ES2698076T3

ES2698076T3 - Identificación de los dominios inmunosupresores en las proteínas de fusión de los virus de ARN con envoltura

Info

Publication number: ES2698076T3
Application number: ES12781027T
Authority: ES
Inventors: Duch Mogens Ryttergård; Shervin Bahrami
Original assignee: Isd Immunotech Aps
Current assignee: Isd Immunotech Aps
Priority date: 2011-10-07
Filing date: 2012-10-05
Publication date: 2019-01-30
Anticipated expiration: 2032-10-05
Also published as: DK2763696T3; WO2013050048A3; US20210206812A1; US20240150409A1; US10961279B2; EP2763696A2; EP2763696B1; US20160362454A1; WO2013050048A2; US20140335117A1

Abstract

Un método para identificar un dominio inmunosupresor en la proteína de fusión de un virus de ARN con envoltura que tiene una membrana lipídica, comprendiendo dicho método: a. Identificar al menos un dominio bien conservado entre el grupo que consiste en los dominios de membrana de la proteína de fusión y los dominios de superficie de la proteína de fusión; i. alinear candidatos de virus de virus dentro de un orden usando una herramienta de alineación; si no se identifican en la etapa (i) tramos de aminoácidos conservados que varían de 6 a 30 aminoácidos de longitud, ii. alinear candidatos de virus de la familia de virus utilizando una herramienta de alineación; si no se identifican en la etapa (ii) tramos de aminoácidos conservados que varían de 6 a 30 aminoácidos de longitud, iii. alinear candidatos de virus de la subfamilia de virus utilizando una herramienta de alineación; si no se identifican en la etapa (iii) tramos de aminoácidos conservados que varían de 6 a 30 aminoácidos de longitud, iv. alinear candidatos de virus de virus de un género utilizando una herramienta de alineación; si no se identifican en la etapa (iv) tramos de aminoácidos conservados que varían de 6 a 30 aminoácidos de longitud, v. alinear secuencias virales individuales de una sola especie de virus usando una herramienta de alineación; b. Proporcionar al menos un péptido con la secuencia de dicho al menos un dominio bien conservado identificado; c. Opcionalmente, dimerizar o multimerizar dicho al menos un péptido; y d. Confirmar la actividad inmunosupresora de dicho al menos un péptido opcionalmente dimerizado o multimerizado probando dicho al menos un péptido opcionalmente dimerizado o multimerizado para la actividad inmunosupresora.

Description

DESCRIPCIÓN

identificación de los dominios inmunosupresores en las proteínas de fusión de los virus de ARN con envoltura

La presente invención se refiere a virus de ARN con envoltura. En particular, la invención se refiere a la identificación de los dominios inmunosupresores en proteínas de fusión de virus de ARN con envoltura.

Antecedentes en el estado de la técnica

Clasificación de virus

Clasificación del ICTV

El Comité Internacional sobre Taxonomía de Virus (ICTV) desarrolló el sistema de clasificación actual y escribió pautas que ponen un mayor peso en ciertas propiedades del virus para mantener la uniformidad de la familia. Se ha establecido una taxonomía unificada (un sistema universal para clasificar virus). El séptimo informe del ICTV formalizó por primera vez el concepto de las especies de virus como el taxón (grupo) más bajo en una jerarquía de ramificaciones de taxones virales. Sin embargo, en la actualidad solo se ha estudiado una pequeña parte de la diversidad total de virus, encontrándose a partir de los análisis de muestras de humanos que aproximadamente el 20% de las secuencias de virus recuperadas no se habían observado antes, y muestras del medio ambiente, como las del agua de mar y sedimentos oceánicos, encontrándose que la gran mayoría de las secuencias son completamente nuevas.

La estructura taxonómica general es la siguiente:

Orden (-virales)

Familia (-viridae)

Subfamilia (-virinae)

Género (-virus)

Especies (-virus)

En la taxonomía actual (2008) del ICTV, se han establecido cinco órdenes, los Caudovirales, Herpesvirales, Mononegavirales, Nidovirales y Picornavirales. El comité no distingue formalmente entre subespecies, cepas y aislados. En total hay 5 órdenes, 82 familias, 11 subfamilias, 307 géneros, 2.083 especies y cerca de 3.000 tipos aún sin clasificar.

Clasificación de Baltimore

La clasificación de Baltimore de virus se basa en el método de síntesis de ARNm viral.

El sistema de clasificación del ICTV se utiliza junto con el sistema de clasificación de Baltimore en la clasificación moderna de virus.

La clasificación de virus de Baltimore se basa en el mecanismo de producción de ARNm. Los virus deben generar ARNm de sus genomas para producir proteínas y replicarse a sí mismos, pero se utilizan diferentes mecanismos para lograr esto en cada familia de virus. Los genomas virales pueden ser de cadena sencilla (cs) o de cadena doble (cd), ARN o ADN, y pueden o no usar transcriptasa inversa (TI). Además, los virus de ARNcs pueden ser sentido (+) o antisentido (-). Esta clasificación coloca los virus en siete grupos:

• I: virus de ADNcd (por ejemplo, Adenovirus, Herpesvirus, Poxvirus)

• II: virus de ADNcs ADN sentido (+) (por ejemplo, Parvovirus)

• III: virus ARNcd (por ejemplo, Reovirus)

• IV: virus de ARNcs ARN sentido (+) (por ejemplo, Picornavirus, Togavirus)

• V: virus de ARNcs (-) ARN sentido (-) (por ejemplo, Orthomixovirus, Rabdovirus)

• VI: virus de ARNcs-RT ARN sentido (+) con ADN intermedio en el ciclo de vida (por ejemplo, Retrovirus)

• VII: virus de ADNcd-RT (por ejemplo, Hepadnavirus)

Como ejemplo de clasificación viral, el virus de la varicela, varicela zoster (VZV), pertenece al orden Herpesvirales, familia Herpesviridae, subfamilia Alfaherpesvirinae, y género Varicellovirus. VZV está en el Grupo I de la Clasificación de Baltimore porque es un virus de ADNcd que no utiliza transcriptasa inversa.

Muchos virus (por ejemplo, virus de la influenza y muchos virus animales) tienen envolturas virales que cubren sus núcleos de proteína. Las envolturas típicamente se derivan de porciones de las membranas de la célula huésped (fosfolípidos y proteínas), pero incluyen algunas glicoproteínas virales. Funcionalmente, las envolturas virales se utilizan para permitir que los virus ingresen a las células huésped. Las glicoproteínas en la superficie de la envoltura sirven para identificar y unirse a los sitios receptores en la membrana del huésped. Posteriormente, la envoltura viral se fusiona con la del huésped, lo que permite que la cápside viral y el genoma viral entren e infecten al huésped.

Normalmente, en los virus de ARN, una única glucoproteína transmembrana, una proteína de fusión, experimenta una transición conformacional activada por el reconocimiento del receptor o bajo pH, lo que lleva a la inserción de un péptido de fusión en la membrana plasmática o la membrana de una vesícula endocítica. Para algunos virus de ARN, incluidos los miembros de la familia de los paramixovirus, las proteínas separadas de la envoltura median la unión y la fusión. La fusión a la membrana puede ocurrir en la membrana plasmática o en una localización intracelular después de la internalización del virus por endocitosis mediada por receptor. La fusión está mediada por proteínas transmembrana virales conocidas como proteínas de fusión. Tras la activación apropiada, la proteína de fusión interactúa con la membrana objetivo a través de un péptido de fusión hidrófobo y experimenta un cambio conformacional que impulsa la reacción de fusión a la membrana. Existen una variedad de factores desencadenantes de la fusión, que incluyen varias combinaciones de unión del receptor, unión del receptor/correceptor y exposición al pH levemente ácido dentro de la vía endocítica. Las proteínas de fusión de diferentes virus tienen nombres diferentes a pesar de la funcionalidad común. Con base en importantes características estructurales, muchas proteínas de fusión a la membrana de virus están actualmente anotadas en las proteínas de fusión a la membrana de "clase I" ejemplificadas por la hemaglutinina (HA) de la influenza o gp41 del VIH-1, o las proteínas de "clase II" de alfavirus y flavivirus. Los alfavirus y flavivirus son miembros de las familias Togaviridae y Flaviviridae, respectivamente. Estos virus de ARN de sentido positivo con envoltura pequeña están compuestos por una proteína de la cápside que se ensambla con el RNA en la nucleocápside y una bicapa lipídica que contiene las proteínas transmembrana (TM) virales.

Las proteínas de fusión de clase I se sintetizan como precursores de cadena sencilla, que luego se ensamblan en trímeros. Luego, los polipéptidos son escindidos por las proteasas del huésped, lo que es un paso esencial para que las proteínas sean competentes para la fusión. Este evento proteolítico ocurre tarde en el proceso biosintético debido a que las proteínas de fusión, una vez escindidas, son metaestables y se activan fácilmente. Una vez activada, la proteína se repliega en una conformación altamente estable. La sincronización de este último evento es de importancia crucial en el proceso de fusión. El mantenimiento del polipéptido precursor intacto durante el plegado y el ensamblaje de la estructura oligomérica es esencial si la energía libre que se libera durante el evento de replegamiento debe estar disponible para superar las barreras inherentes a la fusión a la membrana. La nueva región amino-terminal que se crea por el evento de escisión contiene una secuencia hidrófoba, que se conoce como el péptido de fusión. La auténtica región carboxi-terminal del polipéptido precursor contiene el anclaje transmembrana. En el polipéptido carboxi-terminal, hay secuencias conocidas como la repetición en héptadas que se predice que tienen una estructura de hélice alfa y forman una estructura de bobina enrollada. Estas secuencias participan en la formación de una estructura altamente estable que caracteriza la conformación posterior a la fusión de la proteína de fusión.

Las proteínas de fusión de clase II son moléculas alargadas similares a dedos con tres dominios globulares compuestos casi en su totalidad por láminas p. El dominio I es un barril p que contiene el extremo N y dos inserciones largas que conectan cadenas p adyacentes y juntas forman el dominio II alargado. La primera de estas inserciones contiene el bucle peptídico de fusión altamente conservado en su punta, que conecta las cadenas p c y d del dominio II (denominado bucle cd) y que contiene 4 enlaces disulfuro conservados, incluidos varios que se encuentran en la base del bucle de fusión. La segunda inserción contiene el bucle ij en su punta, adyacente al bucle de fusión, y un enlace disulfuro conservado en su base. Una región bisagra está situada entre los dominios I y II. Una región enlazadora corta conecta el dominio I al dominio III, un barril p con un pliegue similar al de inmunoglobulina estabilizado por tres enlaces disulfuro conservados. En la molécula de longitud completa, el dominio III es seguido por una región del tallo que conecta la proteína con el anclaje de TM del virus. La adaptación de la estructura del alfavirus E1 a las reconstrucciones microscópicas crioelectrónicas de la partícula viral revela que E1 se ubica casi en paralelo a la membrana del virus y que las interacciones E1-E1 forman una red icosaédrica.

Propiedades inmunosupresoras de virus empacados con proteínas de fusión tipo I

Se ha demostrado previamente que las proteínas de fusión de un subconjunto de virus tipo I [1] empacados (retrovirus, lentivirus y filovirus) presentan una actividad inmunosupresora. Los retrovirus inactivados son capaces de inhibir la proliferación de células inmunes tras la estimulación [2-4]. La expresión de estas proteínas es suficiente para permitir que las células alogénicas crezcan hasta convertirse en un tumor en ratones inmunocompetentes. En un estudio, la introducción de constructos que expresan ENV en células tumorales murinas MCA205, que no proliferan tras la inyección sc en un huésped alogénico, o en células tumorales murinas CL8.1 (que sobreexpresan los antígenos de clase I y se rechazan en un huésped singénico) dio lugar a un crecimiento tumoral en ambos casos [5]. Dichos dominios inmunosupresores se han encontrado en una variedad de virus diferentes con mecanismo de fusión de tipo 1, tal como gamma-retrovirus similares al virus del mono Mason-Pfizer (MPMV) y el virus de la leucemia murina (MLV), lentivirus como el VIH y en filovirus como el virus del Ébola y de Marburgo [6-9].

Esta actividad supresora del sistema inmunitario se localizó en todos los casos en una estructura muy bien definida dentro de las proteínas de fusión de clase I, más precisamente en la curva en la héptada repetida solo en el extremo N-terminal de la estructura transmembrana en la proteína de fusión. Los efectos inmunosupresores varían desde una inhibición significativa de la proliferación de linfocitos [7,8], sesgo de citoquinas (sobrerregulación de IL-10, subregulación de TNF-a, IL-12, IFN-y) [10] e inhibición de la explosión monocítica [11] para la muerte de células T citotóxicas [12]. Es importante destacar que los péptidos que abarcan ISD en estos ensayos deben estar unidos como dímeros o acoplados a un portador (es decir, > monoméricos) para que estén activos. Dichos péptidos derivados de dominios inmunosupresores son capaces de reducir o abolir respuestas inmunes tales como la secreción de citoquinas o la proliferación de células T tras la estimulación. La protección mediada por las propiedades inmunosupresoras de la proteína de fusión del sistema inmunitario del huésped no se limita a la proteína de fusión, sino que cubre todas las proteínas de la envoltura viral mostradas en las membranas virales o celulares, en particular, también la unión mediadora de la proteína del virus a la célula.

Ubicación conjunta del dominio de inmunosupresión y el dominio de fusión

El dominio inmunosupresor de retrovirus, lentivirus y filovirus se superpone a una parte estructuralmente importante de las subunidades de fusión de las proteínas de la envoltura. Aunque la estructura primaria (secuencia) de esta parte de las proteínas de fusión puede variar mucho de un virus a otro, la estructura secundaria, que está muy bien conservada entre diferentes familias de virus, es la de una hélice alfa que se dobla de diferentes maneras durante el proceso de fusión. Esta estructura juega un papel crucial durante los eventos que resultan en la fusión de las membranas virales y celulares. Es evidente que los dominios inmunosupresores de estas proteínas de fusión de clase I (retrovirales, lentivirales y filovirales) se superponen con una estructura proteica muy importante necesaria para la función mecánica de las proteínas de fusión.

La energía necesaria para mediar la fusión de las membranas virales y celulares se almacena en las proteínas de fusión, que se encuentran así en una conformación metaestable en la superficie viral. Una vez que se libera la energía para impulsar el evento de fusión, la proteína encontrará su conformación más estable energéticamente. En este sentido, las proteínas de fusión pueden compararse con resortes cargados que están listos para combarse. Esta conformación de alta energía hace que las proteínas de fusión viral sean muy susceptibles a modificaciones; pequeños cambios en la estructura primaria de la proteína a menudo dan como resultado que la proteína se pliegue en su conformación estable posterior a la fusión. Las dos conformaciones presentan estructuras terciarias muy diferentes de la misma proteína.

En el caso de los retrovirus simples, se ha demostrado que pequeños cambios estructurales en la proteína de la envoltura son suficientes para eliminar el efecto inmunosupresor sin cambiar la estructura y, por lo tanto, el perfil antigénico.

Las proteínas de la envoltura inmunosupresora mutadas son antígenos mucho mejores para la vacunación. Las proteínas pueden inducir un aumento de 30 veces de los títulos de anticuerpos anti-env cuando se usan para la vacunación y son mucho mejores para lanzar una respuesta CTL efectiva [6]. Además, los virus que contienen la forma no inmunosupresora de la proteína amiga de la envoltura del virus de la leucemia murina, aunque son completamente infecciosos en ratones inmunocomprometidos irradiados no pueden establecer una infección en animales inmunocompetentes. Curiosamente, en el último grupo, los virus no inmunosupresores inducen una respuesta inmune tanto celular como humeral, que protege completamente a los animales de la exposición posterior por virus de tipo salvaje [13].

Los dominios inmunosupresores en las proteínas de fusión (proteínas de envoltura viral) de retrovirus, lentivirus y filovirus se conocen desde 1985 para retrovirus [7], desde 1988 para lentivirus [8] y desde 1992 para filovirus [14]. Estos virus, como se mencionó anteriormente, todos pertenecen a virus de ARN con envoltura con un mecanismo de fusión de tipo I. Los dominios inmunosupresores de lentivirus, retrovirus y filovirus muestran una gran similitud estructural. Además, el dominio inmunosupresor de estos virus se encuentra en la misma posición en la estructura de la proteína de fusión, más precisamente en el enlazador entre las dos estructuras de repetición en héptadas justo N-terminal del dominio transmembrana en la proteína de fusión. Estas regiones de repetición en héptadas constituyen dos hélices alfa que desempeñan un papel crítico en el mecanismo activo de la fusión a la membrana por estas proteínas. Los dominios inmunosupresores pueden ubicarse en relación con dos residuos de cisteína bien conservados que se encuentran en estas estructuras. Estos residuos de cisteína están entre 4 y 6 residuos aminoácidos entre sí y en muchos casos se cree que forman puentes disulfuro que estabilizan las proteínas de fusión. Los dominios inmunosupresores en los tres casos incluyen al menos algunos de los primeros 22 aminoácidos que están ubicados en el extremo N con respecto al primer residuo de cisteína. Recientemente, los dominios inmunosupresores en la proteína de fusión de estos virus se han alterado con éxito de tal manera que se han conservado las propiedades fusogénicas de la proteína de fusión. Dichas proteínas de fusión mutadas con propiedades inmunosupresoras disminuidas han demostrado ser antígenos superiores para propósitos de vacunación [13].

La solicitud de patente estadounidense US2007185025A1 se refiere a secuencias que tienen una fuerte conservación de la estructura secundaria entre el dominio C-terminal de la glicoproteína de la envoltura de los filovirus y un dominio inmunosupresor encontrado en las glicoproteínas de la envoltura retroviral, los péptidos filovirales y sus derivados modificados con una fuerte bioactividad inmunosupresora y su identificación.

K. Yaddanapudi et al. 2006 "Implication of a retrovirus-like glycoprotein peptide in the immunopathogenesis of Ebola and Marburg viruses" se refiere a un método para identificar un dominio inmunosupresor en ciertos virus al identificar primero la región con una estructura secundaria fuerte similar a la glicoproteína del retrovirus seguida por la alineación de la secuencia para revelar la similitud de secuencia primaria predictiva de estos dominios inmunosupresores.

Fass D et al. 1995 "Dissection of a retrovirus envelope protein reveals structural similarity to influenza hemagglutinin", divulga una secuencia de aminoácidos específica denominada "repetición hidrofóbica 4-3" que se encuentra en las proteínas de la envoltura retroviral y en la proteína HA de la influenza, análisis estructural de esta "repetición hidrófoba 4-3", y una "secuencia inmunosupresora" presente en la subunidad TM, carboxiterminal a la "repetición hidrófoba 4-3". D8 George J G et al. 1985 "Inhibition of lymphocyte proliferation by a synthetic peptide homologous to retroviral envelope proteins" divulga una proteína de envoltura transmembrana retroviral p15E, que tiene propiedades inmunosupresoras. D8 en particular se refiere a una región conservada de p15E y un péptido sintético, CKS-17, correspondiente a esta región conservada de p15E y las propiedades inmunosupresoras de CKS-17.

Sumario de la invención

Los inventores han podido idear métodos para la identificación de nuevos dominios inmunosupresores o dominios potencialmente inmunosupresores localizados en proteínas mostradas en la superficie de los virus de ARN con envoltura. Los inventores de la presente invención han encontrado sorprendentemente dominios inmunosupresores o dominios potencialmente inmunosupresores en proteínas de fusión en un gran número de otros virus de ARN con envoltura además de lentivirus, retrovirus y filovirus, en los que dichos dominios inmunosupresores no se han descrito previamente.

De acuerdo con un aspecto, la invención se refiere a un método para identificar un dominio inmunosupresor en la proteína de fusión de un virus de ARN con envoltura que tiene una membrana lipídica, comprendiendo dicho método: a. Identificar al menos un dominio bien conservado entre el grupo que consiste en los dominios de membrana de la proteína de fusión y los dominios de superficie de la proteína de fusión;

i. alinear candidatos de virus de virus dentro de un orden usando una herramienta de alineación;

si no se identifican en la etapa (i) tramos de aminoácidos conservados que varían de 6 a 30 aminoácidos de longitud, ii. alinear candidatos de virus de la familia de virus utilizando una herramienta de alineación;

si no se identifican en la etapa (ii) tramos de aminoácidos conservados que varían de 6 a 30 aminoácidos de longitud, iii. alinear candidatos de virus de la subfamilia de virus utilizando una herramienta de alineación;

si no se identifican en la etapa (iii) tramos de aminoácidos conservados que varían de 6 a 30 aminoácidos de longitud, iv. alinear candidatos de virus de virus de un género utilizando una herramienta de alineación;

si no se identifican en la etapa (iv) tramos de aminoácidos conservados que varían de 6 a 30 aminoácidos de longitud, v. alinear secuencias virales individuales de una sola especie de virus usando una herramienta de alineación;

b. Proporcionar al menos un péptido con la secuencia de dicho al menos un dominio bien conservado identificado; c. Opcionalmente, dimerizar o multimerizar dicho al menos un péptido; y

d. Confirmar la actividad inmunosupresora de dicho al menos un péptido opcionalmente dimerizado o multimerizado probando dicho al menos un péptido opcionalmente dimerizado o multimerizado para la actividad inmunosupresora. De acuerdo con un aspecto, la invención se refiere al método descrito anteriormente, en el que la identificación de dicho al menos un dominio bien conservado se realiza entre el grupo que consiste en los dominios de superficie de la proteína de fusión en una o más de las diferentes conformaciones de la proteína de fusión sometidas a fusión.

De acuerdo con un aspecto, la invención se refiere al método descrito anteriormente, en el que el virus de ARN con envoltura es de la familia Orthomyxoviridae.

De acuerdo con un aspecto, la invención se refiere al método descrito anteriormente, en el que el virus de ARN con envoltura es del género Influenzavirus A.

De acuerdo con un aspecto, la invención se refiere al método descrito anteriormente, en el que el virus de ARN con envoltura es de la especie de virus de la Influenza A.

De acuerdo con un aspecto, la invención se refiere al método descrito anteriormente, en el que el virus de ARN con envoltura se selecciona del grupo de cepas de virus que consiste en H1 hasta H16 de Influenza A.

De acuerdo con un aspecto, la invención se refiere al método descrito anteriormente, en el que el virus de ARN con envoltura se selecciona del grupo de cepas de virus que consiste en H3, H7 y H10 de la Influenza A.

De acuerdo con un aspecto, la invención se refiere al método descrito anteriormente, en el que dicho al menos un dominio bien conservado comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO. 4.

Los inventores proponen el uso de hasta cuatro parámetros para la identificación del dominio inmunosupresor en virus de ARN con envoltura con propiedades inmunosupresoras hasta ahora no descritas. Los parámetros propuestos utilizados como parte de una estrategia para identificar una secuencia peptídica o un péptido que probablemente actúe como dominios inmunosupresores pueden comprender uno o más de los siguientes parámetros (preferiblemente se utilizan todos los parámetros):

1) : El péptido se encuentra preferiblemente en la proteína de fusión de los virus de ARN con envoltura;

2) : El péptido es preferiblemente capaz de interactuar con las membranas;

3) : Preferiblemente, existe un alto grado de homología en la estructura primaria (secuencia) del péptido de dicho dominio, ya sea dentro del Orden, Familia, Subfamilia, Género o Especie de virus. Esta característica se debe a que el dominio inmunosupresor está bajo una presión de selección dual, una como una entidad inmunosupresora que garantiza la protección de la partícula viral del sistema inmunitario del huésped, otra como un péptido que interactúa con las membranas;

4) : La posición en la superficie de la proteína de fusión en una conformación dada es preferiblemente una característica de los dominios inmunosupresores. Esto puede ser revelado ya sea por posición en una estructura tridimensional o por tinción con anticuerpos de células que expresan la proteína de fusión o en superficies virales que muestran la proteína de fusión.

Con base en estos parámetros, los inventores han identificado, entre otras cosas, tres nuevos grupos de virus de ARN con envoltura con dominios inmunosupresores en su proteína de fusión:

1: Los inventores han identificado dominios inmunosupresores entre virus de ARN con envoltura con un mecanismo de fusión de tipo II. Hasta ahora, los dominios inmunosupresores no se han descrito para ningún virus de ARN con envoltura con un mecanismo de fusión de tipo II. Los inventores han identificado dominios inmunosupresores en dos posiciones en dos grupos diferentes de virus:

i. Localización conjunta con el péptido de fusión ejemplificado por la identificación de un dominio inmunosupresor común en el péptido de fusión de Flavivirus (virus del dengue, virus del Nilo occidental, etc.), y

ii. En la hélice alfa hidrófoba N-terminal del dominio transmembrana en la proteína de fusión ejemplificada por el hallazgo de un dominio inmunosupresor en dichas hélices de todos los Flaviviridae, por ejemplo, Virus de la hepatitis C, Dengue, Nilo Occidental, etc.

2: Los inventores han identificado dominios inmunosupresores en la proteína de fusión entre virus de ARN con envoltura con mecanismo de fusión de tipo I (excluyendo lentivirus, retrovirus y filovirus). Esta posición se localiza conjuntamente con el péptido de fusión de dicha proteína de fusión como se demuestra mediante la identificación de un dominio inmunosupresor común en el péptido de fusión de todos los tipos de Influenza A y B.

3: Los inventores han identificado dominios inmunosupresores potenciales ubicados en varias posiciones de virus de ARN con envoltura de tipo I (excluyendo lentivirus, retrovirus y filovirus), así como en virus de ARN con envoltura que presentan una proteína de fusión sin una estructura de fusión de tipo I ni de tipo II.

Después de la identificación de los dominios inmunosupresores, estos podrían mutarse para disminuir o anular completamente las propiedades inmunosupresoras de la proteína de la envoltura completa (preferiblemente tanto la parte de unión como la parte de fusión de la proteína de envoltura si estas son proteínas separadas). Dichas proteínas de envoltura viral con propiedades inmunosupresoras reducidas son candidatos ideales para su uso como antígenos en composiciones de vacunas o para la producción de anticuerpos neutralizantes.

d. Confirmar la actividad inmunosupresora de dicho al menos un péptido opcionalmente dimerizado o multimerizado probando dicho al menos un péptido opcionalmente dimerizado o multimerizado para la actividad inmunosupresora. Con respecto a la etapa a, las proteínas de fusión o las proteínas de fusión putativas se identifican usualmente mediante la búsqueda en bases de datos científicas, por ejemplo, tales como la base de datos de búsqueda de taxonomía del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/) y seleccionar proteínas de la Familia, Subfamilia, Género o Especie a investigar y posteriormente buscarlas para fusión, o la proteína de fusión específica, tal como la proteína enumerada en la Tabla 1 más adelante.

Con respecto a la etapa b, los virus se dividen de acuerdo con la siguiente clasificación: Orden (-virales), Familia (-viridae), Subfamilia (-virinae), Género (-virus), Especie (-virus). Para localizar regiones conservadas en las proteínas de fusión, uno o unos pocos candidatos de todos los virus dentro de un orden se alinean primero utilizando una herramienta de alineación, tal como la herramienta de alineación de cobalto (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/). Si se pueden identificar tramos de aminoácidos conservados, tal como en el intervalo de 6 a 30 aminoácidos de longitud, estos se consideran candidatos para regiones inmunosupresoras y se someten a una investigación adicional. Si no se encuentran candidatos en un orden, se aplica el mismo procedimiento a la familia de virus. Si aún no se encuentran candidatos al probar diferentes virus que pertenecen a una familia de virus, se pasa a la subfamilia de virus. Si no se pueden localizar las regiones de homología entre la subfamilia, se prueban los virus de un género y si todavía no se pueden localizar regiones de homología, finalmente se alinean la mayor cantidad posible de secuencias virales individuales de una sola especie de virus (hasta 1400 secuencias virales individuales). En general, las regiones de homología se identifican por tener al menos un 25%, más preferiblemente al menos un 30%, preferiblemente al menos un 40%, más preferidas al menos un 50%, más preferidas al menos un 60%, preferiblemente al menos un 70%, e incluso más preferiblemente al menos 75% de homología (es decir, identidad de secuencia) dentro de una región dada. Con respecto a la etapa c, el péptido dimerizado podría ser sintético, el péptido multimerizado podría mostrarse como proteínas de fusión dimerizadas o trimerizadas mostradas solas o en membranas tales como una partícula viral. Alternativamente, los péptidos multimerizados se pueden acoplar a una proteína transportadora.

Divulgación detallada

La Tabla 1 proporciona una lista de virus y sus dominios inmunosupresores. El asterisco denota una secuencia extremadamente conservada en el dominio inmunosupresor para una determinada clase, grupo, familia o especie de virus. Se enumeran los nuevos dominios inmunosupresores identificados y probados en el ensayo CTLL-2 para una clase, grupo, familia o especie dada de virus. Tanto las columnas con "ISU putativa como se describe en esta solicitud para la identificación de dominios inmunosupresores" como los "Péptidos de dominios de proteínas de fusión que exhiben actividad inmunosupresora (ISU)" son candidatos para dominios que son inmunosupresores. Téngase en cuenta que todas las entradas de la última columna fueron identificadas originalmente por los inventores como miembros de la columna anterior. Debido a la redundancia, las entradas de la última columna no se incluyeron en la columna anterior.

1: Los inventores han identificado dominios inmunosupresores en las proteínas de fusión entre virus de ARN con envoltura con un mecanismo de fusión de tipo II. En la medida en que, no se han descrito previamente dominios inmunosupresores para los virus de ARN con envoltura de tipo II. El dominio inmunosupresor se ha identificado en dos posiciones en la proteína de fusión en dos grupos diferentes de virus A: localización conjunta con el péptido de fusión ejemplificado por la identificación de un dominio inmunosupresor común en el péptido de fusión de Flavivirus (virus del dengue, virus del Nilo Occidental, etc.) y B: en la hélice alfa hidrófoba N-terminal del dominio transmembrana en la proteína de fusión ejemplificada por el hallazgo de un dominio inmunosupresor en dichas hélices de Flaviviridae, por ejemplo, Virus de la hepatitis C, Dengue, virus del Nilo Occidental, etc., consultar la Tabla 1.

2: Los inventores han identificado dominios inmunosupresores en la proteína de fusión entre virus de ARN con envoltura con mecanismo de fusión de tipo I (excluyendo lentivirus, retrovirus y filovirus). Esta nueva posición se localiza conjuntamente con el péptido de fusión de dicha proteína de fusión como se demuestra mediante la identificación de un dominio inmunosupresor común en el péptido de fusión de todos los tipos de Influenza A y B, consultar la Tabla 1.

3: Los inventores han identificado dominios inmunosupresores potenciales ubicados en varias posiciones de virus de ARN con envoltura de tipo I (excluyendo lentivirus, retrovirus y filovirus) y virus de ARN con envoltura sin mecanismo de fusión de tipo I ni de tipo II, consultar la Tabla 1.

De acuerdo con una realización, la invención se refiere a un método para identificar un dominio inmunosupresor en la proteína de fusión de un virus de ARN con envoltura que tiene una membrana lipídica, comprendiendo dicho método: a. Identificar al menos un dominio bien conservado entre el grupo que consiste en los dominios de membrana de la proteína de fusión y los dominios de superficie de la proteína de fusión;

d. Confirmar la actividad inmunosupresora de dicho al menos un péptido opcionalmente dimerizado o multimerizado probando dicho al menos un péptido opcionalmente dimerizado o multimerizado para la actividad inmunosupresora. Al menos un dominio bien conservado puede identificarse entre los dominios, que son dominios de membrana y dominios de superficie. Naturalmente, un dominio que es tanto un dominio de membrana como un dominio de superficie puede ser un dominio bien conservado.

La proteína de fusión se puede identificar buscando la taxonomía en NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/), y seleccionando proteínas de la Familia, Subfamilia, Género o Especie a investigar, y posteriormente buscar estas para la fusión o el nombre específico de la proteína de fusión, por ejemplo, como se indica en la Tabla 1.

El péptido dimerizado podría ser sintético, el péptido multimerizado podría mostrarse como proteínas de fusión dimerizadas o trimerizadas, ya sea mostradas solas o en membranas tales como una partícula viral.

Una forma de probar la actividad inmunosupresora de al menos un péptido dimerizado o multimerizado es probar la actividad inmunosupresora de la proteína de fusión en ausencia y presencia de al menos un péptido dimerizado o multimerizado, y comparar los resultados.

De acuerdo con otras realizaciones, la invención se refiere al método, en el que la identificación de dicho al menos un dominio bien conservado se realiza entre el grupo que consiste en los dominios de superficie de la proteína de fusión en una o más de las diferentes conformaciones de la proteína de fusión sometida a fusión.

De acuerdo con otras realizaciones, la invención se refiere al método, en el que dicho al menos un dominio bien conservado se selecciona entre el grupo que consiste en ISU putativas e ISU identificadas de la Tabla 1 y las SEQ ID NOS 1-200.

La proteína de la envoltura se puede identificar buscando la taxonomía en NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/) y seleccionando proteínas de la Familia, Subfamilia, Género o Especie a investigar y posteriormente buscando estas para envoltura o el nombre específico para la proteína de envoltura o la proteína de unión y fusión, por ejemplo, como se indica en la Tabla 1.

Los experimentos preliminares indican que los dominios inmunosupresores pueden tener un tamaño de 4-30 aminoácidos.

De acuerdo con una realización, la invención se refiere al método, en el que el virus de ARN con envoltura tiene una proteína de fusión con un mecanismo de fusión de tipo II.

De acuerdo con una realización, la invención se refiere al método, en el que el virus de ARN con envoltura, preferiblemente excluyendo lentivirus, retrovirus y filovirus, tiene una proteína de fusión con un mecanismo de fusión de tipo I y en el que los dominios inmunosupresores localizan se conjuntamente con el péptido de fusión en la proteína de fusión, preferiblemente como se demuestra mediante la identificación de un dominio inmunosupresor común en el péptido de fusión de todos los H1 hasta H16 de la influenza A y la influenza B.

De acuerdo con una realización, la invención se refiere al método, en el que el virus de ARN con envoltura, preferiblemente excluyendo lentivirus, retrovirus y filovirus, tiene una proteína de fusión con un mecanismo de fusión de tipo I que excluye virus con un mecanismo de fusión de tipo I en el que la ISU se localiza conjuntamente con el péptido de fusión o la proteína de fusión tiene una estructura que no es una estructura de fusión tipo I ni tipo II.

El dominio inmunosupresor ha sido identificado hasta ahora por los inventores en dos posiciones en dos grupos diferentes de virus A: localización conjuntamente con el péptido de fusión ejemplificado por la identificación de un dominio inmunosupresor común en el péptido de fusión de todos los Flavivirus (virus del Dengue, virus del Nilo Occidental, etc.) y virus de Influenza A y B y B: en la hélice alfa hidrófoba N-terminal del dominio transmembrana en la proteína de fusión ejemplificada por el hallazgo de un dominio inmunosupresor en dichas hélices de Flaviviridae como por ejemplo Virus de la hepatitis C, Dengue, del Nilo Occidental, Fiebre amarilla.

Los inventores se han dado cuenta de que los dominios inmunosupresores potenciales están ubicados en varias posiciones en la proteína de fusión identificable por

2) : El péptido es preferiblemente capaz de interactuar con las membranas;

3): Preferiblemente, existe un alto grado de homología en la estructura primaria (secuencia) del péptido de dicho dominio ya sea dentro de la propia especie viral, en la familia de virus o en un grupo de virus. Este requisito se debe a que el dominio inmunosupresor se encuentra bajo una presión de selección dual, uno como entidad inmunosupresora que garantiza la protección de la partícula viral del sistema inmunitario del huésped, otro como un péptido que interactúa con las membranas; y/o

4): La posición en la superficie de la proteína de fusión en una conformación dada es preferiblemente una característica de los dominios inmunosupresores. Esto puede ser revelado ya sea por la posición en una estructura tridimensional o por tinción con anticuerpos de células que expresan la proteína de fusión o en superficies virales que muestran la proteína de fusión.

El péptido de fusión es un péptido pequeño que penetra la membrana localizado en la proteína de fusión de los virus con envoltura.

De acuerdo con una realización, la invención se puede usar con virus humanos y/o animales.

La tabla 2 a continuación, proporciona la ubicación de una serie de dominios inmunosupresores identificados.

TABLA 2

Toda la proteína E Flavirus Seligman SJ. Constancia y diversidad en el péptido de fusión de flavivirus. Virol J. 2008 14 de febrero; 5: 27.

De acuerdo con una realización, un dominio inmunosupresor puede identificarse por su posición, por ejemplo, como se indica en la Tabla 2.

Las figuras y ejemplos acompañantes se proporcionan para explicar en lugar de limitar la presente invención. Será claro para el experto en la materia que se pueden combinar aspectos, realizaciones y reivindicaciones de la presente invención.

Ejemplos

Soluciones peptídicas

Los péptidos se disolvieron en agua o, en los casos de baja solubilidad en agua, se usaron soluciones de DMSO al 5% para disolver los péptidos.

Ensayo para medir la actividad inmunosupresora de péptidos derivados de proteínas de superficie viral o sus mutantes Los péptidos pueden prepararse por diferentes medios que incluyen, pero no se limitan a, la síntesis en fase sólida comúnmente utilizada para tales fines. Los péptidos se pueden dimerizar usando un residuo de cisteína en el extremo N o C terminal o en la mitad del péptido o usando cualquier otra molécula o átomo que esté unido covalentemente a las moléculas peptídicas.

Los péptidos se pueden acoplar a una proteína portadora tal como BSA mediante enlaces covalentes que incluyen, pero no se limitan a, puentes disulfuro entre los residuos de cisteína del péptido y la proteína transportadora o a través de grupos amino que incluyen aquellos en la cadena lateral o residuos de lisina.

Los péptidos pueden tener aminoácidos derivados no virales añadidos a su extremo C-terminal para aumentar su solubilidad en agua.

Ensayo para probar la actividad inmunosupresora de péptidos.

Diseño del experimento

Las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se preparan en forma fresca a partir de donantes sanos. Estos son estimulados por Con A (5 pg/mL) en forma concomitante con la adición del péptido a diferentes concentraciones (es decir, 25 pM, 50 pM y 100 pM). Los cultivos se mantienen y la proliferación de linfocitos se mide 72 horas más tarde mediante la incorporación de EdU y Click-iT marcando con Oregon Green (Invitrogen, Dinamarca) según lo recomendado por el fabricante. El grado de linfocitos activados es proporcional a la detección de fluorescencia. Ensayo con CTLL-2

Se sembraron 100.000 células CTLL-2 por pozo en una placa de 48 pozos (Nunc) en 200 pL de medio (RPMI L-glutamina 2 mM Na-piruvato 1 mM FCS al 10% 0,5 ng/mL de IL-2) 2 horas después, se añaden los péptidos a los pozos. 24 horas después, las células se marcan con el kit de reacción Click-iT (Invitrogen cat. # C35002). La fluorescencia de las células se mide en un citómetro de flujo. El grado de proliferación en cada muestra es proporcional a la fluorescencia detectada.

Prueba de inmunosupresión a partir péptidos de monoméricos y diméricos.

Cuantificación de la inhibición de la proliferación.

El grado de inhibición de la proliferación de células CTLL-2 se visualiza en los diagramas de las figuras. Las relaciones se calculan dividiendo el número de células marcadas (células en crecimiento) en cultivos en presencia de péptido con cultivos en ausencia de péptidos, pero se agrega el mismo volumen de soluto que se usó para disolver los péptidos. Es decir, en los casos en que los péptidos se disolvieron en DMSO al 5%, se agregó el mismo volumen de DMSO al 5% a las células de control.

Figuras

La Figura 1 muestra el resultado de un experimento que utiliza péptidos derivados de la influenza y el efecto de los péptidos diméricos en la proliferación de células CTLL-2. Los péptidos se acoplan a través de un enlace s-s que involucra los residuos de cisteína. El péptido de INF de tipo silvestre inhibe la síntesis de ADN nuevo, mientras que el péptido no IS # 1 tiene mucho menos y el péptido no IS # 2 no tiene un efecto significativo.

INF tipo silvestre: GLFGAIAGFIENGWEGCGGEKEKEK

INF no IS # 1: GLFGAAGFIENGWEGCGGEKEKEK

INF no IS # 2: GLFAGFIENGWEGCGGEKEKEK

La Figura 2 muestra el resultado de dos experimentos independientes en péptidos derivados de Flavivirus.

FLV IS/1 y FLV IS/2 son dos experimentos independientes que utilizan el péptido dimerizado: en ambos casos, es evidente una inhibición significativa de la proliferación de células CTLL-2, mientras que el péptido monomérico no tiene ningún efecto.

FLV IS/1 y FLV IS/2: DRGWGNGCGLFGKG dimérico

FLV es mono/1: DRGWGNGCGLFGKG monomérico

Péptido de control: un péptido de control no inmunosupresor dimerizado.

Las concentraciones se presentan en pM.

La Figura 3 muestra otro resultado experimental. El péptido dimérico derivado de la proteína de superficie de la Hepatitis C inhibe la proliferación de células T de una manera dependiente de la concentración.

El péptido IS de Hepatitis C tiene la secuencia: PALSTGLIHLHQNIVDVQCGGEKEKEK

La Figura 4 muestra todavía un resultado experimental. El efecto de los péptidos diméricos derivados de Flavivirus en la proliferación de células CTLL-2. Los péptidos se acoplan a través de un enlace s-s utilizando los residuos de cisteína. FLV FUS no IS es representativo de un mutante no inmunosupresor.

Den H3: GDTAWDFGSIGGVFTSVGKCGGEKEKEK

FLV FUS no IS: DRGWGNGCGDFGKG

Apéndice

Clases de virus de ARN con envoltura que contienen patógenos humanos

Flaviviridae (fusión tipo II)

Los Flaviviridae tienen genomas de ARN de cadena sencilla lineal monopartita, de polaridad positiva, de 9,6 hasta 12,3 kilobases de longitud. Las partículas de virales están envueltas y son esféricas, de aproximadamente 40-60 nm de diámetro.

Las principales enfermedades causadas por la familia Flaviviridae incluyen:

Fiebre por Dengue

Encefalitis japonesa

Enfermedad del bosque Kyasanur

Encefalitis del valle Murray

Encefalitis de San Luis

Encefalitis transmitida por garrapatas

Encefalitis del Nilo Occidental

Fiebre amarilla

Infección por el virus de la hepatitis C

Vacunas existentes para Flaviviridae

La exitosa vacuna contra la fiebre amarilla 17D, introducida en 1937, produjo reducciones dramáticas en la actividad epidémica. A mediados del siglo XX se introdujeron vacunas eficaces para la encefalitis japonesa y para la encefalitis transmitida por garrapatas. Los eventos adversos inaceptables han provocado el cambio de una vacuna de encefalitis japonesa cerebro de ratón muerto a vacunas contra la encefalitis japonesa de segunda generación más seguras y efectivas. Estos pueden ser de uso generalizado para prevenir eficazmente esta grave enfermedad en las enormes poblaciones del norte, sur y sureste de Asia. Los virus del dengue producen muchos millones de infecciones anualmente debido a la transmisión de un exitoso vector de mosquito global. Como el control de mosquitos ha fallado, varias vacunas contra el dengue se encuentran en diferentes etapas de desarrollo. Una vacuna quimérica tetravalente que une los genes estructurales de los cuatro virus del dengue en una columna vertebral de la fiebre amarilla 17D se encuentra en las pruebas clínicas de Fase III.

Género Flavivirus

Los flavivirus comparten un tamaño común (40-65 nm), simetría (nucleocápside icosaédrica, con envoltura), ácido nucleico (sentido positivo, ARN de cadena sencilla de aproximadamente 10.000-11.000 bases) y apariencia en el microscopio electrónico.

Estos virus son transmitidos por la picadura de un artrópodo infectado (mosquito o garrapata). Las infecciones humanas con estos virus suelen ser incidentales, ya que los humanos no pueden replicar el virus con títulos lo suficientemente altos como para infectar nuevamente artrópodos y, por lo tanto, continuar el ciclo de vida del virus. Las excepciones a esto son la fiebre amarilla y los virus del dengue, que aún requieren vectores mosquito, pero que están bien adaptados a los humanos para que no dependan necesariamente de los hospedadores animales (aunque ambos continúan teniendo importantes rutas de transmisión animal).

Género Hepacivirus (especie tipo virus de la hepatitis C, el único miembro)

La hepatitis C es una enfermedad infecciosa que afecta al hígado, causada por el virus de la hepatitis C (VHC). La infección suele ser asintomática, pero una vez establecida, la infección crónica puede progresar hasta cicatrización del hígado (fibrosis) y cicatrización avanzada (cirrosis), que generalmente se manifiesta después de muchos años. En algunos casos, las personas con cirrosis desarrollarán insuficiencia hepática u otras complicaciones de la cirrosis, como cáncer de hígado o várices esofágicas y várices gástricas que amenazan la vida. El virus de la hepatitis C se transmite por contacto de sangre con sangre. La mayoría de las personas tienen pocos o ningún síntoma después de la infección inicial, pero el virus persiste en el hígado en aproximadamente el 85% de los infectados. La infección persistente se puede tratar con medicamentos, el interferón peg y la ribavirina son la terapia estándar. En general, el 51% se curan. Aquellos que desarrollan cirrosis o cáncer de hígado pueden requerir un trasplante de hígado, y el virus recurre universalmente después de que se realiza el trasplante. Se estima que 180 millones de personas en todo el mundo están infectadas con hepatitis C. No se sabe que la hepatitis C cause enfermedad en otros animales. No hay vacuna contra la hepatitis C actualmente disponible. La existencia de hepatitis C (originalmente "hepatitis no A no B") se postuló en la década de 1970 y se probó en 1989. Es uno de los cinco virus de hepatitis conocidos: A, B, C, D y E.

El virus de la hepatitis C es un virus pequeño (de 50 nm de tamaño) de ARN sentido positivo, con envoltura, de cadena sencilla. Existen seis genotipos principales del virus de la hepatitis C, que se indican numéricamente (por ejemplo, genotipo 1, genotipo 2, etc.). Con base en el gen NS5 existen tres genotipos principales y once genotipos menores. Los genotipos principales se separaron hace unos 300-400 años del virus ancestral. Los genotipos menores se separaron hace unos 200 años de sus genotipos principales. Todos los genotipos existentes parecen haber evolucionado a partir del genotipo 1 subtipo 1b.

El virus de la hepatitis C se transmite por contacto de sangre con sangre. En los países desarrollados, se estima que el 90% de las personas con infección crónica por el VHC se infectaron mediante transfusión de sangre o productos sanguíneos no seleccionados o mediante el uso de drogas inyectables o exposición sexual. En los países en vías de desarrollo, las principales fuentes de infección por VHC son los equipos de inyección no esterilizados y la infusión de sangre y productos sanguíneos inadecuadamente tamizados.

Género Pestivirus

Fusión tipo II de Togaviridae

Los Togaviridae son una familia de virus, que incluyen los siguientes géneros:

Género Alfavirus

Los alfavirus tienen un genoma de ARN de cadena sencilla sentido positivo. Existen 27 alfavirus, capaces de infectar diversos vertebrados como humanos, roedores, peces, aves y mamíferos más grandes como caballos e invertebrados. La transmisión entre especies e individuos se produce principalmente a través de mosquitos, lo que hace que los alfavirus contribuyan a la recolección de Arbovirus, o virus transmitidos por artrópodos. Las partículas de alfavirus están envueltas, tienen un diámetro de 70 nm, tienden a ser esféricas y tienen una nucleocápside isométrica de 40 nm.

Hay dos marcos de lectura abiertos (ORF) en el genoma, no estructurales y estructurales. El primero es no estructural y codifica proteínas para transcripción y replicación de ARN viral, y el segundo codifica tres proteínas estructurales: la proteína C de nucleocápside central y las proteínas de envoltura P62 y E1 que se asocian como un heterodímero. Las glicoproteínas de superficie viral ancladas a la membrana son responsables del reconocimiento del receptor y la entrada en las células objetivo mediante la fusión a la membrana. La maduración proteolítica de P62 en E2 y E3 provoca un cambio en la superficie viral. Juntas, las "espigas" de glicoproteína E1, E2 y, a veces, E3 forman un dímero E1/E2 o un trímero E1/E2/E3, en la que E2 se extiende desde el centro hacia los vértices, E1 llena el espacio entre los vértices, y E3, si está presente, está en el extremo distal de la espiga. Tras la exposición del virus a la acidez del endosoma, E1 se disocia de E2 para formar un homotrímero E1, que es necesario para que la etapa de fusión conduzca las membranas celular y viral juntas. La glicoproteína alfaviral E1 es una proteína de fusión viral clase II. La estructura del virus del bosque SemLiki reveló una estructura similar a aquella de la glicoproteína E flaviviral, con tres dominios estructurales en la misma disposición de secuencia primaria. La glicoproteína E2 funciona para interactuar con la nucleocápside a través de su dominio citoplasmático, mientras que su ectodominio es responsable de unirse a un receptor celular. La mayoría de los alfavirus pierden la proteína periférica E3, pero en los virus SemLiki permanece asociada con la superficie viral. Género Rubivirus

Género Rubivirus

Mecanismo de fusión tipo II de Bunyaviridae

Bunyaviridae es una familia de virus de ARN de cadena negativa. Aunque generalmente se encuentran en artrópodos o roedores, ciertos virus en esta familia ocasionalmente infectan a los humanos. Algunos de ellos también infectan las plantas.

Los Bunyaviridae son virus transmitidos por vectores. Con la excepción de los Hantavirus, la transmisión se produce a través de un vector artrópodo (mosquitos, garrapatas o mosca de arena). Los hantavirus se transmiten por contacto con heces de ratones ciervos. La incidencia de infección está estrechamente relacionada con la actividad del vector, por ejemplo, los virus transmitidos por mosquitos son más comunes en el verano.

Las infecciones a humanos con ciertos Bunyaviridae, tales como el virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, se asocian con altos niveles de morbilidad y mortalidad, por lo que el manejo de estos virus debe ocurrir con un laboratorio de Bioseguridad de nivel 4. También son la causa de la fiebre grave con síndrome de trombocitopenia.

El virus Hanta o fiebre hemorrágica por Hantavirus, común en Corea, Escandinavia, Rusia y el suroeste de Estados Unidos, se asocia con fiebre alta, edema pulmonar e insuficiencia pulmonar. La mortalidad es de alrededor del 55%. La reacción del anticuerpo juega un papel importante en la disminución de los niveles de viremia.

Género Hantavirus; especie tipo: virus Hantaan

Los hantavirus son virus de ARN de sentido negativo en la familia Bunyaviridae. Los humanos pueden infectarse con hantavirus a través de mordeduras de roedores, orina, saliva o contacto con productos de desecho de roedores. Algunos hantavirus causan enfermedades potencialmente fatales en humanos, fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS) y síndrome pulmonar por hantavirus (HPS), pero otros no se han asociado con enfermedades humanas. E1HPS no se puede transmitir de persona a persona. El nombre hantavirus se deriva del área del río Hantan en Corea del Sur, que proporcionó al miembro fundador del grupo: el virus Hantaan (HTNV), aislado a fines de la década de 1970 por Ho-Wang Lee y sus colegas. El HTNV es uno de los varios hantavirus que causan la HFRS, anteriormente conocida como fiebre hemorrágica de Corea.

Género Ortho Bunya virus

Los ortobunyavirus se mantienen en la naturaleza mediante ciclos de transmisión selváticos entre mosquitos hematófagos y huéspedes mamíferos susceptibles, principalmente roedores y otros mamíferos pequeños. Varios miembros del serogrupo de ortobunyavirus de California, incluidos los virus La Crosse (LAC) y Tahyna (TAH), son patógenos humanos importantes. El virus LAC es una causa importante de encefalitis pediátrica y meningitis aséptica en el medio oeste de los Estados Unidos, donde se reportan aproximadamente 100 casos al año; el virus TAH, originario de Europa central, se asocia con enfermedades febriles similares a la influenza. El virus La Crosse es un patógeno prioritario de la Categoría B del NIAID.

Los ortobunyavirus son virus de ARN de cadena negativa empacados, con un genoma tripartito compuesto por segmentos grandes (L), medios (M) y pequeños (S). El segmento M codifica tres proteínas en un solo marco de lectura abierto (ORF): dos glicoproteínas transmembrana de superficie, denominadas en este documento como Gn (G2) y Gc (G1), respectivamente, para delinear su orden en la poliproteína precursora, y NSm, una proteína de función desconocida. Se cree que Gn y Gc se asocian como un heteromultímero después de la escisión de la poliproteína. Género Phlebovirus; especie tipo: virus de la fiebre del Valle del Rift

El Phlebovirus es uno de los cinco géneros de la familia Bunyaviridae. El género Phlebovirus actualmente comprende más de 70 serotipos antigénicamente distintos, solo algunos de los cuales han sido estudiados. Los 68 serotipos conocidos se dividen en dos grupos: los virus de la fiebre del Phlebotomus (el grupo de la mosca de la arena, transmitido por las moscas de la mariquita Phlebotominae) comprende 55 miembros y el grupo de Uukuniemi (transmitido por garrapatas) comprende los 13 miembros restantes.

De estos 68 serotipos, ocho de ellos se han relacionado con enfermedades en seres humanos. Ellos son: virus Alenquer, virus Candiru, virus Chagres, virus Naples, virus Punta Toro, fiebre del Valle del Rift, virus siciliano y virus Toscana. Recientemente identificado es otro serotipo patógeno humano, el virus SFTS.

La fiebre del Valle del Rift (RVF) es una zoonosis viral (afecta principalmente al ganado doméstico, pero se puede transmitir a los humanos) y causa fiebre. Se transmite por la picadura de mosquitos infectados, típicamente los géneros Aedes o Culex. La enfermedad es causada por el virus de RVF, un miembro del género Phlebovirus (familia Bunyaviridae). La enfermedad se reportó por primera vez en el ganado de Kenia alrededor de 1915, pero el virus no se aisló hasta 1931. Los brotes de RVF ocurren en África subsahariana, con brotes poco frecuentes (pero a veces severamente, en Egipto en 1977-78, varios millones de personas se infectaron y miles murieron durante una epidemia violenta. En Kenia, en 1998, el virus cobró la vida de más de 400 kenianos. En septiembre de 2000 se confirmó un brote en Arabia Saudita y Yemen).

En humanos, el virus puede causar varios síndromes diferentes. Por lo general, los pacientes no presentan síntomas o solo tienen una enfermedad leve con fiebre, dolor de cabeza, mialgia y anomalías hepáticas. En un pequeño porcentaje de casos (<2%), la enfermedad puede progresar a síndrome de fiebre hemorrágica, meningoencefalitis (inflamación del cerebro) o que afecta los ojos. Los pacientes que se enferman generalmente experimentan fiebre, debilidad generalizada, dolor de espalda, mareos y pérdida de peso al inicio de la enfermedad. Por lo general, los pacientes se recuperan en un plazo de 2 a 7 días después del inicio.

Aproximadamente el 1% de los enfermos humanos mueren de la enfermedad. Entre el ganado el nivel de mortalidad es significativamente mayor. En el ganado preñado infectado con RVF existe el aborto de prácticamente el 100% de los fetos. Una epizootia (epidemia de enfermedad animal) de RVF suele estar indicada por primera vez por una ola de abortos inexplicables.

Fusión tipo I de Orthomyxoviridae

Los Orthomyxoviridae (orthos, palabra griega para "directo"; myxa, palabra griega para "moco") son una familia de virus de ARN que incluye cinco géneros: Influenzavirus A, Influenzavirus B, Influenzavirus C, Isavirus y Thogotovirus. Un sexto ha sido recientemente descrito. Los tres primeros géneros contienen virus que causan influenza en vertebrados, incluidas las aves (véase también influenza aviar), los seres humanos y otros mamíferos. Los isavirus infectan al salmón; los Thogotovirus infectan a los vertebrados e invertebrados, como los mosquitos y el piojo de mar.

Los tres géneros de Influenzavirus, que se identifican por diferencias antigénicas en su nucleoproteína y proteína de matriz infectan a los vertebrados de la siguiente manera:

^oInfluenzavirus A infecta a humanos, otros mamíferos y aves, y causa todas las pandemias de gripe

^oInfluenzavirus B infecta a humanos y focas

^oInfluenzavirus C infecta a humanos y cerdos

Mecanismo de fusión tipo I de Paramyxoviridae

La proteína de fusión F se proyecta desde la superficie de la envoltura como un trímero, y media la entrada celular induciendo la fusión entre la envoltura viral y la membrana celular por fusión de clase I. Una de las características definitorias de los miembros de la familia Paramyxoviridae es el requisito de un pH neutro para la actividad fusogénica. Una serie de enfermedades humanas importantes son causadas por paramixovirus. Estas incluyen las paperas y el sarampión, que causaron 745.000 muertes en 2001 y el virus sincitial respiratorio (VSR), que es la causa principal de bronquiolitis y neumonía en bebés y niños. Los virus de la parainfluenza son la segunda causa más común de enfermedad del tracto respiratorio en bebés y niños. Pueden causar neumonía, bronquitis y tosferina en niños y ancianos.

El Metaneumovirus humano, descrito inicialmente en aproximadamente 2001, también está implicado en la bronquitis, especialmente en niños. El género del Paramixovirus también es responsable de una variedad de enfermedades en otras especies animales, como el virus del moquillo canino (perros), el virus del moquillo focino (focas), el morbillivirus del cetáceo (delfines y marsopas), el virus de la enfermedad de Newcastle (aves) y el virus de la peste bovina (ganado). Algunos paramixovirus, como los henipavirus, son patógenos zoonóticos, que aparecen naturalmente en un huésped animal, pero también pueden infectar a los humanos.

El virus Hendra (HeV) y el virus Nipah (NiV) en el género Henipavirus han surgido en humanos y ganado en Australia y el sudeste asiático. Ambos virus son contagiosos, altamente virulentos y capaces de infectar varias especies de mamíferos y causar enfermedades potencialmente fatales. Debido a la falta de una vacuna con licencia o terapias antivirales, HeV y NiV se designan como agentes de nivel de bioseguridad 4 (BSL). La estructura genómica de ambos virus es la de un paramixovirus típico.

Género Pneumovirinae

• El género Pneumovirus (especie tipo virus sincitial respiratorio humano, otros incluyen virus sincitial respiratorio bovino).

• El virus sincitial respiratorio humano (VSR) es un virus que causa infecciones del tracto respiratorio. Es la principal causa de infecciones del tracto respiratorio inferior y visitas al hospital durante la infancia y la niñez. Existe un medicamento profiláctico (no una vacuna) para bebés prematuros (menores de 35 semanas de gestación) y bebés con un defecto cardíaco congénito (CHD) o displasia broncopulmonar (BPD). El tratamiento se limita a la atención de apoyo, incluida la terapia de oxígeno.

• En climas templados hay una epidemia anual durante los meses de invierno. En climas tropicales, la infección es más común durante la temporada de lluvias.

• En los Estados Unidos, el 60% de los bebés se infectan durante su primera temporada de VSR y casi todos los niños se habrán infectado con el virus entre los 2 y 3 años de edad. http://en.wikipedia.org/wiki/Respiratory_syncytial_virus -cite_note-Glezen86-0. De las personas infectadas con VSR, el 2-3% desarrollará bronquiolitis, lo que requerirá hospitalización. La infección natural con VSR induce una inmunidad protectora que se desvanece con el tiempo, posiblemente más que otras infecciones virales respiratorias, y por lo tanto las personas pueden infectarse varias veces. A veces, un bebé puede infectarse sintomáticamente más de una vez, incluso dentro de una temporada de VSR. Las infecciones graves por VRS se han encontrado cada vez más entre los pacientes de edad avanzada.

• El VSR es un virus de ARN de cadena sencilla, sentido negativo de la familia Paramyxoviridae, que incluye virus respiratorios comunes como los que causan el sarampión y las paperas. VSR es un miembro de la subfamilia de paramixovirus Pneumovirinae. Su nombre proviene del hecho de que las proteínas F en la superficie del virus hacen que las membranas celulares de las células cercanas se fusionen, formando sincitios.

Fusion tipo 1 de Coronaviridae

Los coronavirus infectan principalmente el tracto respiratorio superior y el tracto gastrointestinal de mamíferos y aves. De cuatro a cinco cepas diferentes de coronavirus actualmente conocidas infectan a los humanos. El coronavirus humano más publicitado, el SARS-CoV que causa SARS, tiene una patogénesis única porque causa infecciones en el tracto respiratorio superior e inferior y también puede causar gastroenteritis. Se cree que los coronavirus causan un porcentaje significativo de todos los resfriados comunes en adultos humanos. Los coronavirus causan resfriados en los seres humanos principalmente en las temporadas de invierno y principios de la primavera. La importancia y el impacto económico de los coronavirus como agentes causales del resfriado común son difíciles de evaluar porque, a diferencia de los rinovirus (otro virus del resfriado común), los coronavirus humanos son difíciles de cultivar en el laboratorio. Los coronavirus también causan una serie de enfermedades en animales de granja y mascotas domesticadas, algunas de las cuales pueden ser graves y son una amenaza para la industria agrícola. Los coronavirus de animales de granja económicamente significativos incluyen el coronavirus porcino (coronavirus de gastroenteritis transmisible, TGE) y el coronavirus bovino, que ambos producen diarrea en animales jóvenes. Coronavirus felino: 2 formas, el coronavirus entérico felino es un patógeno de importancia clínica menor, pero la mutación espontánea de este virus puede causar peritonitis infecciosa felina (FIP), una enfermedad asociada con una alta mortalidad. Hay dos tipos de coronavirus canino (CCoV), uno que causa una enfermedad gastrointestinal leve y uno que se ha encontrado que causa una enfermedad respiratoria. El virus de la hepatitis del ratón (MHV) es un coronavirus que causa una enfermedad murina epidémica con alta mortalidad, especialmente entre las colonias de ratones de laboratorio. Antes del descubrimiento del SARS-CoV, el MHV había sido el coronavirus mejor estudiado tanto in vivo como in vitro, así como a nivel molecular. Algunas cepas de MHV causan una encefalitis desmielinizante progresiva en ratones que se ha utilizado como modelo murino para la esclerosis múltiple. Se han realizado importantes esfuerzos de investigación para dilucidar la patogénesis viral de estos coronavirus animales, especialmente por virólogos interesados en enfermedades veterinarias y zoonóticas.

Coronavirus de SARS

El SARS está más estrechamente relacionado con los coronavirus del grupo 2, pero no se segrega en ninguno de los otros tres grupos de coronavirus. Se determinó que el SARS era una división temprana de los coronavirus del grupo 2 en función de un conjunto de dominios conservados que comparte con el grupo 2. Una diferencia principal entre el coronavirus del grupo 2 y el SARS es la subunidad de replicasa nsp3 codificada por ORF1a. El SARS no tiene una proteinasa tipo papaína 1.

Arenaviridae: la glicoproteína G2 es una fusión tipo I

Arenavirus es un género de virus que infecta roedores y ocasionalmente humanos. Se sabe que al menos ocho Arenavirus causan enfermedades humanas. Las enfermedades derivadas de los Arenavirus varían en gravedad. La meningitis aséptica, una enfermedad humana grave que causa inflamación en el cerebro y la médula espinal, puede deberse a la infección por el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV). Los síndromes de fiebre hemorrágica se derivan de infecciones como el virus Guanarito (GTOV), el virus Junin (JUNV), el virus Lassa (LASV) que causa la fiebre de Lassa, el virus Machupo (MACV), el virus Sabia (SABV) o el virus Whitewater Arroyo (WWAV)[1]. Los Arenavirus se dividen en dos grupos; Los del Viejo Mundo o los del Nuevo Mundo. Las diferencias entre estos grupos se distinguen geográficamente y genéticamente. Debido a la asociación epidemiológica con roedores, algunos Arenavirus y Bunyavirus se designan como Robovirus.

• Complejo de virus LCMV-Lassa (Viejo Mundo):

^ovirus Ippy

^ovirus Lassa

^ovirus Lujo

^ovirus de coriomeningitis linfocítica

La infección por LCMV se manifiesta en una amplia gama de síntomas clínicos, e incluso puede ser asintomática para individuos inmunocompetentes. El inicio suele ocurrir entre una o dos semanas después de la exposición al virus y es seguido por una enfermedad febril bifásica. Durante la fase inicial o prodrómica, que puede durar hasta una semana, los síntomas comunes incluyen fiebre, falta de apetito, dolor de cabeza, dolores musculares, malestar general, náuseas y/o vómitos. Los síntomas menos frecuentes incluyen dolor de garganta y tos, así como dolor en las articulaciones, el pecho y la parótida. El inicio de la segunda fase ocurre varios días después de la recuperación y consiste en síntomas de meningitis o encefalitis. Los hallazgos patológicos durante la primera etapa consisten en leucopenia y trombocitopenia. Durante la segunda fase, los hallazgos típicos incluyen niveles elevados de proteínas, aumento en el recuento de leucocitos o una disminución en los niveles de glucosa del líquido cefalorraquídeo.

Infección congénita

La coriomeningitis linfocítica es una preocupación particular en obstetricia, ya que se sabe que ocurre transmisión vertical. Para las madres inmunocompetentes, no existe una amenaza significativa, pero el virus tiene efectos dañinos en el feto. Si la infección ocurre durante el primer trimestre, el LCMV aumenta el riesgo de aborto espontáneo. La infección congénita tardía puede provocar malformaciones, como coriorretinitis, calcificaciones intracraneales, hidrocefalia, microcefalia o macrocefalia, retraso mental y convulsiones. Otros hallazgos incluyen cicatrices coriorretinales, atrofia óptica y cataratas. La mortalidad infantil es aproximadamente del 30%. Entre los sobrevivientes, dos tercios tienen anormalidades neurológicas duraderas. Si una mujer ha estado en contacto con un roedor durante el embarazo y se manifiestan síntomas de LCM, se dispone de un análisis de sangre para determinar la infección previa o actual. Una historia de infección no representa un riesgo para futuros embarazos.

Transmisión de humano a humano a través de la donación de órganos

En mayo de 2005, cuatro receptores de trasplantes de órganos sólidos contrajeron una enfermedad que luego se diagnosticó como coriomeningitis linfocítica. Todos recibieron órganos de un donante común y, dentro de un mes del trasplante, tres de los cuatro receptores habían muerto como resultado de la infección viral. La investigación epidemiológica localizó la fuente de un hámster que el donante de órganos había comprado recientemente en una tienda de mascotas de Rhode Island. Un caso similar ocurrió en Massachusetts en 2008. Actualmente, no hay una prueba de infección por LCMV que esté aprobada por la Administración de Fármacos y Alimentos para la evaluación de donantes de órganos. El Informe semanal de morbilidad y mortalidad aconseja a los proveedores de atención médica "considerar la infección por LCMV en pacientes con meningitis aséptica y encefalitis y en receptores de trasplantes de órganos con fiebre inexplicable, hepatitis o insuficiencia orgánica multisistémica".

Hepadnaviridae: mecanismo de fusión ni tipo I ni tipo II

Los Hepadnavirus son una familia de virus que pueden causar infecciones hepáticas en humanos y animales. Existen dos géneros reconocidos.

Los Hepadnavirus tienen genomas muy pequeños de ADN circular parcialmente de cadena doble y parcialmente de cadena sencilla. El genoma consiste en dos cadenas de ADN desiguales. Una tiene una orientación sentido negativo y la otra, más corta, tiene una orientación sentido positivo.

Como es un virus del grupo 7, la replicación implica un ARN intermedio. Los tres marcos principales de lectura abierta están codificados (ORF) y el virus tiene cuatro genes conocidos que codifican la proteína central, la polimerasa del virus, los antígenos de superficie (preS1, preS2 y S) y la proteína X. Se piensa que la proteína X no es estructural; sin embargo, su función y significado son poco entendidos.

Rhabdoviridae: Mecanismo de fusión ni tipo I ni tipo II

Los Rabdovirus portan su material genético en forma de ARN de cadena sencilla sentido negativo. Por lo general, contienen genes para cinco proteínas: proteína grande (L), glicoproteína (G), nucleoproteína (N), fosfoproteína (P) y proteína de matriz (M). Los rabdovirus que infectan a los vertebrados tienen forma de bala. El rabdovirus prototípico y mejor estudiado es el virus de la estomatitis vesicular. Los rabdovirus son patógenos importantes de animales y plantas. Los rabdovirus incluyen RaV (virus de la rabia), VSV (virus de la estomatitis vesicular). Los rabdovirus se transmiten a los hospedadores mediante artrópodos, como pulgones, parásitos, saltamontes, moscas negras, moscas de la arena y mosquitos.

Referencias adicionales

1. Sapir, A., et al., Viral and developmental cell fusion mechanisms: conservation and divergence. Dev Cell, 2008. 14(1): páginas 11-21.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para identificar un dominio inmunosupresor en la proteína de fusión de un virus de ARN con envoltura que tiene una membrana lipídica, comprendiendo dicho método:

a. Identificar al menos un dominio bien conservado entre el grupo que consiste en los dominios de membrana de la proteína de fusión y los dominios de superficie de la proteína de fusión;

1. alinear candidatos de virus de virus dentro de un orden usando una herramienta de alineación;

d. Confirmar la actividad inmunosupresora de dicho al menos un péptido opcionalmente dimerizado o multimerizado probando dicho al menos un péptido opcionalmente dimerizado o multimerizado para la actividad inmunosupresora.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la identificación de dicho al menos un dominio bien conservado se realiza entre el grupo que consiste en los dominios de superficie de la proteína de fusión en una o más de las diferentes conformaciones de la proteína de fusión que experimenta fusión.

3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el virus de ARN con envoltura es de la familia Orthomyxoviridae.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el virus de ARN con envoltura es del género del virus de la Influenza A.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el virus de ARN con envoltura es de la especie del virus de la influenza A.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el virus de ARN con envoltura se selecciona del grupo de cepas del virus que consiste en H1 a H16 de Influenza A.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el virus de ARN con envoltura se selecciona del grupo de cepas de virus que consiste en H3, H7 y H10 de Influenza A.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho al menos un dominio bien conservado comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO. 4.