KR102560706B1

KR102560706B1 - 인도프로펜을 포함하는 조성물 및 그의 용도

Info

Publication number: KR102560706B1
Application number: KR1020150138617A
Authority: KR
Inventors: 조성천; 강종순; 박상철; 이윤일; 김혜빈; 이혜영
Original assignee: 삼성전자주식회사; 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2015-10-01
Filing date: 2015-10-01
Publication date: 2023-07-27
Also published as: KR20170039452A; US20170095451A1; US10610515B2

Abstract

인도프로펜을 포함하는 조성물 및 그의 용도를 제공한다.

Description

인도프로펜을 포함하는 조성물 및 그의 용도{Composition comprising indoprofen and use thereof}

인도프로펜을 포함하는 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.

PGC-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 alpha)는 전사활성 단백질로서 PPAR-감마 및 여러 핵 수용체와 결합하여 다양한 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. PGC-1α는 운동에 의해 근육 세포에서 그의 발현이 증가하며 근육 내 미토콘드리아의 생성(biogenesis) 및 혈관 형성을 촉진하고, 골격근에서 산화성 근섬유의 함량을 증가시킨다.

PGC-1α의 발현 및 산화성 근섬유의 중요성은 여러 연구를 통해 나타나고 있다. 비만 또는 노화 개체의 근육에서 PGC-1α의 발현은 저하되어 나타난다. 또한, PGC-1α 결핍 마우스에서 산화성 근섬유의 감소 및 미토콘드리아 기능의 저하는 근육 능력의 저하와 함께 비만을 동반한 대사질환을 일으키는 것으로 알려져 있다.

인도프로펜(indoprofen)은 비스테로이드성 항염증 약물이다. 기존 연구에서는 인도프로펜의 PGC-1α 관련 효과에 대해 알려진 바가 없었다.

Mitchell R. Lunn 등 (Chem Biol., vol.11, No.11, pp 1489-1493 (2004)) Isabelle Rieu 등(J. Physiol., 587.22, p. 5483-5492, 2009))

일 양상은 인도프로펜, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 용매화물을 유효 성분으로서 포함하는, 포유 동물의 세포 중 PGC-1α의 발현을 증가시키기 위한 조성물을 제공한다.

다른 양상은 인도프로펜, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 용매화물을 유효 성분으로서 포함하는, 근육 타입 중 타입 II를 타입 I로 변화시키거나 타입 I을 증가시키기 위한 또는 포유 동물의 근육 강화 또는 운동 능력을 증가시키기 위한 조성물을 제공한다.

다른 양상은 유효량의 인도프로펜, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 용매화물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 포유 동물의 세포 중 PGC-1α의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.

다른 양상은 유효량의 인도프로펜, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 용매화물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 근육 타입 중 타입 II를 타입 I로 변화시키거나 타입 I을 증가시키기 위한 또는 포유 동물의 근육 강화 또는 운동 능력을 증가시키기 위한 방법을 제공한다.

제1 양상은 인도프로펜, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 용매화물을 유효 성분으로서 포함하는, 포유 동물의 세포 중 PGC-1α의 발현을 증가시키기 위한 조성물을 제공한다.

제2 양상은 인도프로펜, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 용매화물을 유효 성분으로서 포함하는, 근육 타입 중 타입 II를 타입 I로 변화시키거나 타입 I을 증가시키기 위한 또는 포유 동물의 근육 강화 또는 운동 능력을 증가시키기 위한 조성물을 제공한다.

인도프로펜(indoprofen)은 4-(1-옥소-1,3-디히드로이소인돌-2-일)페닐 기를 갖는 프로피온산인 모노카르복시산이며, IUPAC 명칭은 2-[4-(1-옥소-1,3-디히드로-2H-이소인돌-2-일)페닐]프로피온산이다. 인도프로펜은 하기 식 I의 구조를 갖는 것일 수 있다.

[식 I]

상기 인도프로펜은 상업적으로 판매되는 것 또는 직접 합성한 것일 수 있다. 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은, 약학 분야에서 사용되는 통상의 산 부가염, 예를 들면 염산, 브롬산, 황산, 설팜산, 인산 또는 질산과 같은 무기산으로부터 유도된 염 및 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 시트르산, 말레산, 말론산, 메탄술폰산, 타르타르산, 말산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산, 톨루엔술폰산, 옥살산 또는 트리플루오로아세트산과 같은 유기산으로부터 유도된 염을 포함한다. 또한, 상기 염은 통상의 금속 염 형태, 예를 들면 리튬, 소듐, 칼륨, 마그네슘, 또는 칼슘과 같은 금속으로부터 유도된 염을 포함한다. 상기 산 부가염 또는 금속염은 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다.

"용매화물"이란 하나 이상의 용질 분자, 인도프로펜 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 하나 이상의 용매 분자에 의해 형성되는 복합체 또는 집합체를 의미한다. 용매화물은 예를 들면 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세트산과 형성된 복합체 또는 집합체일 수 있다.

상기 인도프로펜은 또한 그의 입체이성질체의 형태일 수 있다. 상기 입체이성질체는 거울상 이성질체(enantiomer) 및 부분입체이성질체(diastereomer)와 같은 모든 입체이성질체를 포함한다. 상기 인도프로펜은 입체이성질체의 순수 형태(stereoisomerically pure form) 또는 하나 이상의 입체이성질체의 혼합물, 예를 들면 라세미 혼합물일 수 있다. 특정 입체이성질체의 분리는 당해 분야에 공지된 통상의 방법 중 하나에 의해 수행될 수 있다.

상기 조성물은 인도프로펜 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 "유효량"으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에 있어서, "유효량"은 세포 중 PGC-1α의 발현을 증가시키기에 충분한 양일 수 있다. 상기 유효량은 또한 근육 타입 중 타입 II를 타입 I로 변화시키거나 타입 I을 증가시키기에 충분한 양일 수 있다. 상기 유효량은 또한 포유동물의 근육 강화 또는 운동 능력을 증가시키기에 충분한 양일 수 있다. 상기 유효량은 근감소증, 근위축증, 비만, 또는 당뇨병을 치료하기에 충분한 양일 수 있다.

용어 "치료"는 치료를 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우 치료 효과를 나타내기에 충분한 양을 의미한다. 용어 "치료"는 개체, 예를 들면 사람을 포함한 포유류에서 질환 또는 의학적 증상을 치료함을 의미하고, 이는 다음을 포함한다: (a) 질환 또는 의학적 증상의 발생을 예방, 즉, 환자의 예방적 치료; (b) 질환 또는 의학적 증상의 완화, 즉, 환자에서 질환 또는 의학적 증상의 제거 또는 회복 야기; (c) 질환 또는 의학적 증상의 억제, 즉, 개체에서 질환 또는 의학적 증상의 진행을 늦춤 또는 정지; 또는 (d) 개체에서 질환 또는 의학적 증상을 경감. 상기 "유효량"은 당업자가 적절하게 선택할 수 있다. 상기 "유효량"은 조성물당 0.01mg 내지 10,000mg, 0.1mg 내지 1000mg, 1mg 내지 100mg, 0.01mg 내지 1000mg, 0.01mg 내지 100mg, 0.01mg 내지 10mg, 또는 0.01mg 내지 1mg일 수 있다.

상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.

약학적 조성물인 경우, 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형을 갖는 것일 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제, 또는 그 조합일 수 있다. 경구 투여 제형은 주사제, 또는 피부 외용제일 수 있다. 피부 외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피 전달 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다.

식품 조성물인 경우, 상기 조성물은 하나 이상의 첨가제를 포함할 수 있다. 상기 첨가제는 농축 과즙 또는 분말 과즙; 수용성 또는 지용성 비타민류; 향미제; 아미노산, 핵산 또는 그들의 염류; 식물 섬유; 또는 미네랄류를 포함한다. 상기 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐제, 또는 드링크제 등 다양한 형태로 제형화될 수 있다.

제1 및 제2 양상에 있어서, 상기 조성물은 "근육 소모 질환"을 치료하는 것일 수 있다. 용어 "근육 소모 질환"은 근육량의 점진적인 감소를 수반하는 질환 또는 상태를 의미한다. 상기 근육은 골격근(skeletal muscle)일 수 있다. 상기 근육 소모 질환은 근감소증(sarcopenia) 또는 근위축증(muscular atrophy)일 수 있다. 근감소증은 나이와 연관된 골격근 질량, 질, 및/또는 강도의 퇴행적 감소일 수 있다. 골격근 질량의 퇴행적 감소는 50세 이후 매년 0.5-1 중량%의 골격근 질량의 감소일 수 있다. 근위축증은 골격근 섬유의 진행성 퇴행에 의해 야기된다.

상기 근육 소모 질환은 다양한 원인에 의해 유발될 수 있다. 상기 근육 소모 질환은 예를 들면, 노화에 의한 근감소증, 당뇨에 의한 근감소증, 비만에 의한 근감소증, 노화에 의한 근위축증, 장기 침상휴식(long-term bed rest)에 의한 근위축증, 치료용 보정물에 의한 근위축증, 또는 악액질(cachexia)에 의한 근위축증일 수 있다. 상기 조성물은 "근육 소모 질환"을 갖는 개체에 투여하기 위한 것일 수 있다.

상기 조성물은 근육 손실의 방지, 근육 재생 또는 분화 촉진, 운동수행능력 향상, 대사기능 향상, 또는 이들의 조합을 달성하기 위한 것일 수 있다.

골격근을 형성하는 근세포 또는 근섬유는, 적근 섬유(red muscle fiber) 또는 지근 섬유(slow-twitch muscle fiber)로 불리는 타입 I 근섬유와 백근 섬유(white muscle fiber) 또는 속근 섬유(fast-twitch muscle fiber)로 불리는 타입 Ⅱ 근섬유로 구분될 수 있다. 타입 I 근섬유는 미오글로빈의 함량이 높아 적색으로 보이며, 다량의 미토콘드리아와 산화효소를 포함하여 유산소성 대사를 한다. 타입 I 근섬유는 느리게 수축하나 잘 피로해지지 않는 특성이 있어 지구성(endurance) 유산소 운동에 이용된다. 타입 Ⅱ 근섬유는 미오글로빈이 적어 희게 보인다. 타입 II 근섬유는 빠르게 수축하고 속력(speed) 및 힘의 짧은 급방출(short burst)에 효율적이나, 쉽게 피로를 야기한다. 상기 조성물은 골격근을 이루는 근섬유 중 타입 II를 타입 I으로 변화시키거나 변화를 촉진하거나 타입 I 근섬유의 양을 증가시키는 것일 수 있다.

상기 대사기능의 향상은 에너지 소모율(energy expenditure)의 증가, 글루코스 내성(glucose tolerance)의 증가, 및/또는 체지방 비율의 감소를 포함할 수 있다.

제3 양상은 유효량의 인도프로펜, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 용매화물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 포유 동물의 세포 중 PGC-1α의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 유효량은 포유 동물의 세포 중 PGC-1α의 발현을 증가시키기에 충분한 양일 수 있다. 상기 세포는 근육 세포일 수 있다. 상기 근육 세포는 골격근 세포일 수 있다. 상기 근육 세포는 대퇴사두근(quadriceps muscle: Quad), 장딴지근(gastrocnemius muscle: GAS), 전경골근(tibialis anterior muscle: TA), 장지신근(extensor digitorum longus muscle: EDL), 또는 족저근(soleus muscle: SOL) 세포일 수 있다. PGC-1α의 저발현은 대조군 개체, 예를 들면, 정상인 유래 근육 세포에 비하여 PGC-1α유전자의 발현 수준이 낮은 것, 동일인에서 설정된 기간 전, 예를 들면 1년, 300일, 200일, 100일, 50일, 30일, 또는 10일 전에 비하여 PGC-1α유전자의 발현 수준이 낮은 것, 또는 설정된 값보다 낮은 것일 수 있다. PGC-1α의 저발현은 PGC-1α유전자가 전혀 발현되지 않는 것을 포함한다. 상기 투여는 세포 중 PGC-1α이 저발현되는 개체에게 투여하는 것일 수 있다. 또한, 상기 투여는 PGC-1α의 저발현으로 야기되는 질병을 갖는 개체에 투여하는 것일 수 있다. 상기 개체는 근육 소모 질환을 갖는 개체일 수 있다.

제4 양상은 유효량의 인도프로펜, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 용매화물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 근육 타입 중 타입 II를 타입 I로 변화시키거나 타입 I을 증가시키기 위한 또는 포유 동물의 근육 강화 또는 운동 능력을 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 상기 유효량은 근육 타입 중 타입 II를 타입 I으로 변화시키거나 또는 변화를 촉진시키거나 타입 I을 증가시키기에 충분한 양일 수 있다. 상기 투여는 근육 타입 중 타입 I의 양이 감소되어 있는 개체는 투여하는 것일 수 있다. 상기 감소는 대조군 개체, 예를 들면, 정상인 유래 근육 세포에 비하여 타입 I의 수준이 낮은 것, 동일인에서 설정된 기간 전, 예를 들면 1년, 300일, 200일, 100일, 50일, 30일, 또는 10일 전에 비하여 타입 I의 수준이 낮은 것, 또는 설정된 값보다 타입 I의 수준이 낮은 것일 수 있다. 상기 유효량은 포유동물의 근육 강화 또는 운동 능력을 증가시키기에 충분한 양일 수 있다. 근육 강화란 타입 II에 비하여 타입 I의 양이 상대적으로 많아지는 것, 산화성 대사가 증가하는 것, 악력이 증가하는 것, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 상기 투여는 근육이 약화되어 있거나 운동 능력이 약화되어 있는 개체는 투여하는 것일 수 있다. 상기 약화는 대조군 개체, 예를 들면, 정상인 유래 근육에 비하여 타입 I의 양이 상대적으로 적은 것, 산화성 대사가 적은 것, 악력이 약한 것, 또는 이들의 조합을 갖는 것, 동일인에서 설정된 기간 전, 예를 들면 1년, 300일, 200일, 100일, 50일, 30일, 또는 10일 전에 비하여 타입 I의 양이 상대적으로 적은 것, 산화성 대사가 적은 것, 악력이 약한 것, 또는 이들의 조합을 갖는 것, 또는 설정된 값보다 타입 I의 양이 상대적으로 적은 것, 산화성 대사가 적은 것, 악력이 약한 것, 또는 이들의 조합을 갖는 것일 수 있다. 상기 개체는 근육 손상에 의한 운동 기능 감소를 겪는 개체일 수 있다.

제3 및 제4 양상에 있어서, 상기 투여는 당해 분야에 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피(transdermal), 점막, 비강내(intranasal), 기관내(intratracheal) 또는 피하 투여일 수 있다. 상기 투여는 전신적 또는 국소적인 것일 수 있다. 상기 투여는 운동 기능이 감소된 부위로의 국소적인 투여일 수 있다. 상기 투여는 근육 조직에 투여하는 것일 수 있다. 상기 투여는 골격 근육에 투여하는 것일 수 있다. 상기 개체는 50세 이상의 사람, 또는 60세 이상의 사람, 예를 들면, 50세 내지 100세, 60세 내지 100세, 70세 내지 100세, 80세 내지 100세, 90세 내지 100세, 60세 내지 90세, 60세 내지 80세, 또는 60세 내지 70세일 수 있다. 상기 근육은 골격근일 수 있다. 상기 골격근은 안면 근육, 목 근육, 배 근육, 등 근육, 가슴 근육, 상지 근육, 또는 하지 근육일 수 있다. 상기 하지 근육은 대퇴사두근(Quad), 장딴지근(GAS), 전경골근(TA), 장지신근(EDL), 또는 족저근(SOL)일 수 있다.

제3 및 제4 양상에 있어서, 상기 투여는 1일당 체중 kg 당 0.1 mg 내지 1,000 mg, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5 mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10 mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg의 양으로 투여하는 것일 수 있다.

제3 및 제4 양상에 있어서, 상기 개체는 포유 동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 인간을 제외한 포유 동물일 수 있다. 상기 개체는 적근 섬유, 지근 섬유, 또는 타입 I 근섬유의 증가를 필요로 하는 개체일 수 있다.

도 1은 근아세포에서 인도프로펜의 농도에 따른 PGC-1α, 근육 분화 마커인 미오게닌 및 MHC, 미오글로빈, 및 미토콘드리아 단백질인 시토크롬 C의 발현 변화를 나타낸다.
도 2는 인도프로펜이 처리된 근아세포의 분화를 나타낸다.
도 3a는 인도프로펜이 투여된 마우스의 전경골근에서의 면역블롯팅 및 그의 정량 결과를 나타낸다.
도 3b는 인도프로펜이 투여된 마우스의 하지 근육을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 3c는 인도프로펜이 투여된 마우스의 장지신근에서 근섬유 타입의 변화를 나타낸다.
도 3d는 인도프로펜이 투여된 마우스의 장지신근에서 미토콘드리아 효소인 SDH 및 NADPH의 활성 변화를 나타낸다.
도 4a는 인도프로펜이 투여된 노화 마우스의 장지신근에서 미토콘드리아 효소인 SDH 및 NADPH의 활성 변화를 나타낸다.
도 4b는 인도프로펜이 투여된 노화 마우스의 하지 근육의 무게를 측정한 결과를 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: PGC1 -α 활성화 물질 스크리닝

1. PGC -1α 리포터 발현 C2C12 근아세포( myoblast ) 확립

C2C12 근아세포는 ATCC(Cat no. CRL-1722, American Type Culture Collection, USA)로부터 구입하였다. C2C12 근아세포에서 PGC-1α 유전자의 발현을 활성화시키는 화합물을 찾기 위해 PGC-1α 리포터를 발현하는 C2C12 세포주(이하 'PGC-1α 리포터 세포주' 또는 'C2C12-PGC-1α 세포주'라 한다.)를 구축하였다. 길이 1kb의 인간 PGC-1α 프로모터 하에 루시페라제(luciferase)와 dscGFP(destabilized Green Fluorescent Protein)를 발현하는 벡터를 제작하고, 이 벡터를 렌티바이러스에 삽입하여 C2C12 세포에 감염시켰다. 이 벡터를 유전적으로 안정하게 발현시키는 세포주를 선발하기 위해 벡터에 포함되어 있는 녹색형광단백질(Green fluorescent protein: GFP)로부터 나오는 형광을 모니터링하였다. 이 벡터의 선발 표지자인 푸로미신(puromycin)을 세포 배양액에 5 ㎍/ml로 첨가하고 PGC-1α 리포터를 발현하는 세포주를 선발하였다. PGC-1α 리포터 세포주에서 루시페라제의 발현 정도는 PGC-1α 프로모터가 받는 자극에 의존한다. 즉, 화합물이 PGC-1α 발현 유도물질이라면 PGC-1α 프로모터를 자극하여 루시페라제의 발현이 증가되고, PGC-1α 발현 억제물질이라면 루시페라제 발현은 감소된다. 발현 정도는 루시페라제의 기질을 첨가해서 나타나는 발광을 측정함으로써 화합물에 의한 PGC-1α 전사의 활성 또는 억제 정도를 측정하였다.

2. PGC -1α 리포터 세포주를 이용한 화합물 스크리닝

섹션1에서 제조한 C2Cl2-PGC-1α 리포터 세포주를 이용하여 한국 화합물 은행에서 제공된 2320종의 화합물에 대하여 PGC-1α 발현 조절 물질을 스크리닝하였다. 구체적으로, 96웰 플레이트의 각 웰 중의 10% 우태아혈청(fetal bovine serum: FBS) 함유 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco)에서 2일에 한번 배지를 교환하면서 70% 컨플루언시(confluent)가 될 때까지 5% CO₂ 배양기에서 C2C12-PGC-1α 리포터 세포를 배양하였다. 그 후 2320종의 화합물을 최종 농도 10μM로 DMSO에 녹인 후 각 웰에 100ul 첨가하고, 48시간 후 루시페라제에 의한 발광 정도를 측정하였다. 구체적으로, 세포 용해버퍼로서 Passive lysis buffer(50 mM Tris-Hcl, 7.5 mM MgCl₂, 750 mM NaCl, 5 mM EGTA, 1% Triton-x 100, 1mM Na₃VO₄, 10 mM NaF, 0.1 mM PMSF(phenylmethanesulfonylfluoride), PI(protease inhibitor) 10 ㎕에 세포를 용해시키고 루시페라제의 기질인 루시페린을 50 ㎕ 첨가하여 효소반응을 시킨 후 발광 정도를 측정하였다. 각 웰과 플레이트에 대해 측정값을 표준화시키고 화합물의 용매인 DMSO를 처리한 웰에서의 측정값을 대조군으로 하여 상대 비율로 표현하였다. 2320종의 화합물에 대하여 PGC-1α 프로모터 활성도를 측정한 결과, 대조군인 DMSO에 비해 2배 이상의 프로모터 활성도를 나타낸 상위 1.5% 화합물 8개를 선정하였다. 8개 화합물 중 PGC-1α 프로모터의 활성을 크게 증가시키면서 안전성이 큰 화합물인 인도프로펜(indoprofen)을 후보 물질로 선별하였다. 인도프로펜은 마우스 50%를 죽이는 농도인 lethal dose(LD)-50가 700 mg/마우스 몸무게 kg이다. 참고적으로, 아스피린의 ID₅₀는 250 mg/kg이다.

실시예 2: 근아세포에 대한 인도프로펜의 영향

1. 인도프로펜 처리된 근아세포에서 PGC -1α, 분화 마커 , 및 미토콘드리아 단백질의 발현 분석

C2C12 근아세포의 근육 세포로의 분화 유도시 인도프로펜에 의한 효과를 분석하였다. C2C12 근아세포의 배양시 성장 배지(growth media)로 15% 우태아혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)을 사용하고, 근육 세포로의 분화를 유도하기 위한 분화 배지(differentiation media)로서 2% 말혈청(horse serum)이 함유된 DMEM을 사용하였다. C2C12 근아세포의 근육 세포로의 분화 유도시, DMSO에 용해된 10 μM 또는 100 μM의 인도프로펜을 첨가하고, 대조군은 DMSO만을 첨가하였다. 48시간 동안 배양하여 분화를 유도한 후 수확된 세포에 RIPA 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton X100, 0.1% SDS, 2 mM EDTA, 0.5% sodium deoxycholate, Proteinase Inhibitor)를 첨가하여 30분간 용해한 뒤, 13,000 rmp에서 30분간 원심분리하였다. 세포 용해 시료 내의 단백질을 정량하여 동량의 단백질을 7% 또는 15% SDS-PAGE 전기영동 하였다. PVDF 막으로 전이한 후, 5% 무지방 우유를 함유한 차단 완충액(blocking buffer)에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 5% BSA에 희석한, 각 단백질에 특이적인 일차항체를 4℃에서 12시간 동안 막과 반응시킨 후, 세척 완충액(wash buffer)으로 5분간 3회 세척하였다. 이차항체를 차단 완충액에 희석하여 상온에서 막과 1시간 동안 반응시킨 후, 세척 완충액으로 5분간 3회 세척하였다. 그 후 ECL reagent (Roche)를 이용하여 X-ray 필름에 노출시켜 단백질 발현량을 확인하였다.

도 1은 근아세포에서 인도프로펜의 농도에 따른 PGC-1α, 근육 분화 마커인 미오게닌 및 미오신 중쇄, 미오글로빈, 및 미토콘드리아 단백질인 시토크롬 C의 발현 변화를 나타낸다. 미오글로빈은 심장 및 골격근에 존재하는 단백질로 혈중 산소를 근육 조직으로 운반하는 역할을 한다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 10 μM 또는 100 μM의 인도프로펜과 함께 배양된 근아세포에서 PGC-1α, 근육 분화 마커인 미오게닌 및 미오신 중쇄(MHC), 미오글로빈, 및 미토콘드리아 단백질인 시토크롬 C의 발현이 대조군에 비해 크게 증가하였다. 인도프로펜은 100 μM에서 최적 활성을 나타내었다.

도 1의 결과는, 인도프로펜이 근육 세포에서 PGC-1α의 유도제로 작용하고, 근아세포의 근육으로의 분화를 촉진한다는 것을 나타낸다. 또한, 인도프로펜에 의해 근육이 산화성 근육으로 변화하고 미토콘드리아의 대사가 촉진된다는 것을 나타낸다.

2. 인도프로펜 처리된 근아세포의 분화

C2C12 근아세포에 10 μM 또는 100 μM의 인도프로펜을 처리하고 3일간 분화시켰다. 대조군에는 DMSO를 처리하였다. MHC 항체를 이용하여 C2C12의 근관(myotube)을 형광 염색하였다. DAPI 염색을 통해 하나의 근관에 속하는 핵의 개수를 정량하였다. 2% 말혈청이 첨가된 DMEM에서 C2C12 세포를 72시간 동안 분화시켰다. 이 세포를 1X PBS로 세척한 후, 4% 파라포름알데하이드로 상온에서 15분간 고정시키고 1X PBS로 3회 세척하였다. 0.2% Triton-X가 첨가된 투과용 완충액(permeablizing buffer)과 10분간 반응시킨 후, 1X PBS로 3회 세척하였다. 5% 우태아혈청을 이용하여 상온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 일차 항체인 항-MHC를 5% 염소 혈청(goat serum)에 1:500으로 희석하여 4℃에서 12시간 동안 반응시킨 후, 1X PBS로 3회 세척하였다. 이차 항체인 항-마우스 IgG-HRP 594 (Invitrogen)를 5% 염소 혈청에 1:500으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 1X PBS로 3회 세척하였다. DAPI를 1X PBS에 1:10000으로 희석하여 1분간 반응시키고, 1X PBS로 세척한 후, 형광 현미경으로 분석하였다.

도 2는 인도프로펜이 처리된 근아세포의 분화를 나타낸다. (A)는 MHC 항체를 이용하여 C2C12의 근관(myotube)을 형광 염색한 결과를 나타낸다. (B)는 MHC 항체로 표지되는 핵의 비율을 나타낸다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 근아세포에 10 μM 또는 100 μM의 인도프로펜을 처리한 경우, 대조군에 비해 MHC 항체로 표지되는 핵의 비율이 유의하게 증가하여, 근아세포의 근관 형성 및 융합능이 증가하였다는 것을 확인할 수 있다. 이는 인도프로펜이 근아세포의 분화를 촉진한다는 것을 의미한다.

실시예 3: 동물 근육에 대한 인도프로펜의 영향

1. 인도프로펜 투여 마우스에서 PGC -1α의 발현 분석

10주령 C57BL/6 암컷 마우스를 온도 22±2℃, 습도 55±5%, 및 1일 12시간의 광주기 및 12시간의 암주기에서 사육하였다. 100 ㎕의 PBS 중 1.5 mg/kg의 인도프로펜 용액을 1일 2회 마우스에 경구 투여하였다. 대조군은 100 ㎕의 PBS를 1일 2회 경구 투여하였다. 음수는 자유로이 급여하였다. 2주간 인도프로펜의 급여 후 마우스의 골격근을 분리하여 면역블롯 분석을 수행하였다.

도 3a는 인도프로펜을 투여한 마우스의 전경골근에서의 면역블롯팅 및 그의 정량 결과를 나타낸다. 측정의 표준오차 *는 P<0.05를 나타낸다. 도 3a에서, (A)는 웨스턴 블롯팅에 의하여 얻어진 막의 사진이며, (B)는 (A)의 웨스턴 블롯팅 사진 중 PGC-1α 밴드 및 미오글로빈 밴드의 크기 정량을 인도프로펜을 투여하지 않은 마우스의 근육 정량값에 대하여 상대적으로 표시한 것이다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, PGC-1α의 발현 및 미토콘드리아 단백질인 미오글로빈의 발현이 대조군에 비해 증가하였다. 이는 인도프로펜의 투여에 의한 PGC-1α의 발현 증가가 골격근에서 미오글로빈의 발현을 증가시킨다는 것을 나타낸다.

2. 인도프로펜 투여 마우스에서 근육 변화 관찰

골격근에서 인도프로펜 투여에 의해 발현이 증가된 PGC-1α의 기능상 결과(functional consequence)를 평가하기 위하여, 상기 2주간 인도프로펜을 급여시킨 마우스의 하지 근육 및 장기를 분리하여 분석하였다.

도 3b는 인도프로펜이 투여된 마우스의 하지 근육을 관찰한 결과를 나타낸다. 도 3b에서, (A)는 각각 대조군 및 실험군 마우스의 하지 근육을 나타내는 사진이고 (B)는 마우스로부터 분리된 5가지 근육 즉, Quad, GAS, TA, EDL, 및 Sol을 나타낸다. 여기서, Quad는 대퇴사두근(quadriceps muscle), GAS는 장딴지근(gastrocnemius muscle), TA는 전경골근(tibialis anterior muscle), EDL은 장지신근(extensor digitorum longus muscle), 및 Sol은 족저근(soleus muscle)을 나타낸다. (C)는 인도프로펜 투여에 의해 심장의 크기 변화가 없다는 것을 나타낸다.

대퇴사두근 및 장딴지근은 주로 해당성 근섬유(glycolytic muscle fiber)가 많이 분포되어 있어서 백근(white muscle)으로 존재한다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, 인도프로펜을 투여한 마우스에서 대퇴사두근 및 장딴지근이 미토콘드리아의 양이 비교적 많은 산화성 근섬유를 많이 함유한 적근으로 전환되었다. 이는 인도프로펜 투여에 의한 PGC-1α의 발현 증가가 산화성 근섬유의 증가를 통해 백근을 적근으로 전환한다는 것을 나타낸다.

3. 인도프로펜 투여 마우스에서 근섬유 관찰

2a형 근섬유와 2b형 근섬유의 분포를 조사하기 위해 인도프로펜을 2주간 투여한 마우스의 장지신근에서 면역조직화학 염색을 수행하였다. 2a형 근섬유는 산화성 근섬유 타입으로서, 호기성(aerobic), 즉, 산소 의존성(oxygen dependent) 에너지원(energy source) 및 혐기성(anaerobic), 즉, 산소가 사용되지 않는 에너지원의 두 타입이 있다. 2b형 근섬유는 해당성 근섬유 타입으로서, 혐기성(anaerobic) 에너지원만을 포함한다.

-80℃의 초저온 냉동고에 보관된 동결 절편을 1x PBS에 2회 세척하였다. 4% 파라포름알데히드를 사용하여 15분간 상온에서 고정시키고, 1x PBS에 2회 세척하였다. 조직과 투과용 버퍼(0.2% Triton-X/PBS)를 30분간 상온에서 반응시키고 1x PBS에 2회 세척하였다. 조직과 Proteinase K를 37℃에서 10분간 반응시켜 항원성 부활(antigen retrieval)을 하고, 1x PBS에 2회 세척하였다. 차단 완충액(0.1% 젤라틴, 5% 염소 혈청, 0.5% BSA, 및 0.1% Triton-X) 중에 1시간 동안 두어 차단시켰다. 일차 항체로서 각각 MHC2a와 MHC2b에 특이적으로 결합하는 토끼 항체를 차단 완충액에 1:500으로 희석하여 4℃에서 12시간 동안 반응시킨 후, 1x PBS에 2회 세척하였다. 2차 항체인 항-토끼 항체를 반응시킨 후, 1x PBS에 2회 세척하였다. 그 후 봉입하여 형광 현미경(Nikon, 본체: Ti-u, 카메라: DS-RI1, 프로그램: NIS-elements BR 3.1)으로 분석하였다.

도 3c는 인도프로펜이 투여된 마우스의 장지신근에서 근섬유 타입의 변화를 나타낸다. 도 3c에서, (A)는 토끼 항-Myh2a 항체를 사용하여 장지신근의 동결 절편에 대하여 면역조직염색한 것을 나타내고, (B)는 토끼 항-Myh2a 항체를 사용하여 장지신근의 동결 절편에 대하여 면역조직염색한 것을 나타낸다. (A)에서 초록색은 항-Myh2a 항체에 의해 염색되는 근섬유, (B)에서 초록색은 항-Myh2b 항체에 의해 염색되는 근섬유를 나타낸다. 초록색으로 염색된 근섬유 수를 정량화한 그래프를 함께 나타내었다. 이 그래프에 나타낸 바와 같이, 인도프로펜이 경구 투여된 마우스의 장지신근에서 산화성 근섬유인 2a형 근섬유의 수가 인도프로펜을 투여하지 않은 대조군 마우스 근육에 비해서 증가하였다. 반면, 해당성 근섬유인 2b형 근섬유의 수는 감소하였다. 이는, 인도프로펜의 투여가 미토콘드리아의 활성도가 높은 산화성 근섬유를 증가시키고 해당성 근섬유를 감소시킨다는 것을 나타낸다.

4. 인도프로펜 투여 마우스에서 미토콘드리아 효소의 활성 분석

인도프로펜을 2주간 투여한 상기 마우스의 장지신근에서 숙시네이트 데히드로게나제(succinic dehydrogenase: SDH) 및 NADPH에 대한 염색을 수행하였다. 이 염색 방법은 미토콘드리아의 전자전달계 관여 효소인 SDH 및 NADPH의 활성을 측정하여 미토콘드리아의 활성도를 분석하는 방법이다. SDH 및 NADPH 염색은 산화성 근섬유의 함량을 나타낸다.

장지신근을 분리 즉시 액화질소를 이용하여 OCT compound로 동결고정한 후, 동결절편기를 이용하여 7 ㎛ 두께로 절단하였다. SDH 염색의 경우, 동결절편화 조직을 SDH가 함유된 0.2 M 인산 완충액(pH 7.4)에서 37℃에서 10분 동안 반응시킨 후 증류수로 세척한 후 봉입하여 관찰하였다. NADPH 염색의 경우, 0.9 mM NADH, 0.9 mM NADH, 및 1.5 mM 니트로블루 테트라졸리움이 함유된 3.5 mM 인산염 완충액(pH 7.4)에서 30분간 반응시킨 후 증류수로 세척한 후 봉입하여 관찰하였다.

도 3d는 인도프로펜이 투여된 마우스의 장지신근에서 미토콘드리아 효소인 SDH 및 NADPH의 활성 변화를 나타낸다. 도 3d에서 (A)는 동결절편화 조직에서 SDH를 염색한 사진이다. (B)는 (A)에서 염색된 영역을 강도에 따라 3 부분, 즉, 짙음(dark), 중간(intermediate), 및 옅음(pale)으로 나누어 그 비율을 표시한 것이다. (C)는 NADPH를 염색한 사진이고, (D)는 염색된 영역을 짙음, 중간, 및 옅음으로 나누어 그 비율을 표시한 것이다. 도 3d에 나타낸 바와 같이, 인도프로펜을 투여한 마우스의 장지신근에서 대조군에 비해 SDH 및 NADPH 활성이 증가된 근섬유의 비율이 높았다. 이는, 인도프로펜의 투여가 근섬유에서 미토콘드리아의 에너지 대사를 활성화시킨다는 것을 나타낸다.

실시예 2 및 3의 결과는, 인도프로펜이 근아세포 및 골격근에서 PGC-1α의 발현을 증가시키고, 이에 의해 미토콘드리아를 많이 함유하고 에너지 대사가 활발한 산화성 근섬유로의 전환이 이루어진다는 것을 나타낸다.

실시예 4: 노화 동물에서 미토콘드리아 효소의 활성 및 근육에 대한 인도프로펜의 영향

1. 인도프로펜 투여 노화 마우스에서 미토콘드리아 효소의 활성 분석

25개월령 노화 암컷 마우스(체중 30g)를 4주간 실험군은 콘오일(corn oil)과 섞은 인도프로펜을 투여하고 대조군은 콘오일만 경구 투여하였다. 25개월령 마우스는 마우스 평균 수명과 인간 평균 수명의 비율로 계산하여 보면, 인간의 경우 약 70 내지 75세에 해당한다. 4주간 인도프로펜을 경구 투여한 상기 노화 마우스의 장지신근에서 실시예 3의 4.에 기재된 방법과 동일한 방법으로 SDH 및 NADPH에 대한 염색을 수행하였다.

도 4a는 인도프로펜이 투여된 노화 마우스의 장지신근에서 미토콘드리아 효소인 SDH 및 NADPH의 활성 변화를 나타낸다. 도 4a에서 (A)는 동결절편화 조직에서 SDH를 염색한 사진이다. (B)는 (A)에서 염색된 영역을 강도에 따라 3 부분, 즉, 짙음, 중간, 및 옅음으로 나누어 그 비율을 표시한 것이다. (C)는 NADPH를 염색한 사진이고, (D)는 염색된 영역을 짙음, 중간, 및 옅음으로 나누어 그 비율을 표시한 것이다. 도 4a에 나타낸 바와 같이, 인도프로펜을 투여한 노화 마우스의 장지신근에서 대조군에 비해 SDH 및 NADPH 활성이 증가된 근섬유의 비율이 높았다. 이는, 인도프로펜의 투여가 노화동물의 근섬유에서도 미토콘드리아의 에너지 대사를 활성화시킨다는 것을 나타낸다.

2. 인도프로펜 투여 노화 마우스에서 근육의 무게 변화 분석

노화 동물의 인도프로펜 투여에 의해 근육의 무게 변화를 분석하기 위하여, 상기 4주간 인도프로펜을 급여시킨 25개월령 노화 암컷 마우스(체중 30g)의 하지 근육을 분리하여 분석하였다.

도 4b는 인도프로펜이 투여된 노화 마우스의 하지 근육의 무게를 측정한 결과를 나타낸다. Sol, Gas, EDL, 및 TA는 각각 족저근, 장딴지근, 장지신근, 및 전경골근을 나타낸다. 도 4b의 결과는, 인도프로펜 투여에 의해 노화 동물에서 하지 근육의 무게가 증가한다는 것을 나타낸다.

Claims

인도프로펜, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 용매화물을 유효 성분으로서 포함하는, 포유 동물의 세포 중 PGC-1α의 발현을 증가시키기 위한 약제학적조성물로서, 상기 조성물은 PGC-1α의 저발현으로 야기되는 개체의 질병의 치료를 위한 것으로서, 상기 질병은 근감소증(sarcopenia), 또는 근위축증(muscular atrophy)인 것이고, 상기 개체에서 근감소증 또는 근위축증이 비유전성(non-inherited)인 것인 약제학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 세포가 근육 세포인 것인 조성물.
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청구항 1에 있어서, 상기 근위축증이 노화, 장기 침상휴식(long-term bed rest), 치료용 보정물, 또는 악액질(cacahexia)에 의한 것인 조성물.
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인도프로펜, 그의 식품으로 허용가능한 염, 또는 용매화물을 유효 성분으로서 포함하는, 포유 동물의 세포 중 PGC-1α의 발현을 증가시키기 위한 식품 조성물로서, 상기 조성물은 PGC-1α의 저발현으로 야기되는 개체의 질병의 개선을 위한 것으로서, 상기 질병은 근감소증(sarcopenia), 또는 근위축증(muscular atrophy)인 것이고, 상기 개체에서 근감소증 또는 근위축증은 비유전성(non-inherited)인 것인 식품 조성물.
청구항 17에 있어서, 상기 세포가 근육 세포인 것인 조성물.
청구항 17에 있어서, 상기 근위축증은 노화, 장기 침상휴식(long-term bed rest), 치료용 보정물, 또는 악액질(cacahexia)에 의한 것인 조성물.