NO318180B1 - Preparater inneholdende nukleinsyrer. - Google Patents

Preparater inneholdende nukleinsyrer. Download PDF

Info

Publication number
NO318180B1
NO318180B1 NO19962791A NO962791A NO318180B1 NO 318180 B1 NO318180 B1 NO 318180B1 NO 19962791 A NO19962791 A NO 19962791A NO 962791 A NO962791 A NO 962791A NO 318180 B1 NO318180 B1 NO 318180B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
preparation according
nucleic acid
lipopolyamine
lipids
ratio
Prior art date
Application number
NO19962791A
Other languages
English (en)
Other versions
NO962791D0 (no
NO962791L (no
Inventor
Jean-Paul Behr
Barbara Demeneix
Jean-Serge Remy
Daniel Scherman
Bertrand Schwartz
Original Assignee
Aventis Pharma Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pharma Sa filed Critical Aventis Pharma Sa
Publication of NO962791D0 publication Critical patent/NO962791D0/no
Publication of NO962791L publication Critical patent/NO962791L/no
Publication of NO318180B1 publication Critical patent/NO318180B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A61K47/544—Phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants

Abstract

Preparater omfattende minst en nukleinsyre og et lipopolyamin. Preparatene finner særlig anvendelse ved genterapi, spesielt før overføring in vivo av nukleinsyrer.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår preparater på basis av nukleinsyrer. Mere spesielt angår oppfinnelsen preparater som omfatter minst en nukleinsyre og et lipopolyamin.
Preparatene finner anvendelse ved genterapi, særlig for overføring av nukleinsyrer.
Gen-terapi består i å korrigere en defekt eller en anomali (mutasjon, feilekspresjon og så videre) eller å sikre ekspresjonen av et terapeutisk interessant protein ved innføring av en genetisk informasjon i denne påvirkede celle eller det påvirkede organ. Denne genetiske informasjon kan innføres enten in vitro i en celle som hentes fra organet hvoretter den modifiserte celle gjeninnføres i organismen, eller direkte in vivo i det egnede vev. Forskjellige teknikker er beskrevet for overføring av denne genetiske informasjon, herunder forskjellige transfeksjonsteknikker som implikerer komplekser av DNA og DEAE dekstran (Pagano et al., "J.Virol." 1 (1967) 891, DNA og nukleære proteiner (Kaneda et al., "Science" 243 (1989) 375), DNA og lipider (Felgner et al., "PNAS" 84 (1987) 7413), DNA og polylysin, anvendelse av liposomer (Fraley et al., "J.Biol.Chem." 255 (1980) 10431), og så videre, og andre. I den senere tid er anvendelsen av vimser som vektorer for overføring av gener kommet inn som et lovende alternativ ved disse fysiokjemiske transfeksjonsteknikker. I denne forbindelse er forskjellige vimser prøvet med henblikk på deres evne til infisering av visse cellulære populasjoner. Særlig gjelder dette retrovimser (HMS, MMS, og så videre), HSV-virusen, de adénoassosierte vimser og adénovirusene.
Imidlertid tillater de teknikker som har vært utviklet til i dag ikke på tilfredsstillende måte å løse vanskelighetene som forbindes med overføring av gener til celler og/eller organismen. Særlig er problemene forbundet med penetrering av nukleinsyren inn i cellene, ikke helt løst. Det er særlig den polyanioniske natur for nukleinsyrene som er til hinder for deres passasje gjennom cellemembranene. Mens det er vist at nakne nukleinsyrer er i stand til å traversere plasma-membranet for visse celletyper in vivo (se særlig WO90/11092), forblir transfeksjonseffektiviteten lav. Videre har de nakne nukleinsyrer en kort plasmatisk halveringstid på grunn av deres nedbrytning av enzymer og deres eliminering via urinveiene. Mens videre rekombinante vimser tillater å forbedre effektiviteten for overføring av nukleinsyrer oppviser deres anvendelse hvis risiki som patogenitet, transmisjon, replikering, rekombinering, transformering, immunogenisitet og så videre.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fordelaktig løsning på disse forskjellige problemer. Søker har således vist at visse preparater omfattende en nukleinsyre og et lipo-polyamin kan tillate overføring in vivo av nukleinsyren til en celle og/eller et organ med stor effektivitet og uten toksisitet. Oppfinnelsens preparater tillater likeledes å unngå mangler forbundet med anvendelsen av virale vektorer (potensielle farer, begrenset størrelse for det overførte gen, høy pris og så videre).
Anvendelsen av visse lipopolyaminer for transfektering in vitro av cellekulturer er allerede beskrevet i teknikken. Således beskriver søknaden EP 394 111 anvendelsen av visse lipopolyaminer for transfektering av cellelinjer in vitro. På samme måte beskriver en artikkel av Demeneix et al. ("IntJ. Dev.Biol." 35 (1991) 481) anvendelsen av et lipopolyamin (dioktadecylamidoglycyl spermin, DOGS) for transfektering av nukleinsyrer in ovo. I henhold til disse dokumenter benyttes lipopolyaminene under betingelser slik at forholdet mellom positive ladninger i lipopolyaminet og de negative ladninger i nukleinsyren ligger mellom 2 og 5 og fortrinnsvis er 3 eller 4. Som vist i eksemplene 8 og 9 i foreliggende søknad tillater imidlertid, meget overraskende, ingen av de betingelser som beskrives i disse dokumenter, transfektering av nukleinsyrer in vivo. På grunn av interaksjonen mellom anioniske makromolekyler eller med den ekstracellulære vevmatrise, blir partiklene som dannes under disse betingelser i realiteten ute av stand til å diffusere til utenfor applikeringssetet og således overføre enhver nukleinsyre in vivo. Videre er de fremstillingsbetingelser som beskrives i disse dokumenter ikke i stand til å realisere farmasøytiske preparater inneholdende vesentlige mengder nukleinsyre. Det er imidlertid nu funnet at, under visse betingelser, lipopolyaminene kan benyttes for transfektering in vivo av nukleinsyrer. Mere spesielt har foreliggende oppfinnere på meget overraskende måte funnet at preparatet inneholdende en nukleinsyre og et lipopolyamin under betingelser slik at forholdet mellom positive ladninger i lipopolyaminet og de negative ladninger i nukleinsyren er lik mindre enn 2, tillater transfektering av nukleinsyren in vivo med høy effektivitet. I tillegg har foreliggende oppfinnere påvist visse betingelser som tillater fremstilling av disse farmasøytiske preparater som inneholder vesentlige mengder nukleinsyre. De farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen utgjør således spesielt fordelaktige verktøy for administrering og overføring av nukleinsyrene in vivo.
Foreliggende oppfinnelse tar sikte på å forbedre den kjente teknikk og angår således et preparat inneholdende en nukleinsyre og et lipopolyamin der forholdet (R) mellom positive ladninger i lipopolyaminet og de negative ladninger i nukleinsyren er lik eller mindre enn 2, for bruk som medikament.
Innenfor oppfinnelsens ramme angir uttrykket lipopolyamin et hvilket som helst amfifilt molekyl omfattende minst et hydrofilt polyaminområde og et lipofilt område. Polyamin-området i lipopolyaminene, kationisk ladet, er i stand til å forbinde seg på reversibel måte med nukleinsyren som er negativt ladet. Denne interaksjon kompakterer nukleinsyren i vesentlig grad. Det lipofile området gjør denne interaksjon ioniske ufølsom overfor det eksterne miljø ved avdekking av den dannede nukleolipidiske partikkel som dannes, med en lipidisk hud.
Fortrinnsvis tilsvarer polyamin-området av lipopolyaminene som benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen, den generelle formel:
der m er et helt tall lik eller større enn 2 og n er et helt tall lik eller større enn 1 hvorved m kan variere mellom de forskjellig grupper av karbon som ligger mellom de to aminer. Fortrinnsvis ligger m fra og med 2 til og med 6 og n fra og med 1 til og med 5. Aller helst representeres polyaminområdet med spermin eller en analog av spermin som har bevart sine bindingsegenskaper til DNA.
Det lipofile området kan være en eventuelt mettet hydrokarbonkjede, kolesterol, et naturlig eller syntetisk lipid, i stand til å danne lamellære eller heksagonale faser.
Fortrinnsvis benytter man innenfor oppfinnelsens ramme de lipopolyaminer som er definert i EP 394 111. Dette dokument beskriver likeledes en fremgangsmåte som kan benyttes for fremstilling av disse lipopolyaminer.
Spesielt fordelaktig måte benytter man innenfor oppfinnelsens ramme de oktadecylamidoglycilspennin (DOGS) eller 5-karboksyspermylamid av palmitoylfosfatidyletanolamin (DPPES).
For å oppnå en optimal effekt av preparatene ifølge oppfinnelsen er de respektive forhold mellom polyamin og nukleinsyre fortrinnsvis bestemt slik at forholdet R mellom positive ladninger i lipopolyaminet og de negative ladninger i nukleinsyren ligger mellom 0,1 og 1,9 og aller helst mellom 0,5 og 1,5.
Innenfor rammen av oppfinnelsen kan nukleinsyren likevel være en desoksyribonukleinsyre som en ribonukleinsyre. Det kan dreie seg om sekvenser av naturlig eller kunstig opprinnelse og særlig genomisk DNA, cDNA, mRN, tRNA, rRNA, hybridsekvenser eller syntetiske eller semisyntetiske sekvenser. Disse nukleinsyrer kan være av human, animalsk, vegetabilsk, bakteriell eller annen opprinnelse. De kan oppnås ved en hvilken som helst kjent teknikk og særlig ved ansøking av banker, ved kjemisk syntese eller også ved blandede metoder som inkluderer kjemisk eller enzymatisk modifisering av sekvensene som oppnås ved lesing av bankene. De kan videre innarbeides i vektorer, for eksempel plasmidiske vektorer.
Hva mere spesielt angår desoksyribonukleinsyrene kan disse være enkelt- eller dobbeltstrenget. Disse desoksyribonukleinsyrer kan bære terapeutiske gener, reguleringssekvenser for transkripsjon eller replikasjon, antiretningssekvenser, områder for binding til andre cellulære forbindelser og så videre.
Innenfor oppfinnelsens ramme menes med terapeutisk gen særlig et hvilket som helst gen som koder for et proteinprodukt med en terapeutisk effekt. Det således kodede proteinprodukt kan være et protein, et peptid og så videre. Dette proteinprodukt kan være homologt vis-å-vis målcellen (det vil si et produkt som normalt eksprimeres i målcellen når denne ikke oppviser noen patologi). I dette tilfellet tillater ekspresjonen av et protein for eksempel å bøte på en utilstrekkelig ekspresjon i cellen eller ekspresjon av et inaktivt protein eller lav aktivitet på grunn av en modifikasjon, eller også å overeksprimere proteinet. Det terapeutiske gen kan være kode for en mutant av et cellulært protein, med øket stabilitet, modifisert aktivitet og så videre. Proteinproduktet kan likeledes være homologt vis-å-vis målcellen. I dette tilfellet kan et uttrykt protein for eksempel komplettere eller tilveiebringe en defisient-aktivitet i cellen for åtillate den å kjempe mot en patologi, eller stimulere en immunrespons.
Blant de terapeutiske produkter innenfor oppfinnelsens ramme kan man mere spesielt angi enzymer, blodderivater, hormoner, lyrnfokiner, interleukiner, interferoner, TNF og så videre (FR 9203120), vekstfaktorer, neurotransmettorer eller deres forløpere eller synteseenzymer, trofiske faktorer: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofin, og så videre; apolipoproteinene: ApoAI, ApoAIV, ApoE, og så videre (FR 93 05125), dystrofin eller et minodystrifin (FR 9111947), proteinet CFTR forbundet med mucoviscidose, tumor-supressor-gener: p53, Rb, Rapi A, DCC, k-rev, og så viderel (FR 93 04745), gener som koder for faktorer implikert i koagulering: faktorene VII, VIII, DC, gener som intervenerer ved reparering av DNA, drepergener, (kinase-thymidin, cytocin déaminase), og så videre.
Det terapeutiske gen kan likeledes være et antiretningsgen-eller -sekvens, hvis ekspresjon i målcellen tillater åkontrollere ekspresjonen av gener eller transkripsjon av cellulært mRNA. Slike sekvenser kan for eksempel transkriberes i målcellen til RNA som er komplementær til cellulær mRNA og derved blokkere deres traduksjon til protein, i henhold til den teknikk som er beskrevet i EP 140 308. Antiretningen omfatter likeledes sekvenser som koder for ribosymer og som er i stand til selektiv destruksjon av mål-RNA (EP 321 201).
Som antydet ovenfor kan nukleinsyren likeledes omfatte en eller flere gener som koder for et antigenisk peptid, hos mennesker eller dyr i stand til å skape en immunrespons. Ved denne spesielle utførelsesform av oppfinnelsen muliggjøres således en realisering enten av vaksiner eller immunoterapeutisk behandling anvendt på mennesker eller dyr, særlig mot mikroorganismer, vimser eller cancere. Det kan særlig dreie seg om spesifikke antigeniske peptider av Epstein Barr-virusen, HIV-vimsen, hepatitt-B-virusen (EP 185 573), pseudo-hundegalskapsvirusen eller også vimser som er spesifikke for tumorer (EP 259 212).
Fortrinnsvis omfatter nukleinsyren likeledes sekvenser som tillater ekspresjon av det terapeutiske gen og/eller genet som koder for det antigeniske peptid i den ønskede celle eller organ. Det kan dreie seg om sekvenser som naturlig er ansvarlig for ekspresjonen av det angjeldende gen når disse sekvenser er i stand til å funksjonere i den infiserte celle. Det kan likeledes dreie seg om sekvenser av forskjellig opprinnelse (ansvarlige for ekspresjonen av andre proteiner, eller også syntetiske). Særlig kan det dreie seg om promotersekvenser for eucaryotiske eller virale gener. For eksempel kan det dreie seg om promoter-sekvenser fra genomet av cellen man ønsker å infisere. På samme måte kan det dreie seg om promotersekvenser fra genomet av en vims. I denne forbindelse kan man for eksempel nevne promoterene for genene EIA, MLP, CMV, RSV, og så videre. Videre kan disse ekspresjonssekvenser modifiseres ved addisjon av sekvenser for aktivering, regulering og så videre.
Videre kan nukleinsyren likeledes, særlig oppstrøms det terapeutiske gen, bære en signalsekvens som styrer det terapeutiske syntetiske produkt inn i målcellens sekresjons veier. Denne signalsekvens kan være den naturlige signalsekvens for det terapeutiske produkt men det kan likeledes dreie seg om en hvilken som helst annen funksjonell signalsekvens eller om en kunstig signalsekvens.
I en annen utførelsesform angår oppfinnelsen preparater inneholdende en nukleinsyre, et lipo-polyamin og et hjelpestoff i stand til å assosiere til lipo-polyamin/nukleinsyre-komplekset og å forbedre transfeksjonskraften. Det er i foreliggende oppfinnelse påvist at transfeksjonskraft for lipo-polyaminene på uventet måte kan økes i nærvær av visse hjelpestoffer (for eksempel lipider eller proteiner) som kan assosiere til komplekse lipo-polyamin/nukleinsyre. Som vist i eksemplene 4 til 7 i foreliggende søknad manifesteres denne forbedring like godt in vitro som in vivo.
Fortrinnsvis omfatter preparatene ifølge oppfinnelsen et eller flere nøytrale lipider som hjelpestoff. Slike preparater er spesielt fordelaktige, særlig når forholdet R er lavt. Det er påvist at tilføyelse av et nøytralt lipid tillater å forbedre dannelsen av nukleolipid-partikler og, på overraskende måte, å favorisere penetreringen av partiklene inn i cellen under destabilisering av membranet.
Aller helst er de nøytrale lipider som benyttes innfor oppfinnelsens ramme slike med to fettkjeder.
På en spesielt fordelaktig måte benyttes naturlige eller syntetiske, zwitterioniske eller ladningsberøvede lipider under fysiologiske betingelser. De kan mere spesielt velges blant dioleoylfosfatidyletanolamin (DOPE), oleyl-palmitoylfosfatidyletanolamin (POPE), di-stéaroyl, -palmitoyl- eller -mirystoyl fosfatidyletanolamin samt deres 1 til 3 ganger metylerte derivater; fosfatidyl glyceroler, diacylglyceroler, glycosyldiacylglyceroler, cérébrosider (som særlig galactocérébrocidene), sfingolipidene, som særlig sfingomyelinene) eller også asialogangliosidene (som særlig asialoGMl og -GM2).
Disse forskjellige lipider kan oppnås enten ved syntese eller ved ekstrahering fra organer (for eksempel fra hjernen) eller egg, ved klassiske, velkjente teknikker. Særlig kan ekstraheringen av naturlige lipider gjennomføres ved hjelp av organiske oppløsningsmidler (se særlig Lehninger, "Biochemistry").
Fortrinnsvis inneholder preparatene ifølge oppfinnelsen 0,1 til 20 ekvivalenter hjelpestoff pr. 1 ekvivalent lipopolyamin, allerhelst 1 til 5 ekvivalenter.
Preparatene ifølge oppfinnelsen kan formuleres med henblikk på administrering ad topisk, kutan, oral, rectal, vaginal, parenteral, intranasal, intravenøs, intramuskulær, subkutan, intraokkulær eller transdermal vei. Fortrinnsvis inneholder de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen en farmasøytisk akseptabel bærer for en injiserbar formulering, særlig for en formulering på nivå med det ønskede organ, eller for administrering ad topisk vei (på hud og/eller slimhinner). Det kan særlig dreie seg om sterile, isotoniske oppløsninger eller tørre preparater, særlig lyofiliserte preparater som, ved tilsetning av sterilisert vann eller fysiologisk serum, tillater konstituering av injiserbare preparater. Dosene av nukleinsyren som benyttes for injeksjon på denne måte samt antallet behandlinger kan tilpasses som funksjon av forskjellige parametre og særlig som funksjon av den benyttede administreirngsmåte, den angjeldende patologi, genet som skal uttrykkes eller også varigheten av behandlingen.
Oppfinnelsen skal illustreres nærmere under henvisning til de følgende eksempler.
Eksempel 1 - Plasmider anvendt for overføring av gener in vivo.
Det ble benyttet tre typer konstruksjoner for å påvise aktiviteten av oppfinnelsens preparater. Plasmider inneholdende genet som koder for luciférase (Lue), plasmider som omfatter genet som koder for B-galactosidase (gen LacZ) og plasmider omfattende genet som koder for kloramfénicol acetyl transferase (CAT).
1.1. Plasmider omfattende genet Lue.
Plasmidet pCMV-luc omfatter promoteren av Cytomégalovirus (CMV), ekstrahert fra plasmidvektoren pcDNA3 (Invitrogen) ved kutting med restriksjonsenzymer Mlu I og Hindin, situert oppstrøms genet som koder for luciférase, innskutt til setene Mlul og Hindin i vektoren pGL basic vektor (Promega).
1.2. Plasmider omfattende genet LacZ.
Plasmidet pCMV-BGal (Clontech) bærer promoteren CMV som befinner seg oppstrøms genet LacZ som koder for 6-galactosidase av Escherichia coli. Vektoren pSV-nls LacZ (pAOnlsLacZ) omfatter den samme promoter, en sekvens for den nukleære lokalisering (fra virus SV40) lokalisert i fase og oppstrøms genet LacZ. Denne konstruksjon tillater ekspresjon av fusjonsproteinet nls-JJ-galactosidase i cellekjernen (se De Luze et al. i "PNAS" 90 (1993) 7322).
1.3. Plasmider som bærer genet CAT.
Plasmider som som genrapportør har genet som koder for kloramfénicol acetyl transferase (CAT) under kontroll av promoteren RSV (pRSV-CAT) og SV40 (pSV40-CAT) er publisert (Boutiller et al., "Prog.Neuro.PhychoPharmacol." et "Biol. Psychiat" 16 (1992) 959; de Luze et al. "PNAS" 90 (1993) 7322).
Eksempel 2 - Overføring av nukleinsyre in vivo til hjernen av nyfødte mus under anvendelse av et lipopolyamin i et forhold R = 0,8.
Dette eksempel beskriver overføringen av plasmid pCMV-luc in vivo til hjernen av nyfødte mus. 30 ug plasmid pCMV-luc (eksempel 1.1.) fortynnes i 30 ul NaCl 150 mM steril (konsentrasjon 1 ug/ul). Derefter tilsettes 0,6 ul dioktadecylamidoglycylspermin (DOGS) 40 mM, fremstilt i 100 % etanol.
Blandingen omrøres kraftig og benyttes for intracerebrale injeksjoner på nyfødte mus. For dette formål anestetiseres musene ved kulde (anbringes på en aluminiumfolie i kontakt med is) hvoretter 2 ul av blandingen (2 ug nukleinsyre) injiseres pr. mus. Injeksjonene realiseres i cortex ved hjelp av en mikromanipulator og en mikro-sprøyte forbundet med en mikro-elektrode.
Hjernene fjernes etter 48 timer, homogeniseres, sentrifugeres og supernatanten benyttes for bestemmelse av luciférase. For dette formål inkuberes supernatanten i nærvær av en buffer omfattende luciferin, coenzym A og ATP, og avgitt lys (generelt i løpet av 10 sekunder) måles ved hjelp av et luminometer (Wood K. (1990) Promega Notes, 28).
De oppnådde resultater viser en aktivitet i normaliserte, relative lysenheter på 425 RLU/hjeme (gjennomsnitt av 10 dyr) (RLU = "relative light unit") når overføringen skjer ved hjelp av preparatet ifølge oppfinnelsen med R = 0,8, sammenlignet med en normalisert aktivitet på 100 RLU/hjerne når overføringen skjer kun ved hjelp av plasmidet (gjennomsnitt av 10 dyr).
Eksempel 3 - Sammenligningen av nukleinsyreoverføringen in vivo i hjerner av nyfødte mus under anvendelse av et lipopolyamin i et forhold R = 1,5 og 0,8.
3.1. Overføring av plasmidet pCMV-luc.
For forholdet R=0,8 er betingelsene som i eksempel 2. For forholdet R=l,5 blir 30 ug av plasmidet pCMV-luc (eksempel 1.1) fortynnet i 30 ul NaCl (150 mM steril (konsentrasjon 1 ug/ml). Deretter blir 1,13 ul dioktadecylamidoglycidyl spermin (DOGS) 40 mM, fremstilt i 100 % etanol, tilsatt.
Blandingen omrøres heftig og benyttes for intracerebrale injeksjoner i nyfødte mus. For dette formål blir musene bedøvet ved hjelp av kulde (anbragt på en aluminiumsfolie i kontakt med is) hvoretter 2 ul av blandingen (2 ug nukleinsyre) injiseres pr. mus. Injeksjonen gjennomføres i cortex ved hjelp av en mikromanipulator og en mikrosprøyte forbundet med en mikrosonde.
Hjernen fjernes etter 48 timer, homogeniseres og sentrifugeres hvoretter supernatanten benyttes for bestemmelse av luciférase i henhold til den protokoll som er beskrevet i eksempel 2. De oppnådde resultater viser en normalisert aktivitet på 89 RL/hjeme (gjennomsnitt av 12 dyr) når overføringen gjennomføres ved hjelp av preparatet ifølge oppfinnelsen med et forhold R=l,5, i motsetning til en normalisert aktivitet på 100 RLU/hjerne når overføringen skjer ved hjelp av oppfinnelsens preparat med et forhold R=0,8 (gjennomsnitt av 11 dyr).
3.2. Overføring av plasmidet pSV-nls LacZ.
Man benytter den samme prosedyre som i eksempel 3.1. ovenfor for å transfektere plasmid pSV-nls LacZ omfattende LacZ som koder for 6-galactosidase under kontroll av en promoter SV40 (simian virus 40). Denne konstruksjon (eksempel 1.2.) koder også for et peptid for signalisering av nukleær lokalisering. fi-galactosidase-enzymet transporteres så mot kjernen og den enzymatiske reaksjon som tilveiebringes av nukleinsyrene begrenses til dette subcellulære området. Injeksjonene realiseres på samme måte som for plasmid pCMV-luc og hjernene blir også fjernet 48 timer etter transfeksjon, fiksert i 2 %-ig paraformaldehyd i 24 timer og deretter behandlet for 6-galactosidase-reaksjon. Hjernene undersøkes deretter på ekspresjonsseter, de positive soner skjæres ut under kryostat (15 um), monteres i rammer og fotograferes. I to uavhengige forsøksserier viser 3 dyr av 10, på nivå med områder som befinner seg rundt injeksjonssonen, grupper av celler hvis kjerne oppviser en utpreget blåfarving som er karakteristisk for fi-galactosidase-aktiviteten.
Eksempel 4 - Overføring av nukleinsyrer in vitro, optimalisering av forholdet lipopolyamin:hjelpestoff.
Dette eksempel beskriver overføringen av nukleinsyrer in vitro (på cellekulturer) ved hjelp av et preparat ifølge oppfinnelsen omfattende nukleinsyre, et lipopolyamin og et hjelpestoff (nøytralt lipid) under forskjellige betingelser.
10^ celler fra fibroblasterlinjene 3T3 og hépatom human HepG2 inkuberes respektivt i nærvær av 1 og 2 ug av plasmidene pCMV-BGal eller oCMV-Luc under forskjellige
betingelser:
i nærvær av DOGS i ladningsforhold R=l og 1,5
i fravær eller i nærvær av 1,2, 5 eller 10 ekvivalenter av et hjelpestoff (DOPE=.
Transfeksjonskraften bestemmes deretter under betingelser som beskrevet i eksempel 2 for luciférase eller ved måling av prosentandelen av celler som oppviser en utpreget blåfarving for LacZ-aktivitet. De oppnådde resultater er angitt i de følgende tabeller.
Eksempel 5 - Transfeksjon av nukleinsyre in vivo i hjerner av nyfødte mus under anvendelse av et lipo-polyamin i et forhold R = 1 og et nøytralt lipid.
I dette eksempel blandes en etanolisk 40 mM DOGS-oppløsning med det tilsvarende volum av en oppløsning av dioleylfosfatidyletanolamin (DOPE) i en konsentrasjon av 80 mM, fremstilt i en l:5-blanding kloroformxtanol. Pr. 1 ekvivalent DOGS inneholder således blandingen 2 ekvivalenter DOPE. 30 ug av plasmidet pCMV-luc (eksempel 1.1.) fortynnes i 30 ul steril 150 mM NaCl (konsentrasjon 1 ug/ul). Deretter tilsettes 1,5 ul av den ovenfor beskrevne DOGS/DOPE-blanding.
Resten av protokollen (injeksjoner, prøvetaking, analyse) er identisk med det som er beskrevet under eksempel 3.1. De oppnådde resultater viser en normalisert aktivitet på 241 RLU/hjerne (gjennomsnitt av 13 dyr) når overføringen skjer i nærvær av et hjelpestoff (nøytralt lipid) mot en normalisert aktivitet på 100 RLU/hjerne når overføringen gjennomføres i nærvær av kun DOGS men med det samme ladningsforhold R = 11 (gjennomsnitt av 13 dyr).
Eksempel 6 - Overføring av nukleinsyre in vivo til hjerner av nyfødte mus under anvendelse av et lipo-polyamin i et forhold R = 1,25 og et nøytralt lipid.
I dette eksempel blandes en etanolisk 40 mM DOGS oppløsning med et likt volum av en 80 mM oppløsning av dioleylfosfatidyletanolamin (DOPE), fremstilt i 1:5 kloroform:etanol. Således inneholder blandingen 2 ekvivalenter DOPE pr. ekvivalent
DOGS.
30 ug av plasmidet pCMV-luc (eksempel 1.1.) fortynnes i 30 ul steril 150 mM NaCl (konsentrasjon 1 |ig/ml). Derefter tilsettes 1,87 ul av den ovenfor fremstilte DOGS:DOPE-blanding.
Resten av protokollen (injeksjoner, prøvetaking, analyse) er identisk med det som er beskrevet under eksempel 3.1. De oppnådde resultater viser en normalisert aktivitet på 405 RLU/hjerne (gjennomsnitt av 8 dyr) når overføringen skjer i nærvær av et hjelpestoff mot en normalisert aktivitet på 100 RLU/hjerne når overføringen gjennomføres i nærvær av kun DOGS men med det samme ladningsforhold R = 1,25 (gjennomsnitt av 8 dyr).
Eksempel 7 - Overføring av nukleinsyre in vivo i hjernen til nyfødte mus under anvendelse av et lipo-polyamin i et forhold R=l,5 og et nøytralt lipid.
I dette eksempel blir en etanolisk 40 mM DOGS oppløsning blandet med et likt volum av en 80 mM oppløsning av dioleylfosfatidyletanolamin (DOPE), fremstilt i en blanding kloroform:etanol 1:5. Således inneholder blandingen 2 ekvivalenter DOPE pr. ekvivalent DOGS.
30 ug plasmid pCMV-luc (eksempel 1.1.) fortynnes i 30 ul steril 150 mM NaCl (konsentrasjon 1 ug/ul) hvoretter 2,26 ul av den ovenfor fremstilte blanding
DOGS/DOPE tilsettes.
Resten av protokollen (injeksjoner, prøvetaking, analyse) er identisk med det som er beskrevet under eksempel 4.1. De oppnådde resultater viser en normalisert aktivitet på 165 RLU/hjeme (gjennomsnitt av 10 dyr) når overføringen skjer ved hjelp av en blanding ifølge oppfinnelsen inneholdende et hjelpestoff (nøytralt lipid) i motsetning til en normalisert aktivitet på 100 RLU/hjerne (gjennomsnitt av 11 dyr) når overføringen skjer ved kun DOGS men med det samme ladningsforhold R = 1,5.
Eksempel 8 - Overføring av nukleinsyre in vitro i mus under anvendelse av et lipo-polyamin i et forhold R=3.
Dette eksempel beskriver overføring av plasmid pCMV-luc in vivo til voksne mus. Forsøkene gjennomføres på voksne mus som er bedøvet med pentobarbital.
8.1. Overføring intravenøst.
Pr. mus blir 100 ug plasmid pCMV-luc fortynnet i 100 ul 150 mM NaCl. Derefter blir 7,5 ul 40 mM DOGS tilsatt. Jugulær-venen eksponeres ved dissekering og den ovenfor beskrevne oppløsning injiseres i retning av hjertet. Huden lukkes derefter med klemmer. 48 timer efter injeksjon blir musene avlivet ved cervical dislokasjon og lever, lunger, milt, hjerne, nyrer og en prøve av skjelett-muskelen taes. Efter homogenisering og sentrifugering blir supernatanten benyttet for analyse på luciférase. Dette forsøk gjennomføres på 4 mus. Ingen ekspresjon av luciférase påvises i de forskjellige prøvede vev.
8.2. Overføring intramusculært.
60 ug av plasmid pCMV-luc fortynnes i 300 ml 150 mM NaCl. Derefter settes 4,5 \ i\ 40 mM DOGS til oppløsningen. 40 ul av den ovenfor beskrevne blanding (10 ug DNA)
injiseres derefter pr. mus, gjennom huden, til den fremre tibilalis muskel. 48 timer efter injeksjon avlives musene ved cervical dislokasjon og de injiserte muskler fjernes. Efter homogenisering og sentrifugering blir supernatantene benyttet for analyse av luciférase. Dette forsøk gjennomføres på 6 mus. Det kan ikke påvises noen ekspresjon av luciférase.
Eksempel 9 - Overføring av nukleinsyre in vivo til mus ved bruk av et lipo-polyamin i forholdet R=4.
Dette eksempel beskriver overføring av plasmid pCMV-luc in vivo til voksne mus. Forsøkene gjennomføres på voksne mus som er bedøvet med pentobarbital.
9.1. Overføring venøst.
Pr. mus blir 100 ug plasmid pCMV-luc fortynnet i 150 ul 150 mM NaCl. Derefter settes 10 (il 40 mM DOGS til oppløsningen. Musenes jugulærvene eksponeres ved dissekering og den ovenfor beskrevne oppløsning injiseres i venen i retning av hjertet. Huden lukkes derefter med klemmer. 48 timer efter injeksjon blir musene avlivet ved cervical dislokasjon, og lever, lunger, milt, hjerne, nyrer og en prøve av skjelettmuskelen, fjernes. Efter homogenisering og sentrifugering benyttes supernatantene for analyse på luciférase. Dette forsøk gjennomføres på 4 mus. Det påvises ingen ekspresjon av luciférase i de forskjellige prøvede vev.
9.2. Overføring intramuskulært.
60 jig plasmid pCMV-luc fortynnes i 300 ul 150 mM NaCl. Derefter settes 6 ul 40 mM DOGS til oppløsningen. 50 ul av den ovenfor beskrevne oppløsning (10 ug DNA) injiseres derefter pr. mus, gjennom huden, til den fremre tibilalis muskel. 48 timer efter injeksjon avlives musene ved cervical dislokasjon og de injiserte muskler fjernes. Efter homogenisering og sentrifugering benyttes supernatantene for analyse av luciférase. Dette forsøk gjennomføres på 6 mus. Det påvises ingen ekspresjon av luciférase.

Claims (22)

1. Preparat inneholdende en nukleinsyre og et lipopolyamin der forholdet (R) mellom positive ladninger i lipopolyaminet og de negative ladninger i nukleinsyren er lik eller mindre enn 2, for bruk som medikament.
2. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at lipopolyaminet omfatter minst et hydrofilt polyamin-område med den generelle formel H2N-(-CH)m-NH-)n-H, der m er et helt tall lik eller større enn 2 og n er et helt tall lik eller større enn 1 idet m kan variere mellom de forskjellige karbongrupper, omfattet mellom 2 aminer og et lipofilt område som kan være en eventuelt mettet hydrokarbonkjede, kolesterol, et naturlig lipid eller et syntetisk lipid i stand til å danne lamellære eller heksagonale faser.
3. Preparat ifølge krav 2, karakterisert ved at m er fra og med 2 til og med 6, og n er fra og med 1 til og med 5.
4. Preparat ifølge krav 2, karakterisert ved atpolyamin-området er representert ved spermin eller en sperminanalog som har bevart sine egen-skaper for binding til DNA.
5. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at lipopolyaminet er valgt blant DOGS og DPPES.
6. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at nukleinsyren er en desoksyribonukleinsyre.
7. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at nukleinsyren er en ribonukleinsyre.
8. Preparat ifølge krav 6 eller 7, karakterisert ved at nukleinsyren er kjemisk modifisert.
9. Preparat ifølge kravene 6 til 8, karakterisert ved at nukleinsyren er en anti-retningssyre.
10. Preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 6 til 8, karakterisert ved at nukleinsyren omfatter et terapeutisk gen.
11. Preparat ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at forholdet R ligger mellom 0,1 og 1,9.
12. Preparat ifølge krav 11, karakterisert ved at forholdet R ligger mellom 0,5 og 1,5.
13. Preparat ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det i tillegg til en nukleinsyre og et lipopolyamin ifølge krav 2, inneholder et hjelpestoff i stand til binding til komplekse lipopolyamin/nukleinsyrer og å forbedre preparatets transfeksjonskraft.
14. Preparat ifølge krav 13, karakterisert ved at hjelpe-stoffet er et eller flere nøytrale lipider.
15. Preparat ifølge krav 14, karakterisert ved at det eller de nøytrale lipider er valgt blant syntetiske eller naturlige lipider, zwitterioniske lipider eller lipider som er berøvet ioneladningen under fysiologiske betingelser.
16. Preparat ifølge krav 15, karakterisert ved at det eller de nøytrale lipider er lipider med to fettkjeder.
17. Preparat ifølge krav 15, karakterisert ved at det eller de nøytrale lipider er valgt blant dioleylfosfatidyletanolamin (DOPE), oleyl-palmitoylfosfatidyletanolamin (POPE), di-stearoyl, -palmitoyl- eller -mirystoyl fosfatidyletanolamin samt deres 1 til 3 ganger N-metylerte derivater; fosfatidylglyceroler, diacylglyceroler, glycosyldiacylglyceroler, cerebrocider (som særlig galactocerebrosidene), sfingolipider (som særlig sfingomyelinene) og asialogangliosidene (som særlig asialoGMl og -GM2).
18. Preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 17, karakterisert ved at lipopolyaminet er som angitt kravene 3 til 5.
19. Preparat ifølge krav 13, karakterisert ved at forholdet R mellom de positive ladninger i lipopolyaminet og de negative ladninger i nukleinsyren er lik eller mindre enn 2.
20. Preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 13 til 19, karakterisert ved at det omfatter 0,1 til 20 ekvivalenter hjelpestoff pr. 1 ekvivalent lipopolyamin, fortrinnsvis 1 til 5 ekvivalenter.
21. Preparat ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer for en injiserbar formulering.
22. Preparat ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det omfatter en farmasøytisk bærer i stand til applikering på huden og/eller slimhinnene.
NO19962791A 1994-01-10 1996-07-02 Preparater inneholdende nukleinsyrer. NO318180B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9400159A FR2714830B1 (fr) 1994-01-10 1994-01-10 Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations.
PCT/FR1995/000022 WO1995018863A1 (fr) 1994-01-10 1995-01-09 Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO962791D0 NO962791D0 (no) 1996-07-02
NO962791L NO962791L (no) 1996-07-02
NO318180B1 true NO318180B1 (no) 2005-02-14

Family

ID=9458870

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO19962791A NO318180B1 (no) 1994-01-10 1996-07-02 Preparater inneholdende nukleinsyrer.

Country Status (15)

Country Link
US (2) US5846947A (no)
EP (1) EP0738328B1 (no)
JP (1) JP4380796B2 (no)
KR (1) KR100377889B1 (no)
AT (1) ATE312190T1 (no)
AU (1) AU707571B2 (no)
CA (1) CA2180872C (no)
DE (1) DE69534669T2 (no)
FI (1) FI962799A (no)
FR (1) FR2714830B1 (no)
IL (1) IL112289A0 (no)
MX (1) MX9602561A (no)
NO (1) NO318180B1 (no)
WO (1) WO1995018863A1 (no)
ZA (1) ZA95137B (no)

Families Citing this family (138)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3887017B2 (ja) * 1994-10-14 2007-02-28 第一製薬株式会社 「遺伝子物質含有組成物」
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
JP4335310B2 (ja) * 1995-06-07 2009-09-30 ザ ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア 疎水性脂質−核酸複合中間体を通して調製される脂質−核酸粒子、及び遺伝子移送のための使用
FR2741066B1 (fr) * 1995-11-14 1997-12-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques
DE19605175A1 (de) 1996-02-13 1997-08-14 Sourovoi Andrej Dr Lipidverbindungen und deren Verwendung
DE19605548A1 (de) * 1996-02-15 1997-09-04 Boehringer Ingelheim Int Zusammensetzung für die Transfektion höherer eukaryotischer Zellen
FR2750704B1 (fr) 1996-07-04 1998-09-25 Rhone Poulenc Rorer Sa Procede de production d'adn therapeutique
FR2754272B1 (fr) * 1996-10-08 1998-11-13 Rhone Poulenc Rorer Sa Procede de preparation de compositions pour le transfert d'acides nucleiques
US7008776B1 (en) * 1996-12-06 2006-03-07 Aventis Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol
CZ299055B6 (cs) 1996-12-06 2008-04-09 Aventis Pharmaceuticals Inc. Izolovaný polypeptid kódovaný genem podobným genupro lipázu, prostredek mající fosfolipázovou úcinnost, farmaceutický prostredek, izolovaný imunizacní peptid a nukleová kyselina, biologicky aktivní prostredek, vektor, rekombinantní bunka, prostredek
WO1998024936A1 (en) * 1996-12-06 1998-06-11 The Regents Of The University Of California Macromolecule-lipid complexes and methods for making and using
CN1177934C (zh) 1997-04-28 2004-12-01 阿文蒂斯药物股份有限公司 腺病毒介导的肿瘤内投送血管生成拮抗剂用于肿瘤的治疗
US6875606B1 (en) 1997-10-23 2005-04-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs Human α-7 nicotinic receptor promoter
FR2777017B1 (fr) * 1998-04-02 2002-08-23 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux agents de transfert d'acides nucleiques, compositions les contenant et leurs applications
EP1068188A1 (fr) * 1998-04-02 2001-01-17 Aventis Pharma S.A. Nouveaux agents de transfert d'acides nucleiques, compositions les contenant et leurs applications
US6225456B1 (en) 1998-05-07 2001-05-01 University Technololy Corporation Ras suppressor SUR-5
US6506889B1 (en) 1998-05-19 2003-01-14 University Technology Corporation Ras suppressor SUR-8 and related compositions and methods
US6441156B1 (en) * 1998-12-30 2002-08-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Calcium channel compositions and methods of use thereof
WO2000061804A1 (en) * 1999-04-14 2000-10-19 Musc Foundation For Research Development Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes
US6224566B1 (en) 1999-05-04 2001-05-01 Cardiodyne, Inc. Method and devices for creating a trap for confining therapeutic drugs and/or genes in the myocardium
US6770740B1 (en) 1999-07-13 2004-08-03 The Regents Of The University Of Michigan Crosslinked DNA condensate compositions and gene delivery methods
EP1276500B1 (en) 2000-03-13 2011-06-08 Cornell Research Foundation, Inc. Blocking leukocyte emigration and inflammation by interfering with cd99/hec2
US20040033600A1 (en) 2001-03-21 2004-02-19 Palli Subba Reddy Ecdysone receptor-based inducible gene expression system
GB0018307D0 (en) 2000-07-26 2000-09-13 Aventis Pharm Prod Inc Polypeptides
AU5345901A (en) 2000-04-13 2001-10-30 Univ Rockefeller Enhancement of antibody-mediated immune responses
US8105825B2 (en) 2000-10-03 2012-01-31 Intrexon Corporation Multiple inducible gene regulation system
DE60144198D1 (de) 2000-12-28 2011-04-21 Wyeth Llc Rekombinantes schutzprotein aus streptococcus pneumoniae
DK1534738T3 (da) 2001-02-20 2012-10-01 Intrexon Corp Nye substitutionsmutantreceptorer og anvendelse heraf i et inducérbart genekpressionssystem på basis af en nuklear receptor
WO2002066612A2 (en) 2001-02-20 2002-08-29 Rheogene, Inc. Novel substitution mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
CA2438119C (en) 2001-02-20 2014-12-16 Rheogene Holdings, Inc. Chimeric retinoid x receptors and their use in a novel ecdysone receptor-based inducible gene expression system
CA2441444C (en) 2001-02-20 2013-09-03 Rheogene Holdings, Inc. Novel ecdysone receptor/invertebrate retinoid x receptor-based inducible gene expression system
ATE448793T1 (de) 2001-03-02 2009-12-15 Univ Rockefeller Rekombinante hybrid-allergenkonstrukte mit verringerter allergenität unter beibehaltung der immunogenität des natürlichen allergens
AUPR621501A0 (en) 2001-07-06 2001-08-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Delivery of ds rna
MXPA04002810A (es) 2001-09-26 2005-06-06 Rheogene Holdings Inc Acidos nucleicos receptores de ecdisona de saltarilla, polipeptidos, y sus usos.
JP2005507247A (ja) 2001-09-26 2005-03-17 レオジーン・ホールディングス，インコーポレーテッド コナジラミエクジソン受容体核酸、ポリペプチド、およびそれらの使用
US20040023910A1 (en) * 2001-09-28 2004-02-05 Zhiming Zhang Use of cyr61 in the treatment and diagnosis of human uterine leiomyomas
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
WO2003100008A2 (en) 2002-05-24 2003-12-04 Schering Corporation Neutralizing human anti-igfr antibody
JP2005537028A (ja) * 2002-06-26 2005-12-08 ザ　ペン　ステート　リサーチ　ファウンデーション ヒト乳頭腫ウイルス感染症を治療する方法及び材料
WO2004002453A1 (en) 2002-06-28 2004-01-08 Protiva Biotherapeutics Ltd. Method and apparatus for producing liposomes
US7375093B2 (en) 2002-07-05 2008-05-20 Intrexon Corporation Ketone ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US7785608B2 (en) 2002-08-30 2010-08-31 Wyeth Holdings Corporation Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease
US7304161B2 (en) 2003-02-10 2007-12-04 Intrexon Corporation Diaclhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes in mammalian systems via an ecdysone receptor complex
US7456315B2 (en) 2003-02-28 2008-11-25 Intrexon Corporation Bioavailable diacylhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
AU2004257373B2 (en) 2003-07-16 2011-03-24 Arbutus Biopharma Corporation Lipid encapsulated interfering RNA
NZ592917A (en) 2003-09-15 2012-12-21 Protiva Biotherapeutics Inc Stable polyethyleneglycol (PEG) dialkyloxypropyl (DAA) lipid conjugates
US7432057B2 (en) 2004-01-30 2008-10-07 Michigan State University Genetic test for PSE-susceptible turkeys
EP2267458A3 (en) 2004-04-20 2011-04-06 Galapagos N.V. Methods, compositions and compound assays for inhibiting amyloid-beta protein production
MXPA06012162A (es) 2004-04-27 2007-03-30 Galapagos Nv Metodos, agentes y ensayos de seleccion de compuestos para inducir diferenciacion de celulas de mamifero no diferenciadas, en osteoblastos.
US7935510B2 (en) 2004-04-30 2011-05-03 Intrexon Corporation Mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
EP1781593B1 (en) 2004-06-07 2011-12-14 Protiva Biotherapeutics Inc. Cationic lipids and methods of use
ATE536418T1 (de) 2004-06-07 2011-12-15 Protiva Biotherapeutics Inc Lipidverkapselte interferenz-rna
WO2005121778A2 (en) 2004-06-14 2005-12-22 Galapagos N.V. Methods for identification, and compounds useful for the treatment of degenerative & inflammatory diseases
EP2386856B1 (en) 2004-06-21 2013-07-24 Galapagos N.V. Methods and means for treatment of osteoarthritis
JP2008504827A (ja) 2004-07-02 2008-02-21 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド 免疫賦活性ｓｉＲＮＡ分子およびその使用方法
US7604798B2 (en) 2004-07-15 2009-10-20 Northwestern University Methods and compositions for importing nucleic acids into cell nuclei
CA2573702C (en) 2004-07-16 2013-10-15 The Government Of The United States Of America As Represented By The Sec Retary Of The Department Of Health And Human Services Vaccine constructs and combination of vaccines designed to improve the breadth of the immune response to diverse strains and clades of hiv
US7485468B2 (en) 2004-10-15 2009-02-03 Galapagos Bv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of joint degenerative and inflammatory diseases
US9034650B2 (en) 2005-02-02 2015-05-19 Intrexon Corporation Site-specific serine recombinases and methods of their use
CA2611944A1 (en) * 2005-06-15 2006-12-28 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipids and uses thereof
US8088382B2 (en) 2005-07-05 2012-01-03 Cornell Research Foundation, Inc. Methods of inhibiting transendothelial migration of neutrophils and monocytes with anti-CD99L2 antibodies
US7666584B2 (en) 2005-09-01 2010-02-23 Philadelphia Health & Education Coporation Identification of a pin specific gene and protein (PIN-1) useful as a diagnostic treatment for prostate cancer
EP1948674A4 (en) 2005-11-02 2009-02-04 Protiva Biotherapeutics Inc MODIFIED SIRNA MOLECULES AND APPLICATIONS THEREOF
US7915399B2 (en) 2006-06-09 2011-03-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
GB0613753D0 (en) 2006-07-11 2006-08-23 Norwegian Radium Hospital Res Method
RU2500815C2 (ru) 2006-07-28 2013-12-10 Санофи-Авентис Композиция и способ лечения опухолей
WO2008060813A2 (en) 2006-10-19 2008-05-22 Merck & Co., Inc. High affinity antibody antagonists of interleukin-13 receptor alpha 1
ES2388567T3 (es) 2006-10-19 2012-10-16 Csl Limited Anticuerpos anti-il-13r alfa 1 y usos de los mismos
AR064642A1 (es) 2006-12-22 2009-04-15 Wyeth Corp Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi
CN104761466A (zh) 2007-05-29 2015-07-08 英特拉克森公司 通过蜕皮素受体复合物调节外源性基因表达的手性二酰基肼配体
EP2162747B1 (en) 2007-06-20 2014-04-30 Galapagos N.V. Molecular targets and methods to identify compounds for treating bone and joint degenerative diseases
US20090069266A1 (en) 2007-06-27 2009-03-12 Northwestern University Methods and compositions for nucleic acid transfer into cells
MX2010001993A (es) 2007-08-23 2010-03-11 Intrexon Corp Metodos y composiciones para diagnosticar una enfermedad.
AU2008302504B2 (en) * 2007-09-17 2014-08-14 Agrofresh Inc. Compositions and methods for the modification of physiological responses in plants
EP2205249B1 (en) 2007-09-28 2018-11-07 Intrexon Corporation Therapeutic gene-switch constructs and bioreactors for the expression of biotherapeutic molecules, and uses thereof
JP2010539993A (ja) 2007-10-08 2010-12-24 イントレキソン コーポレーション 遺伝子操作した樹状細胞および癌の治療のための使用
AU2009238175C1 (en) 2008-04-15 2023-11-30 Arbutus Biopharma Corporation Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
EP2816113A3 (en) 2008-09-11 2015-03-25 Galapagos N.V. Method for identifying compounds useful for increasing the functional activity and cell surface expression of cf-associated mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
NO2356135T3 (no) 2008-11-05 2018-03-24
JP6087504B2 (ja) 2008-11-07 2017-03-01 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー アミノアルコールリピドイドおよびその使用
US8242086B2 (en) * 2008-11-12 2012-08-14 Duke University Methods and compositions for treating disorders caused by a deficiency in a gene product of a CLN gene
WO2010096561A1 (en) 2009-02-18 2010-08-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Synthetic hiv/siv gag proteins and uses thereof
EP2398481A2 (en) 2009-02-19 2011-12-28 Galapagos N.V. Methods for identifying and compounds useful for the diagnosis and treatment of diseases involving inflammation
US20120035245A1 (en) 2009-02-19 2012-02-09 Richard Antonius Jozef Janssen Methods for identifying and compounds useful for the diagnosis and treatment of diseases involving inflammation
EP2398479A2 (en) 2009-02-19 2011-12-28 Galapagos N.V. Methods for identifying and compounds useful for the diagnosis and treatment of diseases involving inflammation
WO2010112569A1 (en) 2009-03-31 2010-10-07 Robert Zimmermann Modulation of adipose triglyceride lipase for prevention and treatment of cachexia, loss of weight and muscle atrophy and methods of screening therefor
WO2010115825A2 (en) 2009-03-31 2010-10-14 Robert Zimmermann Modulation of adipose triglyceride lipase for prevention and treatment of cachexia, loss of weight and muscle atrophy and methods of screening therefor
EP3043179B1 (en) 2009-04-01 2020-05-06 Galapagos N.V. Methods and means for treatment of osteoarthritis
EP2419121B1 (en) 2009-04-17 2018-07-18 New York University Peptides targeting tnf family receptors and antagonizing tnf action, compositions, methods and uses thereof
US9018187B2 (en) 2009-07-01 2015-04-28 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
WO2011000106A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Improved cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
CA2767127A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for delivery of therapeutic agents to solid tumors
WO2011015573A1 (en) 2009-08-03 2011-02-10 Galapagos Nv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of neurodegenerative diseases
WO2011015572A1 (en) 2009-08-03 2011-02-10 Galapagos Nv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of neurodegenerative diseases
US9186370B2 (en) 2010-03-19 2015-11-17 University Of South Alabama Methods and compositions for the treatment of cancer
TWI688395B (zh) 2010-03-23 2020-03-21 英翠克頌公司 條件性表現治療性蛋白質之載體、包含該載體之宿主細胞及彼等之用途
WO2012000104A1 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Protiva Biotherapeutics, Inc. Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
WO2012025873A2 (en) 2010-08-23 2012-03-01 Wyeth Llc STABLE FORMULATIONS OF NEISSERIA MENINGITIDIS rLP2086 ANTIGENS
PE20140173A1 (es) 2010-09-10 2014-02-20 Wyeth Llc Variantes no lipidadas de antigenos orf2086 de neisseria meningitidis
BR112013014457A8 (pt) 2010-12-09 2017-12-19 Pasteur Institut usos da enzima 6-metilguanina-dna-metiltrasferase (mgmt, ec 2.1.1.63) para aumentar a produção de proteína heteróloga, bem como vetor de expressão, células recombinantes e polipeptídeo de fusão compreendendo sinal de secreção peptídica e proteína snap
EP2492279A1 (en) 2011-02-25 2012-08-29 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Rapid immunogen selection method using lentiviral display
WO2012122025A2 (en) 2011-03-04 2012-09-13 Intrexon Corporation Vectors conditionally expressing protein
PL2691443T3 (pl) 2011-03-28 2021-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Sprzężone lipomery i ich zastosowania
WO2012135696A2 (en) 2011-04-01 2012-10-04 University Of South Alabama Methods and compositions for the diagnosis, classification, and treatment of cancer
EP2546358A1 (en) 2011-07-15 2013-01-16 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Methods and reagents for efficient control of HIV progression
WO2013043720A1 (en) 2011-09-20 2013-03-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill Regulation of sodium channels by plunc proteins
WO2013053765A1 (en) 2011-10-11 2013-04-18 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. A non-human animal model of mucosa-associated lymphoid tissue (malt) lymphoma
AU2012328570B2 (en) 2011-10-27 2017-08-31 Massachusetts Institute Of Technology Amino acid derivatives functionalized on the n-terminus capable of forming drug encapsulating microspheres and uses thereof
MX349562B (es) 2011-12-09 2017-08-02 Pasteur Institut Ensayo de inmuno deteccion multiplex.
US9464291B2 (en) 2012-01-06 2016-10-11 University Of South Alabama Methods and compositions for the treatment of cancer
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
SG10201602558UA (en) 2012-03-09 2016-05-30 Pfizer Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
EP2698377A1 (en) 2012-08-17 2014-02-19 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Enhanced rapid immunogen selection method for HIV gp120 variants
WO2014107739A1 (en) 2013-01-07 2014-07-10 Eleven Biotherapeutics, Inc. Antibodies against pcsk9
EP2964665B1 (en) 2013-03-08 2018-08-01 Pfizer Inc Immunogenic fusion polypeptides
EP2968613B1 (en) 2013-03-11 2019-09-11 University of Florida Research Foundation, Inc. Delivery of card protein as therapy for occular inflammation
JP6437467B2 (ja) 2013-03-14 2018-12-19 ガラパゴス・ナムローゼ・フェンノートシャップＧａｌａｐａｇｏｓ Ｎ．Ｖ． 線維化疾患治療において有用な分子標的及び化合物、並びにこれらの同定方法
US9952202B2 (en) 2013-03-14 2018-04-24 Galapagos Nv Methods of identifying compounds for the treatment of fibrosis by using S1PR5
EP2972381A2 (en) 2013-03-14 2016-01-20 Galapagos NV Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of diseases associated with epithelial mesenchymal transition
CN105283439B (zh) 2013-03-15 2018-02-02 英特瑞克斯顿股份有限公司 含硼的二酰基肼类化合物
US20160130585A1 (en) 2013-05-28 2016-05-12 The Johns Hopkins University Aptamers for the treatment of sickle cell disease
CA2923129C (en) 2013-09-08 2020-06-09 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
US11053291B2 (en) 2014-02-19 2021-07-06 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Delivery of Nrf2 as therapy for protection against reactive oxygen species
KR101605421B1 (ko) 2014-03-05 2016-03-23 국립암센터 B 세포 림프종 세포를 특이적으로 인지하는 단일클론항체 및 이의 용도
WO2016004202A1 (en) 2014-07-02 2016-01-07 Massachusetts Institute Of Technology Polyamine-fatty acid derived lipidoids and uses thereof
JP6567657B2 (ja) 2014-09-17 2019-08-28 イントレキソン コーポレーション ホウ素含有ジアシルヒドラジン化合物
BR112017017460A2 (pt) 2015-02-19 2018-04-10 Pfizer Inc. composições de neisseria meningitidis e métodos das mesmas
TW201710503A (zh) 2015-06-12 2017-03-16 長庚醫療財團法人林口長庚紀念醫院 新穎多核苷酸、載體、醫藥組成物以及其用途
US10201618B2 (en) 2015-06-19 2019-02-12 Massachusetts Institute Of Technology Alkenyl substituted 2,5-piperazinediones, compositions, and uses thereof
WO2017062953A1 (en) 2015-10-10 2017-04-13 Intrexon Corporation Improved therapeutic control of proteolytically sensitive, destabilized forms of interleukin-12
NZ752941A (en) 2016-11-09 2023-04-28 Intrexon Corp Frataxin expression constructs
AU2018215585B2 (en) 2017-01-31 2022-03-17 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
EP3539975A1 (en) 2018-03-15 2019-09-18 Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall-Hebron Micropeptides and uses thereof
EP3835320A4 (en) 2018-08-10 2022-06-01 Eutilex Co., Ltd. BINDING OF CHEMERA ANTIGEN RECEPTOR TO HLA-DR, AND CAR-T CELL
AU2020236937B2 (en) 2019-03-08 2023-06-15 Obsidian Therapeutics, Inc. CD40L compositions and methods for tunable regulation
WO2021142376A1 (en) 2020-01-08 2021-07-15 Obsidian Therapeutics, Inc. Compositions and methods for tunable regulation of transcription
EP3885440A1 (en) 2020-03-26 2021-09-29 Splicebio, S.L. Split inteins and their uses
JP2023553343A (ja) 2020-11-25 2023-12-21 アカゲラ・メディスンズ，インコーポレイテッド 核酸を送達するための脂質ナノ粒子および関連する使用方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2645866B1 (fr) * 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
IL105914A0 (en) * 1992-06-04 1993-10-20 Univ California Methods and compositions for in vivo gene therapy
EP0648265A4 (en) * 1992-06-18 1996-12-04 Genpharm Int PROCESS FOR THE PRODUCTION OF NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS HAVING AN ARTIFICIAL YEAST CHROMOSOME.
US5329029A (en) * 1992-11-05 1994-07-12 Wan Barbara Y Phosphatidylalkanolamine derivatives and their use in generating phospholipid conjugates
US5908635A (en) 1994-08-05 1999-06-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method for the liposomal delivery of nucleic acids

Also Published As

Publication number Publication date
ATE312190T1 (de) 2005-12-15
JPH09508100A (ja) 1997-08-19
US6172048B1 (en) 2001-01-09
NO962791D0 (no) 1996-07-02
AU1458395A (en) 1995-08-01
ZA95137B (en) 1995-09-09
WO1995018863A1 (fr) 1995-07-13
CA2180872A1 (fr) 1995-07-13
NO962791L (no) 1996-07-02
FR2714830B1 (fr) 1996-03-22
AU707571B2 (en) 1999-07-15
EP0738328B1 (fr) 2005-12-07
CA2180872C (fr) 2010-04-20
DE69534669D1 (de) 2006-01-12
FI962799A0 (fi) 1996-07-09
KR100377889B1 (ko) 2004-03-19
MX9602561A (es) 1997-03-29
JP4380796B2 (ja) 2009-12-09
EP0738328A1 (fr) 1996-10-23
DE69534669T2 (de) 2006-08-31
FR2714830A1 (fr) 1995-07-13
FI962799A (fi) 1996-07-09
US5846947A (en) 1998-12-08
IL112289A0 (en) 1995-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO318180B1 (no) Preparater inneholdende nukleinsyrer.
US6200956B1 (en) Nucleic acid-containing composition, preparation and use thereof
NO323110B1 (no) Preparat innbefattende en nukleinsyre og kationisk polymer samt anvendelse av polymeren.
Zeng et al. Self-assembled ternary complexes of plasmid DNA, low molecular weight polyethylenimine and targeting peptide for nonviral gene delivery into neurons
Nabel et al. Direct gene transfer for immunotherapy and immunization
AU4674101A (en) Compositions for drug delivery
AU720697B2 (en) Pharmaceutical composition which is useful for the transfection of nucleic acids, and uses thereof
WO1999065461A3 (en) Cationic amphiphile micellar complexes
KR20000057307A (ko) 외인성 핵산이 이입된 재조합 바이러스, 비-바이러스 및비-플라스미드 형질 감염제를 병용하는 유전자 요법에 유용한형질감염 조성물
MXPA97006016A (en) Composition containing nucleic acids, preparation and use
AU737314B2 (en) Nucleic acid containing composition, preparation and uses of same
Morgan Gene therapy protocols
MXPA98001920A (en) Pharmaceutical composition useful for the transfection of nucleic acids and its u
Andreu et al. The Potential for Gene Therapy of Neurodegenerative Disorders
US20050220806A1 (en) Method of transporting physiological polymer using protein having rxp repeated sequence

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees