JP6437467B2 - 線維化疾患治療において有用な分子標的及び化合物、並びにこれらの同定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、分子生物学及び生化学の分野である。本発明は、線維化疾患の治療に有用な物質、特に代替活性化(M2)表現型へのマクロファージ分化を減少又は阻害する物質を同定する方法に関する。代替活性化(M2)表現型への分化の減少又は阻害は、代替活性化(M2)マクロファージが役割を果たす線維化状態及び他の疾患の予防及び/又は治療において有用である。特に本発明は、線維化疾患の予防及び/又は治療において使用するための物質を同定する方法を提供する。
線維症は、線維芽細胞による瘢痕組織の過剰な沈着を特徴とし、これは現在、それに対し治療法のない最大の疾患群の一つである。線維症は、肺、心臓、腎臓、肝臓及び皮膚が冒される様々な慢性疾患における、臓器不全に関連した罹患及び死亡の原因である。先進国での全死亡例のほぼ45%は、心臓血管疾患、肺線維症、糖尿病性腎症及び肝硬変を含む、線維化状態により引き起こされるか又はこれに関連していると推定される(Wynnらの文献、2004)。
本発明は、本明細書に開示された標的物(TARGET)の発現及び/又は活性を阻害する物質は、M2マクロファージのマーカーの発現及び/又は放出の阻害、特にCCL18及び/又はCD206の放出又は発現の抑制により示されるように、マクロファージの代替活性化マクロファージ(M2マクロファージ)への分化を減少又は阻害することが可能であるという発見を基にしている。従って、本発明は、マクロファージのM2マクロファージへの分化において役割を果たす標的物、標的物の発現及び/又は活性をダウンレギュレートすることが可能な物質のスクリーニング方法、並びにマクロファージのM2マクロファージへの分化を阻害することによる、線維症、特に代替活性化マクロファージに関連した疾患の予防及び/又は治療におけるこれらの物質の使用を提供する。本発明は、特に線維症及び線維化疾患による、M2マクロファージの形成及び生物学に関与している標的物を提供する。特定の態様において、本発明は、線維症の発症に関与しているかそうでなければ関連している標的物を提供する。
a)線維化状態の治療において使用するための、標的物ポリペプチドへ特異的に結合する、抗体又はそれらの断片を含む、医薬組成物、
b)線維化状態の治療において使用するための、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉RNA(siRNA)、及び短ヘアピンRNA(shRNA)からなる群から選択される物質を含む、医薬組成物であって、ここで該物質が、線維化状態の治療において使用するための、標的物ポリペプチドをコードしている選択された核酸配列の約17〜約30の近接ヌクレオチドの天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的な核酸配列、又はこれから操作された核酸配列を含む、医薬組成物:に関する。
(定義)
下記の用語は、以下に提示された意味を有することが意図され、且つ本発明の説明及び意図された範囲を理解する上で有用である。
本出願人の発明は、特に増加した数のM2マクロファージ又は増強されたマクロファージのM2マクロファージへの分化に関連された、線維化状態及び障害の治療、予防及び緩和に関連している。
一態様において、本発明は、線維症の治療に有用な化合物を同定する方法であって:
a)被験化合物を、配列番号:26-50からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの断片及び機能性誘導体と接触させる工程;
b)被験化合物の該ポリペプチドへの結合親和性を測定する工程;
c)被験化合物を、マクロファージ細胞集団と接触させる工程;
d)マクロファージのM2マクロファージへの分化に関連した特性を測定する工程;並びに
e)マクロファージのM2マクロファージへの分化を減少又は阻害し、且つ該ポリペプチドへの結合親和性を示すことが可能な化合物を同定する工程:を含む、方法に関する。
a)被験化合物を、配列番号:26-50からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードしている核酸、又はそれらの断片及び機能性誘導体と接触させる工程;
b)被験化合物の該核酸への結合親和性を同定及び/又は測定する工程;
c)被験化合物を、マクロファージ細胞集団と接触させる工程;
d)マクロファージのM2マクロファージへの分化に関連した特性を測定する工程;並びに
e)マクロファージのM2マクロファージへの分化を減少又は阻害し、且つ該ポリペプチドへの結合親和性を示すことが可能な化合物を同定する工程:を含む、方法に関する。
a)被験化合物を、配列番号:26-50からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの断片及び機能性誘導体と、又は配列番号:26-50からなる群から選択されるアミノ酸をコードしている核酸又はその機能性誘導体と接触させる工程;
b)被験化合物の該ポリペプチド又は核酸への結合親和性を同定及び/又は測定する工程;
c)被験化合物を、マクロファージ細胞集団と接触させる工程;
d)マクロファージのM2マクロファージへの分化に関連した又は指標とする特性を測定する工程;並びに
e)マクロファージのM2マクロファージへの分化を阻害又は減少し、且つ該ポリペプチド又は核酸への結合親和性を示すことが可能な化合物を同定する工程:を含む、方法に関する。
a)被験化合物を、配列番号:26-50からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの機能性断片及び機能性誘導体と接触させる工程;
b)該ポリペプチドの活性を測定する工程;
c)被験化合物を、マクロファージ細胞集団と接触させる工程;
d)マクロファージの代替活性化マクロファージへの分化に関連した特性を測定する工程;並びに
e)マクロファージのM2マクロファージへの分化を減少又は阻害すること、及び該ポリペプチドの活性を阻害することが可能な化合物を同定する工程:を含む、方法に関する。
a)被験化合物を、配列番号:26-50からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの機能性断片及び機能性誘導体と、接触させる工程;
b)該ポリペプチドの活性を測定する工程;
c)被験化合物を、マクロファージ細胞の集団と接触させる工程;
d)マクロファージの代替活性化マクロファージへの分化に関連している特性を測定する工程;並びに
e)マクロファージのM2マクロファージへの分化を減少又は阻害し、且つ該ポリペプチドの活性を阻害することが可能な化合物を同定する工程:を含む、方法に関する。
a)被験化合物を、配列番号:26-50からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの機能性断片及び機能性誘導体と、又は配列番号:26-50からなる群から選択されるアミノ酸をコードしている核酸若しくはそれらの機能性誘導体と、接触させる工程;
b)該ポリペプチドの発現又は活性を測定する工程;
c)該ポリペプチドの発現又は活性を阻害することが可能な化合物を同定し、これにより、該ポリペプチドの発現又は活性の阻害が、マクロファージのM2マクロファージへの分化の減少又は阻害を生じるか又はこれに関連している工程:を含む、方法に関する。
a)被験化合物を、配列番号:26-50からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現するマクロファージ細胞の集団と接触させる工程;
b)該細胞中の該ポリペプチドの発現、活性及び/又は量を測定する工程;
c)マクロファージのM2マクロファージへの分化に関連した特性を測定する工程;並びに
d)該ポリペプチドの発現、活性及び/又は量の減少を生じ、且つマクロファージのM2マクロファージへの分化を減少又は阻害することが可能な化合物を同定する工程:を含む、方法に関係する。
a)被験化合物を、配列番号:26-50からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現するマクロファージ細胞の集団と接触させる工程;
b)該細胞中の該ポリペプチドの発現、活性及び/又は量を測定する工程;
c)マクロファージのM2マクロファージへの分化に関連した特性を任意に測定する工程;並びに
d)該ポリペプチドの発現、活性及び/又は量の減少を生じ、且つマクロファージのM2マクロファージへの分化を減少又は阻害することが可能な化合物を同定する工程:を含む、方法に関係する。
(発現阻害性物質)
本発明の方法の特定の実施態様において、被験化合物は、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、短ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)及び低分子干渉RNA(siRNA)からなる群から選択される。
特定の薬物候補化合物は、低分子量化合物である。例えば分子量500ダルトン以下の低分子量化合物は恐らく、生物学的システムにおいて良好な吸収及び浸透を有し、且つ結果的に分子量500ダルトンを上回る化合物よりも成功する薬物候補である可能性がより大きい(Lipinskiらの文献、2001)。ペプチドは、別の特定の薬物候補化合物クラスを構成する。ペプチドは、優れた薬物候補であることができ、妊娠促進ホルモン及び血小板凝集阻害剤などの、商業的に価値のあるペプチドの複数の例が存在する。天然の化合物は、薬物候補化合物の別の特定のクラスである。そのような化合物は、天然の供給源中に発見され、且つそこから抽出され、これはその後合成されることができる。脂質は、別の特定の薬物候補化合物のクラスである。
別の薬物候補化合物の好ましいクラスは、抗体である。本発明はまた、標的物に対して向けられた抗体も提供する。これらの抗体は、細胞内の標的物へ結合するように内在性に産生されるか、又は細胞の外側に存在する標的物ポリペプチドに結合するように組織に添加されてよい。これらの抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってよい。本発明は、キメラ抗体、単鎖抗体及びヒト化抗体、更にはFAb断片及びFAb発現ライブラリーの産物、並びにFv断片及びFv発現ライブラリーの産物も含む。
標的物ポリペプチドへ特異的に結合する抗体又は断片、並びにアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)及び短ヘアピンRNA(shRNA)からなる群から選択される発現阻害性物質は、マクロファージのM2マクロファージへの分化に因果関係があるか又はこれに起因する哺乳類における状態の治療のために治療薬として使用することができる。
本発明はまた、マクロファージのM2マクロファージへの分化を減少又は阻害するインビトロ方法も提供し、該方法は、マクロファージ細胞の集団を、標的物ポリペプチドの活性又は発現のインヒビターと接触させることを含む。特定の実施態様において、該インヒビターは抗体である。代替の実施態様において、該抗体はモノクローナル抗体である。
本発明は、以下に提供される実施例を使用し、更に例示される。実施例は、慣習的適合を使用し、特定の型の条件、規模又は細胞型に容易に改変及び適合させることができることは、当業者には明らかであろう。
(1.1 アッセイのバックグラウンド)
M2マクロファージは、ヒト末梢単球由来のM0マクロファージを、IL-4及びIL-10の組合せでプライミングすることにより、作製することができる。極性化されたM2マクロファージは、高レベルの分泌型CCL18並びに表面-結合型マーカーCD163及びCD206を発現する。更に当業者は同じく、いくつかの陽性対照を、IL-4及びIL-10のシグナル伝達経路に関する入手可能な文献、並びにCCL18のリードアウトを基に選択され得ることを認めるであろう。
M0マクロファージを得るために、50歳を超えない健常ドナー由来のバフィーコートを、末梢血単核細胞PBMCの単離のために、血液バンク(Sanquin、オランダ)から購入した。この単離は、フィコール-パケPLUS勾配(GE healthcare社、カタログ番号17-1440-03)を用いて行い、引き続きCD14+単球を、CD14マイクロビーズ(Miltenyi社、カタログ番号130-050-201)を使用し抽出した。CD14単離後、フローサイトメトリー分析(Facscalibur BD)及びCellQuest Proソフトウェアを使用し、純度に関するQCを、CD14蛍光標識された抗体染色を基に、単離されたCD14+画分について行った。
STAT6_v5を、IL-10及びIL-4経路に関する公的に入手可能なリソース(例えば、Sicaらの文献、2012)を基に、陽性対照としてのCCL18_v1、IL-4R_v6、JAK1_v23及びSTAT6_v6と一緒に使用した。ffluc_v19、ffluc_v24及びluc_v13は、非発現遺伝子(各々、ホタルルシフェラーゼ及びルシフェラーゼ)に対するshRNAであり、陰性対照として使用した。
表2. M2マクロファージアッセイにおける対照のノックダウン配列のまとめ
高結合MSDプレートを使用するCCL18検出アッセイを、開発し且つ自動化した。市販のCCL18 ELISAにおいて使用される抗体対を、384-ウェルのメソスケールディスカバリー(MSD)アッセイと共に使用した(MSD技術の概要については、http://www.mesoscale.com/CatalogSystemWeb/WebRoot/technology/ecl/ walkthrough.htm参照)。自動化は、Bravoシステム(Agilent社)上で行った。自動化は、Bravoシステムを用いて行った。白色の384-ウェル高結合プレート(Lumitrac 600、Greiner Bio-one社)を使用し、PBS中CCL18捕獲抗体(ヒトCCL18/PARC MAb(クローン64507)、マウスIgG1、R&D Systems社)でコーティングし、4℃でインキュベーションした(o/n)。プレートを、PBS-Tween中の5%BSAによりRTで1時間ブロックした。プレートのブロック及び洗浄後、単独濃度のCCL18及び標準曲線を、プレートに追加し、RTで2時間インキュベーションした。その後、プレートを洗浄し、ビオチン標識したCCL18検出抗体(CCL18/PARCビオチン化された親和性精製したPAb、ヤギIgG、R&D Systems社)と共にインキュベーションした。引き続き、これらのプレートを、洗浄緩衝液(PBS-Tween)中で3回洗浄し、試薬緩衝液(PBS-Tween中1%BSA)中のストレプトアビジン-HRP(カタログ番号DY998、R&D Systems社)と共にインキュベーションした。振盪しながら室温で30分間インキュベーションした後、プレートを、洗浄緩衝液で3回洗浄し、その後15分前に調製したルミネセント基質(BM化学発光ELISA基質(HRP)、Roche社)を添加した。およそ5分後、プレートを、Envision装置(PerkinElmer社)において、Victor Wallacソフトウェアを使用し、測定した。
一次スクリーンは、完全アデノウイルスshRNAライブラリーを含むshRNA構築体(4438遺伝子に対し設計された12210 shRNA構築体)を用いて行った。このライブラリーは、34×384-ウェルプレートからなり、且つスクリーンは、生物学的2つ組みで行った。パイロットスクリーンを基に、MOI4を選択した。全ての個別の384-ウェルソースプレートは、縦列13及び14に配置された、12の陰性対照ウェル及び20の陽性対照ウイルスを含んだ(図1)。追加のQCプレートも測定した。QCプレートは、試料希釈因子を決定するために、縦列13及び14に配置された対照ウイルスのみ含んだ。残りのウェルは、陰性対照の性能及びプレート間変動を評価するために、アデノウイルスにより形質導入されなかった細胞からなった。全体で、3つの希釈を、使用した3種のドナー全て(ドナーCQ、CR及びCU)由来のQC試料で作製した。縦列21を、CCL18標準のために使用し、個別に各ドナーについての最適希釈因子を決定した。5つの陽性対照中の3つは、陰性対照と比べ、40%を超える阻害を生じなければならない。プロトコールの設定を、図2に概説している。
試料集団は、Shapiro-Wilk検定を基に、非ガウス分布を有し、且つ正規化が必要であった。平均及びSDの代わりに中央値及び中央絶対偏差値(MAD)を利用する、ロバストZ-スコアを使用した(Zhangらの文献、2006)。この正規化法は、極値及び分布の非対称に対し感度が余り良くなく、従って生データポイントで観察された歪のある試料分布に適していた。可能性のあるプレート効果を、色分け図(heat map)を用いて評価した。
3つのQCプレートの全てについて、非形質導入試料は、プレート間変動をほとんど示さず(データは示さず)、且つ陰性対照は、無ウイルス対照と比べ、25%以内の減少及び帰納範囲(induction range)に留まった。
(2.1 バックグラウンド)
実施例1に記載と同じアッセイの設定を使用する再スクリーンを、一次スクリーンに続けた。一次M2マクロファージ分化スクリーン(実施例1)において同定された999ウイルスを、再スクリーンにおいて更に評価した。再スクリーンのために、異なる形質導入プレートレイアウトを設計した。このレイアウトにおいて、外側ウェルは省略し、陰性対照を、可能性のあるプレート効果を検出することができるようは方式で配置した。更にヒットコーリング解析は、陰性対照の平均を基に行われたので、プレート含量の>30%は、陰性対照からなった。一次スクリーンから同定されたヒットは全て、再増幅させ(repropagate)、プレート全体に無作為に分布させた。
再スクリーンは、8個の384-ウェルプレートからなり、且つ1ドナーにおいてMOI4で、生物学的2つ組で行った。細胞は、実施例1と同じプロトコールに従い入手した。全ての個別の384-ウェルソースプレートは、図4に示したようにプレート全体に分布された80の陰性対照及び12の陽性対照ウイルスを含んだ。このアッセイ設定は、一次M2マクロファージ分化スクリーンと同一であった(実施例1参照)。プレートレイアウトに従い対照のみを含むQCプレートを、本アッセイに含んだ。QCプレートを使用し、CCL18分泌が測定される上清のための希釈因子を決定した。試料は、1:37.5で希釈した。
データの正規化は、平均陰性対照を基にしたロバストZスコアを用いて行った。陰性対照を基にしたロバストZスコアは、リードアウト値から陰性対照の中央値を減算したものを陰性対照のMAD(中央絶対偏差値)で除算することにより計算した。2つ組値の性能を評価するために、試料値を基にしたスピアマン相関係数を計算した。
図5において、再スクリーンの対照及び試料性能が示され、この図において、陽性対照と陰性対照の明らかな分離を認めることができる。2つ組データ点間の強力な相関は、平均スピアマン 0.93で、2つ組プレートにつき0.91から0.96までの範囲で認められた。陰性対照と比較した陽性対照の性能を基に、B-スコアカットオフ値-1.3を、ヒットコーリングに使用した。このカットオフ値により、いずれの陰性対照も、ヒットとして同定されず、陽性対照の100%が、ヒットとして同定された。
(3.1 アッセイのバックグラウンド)
600種の確認した候補標的物を、その阻害がマクロファージのM2マクロファージへの分化を阻害した一次スクリーン及び再スクリーンにおいて同定した(実施例1及び2)。これらのshRNAは、古典的に活性化されたM1マクロファージの発達を妨害しないことを評価するために、標的の発現を阻害し、次にM1表現型を阻害するshRNA構築体を除外する、M1対比スクリーンを開発した。
マクロファージを得るために、健常ドナー由来のバフィーコートを、末梢血単核細胞PBMCの単離のために、血液バンク(Sanquin、オランダ)から購入した。この単離は、フィコール-パケ勾配(GE healthcare社)を用いて行い、引き続きCD14+単球を、CD14マイクロビーズ(Miltenyi社、カタログ番号130-050-201)を使用し抽出した。CD14単離後、フローサイトメトリー分析(Facscalibur BD社)及びCellQuest Proソフトウェアを使用し、純度に関するQCを、CD14蛍光標識された抗体染色により、PBMC及び単離されたCD14+画分について行った。
分泌されたTNFαを、製造業者のプロトコールに従い、均一時間分解蛍光(HTRF)技術(Cisbio Bioassays社、カタログ番号:62TNFPEC)を用いて測定した。シグナルを、描画装置(envision machine)(Perkin Elmer社)において、665及び620nmで測定し、且つVictor Wallacソフトウェアを用いて解析した。較正曲線を使用し、生の蛍光シグナルを、TNFα濃度と相関させた。
陽性対照ウイルスTNF_v12に加え、M1経路の遺伝子(MYD88、TLR4、NFKB1、TRAF6及びTNFα)を標的とする新規の推定陽性対照の選択を、TNFα阻害について評価し、M1対比スクリーンを更にバリデートした。TRAF6_v4陽性対照は、ドナーEKにおいて60%以上の阻害を示し、TNF_v9陽性対照による処理は、ドナーEKにおいてTNFαの40%以上の減少を生じた。MYD88_v4陽性対照は、ドナーELにおけるおよそ40%の阻害を示した。TNF_v12陽性対照のみが、両方のドナーにおいて、陰性対照の平均と比べ、60%を超える阻害を示した。これらの陽性対照は全て、M1対比スクリーンの開発に進めた。
実験設定は、下記であった:0日目に、5,000個のCD14+細胞/ウェルを、M-CSF含有培地の入った384-ウェルプレートに播種した。5日後、形質導入を行い、引き続き翌日リフレッシュを行った。10日目に、20ng/mL IFN-γ及び5ng/mL LPSを含有するトリガーを添加し、12日目にリフレッシュした。トリガーは、収穫前に16時間リフレッシュした。上清を、13日目に収穫し、その中の分泌型TNFαを、TNFα HTRFアッセイを用いて決定した(図6)。M1対比スクリーンは、再スクリーンのウイルス再増幅アリコートのセットに類似した8個の384-ウェルソースプレートからなった。従ってレイアウトは、CCL18陽性対照を、TNFαリードアウトについての3種の陽性対照MYD88_v4、TRAF6_v6及びTNF_v12と置き換えた以外は、再スクリーンのレイアウトと同じであった(図7)。スクリーンは、1つのバッチにおいて、MOI8で、2つのドナーにおいて行った(ドナーEO及びEP)。加えて、ウイルス対照のみを含む各ドナーのための1つのQCプレートを、各実験設定に含んだ。これらのプレートを、TNFα HTRFを用いて最初に評価し、どのドナーが最も最適なアッセイウィンドウを提供したかを決定した。
TNFαデータの正規化は、平均陰性対照を基にしたロバストZ-スコアを用いて行った。位置的効果は、引き続きB-スコアを計算することにより、補正した。
729のヒットを、この対比スクリーンにおいて同定した。再スクリーンの同じウイルスセットを使用したので、対比スクリーンの結果を、M2マクロファージ分化再スクリーンの結果(実施例1)と比較した。これは、M1分化に影響を及ぼさなかった総数408の確認された候補標的物の同定を生じた(表6)。これらの408の確認された候補標的物は、更なるバリデーションに進めた。
(4.1 アッセイのバックグラウンド)
候補shRNA構築体はM2分化を阻害したことを確認するために、一次CCL18リードアウトとは異なるリードアウトを伴うバリデーションアッセイを、開発することができる。2種の表面マーカーCD163及びCD206は、M2マクロファージ上で発現されることがわかっており、且つM0、M1及びM2マクロファージ間の識別に使用することができる(Murrayらの文献、2011)。M2アッセイ開発の期間中及びスクリーニング相を通じて、CD163及びCD206の両方の発現レベルを、マクロファージ分化を評価するためのQC分析に使用した(実施例1参照)。M2プライミングされたマクロファージは、M0及びM1マクロファージと比べ、CD163及びCD206の増強された発現を示した。M2プライミング時のCD206発現の誘導は、CD163よりもより顕著であり、結果的にリードアウトとしてCD206を使うバリデーションアッセイの開発を決断した。
間接標識化のために、マウス-抗-ヒトCD206一次抗体(BD Pharmingen社、カタログ番号555953)を、ヤギ-抗-マウスAlexa488二次抗体(Invitrogen社、カタログ番号A-11001)と組合せて使用した。一次抗体及び二次抗体の両方を、異なる希釈で試験し、最適な染色条件をみつけた。
ハイスループットスクリーニングフォーマットにおいてCD206 ICC染色を定量するために、アルゴリズムを開発した。アルゴリズムのアウトプットは、造影された領域において認められる、CD206を発現しているマクロファージの数の代表値を提供するはずである(図8)。先の実験のFACSデータを基に、M0、M1及びM2マクロファージは全て、ある程度のレベルのCD206を発現した。M2マクロファージのみが、CD206の増強された発現を基に、M1及びM0集団から識別され得る。
実施例1及び2において使用した3種の陰性対照ウイルスはまた、M2バリデーションアッセイにおいても試験した。陰性対照は、無ウイルス対照と比べ、25%を超えてリードアウトを阻害も誘導もしてはならない。3種の陰性対照は全て、この基準を満たし、M2バリデーションアッセイのための陰性対照として選択した。
毒性アッセイは、毒性作用に起因した偽陽性ヒットを除くためのバリデーションの一部として開発した。市販のCell Titer Blue(CTB)試薬(Promega社、カタログ番号G8081)を使用し、細胞の代謝能を測定することができる。CTB試薬は、色素レサズリンを含有し、生存細胞は、レサズリンを高度に蛍光を発するレソルフィンに変換することができる。CTB試薬は、培地を交換するか、又は細胞上の培地に試薬を直接添加するかのいずれかで、5種の希釈のうちの1種で細胞に添加した。24時間後、生存度を表す相対蛍光単位(RFU)を、画像化装置上で測定した。
M2マクロファージスクリーン(実施例1)及びM1対比スクリーン(実施例2)に続けて、408種の候補標的物に対するshRNAを、13個の96-ウェルウイルスソースプレートからなるM2 CD206バリデーションスクリーンにおいて試験した。このスクリーンは、生物学的2つ組で、MOI4で行った。毒性アッセイと一緒に組合せたプロトコールを、図9に示した。
CD206アッセイによる平均スピアマンは、0.73であり、2つ組プレートにつき0.54から0.86までの範囲であり、これは、反復間の強力な相関関係を示唆している。対照性能は、陽性対照(MRC1_v1、MRC1_v2及びJAK1_v23)と陰性対照の間の明らかな分離を示した。陰性対照は、無ウイルス対照と同じ範囲で行い、リードアウトに対する非特異的(a-specific)ウイルス作用の存在しないことを示唆している。ヒット-コーリングのためのカットオフ値は、陽性対照と陰性対照の間の分離を基に決定した。更に、カットオフ値はまた、CD206陽性細胞の〜60%からなるM0マクロファージ中のCD206陽性細胞の割合を基にした(図10A)。これらのパラメータを基に、ロバストZスコアカットオフ値≦-3を、選択した。陰性対照はいずれも、ヒットとして同定されず、且つMRC1_v1、MRC1_v2及びJAK1_v23陽性対照の100%が、ヒットとして同定された。
(5.1 バックグラウンド)
ノックダウン構築体が、異なるmRNAの発現、その後意図されたmRNAの発現に対する作用、いわゆるオフ-標的作用を有することを排除するために、オン標的バリデーションを、確認された候補標的物により行った。実施例1-3のスクリーンを通過した56の確認された候補標的物を、オン標的バリデーションのために選択した。この目的のために、同じ確認された候補標的物の異なる部位を標的化している複数のアデノウイルス-shRNAを設計し、且つ一次スクリーン及びM1対比スクリーン設定を用い試験した。オリジナルの配列を含む少なくとも2つの独立したshRNA配列がM2及びM1バリデーションスクリーンの基準を通過した場合に、確認された候補標的物を、「オン-標的」と称した。
2つの異なる対照パネルを、実施例3及び1に応じて説明されたM1及びM2分化アッセイのために使用した。
オン標的バリデーションのために、異なるウイルスレイアウトを設計した。そのレイアウトにおいて、外側ウェルは省略し、且つ陰性対照を基にしたヒットコーリングを可能にし及び可能性のあるプレート効果の補正のために、プレートの>30%に陰性対照を満たした。陽性対照は、M2及びM1オン標的バリデーションの両方のために含んだ。更に、スタウロスポリンの連続希釈を、毒性アッセイの参照として、非形質導入細胞に対する縦列1に添加した。候補標的物に対し向けられた全てのアデノウイルス-shRNAは、プレート全体に無作為に分布された。「無-ウイルス」対照(ウイルス処置を伴わない試料)は、ウイルスを含まないスポットについてプレート上に配置した。
(5.4.1 M2「オン標的」スクリーンデータ解析)
B-スコア解析を適用し、M2オン標的スクリーンから得られたCCL18データを正規化し、次にスピアマン順位相関係数を使用し、複製性能を評価した。M2オン標的スクリーンに関する平均スピアマン相関は0.95であり、これは複製物間の強力な相関を指摘した。対照性能は、陽性対照(CCL18_v1、STAT6_v6及びJAK1_v23)と陰性対照の間の明確な分離を示した。陰性対照は、「無ウイルス」対照と同じ範囲で行った。これらの結果を基に、B-スコアカットオフ値≦-1.6を、ヒットコーリングに使用した。
M2オン標的バリデーションスクリーンにおけるCTB評価から得られたデータもまた、B-スコア正規化及びスピアマン順位相関を用い解析した。M2 CTBスクリーンに関する平均スピアマン相関は0.89であり、これは複製物間の強力な相関を指摘した。ヒットコーリングのためのカットオフ値は、無ウイルス対照に対する30%のシグナル減少レベルを基にし、これはB-スコア値-8に相当した。毒性に関する陽性対照として、様々な濃度のスタウロスポリン及びIL4R_v6ウイルスを使用し、毒性を導入した。IL4R_v6陽性対照は、カットオフ値-8でのヒットとして同定した。様々な濃度のスタウロスポリンの添加は、投与量-反応曲線を生じ、これはCTBアッセイは、毒性の感度の良い測定であることを指摘した。これらの結果を基に、M2マクロファージにおける無毒の標的のヒットコーリングのカットオフ値は、B-スコア>-8での設定であった。
M1オン標的スクリーン由来のTNFαデータもまた、B-スコア正規化を用い解析した。M1オン標的アッセイに関する平均スピアマンは0.84であり、これは反復物間の強力な相関を指摘した。対照性能は、2つの陽性対照(TNF_v12、TRAF6_v6)間の明確な分離を示したのに対し、TRAF6_v4及びMYD88_v4は、TNFαシグナルのより少ない阻害を示した。陰性対照は、無ウイルス条件と比べ、先のM1アッセイにおいて同じく認められたような小さい作用を示した。この作用は、無ウイルス対照と比べ、25%限界内であり、従ってアッセイ基準を通過する。これらの結果を基に、カットオフ値>-3を、ヒットコーリングに使用した。
M1オン標的毒性アッセイのCTBリードアウトを基に、B-スコアを正規化に使用し、反復性能を評価した。M1オン標的アッセイに関する平均スピアマンは、0.83であった。ヒットコーリングのためのカットオフ値は、無ウイルス対照に対する30%のシグナル減少レベルを基にした。これは、B-スコア値-8に相当した。毒性に関する陽性対照として、様々な濃度のスタウロスポリン及びIL4R_v6ウイルスを使用し、毒性を導入した。様々な濃度のスタウロスポリンの添加は、投与量-反応曲線を生じ、これはCTBアッセイの感度を指摘した。これらの結果を基に、ヒットコーリングのカットオフ値は、>-8であると決定した。
少なくとも2つの独立したshRNA配列が、毒性の観察を伴わずにM2及びM1「オン標的」バリデーションスクリーンのカットオフ値基準を通過した場合、このshRNAは、「オン標的」として指定された。これらの基準を基に、14種の遺伝子標的が、オン標的として同定された。これらの結果のまとめは、表14に示している。
(6.1 バックグラウンド)
実施例5においてオリジナルの構築体がヒットとして同定されていない34種の標的を、異なる「オン標的」スクリーンにおいて再試験した。プレートレイアウト及び実験設定は、実施例5の「オン標的」バリデーションと同じであった。形質導入は、2種のソースプレートを用いて行い、一つは相対的に低いIUを伴うウイルス構築体を含み、一つは相対的に高いIUを伴うウイルス構築体を含んだ。
M2及びM1スクリーンの両方について、複数のウイルス希釈物を、2種のソースプレートで作製し、細胞の形質導入に使用した。これは、全てのウイルス構築体が、M2スクリーンに関してMOI範囲3〜5で、及びM1スクリーンに関して6.5〜9で添加されるように行った。これを行うことにより、全てのウイルス構築体の性能は、M2及びM1アッセイについて、各々MOI 4及び8で添加された陰性対照及び陽性対照の性能とより同等であった。
データは、B-スコアを用い正規化した。Bスコアの決定に関して、試料と同等のMOIを伴う陰性対照を使用した。反復性能は、スピアマン相関を用い解析し、且つ全て(al)>0.4であった。4つのスクリーン全てにおいて、適切なウィンドウを、陽性対照と陰性対照の間に認めた。ヒットコーリングのためのカットオフ値は、対照性能を基にした(表9)。
オリジナルのヒットを含む少なくとも2つの独立したshRNA配列が、スクリーンにおいて確認された場合、この標的は、「オン標的」と宣言される。合計して、13標的が、IUベースのM2及びM1オン標的バリデーション及び毒性スクリーンの結果を基に、オン標的であることがわかった。
(7.1 バックグラウンド)
マクロファージにおいて同定された標的のmRNA発現を確認するために、mRNAをこれらの細胞から単離し、全トランスクリプトーム配列決定を行った。線維化状態に関連するように、これらの標的物は、該疾患の関連組織において発現されるものとする。従って、患者材料における標的物の発現を確認することに加え、肺胞マクロファージ(AM)を、IPF患者由来の肺組織から単離した。
マクロファージを得るために、2名の健常ドナー由来のバフィーコートを、PBMCの単離のために、血液バンク(Sanquin、オランダ)から購入した。この単離は、フィコール勾配を用いて行い、引き続きCD14+単球を、CD14マイクロビーズ(Miltenyi社、カタログ番号130-050-201)を使用し抽出した。CD14単離後、フローサイトメトリー分析を使用し、純度に関するQCを、PBMC及び単離されたCD14+画分について行った。
全RNAを、市販のRNA単離キット(RNeasy Mini Kit、Qiagen社)を用い、M0及びM2マクロファージに加えAMから単離した。濃度及び純度を、NanoDrop 2000(Thermo Scientific社)を用い、チェックした。
RNA試料(複数可)の品質及び完全性を、Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies社)を使用するRNA 6000 Lab-on-a-Chipにおいて分析した。試料品質は、試料調製の必要要件に合致した。Illumina(登録商標)mRNA-Seq試料調製キットを、試料の処理に使用した。試料調製は、Illuminaプロトコール「mRNA配列決定のための試料調製」(1004898 Rev. D)に従い行った。簡単に述べると、mRNAを、全RNAから、ポリ-T-オリゴ-付着した磁気ビーズを用いて単離した。mRNAの断片化後、cDNA合成を行った。これを、配列決定アダプターとのライゲーション及び生じた生成物のPCR増幅のために使用した。試料調製後の品質及び収量は、DNA 1000 Lab-on-a-Chip(Agilent Technologies社)により測定し、全ての試料は、品質管理を通過した。得られた生成物のサイズは、広範なサイズ分布300〜600bpを持つ予想された生成物と一致した。
Illumina HiSeq 2000(Solexa社)を使用するクラスター化及びDNA配列決定を、製造業者のプロトコールに従い行った。合計6.5pmolのDNAを使用した。各々Read 1及びRead 2配列決定プライマーを使用する100サイクルの2つの配列決定の読みを、フローセルにより行った。
画像解析、塩基-コーリング、及び品質チェックを、Illuminaデータ解析ピペリン(pipeline)RTA v1.13.48及び/又はOLB v1.9及びCASAVA v1.8.2により行った。Illumina配列決定試行の品質を評価するために行ったQA解析は、Solexa技術を使用する良好な品質の標準試行のための品質測定法を基にした。フローセルの全てのレーンは、QA解析を通過した。加えて、Illumina社が供給したPhi Xコントロールを基にした詳細な誤差率情報を、報告した。Phi Xコントロールは、少量で試料へ添加される(読み値の最大5%)。Illumina対照DNAからの読み値を、データの処理時に、Illuminaピペリンにより取り除いた。誤差率は、Illuminaピペリン中のELANDアライナー(aligner)を使用し、Phi X参照ゲノムに対する品質フィルターを通過する読み値のアラインメント後に、算出した。全ての誤差率は、許容された基準内であった。
Illumina HiSeq 2000シークエンサーから得られた読み値は、最小閾値Q25及び最短長さ50塩基の品質スコアによりフィルタリングした。次に読み値は、各試料についてBowtie v0.12.7アライナーにより、ヒト参照ゲノム(hg19)とアラインメントした。新規アイソフォームを、デフォルトの設定及びマスクとしての既知のトランスクリプトームアノテーション(Homo_sapiens.GRCh37.65.gff)を使用し、Cufflinks v2.02パッケージにより同定した。各試料について新規アイソフォームの同定後、新たに検出されたアイソフォームを、全ての試料についてマージさせ、標準トランスクリプトームアノテーションに加えた。最後に、FPKM(断片数/転写物キロベース/マップされた100万の断片)値を、各試料について、Cufflinksにより計算し、デフォルトのCufflinksアウトプットにおいて報告した。FPKM値は、試料中の、従ってmRNA-配列解析及びスクリーニングアッセイに使用された細胞中のmRNAの定量的代表値である。高度に豊富なmRNAは、高いFPKM値を生じるのに対し、低いFPKM値は、低コピー数のmRNAを表す。
IPF患者組織試料を、組織溶液から得た。肺胞マクロファージの単離は、T80細胞培養フラスコ上への接着により行った。これらの細胞の一部を、この細胞調製品中のマクロファージ集団の量を決定するためのフローサイトメトリー分析に使用した。このために、マウス-抗-ヒトCD68-FITC抗体(Miltenyi社、カタログ番号130-096-964)を使用し、CD68発現マーカーを検出し、これは肺胞マクロファージにおいて発現されることがわかっている(Kunischらの文献、2004)。合計でゲート通過された(gated)細胞の73%が、CD68陽性であることがわかり、これはマクロファージ集団を表している。
このmRNA-配列決定解析の結果を、表12に含み、且つ標的物の選択基準として使用した。発現データは、FPKM値として列記し、且つ標的物の選択基準として使用した。遺伝子は、FKPM値が決定された場合に、発現されたと考えられた。これらの結果は、これらの標的物は、M0及びM2マクロファージの両方において発現されることを示している。
この分析の結果は、表15に含まれる。発現データは、Cq値として列記し、且つ標的物の選択基準として使用した。遺伝子は、Cq値最大35で発現されると考えられ、35を超えるC値は「発現されない」と考えられた。これらの結果は、本標的物はAMにおいて発現されることを示している。
(8.1 バックグラウンド)
shRNAノックダウン構築体が、異なるmRNAの発現、その後意図されたmRNAの発現に対する作用、いわゆるオフ-標的作用を有することを排除するために、オン-標的バリデーションを、選択された標的物に対するsiRNA構築体を用い、確認された候補標的物により行った。
CCL18、JAK1及びSTAT6に対するsiRNAを、陽性対照として使用し、且つ非-標的化siRNA(Thermo Fisher Scientific Biosciences社)を、陰性対照として使用した。
実験設定は、以下のようであった:0日目に、CD14+細胞20,000個/ウェルを、10%FBS、1%P/S及び100ng/ml M-CSFを含むRPMI Glutamax培地の入った、96-ウェルプレートに播種した。5日後、siRNAトランスフェクションを行った。細胞を、Dharmafect 1(Thermo社、カタログ番号T-2001-03)0.02〜0.2μL/ウェルを用いて、トランスフェクトした。OnTarget Plus siRNA(Thermo Fisher Scientific Biosciences社)を、最終濃度20nMで、1ウェルにつき4種の構築体のスマートプールとして使用した。EFEMP2に関して、各siRNA構築体を同じく個別に試験した。1日後、細胞を、10%FBS、1%P/S、及び細胞のM2へのプライミングに必要なサイトカイン(20ng/ml IL-4及び20ng/ml IL-10)を含むRPMI Glutamax培地でプライミングした。8日目の細胞に、スタウロスポリンを、各プレートの対照ウェルへ添加した(各プレート上1つの単独列)。9日目、上清を収集し、CTB試薬を細胞に添加した。同日、RNA単離を、標準MagMax全RNA単離キット(Ambion社、カタログ番号AM1830)を、品質対照としてCell Titer Blueアッセイ(Promega社、カタログ番号G808B)と一緒に使用し行った。CCL18を、実施例1に説明したように、ELISAを使用し、上清中で測定した。
正規化された阻害率(NPI)解析を用い、siRNA構築体のリードアウトに対する作用を定量化した。計算において、CCL18 siRNAを陽性対照として使用し、且つ非-標的化siRNAを陰性対照として使用した。正規化された阻害率(NPI)は、試料測定値と陽性対照平均の差を、陽性対照と陰性対照の差により、除算することにより算出した。
(9.1 バックグラウンド)
インビボにおける標的物遺伝子の発現を試験するために、いくつかのマウス及びラット線維症モデルを試験し、腎臓、肺及び皮膚などの特定組織における発現を決定した。
一側尿管閉塞を、Balb/c雌マウス(Harlan社-フランスより)において、1群あたりマウス10匹で作製した。0日目に、マウスに、腹腔内注射により麻酔をかけ、皮膚の切開後、左側尿管を切り離し、その長手方向に沿って2点を4.0絹糸で結紮した。その後尿管を、2つの結紮の間で切断した。無傷のマウスを、対照として使用した。マウスを、10又は21日後に、麻酔下での鋏による放血により屠殺した。
腎摘出術を、Sprague-Dawley雄ラット(CERJ社-フランスより)において、1群あたりラット10匹で作製した。0日目に、ラットに麻酔をかけ、皮膚の切開後、副腎を保護しながら、腎臓皮膜を除去した。腎門部を結紮し、右側腎臓を摘出した。左側腎臓の末端を、メスで切除し、5/6腎摘出を生じた。ラットを、4又は8週間後に屠殺した。
肺線維症を、ブレオマイシン静脈内投与について、CD1雄マウス(CERJ社-フランスより)において、1群あたりマウス6〜8匹で誘導し、且つブレオマイシン脊髄内投与について、C57/Bl6 J雌マウス(Janvier社より)において、1群あたりマウス14匹で誘導した。
強皮症は、Balb/c雌マウス(CERJ社-フランスより)において、1群あたりマウス15匹で誘導した。0日目に、マウスに、溶液(キシラジン5mg/kg、ケタミン75mg/kg)の腹腔内注射により麻酔をかけ、剃毛した。ブレオマイシン1mg/ml溶液又は食塩水の容積100μlを、マウスの剃毛した背部へ、26g針により、皮下注射した。ブレオマイシンを、連続する3週間にわたり1週につき5日間注射した。合計の実験期間は、6週間であった。6週間後に、マウスを、麻酔下での鋏による放血により屠殺した。
インビボ実験の最後に、動物を屠殺し、組織(UUOモデルについて1/2マウス腎臓、5/6NTXモデルについて1/3ラット腎臓、マウス強皮症モデルについて皮膚小片、及びマウス肺線維症モデルについて肺一葉)を、RNALater(登録商標)安定化溶液(Ambion社、#AM7021)の入った、2ml-マイクロチューブ(Ozyme社、#03961-1-405.2)中に収集した。組織を、Precellys(登録商標)24組織ホモジナイザー(Bertin Technologies社)内で1.4mmセラミックビーズ(Ozyme社、#03961-1-103、BER1042)により破壊した。全RNAを単離し、組換えDNase消化に供し、Qiazol(登録商標)(Qiagen社、#79306)及びNucleoSpin(登録商標)RNAキット(Macherey-Nagel社、#740955.250)を製造業者の推奨に従い用い精製した。RNAを、RNase-非含有水60μlにより溶離した。RNAの濃度及び純度を、260、280及び230nmでの吸光度により決定した。cDNAを、全RNA 500ngから、高性能cDNA RTキット(Applied Biosystems社、#4368814)を使用する逆転写により、調製した。10倍希釈したcDNA調製品5μlを、リアルタイム定量的PCRに使用した。qPCRは、SYBR Green技術を使用するQiagen社からの遺伝子特異的プライマーにより行った。反応は、ViiA7リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems社)中での、95℃で5分間の変性工程、続けて40サイクル(95℃で10秒間、60℃で30秒間)で実行した。
各遺伝子の発現レベルは、対照動物におけるそれらの閾値サイクル(CT)値により推定した。
腎臓において発現不良であったMS4A4Aを除き、全ての試験したmRNAは、線維性組織(腎臓、肺及び皮膚)において良好に発現された(表11参照)。
[構成1]
線維症の治療に有用な化合物を同定する方法であって:
a)被験化合物を、配列番号:26-50からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの断片及び構造的機能性誘導体と接触させる工程;
b)被験化合物の該ポリペプチドへの結合親和性を決定する工程;
c)被験化合物を、マクロファージ細胞集団と接触させる工程;
d)マクロファージの代替活性化マクロファージへの分化に関連した特性を測定する工程;並びに
e)マクロファージの代替活性化マクロファージへの分化を減少又は阻害し、且つ該ポリペプチドへの結合親和性を示すことが可能な化合物を同定する工程:を含む、前記方法。
[構成2]
線維症の治療に有用な化合物を同定する方法であって:
a)被験化合物を、配列番号:26-50からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの機能性断片及び機能性誘導体と接触させる工程;
b)該ポリペプチドの活性を測定する工程;
c)被験化合物を、マクロファージ細胞集団と接触させる工程;並びに、
d)マクロファージの代替活性化マクロファージへの分化に関連した特性を測定する工程;並びに
e)マクロファージの代替活性化マクロファージへの分化を減少又は阻害し、且つ該ポリペプチドの活性を阻害することが可能な化合物を同定する工程:を含む、前記方法。
[構成3]
線維症の治療に有用な化合物を同定する方法であって:
a)被験化合物を、配列番号:26-50からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現するマクロファージ細胞集団と接触させる工程;
b)該細胞中の該ポリペプチドの発現、活性及び/又は量を測定する工程;
c)マクロファージの代替活性化マクロファージへの分化に関連した特性を測定する工程;並びに
d)該ポリペプチドの発現、活性及び/又は量の減少を生じ、且つマクロファージの代替活性化マクロファージへの分化を減少又は阻害することが可能な化合物を同定する工程:を含む、前記方法。
[構成4]
マクロファージのM2マクロファージへの分化を減少又は阻害するのに有用な化合物を同定する方法であって:
a)被験化合物を、配列番号:26-50からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの機能性断片及び機能性誘導体と接触させる工程;
b)該ポリペプチドの活性を測定する工程;
c)被験化合物を、マクロファージ細胞集団と接触させる工程;並びに、
d)マクロファージの代替活性化マクロファージへの分化に関連した特性を測定する工程;並びに
e)マクロファージのM2マクロファージへの分化を減少又は阻害し、且つ該ポリペプチドの活性を阻害することが可能な化合物を同定する工程:を含む、前記方法。
[構成5]
マクロファージのM2マクロファージへの分化を減少又は阻害するのに有用な化合物を同定する方法であって:
a)被験化合物を、配列番号:26-50からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの機能性断片及び機能性誘導体と接触させるか、又は配列番号:26-50からなる群から選択されるアミノ酸をコードしている核酸若しくはそれらの機能性誘導体と接触させる工程;
b)該ポリペプチドの発現又は活性を測定する工程;
c)該ポリペプチドの発現又は活性を阻害することが可能な化合物を同定し、これにより、該ポリペプチドの発現又は活性の阻害が、マクロファージのM2マクロファージへの分化の減少又は阻害を生じるか又はこれに関連している工程:を含む、前記方法。
[構成6]
前記核酸が、配列番号:1-25からなる群から選択される、構成5記載の方法。
[構成7]
前記試験される化合物を対照と比較する工程を追加的に含む、構成1〜5のいずれか1記載の方法。
[構成8]
前記ポリペプチドが、検出可能な標識と結合されている、構成1〜5のいずれか1記載の方法。
[構成9]
前記工程(a)及び(b)の該ポリペプチド配列が、インビトロ無細胞調製物中に存在する、構成1又は2記載の方法。
[構成10]
前記工程(a)及び(b)の該ポリペプチド配列が、細胞内に存在する、構成1、2、4又は5のいずれか1記載の方法。
[構成11]
前記細胞が、該ポリペプチドを天然に発現する、構成10又は3記載の方法。
[構成12]
前記細胞が、該ポリペプチドを発現するように操作されている、構成10又は3記載の方法。
[構成13]
前記細胞が、哺乳類細胞である、構成10〜12のいずれか記載の方法。
[構成14]
前記細胞が、マクロファージ細胞である、構成13記載の方法。
[構成15]
前記特性が、代替活性化マクロファージのマーカーの放出又は発現の阻害である、構成1〜4のいずれか記載の方法。
[構成16]
前記特性が、CCL18、CCL13、TGFβ、CCL22、CCL17、可溶性フィブロネクチン、葉酸受容体β、CD206、及びCD163からなる群から選択されるマーカーの発現又は放出である、構成15記載の方法。
[構成17]
前記マーカーが、CCL18又はCD206である、構成16記載の方法。
[構成18]
前記細胞が、M2マクロファージへのマクロファージ分化を誘導する因子(M2誘導性因子)により誘発されている、構成1〜4のいずれか記載の方法。
[構成19]
前記細胞が、IL4、IL10、IL13、免疫複合体及びリポ多糖からなる群から選択される1以上のM2誘導性因子により誘発されている、構成1〜4のいずれか記載の方法。
[構成20]
前記細胞が、IL10及びIL4の組合せにより誘発されている、構成19記載の方法。
[構成21]
前記方法が:
マクロファージの古典的活性化(M1)マクロファージへの分化に関連した特性を測定し、且つ該分化を阻害しない化合物を同定する工程:を追加的に含む、構成1〜5のいずれか記載の方法。
[構成22]
前記特性が、M1マクロファージ表現型のマーカーのレベル及び/又は発現であり、並びに該マーカーのレベルを増加しない化合物が、同定される、構成21記載の方法。
[構成23]
前記マーカーが、TNFαである、構成22記載の方法。
[構成24]
前記被験化合物が、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、短ヘアピンRNA(shRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、及びマイクロRNA(miRNA)からなる群から選択される、構成3記載の方法。
[構成25]
前記被験化合物が、配列番号:1-25からなる群から選択される核酸配列の約17〜約30の近接ヌクレオチドの天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的な、又はこれから操作された核酸配列を含む、構成24記載の方法。
[構成26]
哺乳類細胞中のベクターが、該化合物を発現する、構成24記載の方法。
[構成27]
前記ベクターが、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス又はセンダイウイルスのベクターである、構成26記載の方法。
[構成28]
前記アンチセンスポリヌクレオチド、該siRNA又は該shRNAが、センス鎖に相補的な17-25ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、ここで該センス鎖が、配列番号:1-25からなる群から選択される核酸配列の17-25の連続ヌクレオチドから選択される、構成24記載の方法。
[構成29]
前記化合物が、抗体又は抗体断片である、構成1〜5のいずれか1記載の方法。
[構成30]
線維化状態の治療に使用するための、配列番号:26-50からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する、抗体又はそれらの断片を含有する医薬組成物。
[構成31]
前記抗体が、モノクローナル抗体である、構成30記載の医薬組成物。
[構成32]
前記抗体が、単鎖抗体である、構成30記載の医薬組成物。
[構成33]
線維化状態の治療に使用するための、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)及び短ヘアピンRNA(shRNA)からなる群から選択される物質を含有する医薬組成物であって、ここで該物質が、線維化状態の治療に使用するための、配列番号:1-25からなる群から選択される核酸配列の約17〜約30の近接ヌクレオチドの天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的な、又はこれから操作された核酸配列を含む、前記医薬組成物。
[構成34]
構成30〜33のいずれか一項記載の線維化状態の治療において使用するための医薬組成物であって、ここで該線維化状態が、マクロファージの代替活性化(M2)マクロファージへの分化に関連した線維化状態である、前記医薬組成物。
[構成35]
前記線維化状態が、特発性肺線維症(IPF)、嚢胞性線維症、医原性薬剤誘発性線維症を含む様々な病因の他のびまん性実質性肺疾患、職業及び/又は環境が誘導した線維症、肉芽腫性疾患(サルコイドーシス、過敏肺炎)、膠原血管病、肺胞タンパク症、ランゲルハンス細胞肉芽腫症、リンパ脈管筋腫症、遺伝性疾患(ハーマンスキー・パドラック症候群、結節硬化症、神経線維腫症、代謝性蓄積症、家族性間質性肺疾患)、放射線誘導性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、強皮症、ブレオマイシン誘導性肺線維症、慢性喘息、珪肺、アスベスト誘導性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、腎線維症、尿細管間質性線維症、糸球体腎炎、巣状分節性糸球体硬化症、IgA腎症、高血圧、アルポート症候群、消化管線維症、肝線維症、肝硬変、アルコール誘導性肝線維症、毒物/薬物誘導性肝線維症、ヘモクロマトーシス、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、胆管損傷、原発性胆汁性肝硬変症、感染症誘導性肝線維症、ウイルス誘導性肝線維症、自己免疫肝炎、角膜瘢痕化、肥厚性瘢痕化、デュピュイトラン病、ケロイド、皮膚線維症、皮膚強皮症、全身性硬化症、脊髄損傷/線維症、骨髄線維症、血管再狭窄、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化、ヴェーゲナー肉芽腫症及びペイロニー病から選択される、構成34記載の線維化状態の治療において使用する医薬組成物。
[構成36]
前記線維化状態が、特発性肺線維症(IPF)である、構成35記載の線維化状態の治療において使用する医薬組成物。
[構成37]
マクロファージの代替活性化(M2)マクロファージへの分化を減少又は阻害するインビトロ方法であって、マクロファージ細胞を含む哺乳類細胞の集団を、配列番号:26-50からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの活性又は発現のインヒビターと、接触させる工程を含む、前記インビトロ方法。
[構成38]
前記インヒビターが、抗体である、構成37記載の方法。
[構成39]
前記抗体が、モノクローナル抗体である、構成37記載の方法。
[構成40]
前記インヒビターが、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)及び短ヘアピンRNA(shRNA)からなる群から選択され、ここで該インヒビターが、該ポリペプチドをコードしている核酸の約17〜約30の近接ヌクレオチドの天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的な、又はこれから操作された核酸配列を含む、構成37記載の方法。
Claims (33)
- 線維症の治療に有用な化合物を同定する方法であって:
a)被験化合物を、配列番号:26のアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させる工程;
b)被験化合物の該ポリペプチドへの結合親和性を決定する工程;
c)被験化合物を、マクロファージ細胞集団と接触させる工程;
d)マクロファージの代替活性化マクロファージへの分化に関連した特性を測定する工程;並びに
e)マクロファージの代替活性化マクロファージへの分化を減少又は阻害し、且つ該ポリペプチドへの結合親和性を示すことが可能な化合物を同定する工程:を含む、前記方法。 - 線維症の治療に有用な化合物を同定する方法であって:
a)被験化合物を、配列番号:26のアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させる工程;
b)該ポリペプチドの活性を測定する工程;
c)被験化合物を、マクロファージ細胞集団と接触させる工程;
d)マクロファージの代替活性化マクロファージへの分化に関連した特性を測定する工程;並びに
e)マクロファージの代替活性化マクロファージへの分化を減少又は阻害し、且つ該ポリペプチドの活性を阻害することが可能な化合物を同定する工程:を含む、前記方法。 - 線維症の治療に有用な化合物を同定する方法であって:
a)被験化合物を、配列番号:26のアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現するマクロファージ細胞集団と接触させる工程;
b)該細胞中の該ポリペプチドの発現、及び/又は活性を測定する工程;
c)マクロファージの代替活性化マクロファージへの分化に関連した特性を測定する工程;並びに
d)該ポリペプチドの発現、及び/又は活性の減少を生じ、且つマクロファージの代替活性化マクロファージへの分化を減少又は阻害することが可能な化合物を同定する工程:を含む、前記方法。 - マクロファージの代替活性化マクロファージへの分化を減少又は阻害するのに有用な化合物を同定する方法であって:
a)被験化合物を、配列番号:26のアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させる工程;
b)該ポリペプチドの活性を測定する工程;
c)被験化合物を、マクロファージ細胞集団と接触させる工程;
d)マクロファージの代替活性化マクロファージへの分化に関連した特性を測定する工程;並びに
e)マクロファージの代替活性化マクロファージへの分化を減少又は阻害し、且つ該ポリペプチドの活性を阻害することが可能な化合物を同定する工程:を含む、前記方法。 - マクロファージの代替活性化マクロファージへの分化を減少又は阻害するのに有用な化合物を同定する方法であって:
a)被験化合物を、配列番号:26のアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させるか、又は配列番号:26のアミノ酸をコードしている核酸と接触させる工程;
b)該ポリペプチドの発現又は活性を測定する工程;
c)該ポリペプチドの発現又は活性を阻害することが可能な化合物を同定し、これにより、該ポリペプチドの発現又は活性の阻害が、マクロファージの代替活性化マクロファージへの分化の減少又は阻害を生じる工程:を含む、前記方法。 - 前記核酸が、配列番号:1である、請求項5記載の方法。
- 前記試験される化合物を対照と比較する工程を追加的に含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、検出可能な標識と結合されている、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 前記工程(a)及び(b)の前記ポリペプチド配列が、インビトロ無細胞調製物中に存在する、請求項1又は2記載の方法。
- 前記工程(a)及び(b)の前記ポリペプチド配列が、細胞内に存在する、請求項1、2、4又は5のいずれか一項記載の方法。
- 前記細胞が、前記ポリペプチドを天然に発現する、請求項10又は3記載の方法。
- 前記細胞が、前記ポリペプチドを発現するように操作されている、請求項10又は3記載の方法。
- 前記細胞が、哺乳類細胞である、請求項10〜12のいずれか記載の方法。
- 前記細胞が、マクロファージ細胞である、請求項13記載の方法。
- 前記特性が、代替活性化マクロファージのマーカーの放出又は発現の阻害である、請求項1〜4のいずれか記載の方法。
- 前記特性が、CCL18、CCL13、TGFβ、CCL22、CCL17、可溶性フィブロネクチン、葉酸受容体β、CD206、及びCD163からなる群から選択されるマーカーの発現又は放出である、請求項15記載の方法。
- 前記マーカーが、CCL18又はCD206である、請求項16記載の方法。
- 前記細胞が、代替活性化マクロファージへのマクロファージ分化を誘導する因子により誘発されている、請求項1〜4のいずれか記載の方法。
- 前記細胞が、IL4、IL10、IL13、免疫複合体及びリポ多糖からなる群から選択される1以上の代替活性化マクロファージ誘導性因子により誘発されている、請求項1〜4のいずれか記載の方法。
- 前記細胞が、IL10及びIL4の組合せにより誘発されている、請求項19記載の方法。
- 前記方法が:
マクロファージの古典的活性化(M1)マクロファージへの分化に関連した特性を測定し、且つ該分化を阻害しない化合物を同定する工程:を追加的に含む、請求項1〜5のいずれか記載の方法。 - 前記特性が、M1マクロファージ表現型のマーカーのレベル及び/又は発現であり、並びに該マーカーのレベルを増加しない化合物が、同定される、請求項21記載の方法。
- 前記マーカーが、TNFαである、請求項22記載の方法。
- 前記被験化合物が、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、短ヘアピンRNA(shRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、及びマイクロRNA(miRNA)からなる群から選択される、請求項3記載の方法。
- 前記被験化合物が、配列番号:1の核酸配列の約17〜約30の近接ヌクレオチドの天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的な、又はこれから操作された核酸配列を含む、請求項24記載の方法。
- 哺乳類細胞中のベクターが、前記化合物を発現する、請求項24記載の方法。
- 前記ベクターが、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス又はセンダイウイルスのベクターである、請求項26記載の方法。
- 前記アンチセンスポリヌクレオチド、前記siRNA又は前記shRNAが、センス鎖に相補的な17-25ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、ここで該センス鎖が、配列番号:1の核酸配列の17-25の連続ヌクレオチドから選択される、請求項24記載の方法。
- 前記化合物が、抗体又は抗体断片である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- マクロファージの代替活性化マクロファージへの分化を減少又は阻害するインビトロ方法であって、マクロファージ細胞を含む哺乳類細胞の集団を、配列番号:26のアミノ酸配列を含むポリペプチドの活性又は発現のインヒビターと、接触させる工程を含む、前記インビトロ方法。
- 前記インヒビターが、抗体である、請求項30記載の方法。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項30記載の方法。
- 前記インヒビターが、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)及び短ヘアピンRNA(shRNA)からなる群から選択され、ここで該インヒビターが、該ポリペプチドをコードしている核酸の約17〜約30の近接ヌクレオチドの天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的な、又はこれから操作された核酸配列を含む、請求項30記載の方法。
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