좀

c-myb 코돈 2-9에 상응하는 센스와 안티센스 OPT를 준비하였다. 센스(서열 6)와 안티센스(서열 7) c-myb 서열은 다음과 같다;

L-myc DOTAP 비로좀을 만드는 방법과 동일한 방법을 이용하여 DOTAP 비로좀에 OPT를 포집시킨다. 사람 골수 백혈병 세포주 KG-1과 사람 급성 임파아구 백혈병 세포주 CEM-C3에 센스와 안티센스 c-myb 비로좀을 노출시킨다. KG-1 세포의 증식은 프로토온코겐 myb 유전자 생성물에 따라 달라지나, 반면에 CEM-C3 세포는 c-myb 유전자에 따라 달라지지는 않는다. KG-1 세포를 각각 센스와 안티센스 OPT의 18, 36, 72pmol을 포함하는 센스와 안티센스 c-myb 비로좀 25, 50, 100㎕에 배양한다. 2, 3, 4일에 세포의 수를 측정한다.

센스와 안티센스 c-myb 비로좀을 25㎕ 추가하면 세포 생장에 한계 효과만을 가진다(도 15). 그러나, 50㎕(도 16) 및 100㎕(도 17) 추가하면 세포 생장을 강하게 저해한다. 더 많은 약량의 센스 c-myb 비로좀을 이용하면 저해 효과가 나타난다는 것을 알 수 있다. 이와 같은 효과는 비로좀 막에 의해 유도되는 것이 아님을 알 수 있는데, 그 이유는 CEM-C3 세포는 동일 비로좀 준비물에 의해 영향을 받지 않기 때문이다(도 18).

명세서에 사용된 약어

2'-OMe ; 2'-O 메틸

CALLA ; 보통의 급성 임파아구 백혈병 항원

CAT ; 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제

DOTAP ; N-[(1,2,3-디올레일옥시)-프로필]-N,N,N-트리메틸암모니움메틸-설페이트

FITC-OPT; N-[(1,2,3-디올레일옥시)-프로필]-N,N,N-트리메틸암모니움 클로라이드

G418 ; 젠티신^R디설페이트(Geneticin^Rdisulfat(항생제 G418))

HA ; 헤마글루티닌

IL-6 ; 인터루킨 6

MPB.PE ; N-[4-(p-말레이미도)-페닐부티릴]-포스파티딜에탄올아민(=교차결합제-인지질 복합체)

msc ; 혼합형 기준 서열

NA ; 뉴라미니다제

옥틸-POE; n-옥틸-올리고-

ODN ; 올리고데옥시뉴클레오티드

OEG ; 옥타에틸렌글리콜 모노도데실에테르(C₁₂E₈)

OPT ; 올리고데옥시리보뉴클레오티드 포스포로티오에이트

PC ; 포스파티딜콜린

PE ; 포스파티딜에탄올아민

PNA ; 펩티드 핵산

SCLC ; 소세포 폐암

SV40 ; 원숭이 바이러스 40

Claims

양전하를 띈 지질 이중층으로 된 지질 소포에 있어서, 양이온 또는 다가양이온 지질과 막에 끼워진 또는 공유결합된 적어도 한 개의 천연 또는 합성 바이러스성 융합 펩티드로 구성된 것을 특징으로 하는 지질 소포.
제 1 항에 있어서, 막은 전체 지질에 대해;

1) 양이온 또는 다가 양이온 지질이 100wt%;

2) 양이온 또는 다가 양이온 지질이 90 내지 95wt%와 포스파티딜에탄올아민이 5 내지 10wt%; 또는

3) 양이온 또는 다가 양이온 지질이 45 내지 90wt%와 포스파티딜에탄올아민이 5 내지 10wt%; 포스파티딜콜린이 5 내지 50wt%으로 구성된 것을 특징으로 하는 지질 소포.
제 1 항 또는 2 항에 있어서,

1) 양이온 지질은 N-[(1,2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모니움 클로라이드(DOTMA), N-[(1,2,3-디올레일옥시-프로필]-N,N,N-트리메틸암모니움메틸-설페이트(DOTAP),N-t-부틸-N'-테트라데실-3-테트라데실아미노프로피온아미딘 중에서 선택된 적어도 한 개로 구성되고;

2) 다가양이온 지질은 1,3-디팔미토일-2-포스파티딜에탄올아미도-스페르민(DPPES), 디옥타데실-아미도글리실 스페르민(DOGS), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카르복사미드)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미니움 트리플로로아세테이트(DOSPA); 1,3-디올레일옥시-2-(6-카르복시-스페르밀)-프로필아미드(DOSPER); N,N,N',N'-테르라메틸-N,N'-비스(2-하이드록시에틸)-2,3-디올레일옥시-1,4-부텐디암모니움 이오다이드(THDOB) 등에서 선택된 것중 적어도 한 개로 선택된 것을 특징으로 하는 지질 소포.
전술한 어느 한 항에 있어서, 융합 펩티드는 헤마글루티닌 삼량체 또는 단량체, 이의 절단된 소단위 한 개 또는 두 개, 글리코펩티드 HA1와 HA2, 천연 원으로부터 분리된 융합 펩티드와 합성 융합 펩티드에서 선택되는 것을 특징으로 하는 지질 소포.
전술한 어느 한 항에 있어서, 막은 적어도 한 개의 세포-특이적인 표식과 적어도 한 개의 이가기능성 교차 결합제로 구성되고, 이때 세포-특이적인 표식은 교차 결합제에 의해 막에 결합되는 것을 특징으로 하는 지질 소포.
제 5 항에 있어서, 세포-특이적인 표식은 단클론항체, F(ab')₂단편, Fab' 단편, 사이토킨 및 생장 인자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 지질 소포.
전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 소포에는 원하는 유전자 물질로 구성되는데, 바람직하게는 짧은 사슬의 DNA 또는 RNA, 데옥시리보뉴클레오티드, 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 올리고데옥시리보뉴클레오티드 셀레노에이트, 올리고데옥시리보뉴클레오티드 포스포로도티오에이트, 올리고데옥시리보뉴클레오티드 포스포라미데이트, 올리고데옥시리보뉴클레오티드 메틸포스포네이트, 펩티드 핵산, 리보뉴클레오티드, 올리고리보뉴클레오티드, 올리고리보뉴클레오티드 포스포로티오에이트, 2'-OMe-올리고리보뉴클레오티드 포스페이트, 2'-OMe-올리고리보뉴클레오티드 포스포로티오에이트, 리보자임, 유전자, 플라스미드 및 벡터에서 선택되는 것을 특징으로 하는 지질 소포.
전술한 어느 한 항에 있어서, 소포의 직경은 120-180㎚인 것을 특징으로 하는 지질 소포.
양전하를 띈 지질 이중층 막과 적어도 한 개 바이러스성 융합 펩티드로 구성된 소포를 만드는 공정에 있어서,

a) 비-이온성 계면활성제를 포함하는 적절한 완충액에 적어도 한 개의 천연 또는 합성 바이러스성 융합 단백질을 용해시키고;

b) 양이온/또는 다가양이온 지질을 용액에 첨가하고, 용해시키고; 그리고

c) 폴리스티렌 마이크로-캐리어 비어, 적절하게는 SM-2 바이오비드로 용액을 처리하여 계면활성제를 제거하여, 양전하를 띈 지질 이중층 소포를 포함하는 현탁액이 형성되는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 공정.
제 9 항에 있어서,

1) 양이온 지질은 N-[(1,2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모니움 클로라이드(DOTMA), N-[(1,2,3-디올레일옥시-프로필]-N,N,N-트리메틸암모니움메틸-설페이트(DOTAP),N-t-부틸-N'-테트라데실-3-테트라데실아미노프로피온아미딘 중에서 선택된 적어도 한 개로 구성되고;

2) 다가양이온 지질은 1,3-디팔미토일-2-포스파티딜에탄올아미도-스페르민(DPPES), 디옥타데실-아미도글리실 스페르민(DOGS), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카르복사미드)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미니움 트리플로로아세테이트(DOSPA); 1,3-디올레일옥시-2-(6-카르복시-스페르밀)-프로필아미드(DOSPER); N,N,N',N'-테르라메틸-N,N'-비스(2-하이드록시에틸)-2,3-디올레일옥시-1,4-부텐디암모니움 이오다이드(THDOB) 등에서 선택된 것중 적어도 한 개로 선택된 것을 특징으로 하는 공정.
제 9 항 또는 제 10 항중 어느 한 항에 있어서, 완충액은 HEPES 완충액이고, 추가로 10 내지 250μmol 비-이온성 계면활성제를 포함하고, 이때 비-이온성 계면활성제는 옥타에틸렌글리콜 모노도데실에테르와 n-옥틸-올리고-옥시에틸렌에서 선택되는 것을 특징으로 하는 공정.
제 9 항 내지 11항중 어느 한 항에 있어서, 바이러스성 융합 펩티드는 헤마글루티닌 삼량체 또는 단량체, 이의 절단된 소단위 한 개 또는 두 개, 글리코펩티드 HA1와 HA2, 천연 원으로부터 분리된 융합 펩티드와 합성 융합 펩티드에서 선택되는 것을 특징으로 하는 공정.
제 9 항 내지 12항중 어느 한 항에 있어서, 포스파티딜에탄올아민과 포스파티딜콜린을 (b)단계에 혼합하는 것을 특징으로 하는 공정.
제 9 항 내지 13항중 어느 한 항에 있어서, 적어도 한 개의 세포-특이적인 표식과 이가기능기 교차결합제는 (b) 단계의 용액에 첨가하고, 적절하게는 포스파티딜에탄올아민, 이가기능기 교차결합제와 세포-특이적인 표식으로 구성된 미리 형성된 분자 복합체형으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 공정.
제 9 항 내지 14 항중 어느 한 항에 있어서, (b)단계에는 총 지질에 기초하여

1) 양이온 또는 다가 양이온 지질이 100wt%;

2) 양이온 또는 다가 양이온 지질이 90 내지 95wt%와 포스파티딜에탄올아민이 5 내지 10wt%; 또는

3) 양이온 또는 다가 양이온 지질이 45 내지 90wt%와 포스파티딜에탄올아민이 5 내지 10wt%; 포스파티딜콜린이 5 내지 50wt%을 첨가하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 공정.
제 9 항 내지 15항중 어느 한 항에 있어서, 마이크로캐리어 비드는 습식 메쉬 크기가 20-50(0.84-0.30㎜)이고, (c) 단계 용액은 최소 4시간동안 마이크로캐리어 비드로 처리하는 것을 특징으로 하는 공정.
제 9 항 내지 16 항중 어느 한 항에 있어서, 원하는 유전자 물질은 (b) 단계 용액에 첨가하는 것을 특징으로 하는 공정.
제 9 항 내지 16항 중 어느 한 항에 있어서, 원하는 유전자 물질은 (c) 단계의 소포 현탁액에 추가하고, 생성된 혼합물을 초음파파쇄하여 원하는 유전자 물질이 소포로 결합되도록하고, 이때 결합이 안된 물질은 겔 여과에 의해 소포로부터 분리하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 공정.
제 14 항 내지 18항중 어느 한 항에 있어서, 세포-특이적인 표식은 단클론성 항체, F(ab')2 단편, Fab' 단편, 사이토킨, 생장인자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 공정.
제 14 항 내지 제19항중 어느 한 항에 있어서, 교차결합제는 이형성이가기능기 숙시니미딜 유도체, 적절하게는 비스-N-숙시니미딜 유도체와 광활성화되는 이형성이가기능기 교차결합제에서 선택되는 것을 특징으로 하는 공정.
제 14 항 내지 제20항중 어느 한 항에 있어서, 미리 형성된 분자 복합체는 반응 혼합물에서 얻고, 이때 세포-특이적인 표식은 티올기를 통하여 공유결합으로 연결된 교차결합제-포스파티딜에탄올아민 분자의 교차결합 부분에 결합되는데, 이때 상기 교차결합제-포스파티딜에탄올아민 분자는 N-[4(p-말레이미도페닐)-부티릴]-포스파티딜에탄올아민(MPB.PE)와 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트-포스파티딜에탄올아민(MCC.PE)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 공정.
제 21 항에 있어서, 반응 안된 교차결합제-포스파티딜에탄올아민 분자, 특히 반응 안된 MPB.PE 또는 MCC.PE는 아가로즈 매트릭스를 이용한 친화성 크로마토그래피와 같은 겔 크로마토그래피를 이용하여 반응 혼합물로부터 제거하는데, 가장 적절한 방법은 환원된 티오프로필세파로즈 6B를 이용하여 제거하는 것을 특징으로 하는 공정.
제 9 항 내지 제 22 항중 어느 한 항에 있어서, 원하는 유전자 물질은 짧은 사슬의 DNA 또는 RNA, 데옥시리보뉴클레오티드, 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 올리고데옥시리보뉴클레오티드 셀레노에이트, 올리고데옥시리보뉴클레오티드 포스포로도티오에이트, 올리고데옥시리보뉴클레오티드 포스포라미데이트, 올리고데옥시리보뉴클레오티드 메틸포스포네이트, 펩티드 핵산, 리보뉴클레오티드, 올리고리보뉴클레오티드, 올리고리보뉴클레오티드 포스포로티오에이트, 2'-OMe-올리고리보뉴클레오티드 포스페이트, 2'-OMe-올리고리보뉴클레오티드 포스포로티오에이트, 리보자임, 유전자, 플라스미드 및 벡터에서 선택되는 것을 특징으로 하는 공정.
표적 세포 또는 조직으로 유전자 물질을 특이적으로 또는 비-특이적인 방식으로 전달하기 위해 제9항 내지 제23항에 따른 공정을 이용하여 만드는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제8항에 따른 특징을 가진 양전하를 띈 지질 소포.
사람 또는 동물의 질병의 치료 및 예방을 위한 약물을 제조하는데 이용될 수 있는 양전하를 띈 지질 소포에 있어서, 제9항 내지 제23항에 따른 공정을 이용하여 만드는 것을 특징으로 하는 양전하를 띈 지질 소포.
양전하를 띈 지질 소포에 있어서, 소포는 양전하를 띈 지질 이중층으로 되고, 양이온 또는 다가양이온 지질과 막에 끼워진 또는 공유결합된 적어도 한 개의 천연 또는 합성 바이러스성 융합 펩티드와 적절하게는 막에 적어도 한 개의 세포-특이적인 표식으로 구성되고 약물 수송용 담체 시스템으로 이용되는 것을 특징으로 하는 양이온 지질 소포.
제 26 항에 있어서, 지질 소포는 포유류 세포를 죽이거나 증식시키기 위해 유전자 물질을 비-감염성으로 전달하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 양이온 지질 소포.
양전하를 띈 지질 소포에 있어서, 소포는 양전하를 띈 지질 이중층으로 되고, 양이온 또는 다가양이온 지질과 막에 끼워진 또는 공유결합된 적어도 한 개의 천연 또는 합성 바이러스성 융합 펩티드와 적절하게는 막에 적어도 한 개의 세포-특이적인 표식으로 구성되고, 암을 치료하기 위한 제약학적 조성물을 제조하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 양이온 지질 소포.
제 26 항 내지 28항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스성 융합 펩티드는 헤마글루티닌 삼량체 또는 단량체, 이의 절단된 소단위 한 개 또는 두 개, 글리코펩티드 HA1와 HA2, 천연 원으로부터 분리된 융합 펩티드와 합성 융합 펩티드에서 선택되는 것을 특징으로 하는 양이온 지질 소포.
제 26 항 내지 29항 중 어느 한 항에 있어서, 세포-특이적인 표식은 단클론성 항체, F(ab')2 단편, Fab' 단편, 사이토킨, 생장인자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 양이온 지질 소포.
제 26 항 내지 제 30 항중 어느 한 항에 있어서, 소포에는 유전자 물질을 포함하는데, 이때 원하는 유전자 물질은 짧은 사슬의 DNA 또는 RNA, 데옥시리보뉴클레오티드, 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 올리고데옥시리보뉴클레오티드 셀레노에이트, 올리고데옥시리보뉴클레오티드 포스포로도티오에이트, 올리고데옥시리보뉴클레오티드 포스포라미데이트, 올리고데옥시리보뉴클레오티드 메틸포스포네이트, 펩티드 핵산, 리보뉴클레오티드, 올리고리보뉴클레오티드, 올리고리보뉴클레오티드 포스포로티오에이트, 2'-OMe-올리고리보뉴클레오티드 포스페이트, 2'-OMe-올리고리보뉴클레오티드 포스포로티오에이트, 리보자임, 유전자, 플라스미드 및 벡터에서 선택되는 것을 특징으로 하는 양이온 지질 소포.
제 26 항 내지 31항 중 어느 한 항에 있어서, 소포는 암, 백혈병, 바이러스 감염을 안티센스 치료법으로 치료하는데 적합한 적어도 한 개의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 양이온 지질 소포.
제 32 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 트로토온코젠 또는 온코젠 인코드된 mRNA를 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 양이온 지질 소포.
사람 또는 동물의 질병을 진단하고, 이를 치료 또는 예방하는데 이용하는 제약학적 조성물을 제조하는데 이용하기 위해 제9항 내지 제23항에 따른 공정을 이용하여 만드는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제8항에 따른 특징을 가진 양전하를 띈 지질 소포.