KR102177776B1 - 가디퀴모드를 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 질환 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 가디퀴모드(Gardiqiomod)를 포함하는 근원세포의 분화 촉진용 조성물, 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 근력강화용 조성물 및 근력 강화용 사료 또는 사료 첨가제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 가디퀴모드를 이용한 근원세포의 분화 촉진 방법, 분화된 근원세포의 제조방법 및 근력 약화 관련 질환의 치료방법에 관한 것이다.

Description

가디퀴모드를 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 질환 치료용 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING MUSCULAR WEAKNESS-RELATED DISEASE COMPRISING GARDIQUIMOD AS EFFECTIVE INGREDIENT}

본 발명은 가디퀴모드(Gardiquimod)를 포함하는 근원세포의 분화 촉진용 조성물 및 근력 약화 관련 질환의 치료용 조성물에 관한 것이다.

근력의 약화를 유발하는 질환은 노화와 함께 진행되는 근감소증(sarcopenia), 단백질 대사의 불균형이나 근육사용 감소에서 유발되는 근위축증(muscle atrophy), 또는 노화와 함께 진행되는 심위축증(acardiotrophy)등이 있다.

근감소증은 노화가 진행되는 동안 근육량 감소에 의해 근력이 저하되는 현상을 의미한다. 근감소증은 근육량의 감소뿐만 아니라, 근섬유 종류의 변화로도 관찰된다. 나이가 들면 근섬유의 타입 1과 타입 2가 비슷한 비율로 감소하는데 반해, 근감소증이 오면 타입 2의 근섬유 두께에는 큰 변화가 없지만 타입 1의 근섬유 두께는 눈에 띄게 감소한다. 이러한 근감소증은 노인들 사이에서 일어나는 노쇠와 기능 장애를 유발한다고 보고되고 있다(Roubenoff R., Can. J. Appl. Physiol. 26, 78-89, 2001).

근감소증은 다양한 요인에 의해 유발되나, 각각의 요인들에 대한 연구는 미진한 실정이다. 근감소증의 가장 큰 특징인 근육량 감소의 원인으로는 위성 세포의 활성(satellite cell activation) 감소가 중요한 원인으로 알려져 있다. 위성 세포란 기저막(basement membrane)과 근섬유의 근(sarcolemma) 사이에 위치하고 있는 작은 단핵 세포이다. 이들은 부상 또는 운동과 같은 자극에 의해 활성화되어 근원세포(myoblast)로 증식하며, 분화가 진행되면 다른 세포와 융합되어 다핵의 근섬유를 형성한다. 따라서, 위성 세포의 활성이 감소함에 따라 손상된 근육을 재생하는 능력이나 분화 신호에 대한 반응이 떨어지게 되고, 그 결과, 근육 형성이 저하된다.

근위축증(Muscle atrophy)은 영양결핍이나 장기간 근육을 사용하지 않은 경우 나타나는 증상으로, 정상적인 단백질의 합성과 분해의 균형이 붕괴되어 단백질이 분해됨으로써 나타나게 된다.

한편, 심위축증(acardiotrophy)은 암과 같은 소모성질환 또는 노쇠했을 때 나타나며, 심근섬유가 가늘어지게 된다. 따라서, 근속(muscle fascicle)의 용적이 감소하고, 심장 전체가 작아지며, 심외막하의 지방조직이 감소한다. 또한, 관상동맥이 굽어지게 된다.

근감소증과 같은 근력 약화 관련 질환은 운동과 식이요법을 통해 개선될 수 있으나, 그 효과가 미미하고, 장기적인 치료방법으로는 부적절하다. 또한, 호르몬제를 활용한 약물치료 방법이 제시되고 있으나, 장기적인 호르몬 투여로 인한 부작용이 발생할 수 있다는 문제점이 있다.

따라서 근력약화 관련 질환을 치료하기 위해 부작용이 없는 치료방법으로 근원세포의 분화 방법이 각광받고 있으며, 이에 따라 근원세포의 분화를 촉진할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다.

Roubenoff R., Can. J. Appl. Physiol. 26, 78-89, 2001.

본 발명자들은 근원세포의 분화를 촉진함으로써 근육량을 증가시키고, 근육기능을 효과적으로 회복시키는 근력 약화 관련 질환 치료제를 개발하기 위해 노력한 결과, 가디퀴모드가 근원세포의 분화를 촉진하여 근력약화 관련 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 근원세포의 분화 촉진용 조성물 및 이를 이용한 근육세포의 분화 촉진 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 근력 약화 관련 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 근력 강화용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 일 측면은, 가디퀴모드(Gardiquimod)를 포함하는 근원세포(myoblast)의 인비트로(in vitro) 분화 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은, 가디퀴모드를 체외 근원세포에 처리하는 단계를 포함하는 인비트로에서 근원세포의 분화 촉진 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은, 가디퀴모드를 체외 근원세포에 처리하여 근원세포를 분화시키는 단계를 포함하는 인비트로에서 분화된 근원세포의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은, 가디퀴모드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은, 가디퀴모드 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은, 가디퀴모드, 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근력 강화용 조성물을 제공한다.

가디퀴모드는 근원세포의 분화를 촉진하여 근관을 형성할 수 있으므로 근육 약화를 방지할 뿐만 아니라, 효과적으로 근육 기능을 개선할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 근육 약화 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 가디퀴모드의 처리에 따른 마이오신 중쇄(MyHC) 단백질의 배수변화 값을 In-Cell ELISA 분석으로 측정한 것이다.
도 2는 가디퀴모드의 농도별(0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 및 5 μM) 처리에 따른 마이오신 중쇄(MyHC) 단백질의 배수변화 값을 In-Cell ELISA 분석으로 측정한 것이다.
도 3은 가디퀴모드의 농도별(0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10 및 20 μM) 처리에 따른 근원세포의 분화 유도 효과를 분비형 루시퍼라제 리포터 시스템을 통해 측정한 것이다.
도 4는 근원세포에 대한 가디퀴모드의 세포독성을 측정한 것이다.
도 5는 가디퀴모드를 처리한 일차근원세포의 분화를 위상차현미경으로 확인한 것이다.
도 6은 가디퀴모드를 처리한 근원세포의 분화를 면역세포화학법으로 확인한 것이다.
도 7은 가디퀴모드를 처리한 근원세포에서 마이오신 중쇄(MyHC)의 발현을 웨스턴 블랏(western blot)으로 확인한 것이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명의 일 가디퀴모드(Gardiquimod)를 포함하는 근원세포(myoblast)의 인비트로(in vitro) 분화 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 상기 "가디퀴모드"는 IUPAC(International Union of Pure and Applied Chemistry)의 명칭이 "1-(4-Amino-2-((ethylamino)methyl)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-yl)-2-methylpropan-2-ol"인 화합물을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에서 사용한 가디퀴모드는 화학식이 C₁₇H₂₃N₅O이고 분자량이 313.405인 화합물이다. 일반적으로 가디퀴모드는 담즙에서 분비되는 담즙산의 일종으로, 톨유사수용체-7(Toll-like receptor-7; TLR-7) 작용제(agonist)로서, 면역반응을 변화시키는 작용을 하는 것으로 알려져 있으나, 근원세포 분화와의 연관성에 대해서는 전혀 알려진 바가 없다. 본 발명자들은 가디퀴모드에 근원세포 분화 용도가 있음을 최초로 규명하여 본 발명을 완성하였으며, 가디퀴모드의 구조는 하기 화학식 1에 나타난 바와 같다

[화학식 1]

본 발명에서 사용되는 용어, "근원세포 분화"란 단핵인 근원세포(myoblast)가 융합을 통해 다핵의 근관(myotube)를 형성하는 과정을 의미한다. 특히, 분화가 거의 끝나는 후기에는 마이오신 중쇄(MyHC, Myosin Heavy Chain)의 발현이 증가한다. 근원세포 분화와 관련하여, 근육 전구체 세포에 해당하는 근원세포는 자기복제(self-renewal)하는 경우에는 주로 Pax7⁺ 마커를 나타내며, 증식하는 경우 Pax7⁺/MyoD⁺를 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한, 근관을 형성하는 분화단계의 세포는 예컨대 Pax7^- MyoD⁺ MyoG⁺ 마커를 이용하여 구분할 수 있다. 상기 근관을 형성하는 분화 초기단계의 세포는 마이오신 D(MyoD)와 같은 근원성 전사인자(myogenic transcription factor)의 발현이 증가할 수 있고, 중기에는 마이오신 G(MyoG)가 증가할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "인비트로(in vitro)"란 임상화학검사나 연구에 있어서 시험관내에서 행하는 조작을 의미한다. 특히, 인비트로 연구는 검체를 채취해 시험관내에서 행하기 때문에 실험체를 직접적으로 다루지 않으므로 검사나 실험을 실시하기 용이하고, 윤리적인 문제가 발생하지 않는 장점이 있다.

상기 조성물은 혈청이 포함된 DMEM 분화용 배지일 수 있으나, 근원세포의 분화를 촉진할 수 있는 배지 또는 조성물이면 제한 없이 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 세포배양 또는 분화에 필요한 부가적인 물질을 더욱 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 가디퀴모드의 농도에 따른 세포독성을 평가한 결과, 20 μM 이하의 농도에서 가디퀴모드는 세포독성을 보이지 않으므로(도 4), 상기 근원세포의 인비트로 분화 촉진용 조성물은 가디퀴모드를 0.01 μM 내지 20 μM의 농도로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 가디퀴모드를 체외 근원세포에 처리하는 단계를 포함하는 인비트로에서 근원세포의 분화 촉진 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 근원세포의 분화 촉진 방법은 가디퀴모드를 체외 근원세포에 처리하여 분화를 촉진할 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 가디퀴모드를 근원세포에 처리하여 근원세포를 분화시키는 단계를 포함하는 인비트로에서 분화된 근원세포의 제조방법을 제공한다. 상기 제조방법은 가디퀴모드를 인비트로의 체외 근원세포에 처리하여 근원세포를 분화시키는 단계를 포함함으로써, 분화된 근원세포를 제조하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 가디퀴모드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"이란 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 화합물의 제형을 의미한다. 상기 약학적으로 허용 가능한 염은, 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플로로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리신산 등과 같은 유기 카본산, 메탄설폰산, 에탄술폰산, 벤젠설폰산 또는 p-톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염이 포함될 수 있다. 예를 들어, 약학적으로 허용되는 카르복실산 염에는, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 금속염 또는 알칼리 토금속 염, 라이신, 아르지닌, 구아니딘 등의 아미노산 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸) 메틸아민, 디에탄올아민, 콜린 및 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등이 포함될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "근력 약화"는 한 개 또는 그 이상의 근육의 힘이 감소된 상태를 의미한다. 상기 근력 약화는 어느 한 근육이나, 몸의 한쪽, 상지나 하지 등에 국한될 수도 있고, 전신에 걸쳐 나타날 수도 있다. 또한 근피로나 근육통을 포함하는 주관적인 근력 약화 증상은 이학적 검진을 통해 객관적인 방법으로 정량화될 수 있다.

본 발명에서 "근력 약화 관련 질환"은 근력약화로 인해 발생할 수 있는 모든 질환을 의미하며, 구체적으로 체내 근세포 수가 감소하거나 위성세포 활성이 감소되어 근원세포의 분화능력이 감소 혹은 약화된 질환으로 근원세포 분화 촉진을 통해 예방, 개선 혹은 치료를 기대할 수 있는 질환을 말한다. 본 발명에서 근력 약화 질환은 예를 들어 근감소증, 근위축증, 또는 심위축증일 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 근원세포의 분화 촉진을 통해 근감소증, 근위축증, 또는 심위축증의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "근감소증(sarcopenia)"은 노화에 따른 점진적인 골격 근육량의 감소를 의미한다. 직접적으로 근력의 저하를 유발하며 그 결과 각종신체기능의 감소 및 장애를 일으킬 수 있는 상태를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "근위축증(muscle atrophy)"은 사지의 근육이 거의 좌우대칭적으로 점점 위축되는 증상을 의미한다. 척수에 있는 운동신경섬유 및 세포의 진행성 변성을 유발하여 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)과 척수성 진행성 근위축증(Spinal progressive muscular atrophy, SPMA)을 일으킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "심위축증(acardiotrophy)"은 심장이 외부적이거나 내부적인 요인에 의해서 위축되어 가는 증상이다. 기아, 소모성질환, 노쇠했을때 심근섬유가 마르고 가늘어져 지방조직의 감소를 유발하는 심장의 갈색위축 증세를 일으킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "근육 퇴행 위축증(muscle dystrophy)"은 점진적인 근위축과 근쇠약이 나타나는 질환으로서, 병리학적으로 근육섬유의 괴사를 특징으로 하는 퇴행성 근육병증을 의미한다. 근세포막의 손상으로 근육섬유의 괴사와 퇴행과정을 거쳐 근력저하 및 위축이 발생하게 된다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 상기 조성물의 투여에 의해 근육 약화 관련 질환의 발병을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 근육 약화 관련 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 본 발명의 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

상기 약학적 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 근원세포의 분화를 촉진시킬 수 있다. 구체적으로, 가디퀴모드를 근원세포에 처리한 후, 근원세포의 분화정도를 위상차 현미경(Phase Contrast microscopy)으로 관찰한 결과, 음성 대조군(DMSO)에 비해 분화가 촉진되어 근관이 다수 형성되는 것을 확인하였으며(도 5), 면역세포화학법 및 웨스턴 블랏을 통해서도 근원세포의 분화 촉진 효과가 매우 높음을 확인하였다(도 6 및 도 7). 상기 결과는 가디퀴모드가 근원세포의 분화를 촉진하는데 효과적이며 근육 약화 관련 질환의 예방 및 치료에 유용할 수 있음을 시사한다.

본 발명의 다른 측면은 가디퀴모드 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품 조성물은 근육 약화 관련 질환을 예방 또는 개선하기 위하여 근육 약화 관련 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 질환 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 식품 조성물은 근원세포의 분화를 촉진하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

또한, 본 발명의 식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 가디퀴모드, 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근력강화용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "근력강화"는 신체 수행의 강화, 최대 지구력의 강화, 근육량의 증가, 근육 회복의 강화, 근육 피로의 감소, 에너지 수지의 개선 또는 이들의 조합 효과를 의미한다. 본 발명의 근력강화용 조성물은 근원세포를 근육 세포로 분화시키는 능력을 통하여 근육량을 증가시켜 전체 근육량을 증가시킬 수 있으며, 최대 지구력이 강화되고, 이에 따라 신체 수행이 강화되고 근육 피로도 감소할 수 있다. 또한, 근육 세포가 빠르게 대체될 수 있기 때문에 근육의 손상에 대하여 빠르게 치유될 수 있다. 본 발명의 근력 강화용 조성물은 사료 또는 사료 첨가제로 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "사료"는 동물의 생명을 유지하는데 필요한 유기 또는 무기 영양소를 공급하는 물질을 의미하고, "사료 첨가제"는 동물의 생산성 향상이나 건강을 증진시키기 위해 사료에 첨가되는 물질을 의미한다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1. 근원세포의 배양

실시예 1.1. 일차 근원세포 분리 및 배양

일차 근원세포를 분리하기 위하여 1 내지 5일 된 생쥐를 70% 에탄올로 세척한 후 CO₂를 사용하여 질식시켰다. 상기 실험쥐의 뒷다리 발목 윗부분과 무릎을 절단하여 1X 인산완충용액(phosphate-buffered saline, PBS)에 담그고, 멸균 상태의 핀셋으로 피부와 뼈를 제거하여 근육조직을 모았다. 모아진 근육조직을 1X PBS로 3번 세척한 후 잘게 조각을 내었다. 상기 조각난 근육조직에 1 ㎖ 콜라게나제(1.5 U/㎖), 1 ㎖ 디스파제(dispase, 2.4 U/㎖) 및 5 ㎕ CaCl₂(1 M)를 혼합한 효소용액을 첨가한 후 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 효소와 반응시킨 근육조직을 나일론 그물(Nylon mesh, 80 μM)로 필터링하여 뼈 등을 걸러내고, 800 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수득하였다.

상기 수득한 세포(일차 근원세포)를 2 ㎖ F10 배지(Invitrogen)에 다시 풀어 100 mm 일반 배양용기로 옮긴 것을 P1이라 하였으며, 1시간 간격으로 0.1% 젤라틴이 코팅된 배양용기로 옮기는 과정을 P5까지 반복하였다. 상기 세포들은 37℃에서 5% CO₂가 포함된 배양기에서 배양하였으며, 2일에 한 번씩 새로운 F10 배지로 교체해 주었다. 세포를 계대할 때는 0.005% 트립신을 사용하여 세포를 배양용기에서 분리시켰고, 근육세포로 분화를 유도할 때에는 5% 말 혈청(horse serum)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Invitrogen)을 사용하였다.

실시예 1.2. 근원세포주 C2Cl2의 배양

C2Cl2(American Type Culture Collection에서 구입)는 C3H 종의 생쥐에서 얻은 근원세포주로서, 근원세포의 분화 연구에 널리 사용되고 있다. 상기 C2C12 세포는 일반적인 세포 배양용 배지와 분화용 배지에서 각각 배양하였다. 정상적인 세포 배양용 배지(GM, growth media)로는 10% 어린 소혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 DMEM을 사용하였으며, 분화용 배지(DM, differentiation media)로는 2% 말 혈청이 포함된 DMEM을 사용하였다.

실시예 2. 근원세포(myoblast)의 분화 촉진 유도

실시예 2.1. In-Cell ELISA를 이용한 분화 촉진 탐색

일차 근원세포(Primary myoblast)에서 발현되는 마이오신 중쇄(MyHC)의 단백질 양을 비교하기 위하여 In-Cell ELISA 방법을 실시하였다.

구체적으로, 0.1% 젤라틴으로 코팅되어 있는 96-웰 플레이트에 웰당 5x10³ 개의 일차 근원세포를 접종하였고, 24시간 후에 5% 말 혈청이 첨가된 DMEM으로 바꿔 분화를 유도하였다. 24시간 마다 DMSO(5%) 또는 처리 농도의 화합물(chemicals), 또는 인슐린이 포함된 DMSO(5%)를 첨가한 새로운 배지로 교체하였다. 분화 후 3일째에 배지를 제거하고, 100 ㎕ 파라포름알데하이드(paraformaldehyde, 3.7%)를 상온에서 15분 처리하여 세포를 고정시켰다. 인산완충용액(1X PBS)으로 세척을 한 후, 0.1% 사포닌, 3% triton X-100, 0.009% 소듐 아자이드(sodium azide)가 포함된 100 ㎕ 투과용 버퍼(permeabilization buffer)를 상온에서 15분간 처리하여 세포막에 구멍을 뚫었다.

상기 세포를 다시 1XPBS로 세척한 후, 0.1% 알부민(bovine serum albumin)이 포함된 100 ㎕ 블로킹 버퍼(blocking buffer)로 상온에서 1시간 처리하였다. 상기 세포를 1XPBS로 3번 세척한 후, 1 : 500으로 희석된 1차 항체(SC-20641, Santa Cruz Biotechnology) 100 ㎕를 첨가하여 37℃에서 2시간 반응시켰다. 반응시킨 세포를 다시 1XPBS 로 3번 세척한 후, 1 : 10,000으로 희석한 2차 항체(Goat anti-Rabbit IgG-HRP) 100 ㎕를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 상기 세포를 1XPBS 로 3번 세척한 후, 50 ㎕ TMB 용액(Gen Depot #T3551)을 첨가하여 20분 동안 반응시켰고, 50 ㎕ 정지용액(stop solution, Gen Depot #T3552)을 첨가하여 반응을 멈추게 하였다. 상기 세포의 MyHC 단백질 수준을 분석하기 위하여 485 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 결과를 분석하였다(도 1).

특히, 분화과정은 구체적으로 일차 근원세포의 배양배지를 분화배지로 교체한 후 3일 동안 매일 새 분화배지로 배지를 교환함으로써 근육세포로의 분화를 유도하였다. 3일 후 In-Cell ELISA 실험을 통해 MyHC 단백질 수준을 비교하였다.

도 1을 참조하면, 0.5 μM 가디퀴모드의 분화 촉진 효과는 MYH 배수변화(fold change) 값이 1.18(n = 3)으로, DMSO 처리군(음성 대조군)과 비교하였을 때 현저히 증가하였고, 0.6 ㎍/㎖ 인슐린 처리군(양성 대조군)과 유사한 수준으로 나타났다. 상기 결과는 가디퀴모드가 약물 운반체인 DMSO보다 MYH 배수변화 값이 높아 분화를 촉진하며, 그 촉진 정도가 근육세포 분화 유도 약물로 이미 보고된 인슐린의 촉진 정도와 유사함을 시사한다.

실시예 2.2. 가디퀴모드의 농도에 따른 분화 유도 효과 확인

가디퀴모드를 근원세포에 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 및 5 μM 의 농도로 각각 처리(n = 3)한 후 MyHC 의 양을 In-Cell ELISA 방법을 통해 측정하였다(도 2). 그 결과, 도 2를 참조하면, 0.5 μM의 가디퀴모드를 처리한 경우, 분화 촉진 증가 효과가 우수하였으며, 0.1 내지 2 μM의 가디퀴모드를 처리한 경우 분화 촉진 효과가 유의하게 증가하였으며, 특히, 0.5 μM의 가디퀴모드를 처리하였을 때 분화 촉진 효과가 급격하게 증가하였다.

실시예 2.3. 분비형 루시퍼라제 리포터 시스템(Secreted luciferase reporter system)을 이용한 가디퀴모드의 근원세포 분화 유도 효과 확인

가디퀴모드의 근원세포의 분화 촉진능을 평가하기 위해, 분비형 루시퍼라제 리포터 시스템(secreted luciferase reporter assay)을 사용하였다.

구체적으로, 루시퍼라제 효소가 안정적으로 발현할 수 있는 분비형 루시퍼라제 C2C12(secreted luciferase C2C12) 근원세포를 96-웰 플레이트에 웰당 5x10³ 개를 접종하였고, 24시간 후에 5% 말 혈청이 첨가된 DMEM으로 바꿔 분화를 유도하였다. 24시간 마다 DMSO(5%) 또는 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10 및 20 μM의 가디퀴모드, 또는 인슐린이 포함된 DMSO(5%)를 첨가한 새로운 배지로 교체하였다. 분화 2일차에 C2C12 세포의 분화과정에서 분비된 루시퍼라제(luciferase) 효소를 포함하는 배지를 수집 하여 새로운 96-웰 플레이트에 각각 50 ㎕씩 분주한 뒤, 루시퍼라제 기질(luciferase substrate)인 코엘렌테라진(coelenterazine) 5 ㎕씩 넣어 반응시킨 후, 생성되는 빛을 루미노미터(luminometer)를 이용하여 측정하였다(도 3).

그 결과, 도 3을 참조하면, 0.5 μM 내지 10 μM의 가디퀴모드를 처리한 경우, 근육 분화 촉진 효과가 유의하게 증가하였다.

실시예 3. 가디퀴모드의 근원세포에 대한 세포독성 측정

가디퀴모드의 세포독성을 측정하기 위해 배양된 세포에서 세포독성에 관한 연구에 주로 사용하는 MTT(Tetrazolium-based colorimetric) 시험법을 사용하였다.

구체적으로, 세포 배양용 배지(GM)를 사용하여 96-웰 플레이트에 웰당 5x10³개의 일차 근원세포를 접종하였고, 24시간 후 분화용 배지(DM)에서 가디퀴모드를 농도별(0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 50 및 100 μM)로 각각 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 각각의 시료가 포함된 플레이트에 2 mg/ml 내지 5 mg/ml의 MTT 용액을 넣고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 4시간 방치하였다. 그 다음, MTT 용액을 제거하고 DMSO를 분주한 뒤 빛을 차단한 상태에서 플레이트를 10분 내지 30분 동안 충분히 흔들어 주었다. 그 다음, 플레이트 리더(plate reader)를 이용하여 500 nm 내지 600 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 완전한 세포사멸을 위한 대조군으로서 1 mM H₂O₂를 처리하였다. 세포 생존시에 생성되는 MTT 포르마잔(formazan) 수치를 DMSO 처리 대조군에 대한 비율로 표시하였다(도 4).

그 결과, 도 4를 참조하면, 가디퀴모드의 농도가 50 μM 이상인 경우, 세포생존률이 유의하게 감소하였으나, 20 μM 이하의 경우, 세포독성이 낮거나 없음을 확인하였다.

실시예 4. 가디퀴모드의 근원세포 분화 촉진 효과 확인

실시예 4.1. 위상차현미경(Phase contrast microscopy)를 통한 근원세포의 분화 확인

가디퀴모드에 의한 일차 근원세포에서 근관(myotube)의 다량 형성을 확인하기 위하여, 0.1% 젤라틴이 코팅된 덮개 유리에서 일차근원 세포(primary myoblast)를 약물전달체인 DMSO 및 가디퀴모드를 각각 0.5 μM씩 처리하면서 3일 동안 분화시킨 후 위상차현미경으로 관찰하였다(도 5).

그 결과, 도 5를 참조하면, 가디퀴모드 처리군의 경우, DMSO 처리군 보다 근관을 많이 형성하였으며, 상기 결과는 가디퀴모드가 근원세포의 분화를 촉진시킴을 시사하는 것이다.

실시예 4.2. 면역세포화학염색법(Immunocytochemistry)를 통한 근원세포의 분화 확인

DMSO(음성 대조군) 및 가디퀴모드를 각각 처리하면서 C2Cl2 세포주의 분화를 유도시킨 후, 3일째 되는 날 근원세포의 분화 정도를 비교하기 위해 MyHC에 대한 항체로 염색하여 단백질 발현을 확인하였다.

구체적으로, 0.1% 젤라틴이 코팅된 덮개 유리에서 C2Cl2 세포를 3일 동안 분화시켰다. 세포를 1X PBS로 세척한 후, 3.7% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 상온에서 15분간 고정 시키고, 1X PBS로 3번 세척한 후, 투과용 버퍼(permeabilization buffer)를 넣고 상온에서 15분간 반응시켰다. 다시 1X PBS로 3번 세척한 후 1% BSA가 들어있는 PBST(blocking buffer, 0.5% Tween 20이 포함된 PBS)로 30분간 반응시켜 불특정한 항체 결합을 억제하였다. MyHC에 대한 1차 항체(SC-20641, Santa Cruz Biotechnology)를 블로킹 버퍼(blocking buffer)에 1 : 500으로 희석하여 첨가한 후, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 1X PBS로 3번 세척한 후 블로킹 버퍼(blocking buffer)에 1 : 5,000으로 희석한 2차 항체(Goat anti-Rabbit IgG-HRP)를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응 시킨 후, 1X PBS로 3번 세척하였다. 덮개 유리를 슬라이드 유리에 올리고 형광 현미경으로 사진을 찍어 결과를 분석하였다(도 6).

그 결과, 도 6을 참조하면, DMSO 처리군에 비해 가디퀴모드 0.5 μM을 처리하였을 때 MyHC의 발현이 매우 증가하였다.

실시예 4.3. 웨스턴 블랏(Western blot)을 통한 근원세포의 분화 확인

배양용 배지에 C2C12 세포를 분주하여 24시간 배양한 후 분화 배지에 각각 DMSO 및 가디퀴모드를 각각 0.5 μM씩 매일 처리하면서 분화를 유도하였다. 분화 유도 3일째에 세포를 수득하여 1200 rpm에서 3 분간 원심분리하였다. 상기 세포에 100 ㎕ 라이시스 버퍼를 첨가한 후 초음파 분해(sonication)시키고, 3000 rpm에서 10분간 원심분리하여 수용성 단백질을 얻었고, 4X 샘플버퍼(sample buffer)를 첨가하여 끓는 물에서 5분간 반응시켰다. 10 ㎍의 단백질을 12% SDS-PAGE 겔에 로딩하여 전개한 후 와트맨 멤브레인(Watman membrane)으로 옮겼다. 상기 멤브레인을 5% 탈지유(skim milk)로 1시간 동안 상온에서 블로킹해주고, TTBS(0.03% Tween20, Tris 2.42 g, NaCl 9 g, pH 7.4, 1 L)로 5분씩 5번 세척하였다. 5% 탈지유가 포함된 TTBS에 1차 항체를 1 : 500으로 희석하여 첨가한 후 상온에서 2시간 반응시킨 다음, 다시 TTBS로 5분씩 5번 세척하였다. 다시 5% 탈지유가 포함된 TTBS에 2차 항체를 1 : 5,000으로 희석하여 첨가한 후 상온에서 2시간 반응시키고 TTBS로 5분씩 5번 세척한 후 ECL(Enhanced Chemiluminescent solution, Pierce)을 첨가하였다. 이후, 상기 멤브레인을 X-ray 필름에 노출시켜 단백질의 양을 확인하였다(도 7).

그 결과, 도 7을 참조하면, 가디퀴모드를 처리하였을 때, 대조군인 DMSO 처리군에 비하여 동량의 단백질에 포함된 MyHC 단백질의 양이 매우 증가하였다.

상기 결과는 가디퀴모드의 근원세포에 대한 분화 촉진 효과가 매우 높음을 시사하며, 이를 이용하여 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (8)

1. 가디퀴모드(Gardiquimod)를 포함하는 근원세포(myoblast)의 인비트로(in vitro) 분화 촉진용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 가디퀴모드의 농도는 0.01 μM 내지 20 μM인, 근원세포의 인비트로 분화 촉진용 조성물.
3. 가디퀴모드를 체외 근원세포에 처리하는 단계를 포함하는 인비트로에서 근원세포의 분화 촉진 방법.
4. 가디퀴모드를 체외 근원세포에 처리하여 근원세포를 분화시키는 단계를 포함하는 인비트로에서 분화된 근원세포의 제조방법.
5. 가디퀴모드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근감소증 및 심위축증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
6. 삭제
7. 가디퀴모드 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근감소증 및 심위축증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
8. 삭제

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