KR20000070914A - 안정화된 양이온 형질감염제(들)/핵산 입자의 제형 - Google Patents

안정화된 양이온 형질감염제(들)/핵산 입자의 제형 Download PDF

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Abstract

본 발명은 형질감염제 및 핵산 이외에 시간이 지남에 따라 입자의 응집을 막기에 충분한 양의 적어도 하나의 비이온 계면활성제를 포함함을 특징으로 하는, 안정화된 양이온 형질감염제(들)/핵산 복합체 입자를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 계면활성제는 폴리옥시알킬렌 또는 이의 유도체이다.

Description

안정화된 양이온 형질감염제(들)/핵산 입자의 제형{FORMULATION OF STABILISED CATIONIC TRANSFECTION AGENT(S)/NUCLEIC ACID PARTICLES}
다수의 유전 질환은 발현시의 결함 및/또는 이상, 즉 결손 또는 과잉의, 하나 이상의 핵산 발현과 관련된다. 유전자 요법의 주요 목적은 클로닝 유전자의 생체내 또는 시험관내에서 세포 발현을 통한 이러한 타입의 유전적 이상을 치유하는데 있다.
현재, 이러한 타입의 유전 정보의 세포내 전달을 위한 몇몇 방법이 제안되고 있다. 이들 중 한 방법은, 특히, 화학 또는 생화학적 벡터의 사용에 기초한다. 합성 벡터는 두가지 주요 기능을 가진다: 형질감염될 DNA의 복합체 형성 및 이의 세포 부착 및 원형질막, 적절한 경우에는, 두 핵산막을 가로지르는 통과 촉진. 개발된 합성 벡터 중, 폴리라이신 및 DEAE-덱스트란 타입 또는 리포펙탄트의 양이온 중합체가 가장 유리하다.
리포펙탄트 타입의 양이온 형질감염제, 좀더 정확하게는 양이온 지질의 사용에 기초한 기술 개발과 함께 이러한 양식의 형질감염에 있어 주된 진보가 달성되었다. 따라서 양으로 하전된 양이온 지질, N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)는 리포솜 또는 작은 비히클의 형태로, 음으로 하전된 DNA와 자발적으로 충돌하여, 음으로 하전되도록 융합할 수 있는 지질-DNA 복합체를 형성하고, 세포막과 융합할 수 있는 지질-DNA 복합체를 형성한 다음 DNA의 세포내 전달을 가능케 함이 입증되었다.
DOTMA 이래로, 기타 양이온 지질이 이러한 구조 모델상에서 발전했다: "스페이서" 아암에 의해 아미노 그룹과 결합된 친지성 그룹. 이들 중, 좀더 구체적으로는 친지성 그룹으로, 두개의 지방산 또는 콜레스테롤 유도체를 포함하고, 추가로, 적절한 경우, 아미노 그룹으로, 4급 암모늄 그룹을 포함하는 것들이 언급될 수 있다. DOTAP, DOBT 또는 ChOTB가 특히 이러한 부류의 양이온 지질의 대표격으로 언급될 수 있다. DOSC 및 ChOSC와 같은 기타 화합물은 4급 암모늄 그룹 대신 콜린 그룹의 존재로 특징지워진다.
또다른 부류의 리포펙탄트, 리포폴리아민도 기술되고 있다. 일반적으로, 이는 소위 스페이서 영역을 통해, 친지성 영역과 합쳐진 적어도 하나의 친수성 폴리아민 영역을 포함하는 양쪽성 분자이다. 양으로 하전된 리포폴리아민의 폴리아민 영역은 음으로 하전된 핵산과 가역적으로 결합할 수 있다. 이러한 상호작용은 핵산을 상당한 정도로 응집시킨다. 친지성 영역은 지질막으로 형성된 핵지질 입자를 코팅함으로써 이러한 이온 상호작용을 외부 매질에 대해 둔감하도록 해준다. 이러한 타입의 화합물 중, 양이온 그룹은 4개의 암모늄 그룹(이 중 둘은 1급이고 둘은 2급임)을 함유하는 라디칼 L-5-카복시스퍼민으로 나타내질 수 있다. 화합물 DOGS 및 DPPES가 여기에 속한다. 이들 리포폴리아민은 1차 내분비 세포의 형질감염에 가장 특히 효과적이다. 이 마지막 화합물 류의 대표적인 것으로, 좀더 구체적으로는 특히 특허 출원 WO/17823 및 WO97/18185에 기재된 리포폴리아민이 언급될 수 있다.
그러나, 이들 합성 벡터의 효율은 특히 핵산의 복합체 형성 면에서, 좀더 정확하게는 이들 핵지질 복합체 입자의 안정성의 관점에서 개선의 여지가 있다. 실제로, 기존 핵산/양이온 형질감염제 제형으로는, 복합체 입자의 응집 현상이 빈번하고 빠르게 관찰된다. 이러한 응집체는 분명히 치료 형질감염에는 거의 적합하지 않은 크기를 소유한다. 지금까지 이러한 타입의 침전 현상을 극복하기 위해 제안된 해결책 중 하나는 제형중에 양이온 형질감염제, 예를 들면 리포펙탄트를, 과량, 즉 10 이상의 리포펙탄트/핵산 전하비로 도입하는데 있다. 이러한 해결책이 항상 효과적인 것은 아니라는 사실과 함께, 이것이 안전성의 관점에서 완전히 만족스럽지도 않다. 리포펙탄트 및 양이온 중합체와 같은 양이온 형질감염제는 다량의 경우, 그 자체로 세포에 혼입될 때 비교적 독성을 나타내는 위험을 지닌 화합물이다.
따라서 치료적인 면에서 감소된 전하비를 소유하고 그럼에도 불구하고 응집되지 않은 형태로 시간이 경과함에 따라 안정화된 양이온 형질감염제/핵산 제형을 구축하는 것이 특히 유리할 것이다. 그러나, 앞서 언급했듯이, 이러한 전하비에 상응하는 핵산/리포펙탄트 농도 지대는 일반적으로 불안정한 물리적 상태와 관련된다. 핵지질 입자의 응집 현상이 빠르게 관찰된다. 추가로, 기존에 양이온 형질감염제/핵산 제형에 사용된 NaCl 타입의 염의 존재는 특정 농도에서, 핵지질 입자의 침전을 유도할 수 있음이 알려졌다. 따라서, 염의 농도가 높을수록, 침전이 관찰되는 형질감염제의 농도 범위도 커진다.
본 발명은 입자가 비이온 표면 활성제에 의해 크기가 안정화되는 양이온 형질감염제(들)/DNA 배합물 및 유전자 요법에서 이들의 용도에 관한 것이다.
도 1: 시간의 함수로서, 전하비 (+/-) 2.5에서, RPR 120535/DNA 복합체의 크기 변화에 대한 폴옥살콜의 효과.
도 2: 시간의 함수로서, 전하비 (+/-) 2.5에서, RPR 120531/DNA 복합체의 크기 변화에 대한 폴옥살콜의 효과.
도 3: RPR 120535/DNA 배합물에 대한 폴옥살콜의 효과.
도 4: 전하비 (+/-) 2.5에서, RPR 120535/DNA 복합체의 루시퍼라제 활성(RLU/용출물 5 ㎕)에 미치는 폴옥살콜의 효과.
도 5: 파트 A: 폴옥살콜의 부재 또는 존재하에 RPR 120535/DNA 복합체 구조의 개략적인 설명.
파트 B: 폴옥살콜의 부재 및 존재하에 BGTC/DNA 복합체 구조의 개략적인 설명.
재료
하기 실시예에서 사용된 표면 활성제는 화학식 OH(CH2CH2O)75(CH(CH3)CH2O)30(CH2CH2O)75H의 폴옥살콜이다. 이는 상표명 Pluronic F68하에 시판된다. 하기 실시예에서 사용된 폴옥살콜 공급액은 물에 10%(중량/용적)이다.
샘플 제조에 이용된 DNA는 PCT/FR 96/01414에 기재된 pXL2774 플라스미드이다. 이는 pH 7.5의 Tris/EDTA 완충액(10 mM/0.1 mM)에서 0.7 mg/㎖의 농도로 사용된다.
사용된 양이온 지질은 하기와 같다: H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17CH3]2(RPR 120535)(아세테이트염) 및 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)17CH3](RPR 120531)(트리플루오로아세트산염), 둘모두 PCT/FR 96/01774에 기재되어있다. 이들은 물에서 5 mM의 농도로 이용되고 50℃에서 25분간 가열하여 용해된 다음, 용액은 실온으로 냉각된다.
방법
800 ㎕의 다양한 용액으로 충진된 플라스틱 셀(4개의 투명면)를 이용하여, Coulter N4Plus로 유체역학 직경을 측정하고, 이는 90℃에서 단일모드 양식으로 수행된다.
각각 260 nm 및 590 nm의 여기 및 방출 파장을 이용하여, Perkin Elmer LS50B상에서 형광을 측정한다. 여기 및 방출을 위한 슬릿 폭을 5 nm로 세팅한다. 5 ㎍의 에티디움 브로마이드/㎖의 최종 농도를 첨가한 후 형광값을 기록한다.
0.5 mg의 DNA/㎖를 함유하는 7 ㎕의 제조 샘플을 이용하여 저온-투과 전자 현미경(저온-TEM) 실험을 수행하며, 이 샘플은 구멍 난 막으로 덮힌 탄소-코팅된 구리 그리드상에 놓인다. 액상수를 유리화된 물로 전환시키기 위해 그리드를 액체 에탄에 함침시킨다. 다음, 이 그리드를 액상 질소로 냉각된 표본 홀더안에 비치하고 현미경(Philips CM12)에 위치시켜 관찰한다.
D43 라인상의 Orsay(France) 중 신크로트론(LURE)으로 저각 X-선 회절 실험을 수행한다. 샘플을 0.5 mg DNA/㎖로 제조한 다음 원심분리한다. 두개의 창이 캡톤으로 구성된 셀에 펠릿을 놓아둔다. 게르마늄-함유 모노크로메이터(111 반사)는 0.138 nm의 파장을 선택한다.
30일간 자란 마우스의 꼬리 정맥에, 양이온 지질 벡터와 합쳐진 0.2 mg DNA/㎖를 함유하는 200 ㎕의 용액을 주사함으로써 생체내 형질감염을 수행한다. 주사 24 시간 후, 마우스를 인도적으로 죽인 다음 각종 기관을 수거한다(폐, 간, 심장, 신장, 비장). 이들 기관을 Ultraturax를 이용하여 용출 완충액에서 분쇄한다. 얻어진 분쇄 산물을 원심분리한 다음, 상등액 10 ㎕를 모아 루시퍼라제 활성을 평가한다.
본 발명의 목적은 감소된 양의 벡터에 대한 안전성 관점 및 감소된 전하가 주어진 기타 단백질과의 충돌 관점에서 유리한, 이들 양이온 형질감염제/핵산 농도 지대의 값을 증진시키는데 있다. 실제로, 복합체가 비교적 낮은 전하를 가질 경우, 생체내에서 혈청 단백질과 충돌 위험은 상당히 줄어든다. 이는 물론 생체내에서 핵산의 전달에 특히 유리하다[참조문헌: Remy, J.S. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995; 92, 1744-1748]. 다수의 논문은 혈청 단백질과 리포솜간의 이러한 타입의 상호작용에 관해 언급하고 있다[참조문헌: Senior, J.H. et al. Biochim. Biophys. Acta 1991, 1070, 173-179; Hernandez-Caselles, T et al. Molecular and cellular Biochemistry 1993, 120, 119-126; Oku, N. et al. Biochim. Biophys. Acta 1996, 1280, 149-154]. 유전자 요법에 사용된 DNA-기제 복합체에 의한 보체 시스템의 활성화에 관한 자료도 공개되어있다. 보체 활성화의 정도는 양이온/DNA 비(또는 전하비)에 좌우된다. 후자 현상은 특히 폴리라이신, 리포스퍼민(예를 들면 DOGS)과 같은 다가양이온의 경우에 사실이다. 보체 활성화는 DOTAP, DC-Chol 또는 DOTMA와 같은 4급 암모늄에 대한 전하비에는 덜 민감하다[참조문헌: Plank, C. et al. Human Gene Therapy 1996, 7, 1437-1446].
결국, 치료적인 관점에서 고 농도의 핵산 및/또는 감소되거나 심지어 중성에 가까우면서 추가로, 콜로이드 타입의 유체 형태에서 안정화되는, 즉 비응집되는 전하비(이 두 특성은 명백하게는 본래 비조화적임)에서 양이온 형질감염제/핵산 복합체 제형을 구축하는 것이 특히 유리할 것이다.
뜻밖에도, 본 출원인은 본래 불안정한, 즉 빠르게 응집체를 형성할 수 있는 양이온 형질감염제(들)/핵산 복합체의 입자에 비이온 표면 활성제의 첨가가 이러한 현상을 효과적으로 차단하여 160 nm 이하의 입자 크기에서 복합체 입자를 안정화시킬 수 있음을 입증하였다.
본 발명의 제 1 주제는 추가로, 160 nm 이하의 크기에서 입자 크기를 안정화시키기에 충분한 양으로 적어도 하나의 비이온 표면 활성제를 혼입함을 특징으로 하는, 양이온 형질감염제(들)/핵산 복합체의 입자를 포함하는 유전자 요법에 유용한 조성물이다.
본 발명의 경우, 안정화된 입자는 특히 이들 입자가 용액에서 분산된 상태로 유지될 경우 크기가 시간의 경과에 따라 달라지지 않는 입자를 나타내는 것으로 한다. 기존 제형과는 달리, 즉 비이온 표면 활성제 없이, 청구된 조성물은 특히 이러한 분산에서 지적된 응집 타입의 변형없이 장시간 동안 저장될 수 있다. 이렇게 안정화된 입자의 크기는 일반적으로 50 내지 160 nm, 바람직하게는 75 내지 150 nm로 달라진다.
청구된 비이온 표면 활성제의 부재하에, 청구된 조성물내에 존재하는 복합체 입자는 자발적으로 크기가 160 nm 이상의 입자 응집체가 된다.
또한, 본 출원인은 본 발명에 따른 조성물이 교대로 지질 이중층과 이 사이에 삽입된 DNA 층을 지닌 라멜라 구조를 소유함을 입증했다.
본 발명에 따른 비이온 표면 활성제는 바람직하게는 적어도 하나의 소수성 단편 및 적어도 하나의 친수성 단편을 소유한다. 소수성 부위는 지방족 체인, 폴리옥시알킬렌, 알킬리덴 폴리에스테르, 수지상 벤질 폴리에테르 헤드를 지닌 폴리에틸렌 글리콜, 또는 콜레스테롤로 적당할 수 있다. 친수성 부위로는, 폴리옥시알킬렌, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈 또는 사카라이드가 가능하다.
바람직하게는, 본 발명의 구조내에 사용된 표면 활성제는 비이온 폴리올에서 나온 것이거나 좀더 상세하게는 상이한 길이 및/또는 형태의 알킬렌 그룹을 지닌 폴리옥시알킬렌에서 유래되거나 또는 중합체내의 다른 것들에서 유래된다.
좀더 바람직하게는, 이는 화학식 HO(CH2CH2O)a(CH(CH3)CH2O)b(CH2CH2O)cH에 상응하고, 여기서 a, b 및 c는 서로 독립적으로, 20 내지 100 사이에서 변할 수 있는 정수를 나타낸다.
비이온제는 바람직하게는 본 발명에 따른 조성물내에 조성물의 0.01% 내지 10 중량/용적%의 농도, 좀더 바람직하게는 0.02% 내지 5 중량/용적%의 농도로 존재한다.
몇몇 이유로 인해 이러한 비이온 표면 활성제의 존재는 복합체와의 배합시 유리하다:
본 발명에 따르면, 양이온 형질감염제(들) 및 핵산은 물론 응집 현상의 발달에 호적한 전하비로 조성물내에 존재한다. 이는 양이온 형질감염제(들)에 의해 운반된 양전하가 복합체 형성된 핵산에 의해 운반된 음전하에 비해 단지 약간 과량이거나, 겨우 이들을 충분히 균형잡을 정도임을 암시한다. 이러한 전하비는 생체내에서 특히 유리한데 이는 혈청 또는 기타 단백질 예를 들면 알부민과의 상호작용 면에서 덜 손상적이고 안전성 면에서 좀더 유리하기 때문이다. 설명하자면, 이 전하비는 바람직하게는 1 내지 6 사이에서 변하고, 이는 좀더 바람직하게는 4 이하이다.
추가로, 이러한 표면 활성제는 생체내 투여에 충분히 적합하다. 본 발명에 따른 제형의 경우, 실제로 처리될 세포 중으로 주사하기 이전에 이 비이온 표면 활성제를 제거할 필요는 없다.
결국, 본 발명에 따른 조성물은 유리하게 저장될 수 있다. 비이온 표면활성제의 존재는 효과적으로 조성물 내부의 침전 현상을 차단한다.
본 발명에 따른 바람직한 표면 활성제의 예로는, 가장 구체적으로는 화학식 OH(CH2CH2O)a(CH(CH3)CH2O)b(CH2CH2O)cH(여기서 a는 75, b는 30, c는 75임)의 화합물이 언급될 수 있다.
기타 바람직한 비이온 표면 활성제는 수지상 벤질 폴리에테르 헤드를 지닌 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 알콜 또는 폴리옥시에틸렌 노닐페닐 에테르이다.
양이온 형질감염제는 바람직하게는 본 발명에 따르면, 양이온 중합체 및 리포펙탄트를 말한다.
좀더 특히 리포펙탄트의 경우, 이는 본 발명을 위해 핵산의 세포 형질감염에 관해 활성제로 이미 제안된, 지질 특성 및 양전하를 지닌 이러한 명칭하의 화합물 또는 혼합물을 포함하는 것으로 의도된다.
일반적으로, 이들은 친수성 영역과 결합되거나 해리된 적어도 하나의 친지성 영역을 포함하는 양쪽성 분자이다.
첫번째 류의 화합물의 대표적인 예로는, 특히 양이온 리포솜을 형성할 수 있는 지질 혼합물이 제안될 수 있다. 이들 제형은 POPC, 포스파티딜세린, 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 리포펙타민 또는 하기에서 정의된 양이온 지질과 합쳐진 말레이미도페닐부티릴포스파티딜에탄올아민을 함유할 수 있다.
본 발명의 특정 양태에 따르면, 사용된 리포펙탄트제는 양이온 영역을 소유한다.
구조 모델: 소위 "스페이서" 아암을 통해 아미노 그룹과 결합된 친지성 그룹상에 구성된 이러한 타입의 양이온 지질의 예로는 좀더 구체적으로는 DOTMA가 언급될 수 있고 또한 친지성 그룹으로, 두개의 지방산 또는 콜레스테롤 유도체를 포함하는 것들, 및 추가로, 적절한 경우, 아미노 그룹으로, 4급 암모늄 그룹을 포함하는 것들이 언급될 수 있다. 특히 이러한 부류의 양이온 지질의 대표적인 것으로 DOTAP, DOBT 또는 ChOTB가 언급될 수 있다. DOSC 및 ChOSC와 같은 기타 화합물은 4급 암모늄 그룹 대신 콜린 그룹의 존재를 특징으로 한다.
유리하게도, 본 발명에 적당한 리포펙탄트는 또한 폴리아민 영역이 화학식 H2N-(-(CH)m-NH-)n-H (여기서 m은 2 이상의 정수이고 n은 1 이상의 정수임)에 상응하는 리포폴리아민 중에서 선택될 수 있고, m의 경우 2 아민간의 상이한 탄소 그룹 사이에서 달라질 수 있으며, 이 폴리아민 영역은 콜레스테롤 타입, 또는 라멜라 또는 육각형 상을 형성할 수 있는 천연 또는 합성 지질의 포화 또는 불포화 탄화수소 체인의 친지성 영역과 공유 결합된다. 이 폴리아민 영역은 좀더 바람직하게는 스퍼민 또는 핵산-결합성을 보존하고 있는 이의 유사체 중 하나로 표현된다.
특허 출원 EP 394 111은 본 발명의 구조내에 사용될 수 있는 이러한 부류의 리포폴리아민에 관해 기술하고 있다. 이들 리포폴리아민의 대표적인 예로는, 좀더 구체적으로는 디옥타데실아미도글리실 스퍼민(DOGS) 및 팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카복시스퍼밀아미드(DPPES)가 언급될 수 있다.
특허 출원 WO 96/17823에 기재된 리포폴리아민도 본 발명에 따라 유리하게 사용될 수 있다. 이들은 하기 화학식으로 표현된다.
상기 식에서,
R은를 나타내고,
X 및 X'는 각각 독립적으로, 산소 원자, 메틸렌 그룹 -(CH2)q-(q는 0,1,2 또는 3임), 또는 아미노 그룹 -NH- 또는 -NR'-(R'는 C1내지 C4알킬 그룹을 나타냄)를 나타내며,
Y 및 Y'는 서로 독립적으로, 메틸렌 그룹, 카보닐 그룹 또는 그룹 C=S를 나타내며,
R3, R4및 R5는 서로 독립적으로, 수소 원자 또는 치환 또는 비치환 C1내지 C4알킬 라디칼을 나타내고, 이때 p는 0 내지 5 사이에서 변할 수 있으며,
R6는 콜레스테롤 유도체 또는 디알킬아미노 그룹 -NR1R2(R1및 R2는 서로 독립적으로, 포화 또는 불포화, 직쇄 또는 측쇄 C12내지 C22지방족 라디칼을 나타냄)를 나타낸다.
이들 리포폴리아민의 대표적인 예로, 가장 구체적으로는 2,5-비스(3-아미노프로필아미노)펜틸(디옥타데실카바모일메톡시)아세테이트 및 1,3-비스(3-아미노프로필아미노)-2-프로필(디옥타데실카바모일메톡시)아세테이트가 언급될 수 있다.
결국, 본 발명의 구조내에서 값이 증가되는 신규 리포폴리아민에 관해서는 최근에 와서 특허 출원 WO 97/18185에 기재되어있다. 이들은 하기 화학식의 화합물이다.
상기 식에서,
R1, R2및 R3는 서로 독립적으로, 수소 원자 또는 그룹 -(CH2)q-NRR'(이때 q는 상이한 그룹 R1, R2및 R3와는 독립적으로, 1,2,3,4,5 및 6 사이에서 변할 수 있음)를 나타내고,
R 및 R'는 서로 독립적으로, 수소 원자 또는 그룹 -(CH2)q'-NH2'(이때 q'는 상이한 그룹 R과 R'와는 독립적으로, 1,2,3,4,5 및 6 사이에서 달라질 수 있음)를 나타내며,
m, n 및 p는 서로 독립적으로, 0과 6 사이에서 변할 수 있는 정수를 나타내고, n이 1이상이면, m은 상이한 값을 취하고 R3는 상기 화학식의 의미와는 상이할 수 있으며,
R4는 화학식그룹을 나타내며,
R6및 R7은 서로 독립적으로, 수소 원자 또는 두 그룹 중 적어도 하나가 수소와는 상이한 포화 또는 불포화 C10내지 C22지방족 라디칼을 나타내며,
u는 0 내지 10 사이에서 선택된 정수로, u가 1 이상의 정수이면, R5, X, Y 및 r은 상이한 단위 [X-(CHR5)r-Y]에서와는 상이한 의미를 가질 수 있으며,
X는 산소 또는 황원자, 또는 모노알킬화되거나 모노알킬화되지않은 아민 그룹을 나타내며,
Y는 카보닐 그룹 또는 메틸렌 그룹을 나타내며,
R5는 수소 원자 또는 적절한 경우에 치환된 천연 아미노산 사이드 체인을 나타내며,
r은 1 내지 10 사이에서 변하는 정수를 나타내고, r이 1이면, R5는 치환 또는 비치환 천연 아미노산 사이드 체인을 나타내고, r이 1 이상이면, R5는 수소 원자를 나타낸다.
이들 리포폴리아민의 대표적인 예로는, 좀더 상세하게는 하기의 것들이 언급될 수 있다: {H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17CH3]2, H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17CH3]2, H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)17CH3]2. 특히 유리한 방법에서, 본 발명의 구조내에서는, 리포펙타민, 디옥타데실아미도글리실 스퍼민(DOGS), 팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카복시스퍼밀아미드(DPPES), 2,5-비스(3-아미노프로필아미노)펜틸(디옥타데실카바모일메톡시)아세테이트, 1,3-비스(3-아미노프로필아미노)-2-프로필(디옥타데실카바모일메톡시)아세테이트, {H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17CH3]2, H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17CH3]2,및/또는 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)17CH3]2이 사용가능하다. 이는 또한 좀더 상세하게는 문헌[참조: J.M.Lehn et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1996, 93, 9682-9686]에 기재된 것들과 같이, 하나 이상의 구아니디늄 및/또는 아미디늄 그룹이 혼입된 양이온 지질일 수 있다.
본 발명에 따르면, 양이온 형질감염제로 사용될 수 있는 양이온 중합체는 바람직하게는 하기 화학식 1의 화합물이다.
상기 식에서,
R은 수소 원자 또는 화학식그룹일 수 있고,
n은 2 내지 10 사이의 정수이며,
p와 q는 합 p+q이 100 내지 107Da의 평균 중합체 분자량이도록 하는 정수이다.
상기 화학식 1에서, n의 값은 상이한 단위 p 사이에서 달라질 수 있다. 따라서, 화학식 1 그룹은 단일중합체 및 이질중합체 둘모두에 함께 존재한다.
좀더 바람직하게는, 화학식 1에서, n은 2 내지 5 사이이다. 특히, 폴리에틸렌 이민(PEI) 및 폴리프로필렌 이민(PPI)의 중합체는 충분히 유리한 성질을 나타낸다. 본 발명을 수행하는데 바람직한 중합체는 분자량이 103내지 5 x 106사이인 것들이다. 예를 들면, 평균 분자량 50,000 Da(PEI50K)의 폴리에틸렌 이민, 평균 분자량 22,000 Da(PEI22K)의 폴리에틸렌 이민 또는 평균 분자량 800,000 Da(PEI800K)의 폴리에틸렌 이민이 언급될 수 있다.
PEI50K, PEI22K 및 PEI800K는 시판되고 있다. 화학식 1로 대표되는 기타 중합체의 경우, 이들은 특허 출원 FR 94/08735에 기재된 공정에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물에서, 양이온 형질감염제와 복합체 형성된 핵산은 데옥시리보핵산과 리보핵산 모두가 가능하다. 이들은 천연 또는 인공 기원 서열, 특히 게놈 DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA, 하이브리드 서열 또는 변형되거나 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드의 합성 또는 반합성 서열이 가능하다. 이들 핵산은 인간, 동물, 식물, 박테리아 또는 바이러스 기원 등일 수 있다. 이들은 당해 분야의 숙련인에게 공지된 기술, 특히 라이브러리 스크리닝, 화학 합성 또는 라이브러리 스크리닝에 의해 얻어진 서열의 화학 또는 효소적 변형을 포함하는 혼합법에 의해 얻어질 수 있다. 이들은 화학적으로 변형될 수 있다.
데옥시리보핵산에 대해 좀더 상세히 말하면, 이들은 일 또는 이본쇄, 및 짧은 올리고뉴클레오티드 또는 보다 긴 서열일 수 있다. 이들 데옥시리보핵산은 치료 유전자, 전사 또는 복제를 조절하는 서열, 변형되거나 변형되지 않은 안티센스 서열, 기타세포 성분에 결합하는 영역 등을 운반할 수 있다.
본 발명을 위해, 치료 유전자는 특히 치료 효과를 지닌 단백질 산물을 암호화하는 유전자를 의미하는 것으로 이해된다. 이렇게 암호화된 단백질 산물은 단백질, 펩티드 등일 수 있다. 이 단백질 산물은 표적 세포(즉 후자가 병리를 나타내지 않는 경우 표적 세포에서 일반적으로 발현되는 산물)의 경우와 상동일 수 있다. 이 경우, 단백질의 발현은 예를 들면, 세포에서 불충분한 발현 또는 비활성이거나 변형으로 인해 약하게 활성인 단백질의 발현을 보상할 수 있거나, 상기 단백질을 과발현시킬 수 있다. 치료 유전자는 증가된 안정성, 변형된 활성 등을 지닌 세포 단백질의 돌연변이체를 암호화할 수도 있다. 단백질 산물은 또한 표적 세포에 대해 이형일 수 있다. 이 경우, 발현된 단백질은 예를 들면, 병리와 싸우거나, 면역 반응을 자극할 수 있는, 세포에서 결여된 활성을 보충하거나 제공할 수 있다.
본 발명을 위한 치료 산물 중, 좀더 구체적으로는 효소, 혈액 유도체, 호르몬, 림포카인: 인터루킨, 인터페론, TNF 등(FR 92/03120), 생장 인자, 신경전달물질 또는 이의 전구체 또는 합성 효소, 영양 인자: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/플레이오트로핀 등, 디스트로핀 또는 미니디스트로핀(FR 91/11947), 낭포성 섬유증과 관련된 단백질 CFTR, 종양 서프레서 유전자: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev 등(FR 93/04745), 응고와 관련된 유전자 암호 인자: 인자 VII, VIII 및 IX, DNA 수선과 관련된 유전자, 자살 유전자(티미딘 키나제, 사이토신 데아미나제), 헤모글로빈 또는 기타 캐리어 단백질용 유전자, 지질 대사와 관련된 단백질, 아포리포프로테인 A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, D, E, F, G, H, J 및 apo(a) 중에서 선택된 아포리포프로테인 형, 예를 들어 리포프로테인 리파제, 헤파틱 리파제, 레시틴 콜레스테롤 아실트랜스퍼라제, 7-알파-콜레스테롤 하이드록실라제, 포스파티드산 포스파타제와 같은 대사 효소, 또는 콜레스테롤 에스테르 전달용 단백질 및 포스포리피드 전달용 단백질과 같은 지질 전달용 단백질, HDL 결합 단백질 또는 예를 들어, LDL 수용체, 잔유 킬로마이크론용 수용체 및 스캐빈저 수용체 중에서 선택된 수용체에 상응하는 유전자 등이 언급될 수 있다.
치료 핵산은 유전자 또는 안티센스 서열일 수 있는데, 표적세포에서의 발현은 유전자의 발현 또는 세포 mRNA의 전사를 통제할 수 있다. 특허 EP 140 308에 기재된 기술에 따르면, 이러한 서열은 예를 들면, 표적 세포에서 세포 mRNA에 상보적인 RNA로 전사될 수 있어 단백질로의 해독을 막는다. 치료 유전자는 또한 표적 RNA를 선택적으로 파괴할 수 있는 리보자임 암호화 서열을 포함한다(EP 321 201).
앞서 지적했듯이, 핵산은 또한 인간 또는 동물에서 면역반응을 생성할 수 있는 항원성 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 특정 양태에서, 본 발명은 따라서 특히 미생물, 바이러스 또는 암으로부터, 백신 또는 인간 또는 동물에 적용될 면역치료법의 생성을 가능케 한다. 이는 특히 엡스타인-바 바이러스, HIV 바이러스, 간염 B 바이러스 (EP 185 573), 위광견병 바이러스, 합포체 형성 바이러스 또는 기타 바이러스에 특이적인 항원성 펩티드, 또는 종양에 특이적인(EP 259 212) 항원성 펩티드일 수 있다.
바람직하게는, 핵산은 또한 치료 유전자 및/또는 세포 또는 원하는 기관에서 항원성 펩티드를 암호화하는 유전자의 발현을 허용하는 서열을 포함한다. 이들은 이들 서열이 감염 세포에서 기능할 수 있는 경우에 본래 관련 유전자의 발현을 담당하는 서열일 수 있다. 이들은 상이한 기원(기타 단백질, 또는 심지어 합성 단백질의 발현 담당)의 서열일 수도 있다. 특히, 이들은 진핵생물 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열일 수 있다. 예를 들어, 이들은 감염될 세포의 게놈에서 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 또한, 이들은 바이러스 게놈에서 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 이 점에서, 예를 들면, E1A, MLP, CMV 및 RSV 유전자의 프로모터 등이 언급될 수 있다. 추가로, 이들 발현 서열은 활성화 또는 조절 서열의 첨가 등에 의해 개질될 수 있다. 프로모터는 유도성 또는 억제성일 수 있다.
또한, 핵산은 특정 치료 유전자의 업스트림에, 표적 세포의 분비 경로에서 합성되어지는 치료 산물을 지시하는 시그널 서열을 포함할 수도 있다. 이 시그널 서열은 치료 산물의 본래 시그널 서열일 수 있지만, 기타 기능 시그널 서열, 또는 인공 시그널 서열일 수 있다. 핵산은 합성된 치료 산물을 세포의 특정 구획으로 지시하는 시그널 서열을 포함할 수도 있다.
또다른 양태에서, 청구된 조성물은 추가로, 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 올레오일팔미토일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디-스테아로일, -팔미토일, -미리스토일 포스파티딜에탄올아민, 1 내지 3회 N-메틸화된 이들의 유도체, 포스파티딜글리세롤, 디아실글리세롤, 글리코실디아실글리세롤, 세레브로시드(예, 특히 갈락토세레브로시드), 스핑고리피드(예, 특히 스핑고마이엘린), 또는 아시알로갱글리오사이드(예, 특히 asialoGM1 및 GM2)를 포함하는 타입의 보조제를 포함할 수 있다.
최근에 와서, 본 출원인은 형질감염 조성물에서 보조제로, 직접 또는 간접적으로, 핵산의 응축과 관련된 화합물을 사용함이 특히 유리함을 입증했다. 이 화합물은 전부 또는 부분적으로, 펩티드 단위(KTPKKAKKP) 및/또는 (ATPAKKAA)로 구성되고, 단위 수는 2 내지 10 사이에서 달라질 수 있다. 이러한 제제는 또한 히스톤의 일부, 뉴클레올린, 프로타민 및/또는 이들의 유도체 중 하나로부터 유도될 수 있다(WO 96/25508). 이러한 화합물은 유리하게도 청구된 조성물에 혼입될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 또한 핵산 복합체를 세포 표면의 수용체 또는 리간드로 향하게 할 수 있는 하나 이상의 표적화 요소를 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 세포 표면 분자에 대한 하나 이상의 항체, 또는 인슐린, 트랜스페린, 폴산 또는 기타 생장 인자와 같은 하나 이상의 막 수용체 리간드, 사이토킨 또는 비타민을 포함할 수 있다. 유리하게도, 조성물은 세포 표면 또는 인접 세포외 매트릭스상에 특정 폴리사카라이드를 표적화하기 위해 변형되거나 변형되지않은 렉틴을 사용할 수 있다. RGD 단위를 갖는 단백질, 한 쌍의 RGD 단위를 함유하는 사이클릭 또는 비-사이클릭 펩티드, 및 폴리라이신 펩티드가 사용될 수도 있다. 최근에 와서는, 특정 세포에 대한 선택성에 있어 특히 유리하고 이들 세포에서 효과적으로 내면화를 수행할 수 있는 천연 또는 합성 리간드 펩티드에 관해서도 기재되어 있다[참조문헌: Bary et al. Nature Medicine, 2, 1996, 299-305]. 이들 표적화제는 일반적으로 고려된 양이온 형질감염제와 접합된다.
본 발명은 또한 청구된 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 좀더 상세히 말하면, 이는 형질감염제 및 핵산이 충분한 양의 비이온 표면 활성제의 존재하에 접촉하여 이렇게 형성된 핵산 복합체 입자를 약 160 nm 이하의 크기로 안정화시키는 것을 특징으로 하는, 크기면에서 안정화된, 양이온 형질감염제(들)/핵산 복합체 입자를 포함하는 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
좀더 상세히 말해, 성분 중 하나, 즉 핵산 또는 리포펙탄트는 제 2 성분과의 접촉 이전에 미리 비이온 표면 활성제와 혼합된다. 비이온 표면 활성제의 부재하에 자발적으로 나타나는 응집 현상은 차단된다.
본 발명에 따른 조성물은 국소, 피부, 경구, 직장, 질, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내, 경피 경로 등에 의한 투여용으로 제형될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물은 주사제용, 특히 원하는 기관 수준에서의 직접 주사용, 또는 국소 경로(피부 및/또는 점막) 투여용의 약학적으로 허용되는 비히클을 함유한다. 이들은 특히 등장, 멸균액, 또는 경우에 따라 멸균수나 생리 식염의 첨가로 주사액 형성을 허용하는 건조, 특히 동결건조 조성물일 수 있다. 주사에 사용되는 핵산의 용량 및 투여 횟수는 상이한 파라미터의 함수로서, 특히 사용되는 투여방식, 관련 병리, 발현시키고자 하는 유전자, 또는 원하는 치료 지속기간의 함수로서 조정될 수 있다. 좀더 구체적으로 말해 투여방식의 경우, 조직 또는 순환로 중으로의 직접 주사, 또는 배양 세포 처리에 이은 주사 또는 이식에 의한 생체내에서의 재이식일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 치료적 관점에서 특히 유리하다. 본 발명에 따르면, 생체내 관점에서 특히 유리한 적절한 크기 및 감소된 전하비의 핵산 복합체를 효과적으로 투여함을 알 수 있다. 일반적으로 관찰된 혈청/핵산 복합체 상호작용은 청구된 조성물의 경우 상당히 희박해진다.
본 발명은 하기 실시예 및 도면에 의해 좀더 상세히 기술될 것이며 이들은 설명적이고 비제한적인 것으로 간주된다.
실시예 1: RPR 120535/DNA 복합체의 크기에 미치는 폴옥살콜의 영향력.
플라스미드(10 ㎍/㎖)를 150 mM NaCl 및 각종 농도의 폴옥살콜을 함유하는 용액에 둔다. 리포펙탄트 RPR 120535를 첨가하여 전하비 (+/-) 2.5를 얻는다. 방법에 기재된 과정에 따라 광자 상관 분광법으로 복합체의 크기를 측정한다. 결과는 도 1에 나타나 있다.
폴옥살콜의 부재(□)하에, 몇분이 지나 입자가 274 nm에서 최대 1000 nm로 변화됨을 알 수 있다. 다음, 배양 몇 시간 후 침전물이 관찰된다.
한편, 0.1% (+)의 폴옥살콜의 존재하에서는, 복합체 크기의 감소가 관찰되고, 크기는 0.8%(○) 및 1%(▲)의 폴옥살콜의 농도에서 안정하게 존재하고 150 nm를 초과해서 변하지 않는다.
1% (중량/용적) 폴옥살콜만을 이용한 리포펙탄트의 배양은 빛의 Quasi-Elastic Diffusion에 의해 검출가능한 입자를 형성하지 않는다. 게다가, DNA를 1% 폴옥살콜을 이용하여 배양할 경우, 입자를 검출할 수 없다.
실시예 2: RPR 120531/DNA 복합체의 크기에 미치는 폴옥살콜의 영향력
이를 위해, 양이온 지질 RPR 120531을 이용하여 실시예 1을 반복한다.
각종 농도의 폴옥살콜에서 150 mM NaCl을 함유하는 용액에 플라스미드 (10 ㎍/㎖)를 둔다. RPR 120531을 첨가하여 전하비 (+/-) 2.5를 얻는다. 광자 상관 분광기(Coulter N4plus)를 이용하여 복합체의 크기를 측정한다. 결과는 도 2에 나타나 있다.
폴옥살콜의 부재하에서는, RPR 120531/DNA 복합체의 크기가 몇 시간이 지나 234 nm에서 590 nm로 변하지만 0.5%(▲) 및 0.9%(○)의 폴옥살콜의 존재하에서는 안정하게 존재함을 알 수 있다.
실시예 3: 폴옥살콜의 존재 및 부재하에 DNA/리포펙탄트 응축 정도의 조절
폴옥살콜의 존재하에 얻어진 입자가 실제로 양이온 지질과 DNA의 배합물에서 유도된 입자인지를 체크한다. 이를 위해, DNA에 삽입될 경우 형광을 발하는 탐침의 삽입 실험을 수행한다. DNA가 유리된 경우의 형광 수준은 높은 반면, 접근이 불가능한 경우에는 낮은데 이는 DNA가 양이온 지질과 응축되기 때문이다. 도 3에 얻어진 결과가 도시되어 있다.
폴옥살콜의 존재 및 부재하에 양이온 지질과 DNA의 배합 후 얻어진 형광
수준을 관찰한다. 우선, 1%의 폴옥살콜의 존재 또는 부재하에 DNA에 삽입된 에티디움 브로마이드의 형광이 변화되지 않음을 주목할 수 있다. 1% 폴옥살콜의 존재 또는 부재하에 양이온 지질/DNA 복합체(전하비 (+/-) 2.5)의 형광 수준은 실제로 동일하다. 이 잔류 형광값은 DNA가 탐침에 접근할 수 없음을 나타낸다.
결론적으로, 폴옥살콜은 일반적으로 일어나는 양이온 지질과 DNA의 배합을 차단하지는 않는다.
실시예 4: DNA 또는 1% 폴옥살콜을 함유하는 RPR 120535를 이용한 시험관내 형질감염
본 출원인은 DNA 또는 양이온 지질 단독과 혼합할 경우 폴옥살콜의 효과를 체크하고자 한다. 이를 위해, 하기 두 샘플을 제조한다:
샘플 1: 300 mM NaCl 및 1% (중량/용적) 폴옥살콜을 함유하는 배지 중 10 ㎍ DNA/㎖.
샘플 2: 300 mM NaCl 및 1% 폴옥살콜을 함유하는 배지 중 60 μM RPR 120535.
하기 표 1에 나타낸 양으로 이들 샘플을 샘플 1의 경우 순서대로: 물, NaCl, DNA 및 폴옥살콜을 혼합하고, 샘플 2의 경우 순서대로: 물, NaCl, 폴옥살콜 및 RPR 120535를 혼합하여 제조한다.
시험 H2O NaCl (5 M) DNA(0.7 mg/㎖) 폴옥살콜(10%) RPR 120535(5 mmol)
1 (㎕) 413 30 7.1 50 0
2 (㎕) 414 30 0 50 6
이들 두 샘플의 생물 활성을 NIH 3T3 세포상에서 시험한다. 24-웰 플레이트상에서 웰당 각종 샘플 용적 50 ㎕를 넣는다.
태 송아지 혈청의 부재하에 형질감염을 수행한다. 복합체의 첨가 2시간 후 후자를 첨가한다.
결과는 1% 폴옥살콜의 존재 및 10% 태 송아지 혈청의 부재하에 비-복합된 DNA를 이용해서는 유전자 전달이 관찰되지 않음을 나타낸다.
또한, 총 단백질 분석은 독성이 뚜렷하지 않음을 입증한다.
실시예 5: 각종 농도의 폴옥살콜에서 안정화된 RPR 120535 리포펙탄트/DNA 복합체 용액을 이용한 시험관내 형질감염
폴옥살콜의 존재하에 이들 입자의 형질감염 효율에 미치는 폴옥살콜을 이용한 입자의 안정화 효과를 분석하고자 한다. 이를 위해, 각종 농도의 폴옥살콜을 함유하는 샘플을 제조한다.
각종 농도의 폴옥살콜(0; 0.5%; 0.8% 및 1%; 중량/용적)에서 300 mM NaCl을 함유하는 배지에 전하비 (+/-) 2.5의 4개의 샘플을 제조한다:
샘플 1: 전하비 (+/-) 2.5, 300 mM NaCl.
샘플 2: 전하비 (+/-) 2.5, 300 mM NaCl, 및 0.5% 폴옥살콜.
샘플 3: 전하비 (+/-) 2.5, 300 mM NaCl, 및 0.8% 폴옥살콜.
샘플 4: 전하비 (+/-) 2.5, 300 mM NaCl, 및 1% 폴옥살콜.
순서대로, 물, NaCl, DNA, 폴옥살콜 및 RPR 120535를, 하기 표 2에 도시된 양으로 혼합하여 이들 샘플을 제조한다.
시험 H2O NaCl(5M) DNA(0.7 mg/㎖) 폴옥살콜(10%) RPR 120535(5 mM)
1 (㎕) 737 48 11.4 0 4
2 (㎕) 697 48 11.4 40 4
3 (㎕) 672 48 11.4 64 4
4 (㎕) 657 48 11.4 80 4
* 샘플 1은 용액에서 입자의 안정성이 없는 양이온 지질 농도 범위에 속하는데, 즉 입자 형태가 서로 응집하여 큰 유체역학 직경(1000 nm 이상)을 소유하는 큰 다발의 응집체를 형성한다.
* 샘플 2는 샘플 1과 동일한 양이온 지질/DNA 전하비를 가지지만, 혼합물은 0.5%(중량/용적)의 폴옥살콜의 존재하에 제조된다. 그러나, 이 농도는 입자의 충분한 안정화를 보장하기에는 부족하다(실시예 1과 비교: RPR 120535/DNA 복합체 크기에 미치는 비이온 중합체의 영향):
* 샘플 3과 4는 안정하고, 입자의 유체역학 직경은 대략 150 nm이다.
각종 제형의 생물 활성을 NIH 3T3 세포상에서 시험한다. 웰당 각종 샘플 용적 50 ㎕(10 ㎍ DNA/㎖ 포함)를 첨가한다. 태 송아지 혈청의 부재하에 형질감염을 수행한다. 복합체를 첨가한지 2시간 후 후자를 첨가한다. 얻어진 결과는 도 4에 나타나 있다.
도 4에서는, 농도에 상관없이 폴옥살콜이 NIH 3T3 세포에서 시험관내 형질감염을 변형하지 않음을 알 수 있다. 폴옥살콜은 태 송아지 혈청의 부재하에, 전하비 (+/-) 2.5에서 RPR 120535/DNA 복합체의 형질감염성을 변형시키지 않는다.
실시예 6: 폴옥살콜로 안정화된 RPR 120535/DNA, BGTC/DNA 및 BGTC/DOPE/DNA 복합체의 구조 측정
이 연구에서, 본 출원인은 저각 X-선 회절 및 투과 전자 현미경에 의해, 양이온 지질 트랜스펙탄트/DNA 복합체의 구조를 측정했다.
도 5a는 RPR 120535/DNA 복합체에 관한 것이다. 폴옥살콜의 부재 및 존재하에 얻어진 구조는 DNA가 주율이 8 nm인 지질 이중층 사이에 샌드위칭되는 라멜라 구조이다. 폴옥살콜의 존재는 작은 크기의 복합체를 얻을 수 있지만, 폴옥살콜의 부재하에서는, 크기가 1000 nm 이상인 침전물이 얻어진다.
도 5b는 양이온 지질 BGTC를 이용하여 얻어진 구조를 나타낸다(특허 출원 WO 97/31935에 기재되어있음). 이 경우, 폴옥살콜의 존재 또는 부재하에 주율이 6.5 nm인 라멜라 구조도 얻어진다. 폴옥살콜의 존재는 이러한 경우에 작은 크기의 복합체를 가지도록 할 수 있다. 보조제 DOPE를 함유하거나 함유하지 않은 복합체의 경우 결과는 일정하게 얻어진다.
따라서, 폴옥살콜의 첨가가 양이온 지질과 DNA의 배합을 방해하지는 않지만, 단지 이 복합체의 교질 상태를 변형시키는 것으로 결론지을 수 있다.
실시예 7: 폴옥살콜로 안정화된 양이온 지질/DNA 복합체의 전신 주입 후 생체내 형질감염.
1) RPR 120535/DNA/F68
본 출원인은 침전된 RPR 120535/DNA 복합체, 및 Pluronic F68의 첨가로 안정화된 이와 동일한 복합체의 전신 주입 후 유전자 전달 효율을 비교한다. 하기 표 3은 F68의 부재하에 복합체가 만들어질 경우, 단지 폐에서만 발현이 관측됨을 나타낸다. 반면, 입자가 F68의 첨가로 교질적으로 안정화되면, 루시퍼라제 활성이 폐에서는 10배 증가하고, 기타 조직(간, 심장)에서 발현이 관찰된다.
지질 RPR 120535
제형 1% F68 10% F68
마우스 balbc balbc
폐 2 ± 0.9 14 ± 0.9
간 0 2 ± 3
신장 0 0
심장 0 1 ± 4
2) BGTC/DOPE/DNA/F68
또다른 지질: BGTC를 이용하여 앞서 기술된 것과 동일한 실험을 수행한다. 유사한 결과, 즉 폐에서 유전자 전달의 개선 및 간, 심장 및 신장에서 측정가능한 발현이 얻어진다. 각종 마우스 균주(아포리포프로테인 E가 결여된 balbc, C57B16, 및 C57B16)를 이용하여 이들 결과를 얻는다. 아포리포프로테인 E가 일반적이거나 결여된 C57B16 마우스를 이용하여 동일한 형질감염 수준이 얻어짐이 주목할 만한데, 이는 이들이 매우 높은 지질 수준, 즉 일반 마우스의 10배의 지질 수준을 보유하기 때문이다. 실제로, 비바이러스 지질 벡터가 사용되면, 이들 복합체는 다량의 이러한 내인성 지질의 존재로 불안정화될 것임을 기대할 수 있다. 하기 표 4는 폴옥살콜의 부재 또는 존재하에 BGTC/DOPE/DNA 복합체의 생체내 형질감염의 결과를 모아놓고 있다.
지질 BGTC/DOPE
제형 0% F68 4% F68
마우스 balbc balbc C57B16 C57B16 KoApoE
폐 6.7 ± 2.8 86.5 ± 65.4 220 ± 99 201 ± 12
간 0 11.4 ± 11.5 47 ± 26 47 ± 23
신장 0 0.34 ± 0.16 1.8 ± 0.9 2.2 ± 0.1
심장 0 0.74 ± 1.05 0.73 ± 0.7 0.6 ± 0.0
실시예 8: 기타 비이온 표면 활성제의 사용.
기타 비이온 표면 활성제를 시험한다: 폴리에틸렌 글리콜 덴드리머, 폴리옥시에틸렌 알콜, 폴리옥시에틸렌 노닐페닐 에테르. 이들은 양이온 지질/DNA 복합체를 안정화하는데 F68과 동일한 능력을 보인다. 수행된 연구에서 양이온 지질은 RPR 120535이다.
1) 폴리에틸렌 글리콜 덴드리머
본 출원인은 분자량 5000 Da인 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 그래프팅된 2세대의 1 벤질 폴리에테르 헤드를 소유하는 덴드리머(SAS11로 불림), 및 분자량 11,000 Da의 PEG상에 그래프팅된 2 벤질 폴리에테르 헤드를 함유하는 것을 제외하고는 동일한 타입의 또다른 덴드리머(SAS9로 불림)를 사용한다. 하기 표 4는 0.02% (중량/용적) 이상의 이들 덴드리머를 사용하여, 마이크론-크기의 형질감염 복합체 침전물은 더이상 얻어지지 않고, 오히려 100 nm 이하 직경을 지닌 입자가 얻어짐을 나타낸다.
2) 폴리옥시에틸렌 알콜
"Brij"로도 불리는, 친수성 부위로 100 옥시에틸렌을 포함하는 이 산물은 1 시간 후, 100 nm 이하의 직경을 지닌 RPR 120535/DNA 복합체를 얻을 수 있게 해준다.
3) 폴리옥시에틸렌 노닐페닐 에테르
이 산물도 RPR 120535/DNA 형질감염 복합체를 교질적으로 안정화시킬 수 있다. 입자의 직경은 100 nm이다.
하기 표 5는 2.75 (+/-) 전하비에서 150 mM NaCl중에 0.25 mg의 DNA/㎖을 함유하는, 각종 비이온 표면 활성제로 안정화된, RPR 120535/DNA 복합체의 nm 직경을 나타내고 있다.
중합체 (중량/용적) 0.05% 0.1% 0.2%
Brij 700 114 ㎚ 69 ㎚ 74 ㎚
SAS11 152 ㎚ 99 ㎚ 71 ㎚
SAS9 104 ㎚ 85 ㎚ 75 ㎚
폴리옥시에틸렌노닐페닐 에테르 142 ㎚ 132 ㎚ 111 ㎚
이들 각종 비이온 표면 활성제로 안정화된 모든 제형에 대해, 본 출원인은 형광 측정에 의해 DNA와 양이온 지질과의 응축 상태를 체크한다. 결과는 양이온 지질/DNA 복합체의 표면에 이들 계면활성제의 존재가 양이온 지질과 DNA의 응축을 변형하지 않음을 나타낸다(결과는 도시되지 않음).

Claims (37)

  1. 또한, 적어도 하나의 비이온 표면활성제를 160 nm 이하의 크기로 입자의 크기를 안정화시키기에 충분한 양으로 혼입함을 특징으로 하는, 안정화된 양이온 형질감염제(들)/핵산 복합체 입자를 포함하는 유전자 요법에 유용한 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 양이온 형질감염제와 핵산이 1 내지 6의 전하비로 존재함을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 양이온 형질감염제와 핵산이 4 이하의 전하비로 존재함을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 활성제가 적어도 하나의 소수성 단편 및 적어도 하나의 친수성 단편을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 소수성 단편이 지방족 체인, 폴리옥시알킬렌, 알킬리덴 폴리에스테르, 벤질 폴리에테르 헤드를 지닌 폴리에틸렌 글리콜, 및 콜레스테롤 중에서 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 친수성 단편이 폴리옥시알킬렌, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈, 또는 사카라이드 중에서 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 활성제가 화학식 HO(CH2CH2O)a(CH(CH3)CH2O)b(CH2CH2O)cH(여기서, a, b 및 c는 서로 독립적으로 20 내지 100 사이에서 달라질 수 있는 정수를 나타냄)의 폴리옥시알킬렌임을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 활성제로, a가 75이고, b가 30이며 c가 75인 화학식 OH(CH2CH2O)a(CH(CH3)CH2O)b(CH2CH2O)cH 화합물을 함유함을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 활성제로, 수지상 벤질 폴리에테르 헤드를 지닌 폴리에틸렌 글리콜 부류의 화합물을 함유함을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 활성제로, 폴리옥시에틸렌 알콜 부류의 화합물을 함유함을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 활성제로, 폴리옥시에틸렌 노닐페닐 에테르를 함유함을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 활성제가 조성물의 0.01% 내지 10 중량/용적%의 농도로 존재함을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 활성제가 조성물의 0.02% 내지 5 중량/용적%의 농도로 존재함을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온 형질감염제가 리포펙탄트임을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 리포펙탄트가 친수성 영역과 결합하거나 해리된 적어도 하나의 친지성 영역을 포함하는 양쪽성 분자임을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 14 항에 있어서, 양이온 리포솜을 형성할 수 있는 지질 혼합물임을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 양이온 지질임을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 적어도 하나의 화학식 H2N-(-(CH)m-NH-)n-H(여기서 m은 2 이상의 정수이고 n은 1 이상의 정수이며, m은 2 아민 사이의 상이한 탄소 그룹간에 달라질 수 있음)의 폴리아민 영역을 포함하는 리포펙탄트이고, 이 폴리아민 영역이 콜레스테롤 타입, 또는 라멜라 또는 육각형 상을 형성할 수 있는 천연 또는 합성 지질의 포화 또는 불포화 탄화수소 체인의 친지성 영역과 공유 결합됨을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서, 폴리아민 영역이 핵산-결합성을 보유하고 있는 스퍼민 또는 이의 유사체 중 하나로 나타내어짐을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 하기 화학식의 리포펙탄트를 포함함을 특징으로 하는 조성물에 있어서,
    상기 식에서,
    R은를 나타내고,
    X 및 X'는 각각 독립적으로, 산소 원자, 메틸렌 그룹 -(CH2)q-(q는 0,1,2 또는 3임), 또는 아미노 그룹 -NH- 또는 -NR'-(R'는 C1내지 C4알킬 그룹을 나타냄)를 나타내며,
    Y 및 Y'는 서로 독립적으로, 메틸렌 그룹, 카보닐 그룹 또는 그룹 C=S를 나타내며,
    R3, R4및 R5는 서로 독립적으로, 수소 원자 또는 치환 또는 비치환 C1내지 C4알킬 라디칼을 나타내고, 이때 p는 0 내지 5 사이에서 변할 수 있으며,
    R6는 콜레스테롤 유도체 또는 알킬아미노 그룹 -NR1R2(R1및 R2는 서로 독립적으로, 포화 또는 불포화, 선형 또는 측쇄 C12내지 C22지방족 라디칼을 나타냄)를 나타내는 조성물.
  21. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 하기 화학식의 리포펙탄트를 포함함을 특징으로 하는 조성물에 있어서,
    상기 식에서,
    R1, R2및 R3는 서로 독립적으로, 수소 원자 또는 그룹 -(CH2)q-NRR'(이때 q는 상이한 그룹 R1, R2및 R3와는 독립적으로, 1,2,3,4,5 및 6 사이에서 변할 수 있음)를 나타내고,
    R 및 R'는 서로 독립적으로, 수소 원자 또는 그룹 -(CH2)q'-NH2'(이때 q'는 상이한 그룹 R과 R'와는 독립적으로, 1,2,3,4,5 및 6 사이에서 달라질 수 있음)를 나타내며,
    m, n 및 p는 서로 독립적으로, 0과 6 사이에서 변할 수 있는 정수를 나타내고, n이 1이상이면, m은 상이한 값을 취하고 R3는 상기 화학식의 의미와는 상이할 수 있으며,
    R4는 화학식그룹을 나타내며,
    R6및 R7은 서로 독립적으로, 수소 원자 또는 두 그룹 중 적어도 하나가 수소와는 상이한 포화 또는 불포화 C10내지 C22지방족 라디칼을 나타내며,
    u는 0 내지 10 사이에서 선택된 정수로, u가 1 이상의 정수이면, R5, X, Y 및 r은 상이한 단위 [X-(CHR5)r-Y]에서와는 상이한 의미를 가질 수 있으며,
    X는 산소 또는 황원자, 또는 모노알킬화되거나 모노알킬화되지않은 아민 그룹을 나타내며,
    Y는 카보닐 그룹 또는 메틸렌 그룹을 나타내며,
    R5는 수소 원자 또는 적절한 경우에 치환된 천연 아미노산 사이드 체인을 나타내며,
    r은 1 내지 10 사이에서 변하는 정수를 나타내고, r이 1이면, R5는 치환 또는 비치환 천연 아미노산 사이드 체인을 나타내고, r이 1 이상이면, R5는 수소 원자를 나타내는 조성물.
  22. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 하나 이상의 구아니디늄 및/또는 아미디늄 그룹을 운반하는 양이온 지질을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온 형질감염제가 양이온 중합체임을 특징으로 하는 조성물.
  24. 제 23 항에 있어서, 양이온 중합체가 화학식 1의 화합물임을 특징으로 하는 조성물에 있어서,
    화학식 1
    상기 식에서,
    R은 수소 원자 또는 화학식그룹일 수 있고,
    n은 2 내지 10의 정수이며,
    p와 q는 합 p+q이 100 내지 107Da의 평균 중합체 분자량이 되도록 하는 정수인 조성물.
  25. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 평균 분자량 50,000 Da인 폴리에틸렌 이민(PEI50K), 평균 분자량 22,000 Da인 폴리에틸렌 이민(PEI22K) 또는 평균 분자량 800,000 Da인 폴리에틸렌 이민(PEI800K)을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  26. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온 형질감염제가 바람직하게는 리포펙타민, 디옥타데실아미도글리실 스퍼민(DOGS), 팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카복시스퍼밀아미드(DPPES), 2,5-비스(3-아미노프로필아미노)펜틸(디옥타데실카바모일메톡시)아세테이트 또는 1,3-비스(3-아미노프로필아미노)-2-프로필(디옥타데실카마모일메톡시)아세테이트, {H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17CH3]2, H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17CH3]2,및 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)17CH3]2중에서 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 데옥시리보핵산임을 특징으로 하는 조성물.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 리보핵산임을 특징으로 하는 조성물.
  29. 제 27 항 또는 제 28 항에 있어서, 핵산이 화학적으로 변형됨을 특징으로 하는 조성물.
  30. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 안티센스 핵산임을 특징으로 하는 조성물.
  31. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 치료 유전자를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  32. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 또한, 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 올레오일팔미토일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디-스테아로일, -팔미토일, -미리스토일 포스파티딜-에탄올아민, 1 내지 3회 N-메틸화된 이들의 유도체, 포스파티딜글리세롤, 디아실글리세롤, 글리코실디아실글리세롤, 세레브로시드(예, 특히 갈락토세레브로시드), 스핑고리피드(예, 특히 스핑고마이엘린) 또는 아시알로갱글리오사이드를 포함하는 타입의 보조제를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  33. 제 1 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로, 양이온 형질감염제와 표적화 요소의 결합을 특징으로 하는 조성물.
  34. 제 33 항에 있어서, 이러한 표적화 요소가 세포 표면 분자에 대해 지향된 항체, 인슐린, 트랜스페린, 폴산 또는 기타 생장 인자와 같은 막 수용체, 사이토킨 또는 비타민, 변형되거나 변형되지 않은 렉틴, RGD 유닛을 갖는 단백질, 한 쌍의 RGD 유닛을 함유하는 사이클릭 또는 비-사이클릭 펩티드, 폴리라이신 펩티드 및 천연 또는 합성 리간드 펩티드 중에서 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
  35. 형질감염제와 핵산이 충분량의 비이온 표면 활성제의 존재하에 접촉하여 이렇게 형성된 핵산 복합체 입자를 약 160 nm 이하의 크기로 안정화시킴을 특징으로 하는, 양이온 형질감염제(들)/핵산 복합체 입자를 포함하는 조성물의 제조방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 핵산 또는 리포펙탄트 중에서 선택된 성분 중 하나가 제 2 성분과 접촉하기 이전에 미리 비이온 표면 활성제와 혼합함을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 35 항 또는 제 36 항에 있어서, 표면 활성제가 제 4 항 내지 제 13 항에 따라 규정됨을 특징으로 하는 방법.
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