PT2266627E

PT2266627E - Vetores mutacionais oligodesoxinucleotídicos de cadeia simples

Info

Publication number: PT2266627E
Application number: PT100086024T
Authority: PT
Inventors: Debra M Walther; Bruce L Frank; Richard A Metz
Original assignee: Valigen Us Inc
Priority date: 1999-08-27
Filing date: 2000-08-25
Publication date: 2015-08-25
Also published as: BR0013590A; AU773242C; CN1384759B; EP1210123B1; JP5813571B2; US6271360B1; US6479292B1; JP2012184246A; DK2266627T3; EP1210123A1; DK2324856T3; PT1210123E; CN1384759A; US20040023392A1; ES2544727T3; DK1210123T3; US7060500B2; EP1210123A4; EP2324856B1; JP2003508451A

Description

DESCRigÄO "Vetores mutacionais oligodesoxinucleotidicos de cadeia simples"

1. CAMPO DA INVENCÄO A invengäo refere-se a oligodesoxinucleótidos de cadeia simples, seus derivados determinados e a métodos para a sua utilizagäo para introdugäo de urna alteragao predeterminada numa localizagäo predeterminada num gene alvo numa célula viva. A célula pode ser urna célula de mamífero, de inseto, de peixe, de verme ou de ave, quer num meio de cultura artificial quer num organismo, urna célula bacteriana ou urna célula vegetal. 0 gene alvo pode ser um gene cromossómico ou um gene extracromossómico, i.e., num cromossoma bacteriano artificial.

2. ANTECEDENTES DA INVENQÁO

Estäo descritas técnicas para efetuar urna alteragao predeterminada numa localizagäo predeterminada numa sequéncia de ácido nucleico alvo de urna célula. Estas técnicas utilizam as enzimas da célula que se referem ä reparagäo do ADN e recombinagäo homologa. Nestas técnicas é sintetizado um oligonucleótido ou um análogo oligonucleotidico que contém duas regibes que possuem a sequéncia do gene alvo que flanqueia urna regiáo, denominada urna "regiáo mutadora", que difere do gene alvo. No presente pedido estes oligonucleótidos e análogos serbo genéricamente denominados "vetores mutacionais". Estes vetores mutacionais podem introduzir alteragóes genéticas predeterminadas num gene alvo através de um mecanismo que se eré envolver recombinagäo homologa e/ou excisäo de nucleótidos e reparagäo.

As Patentes dos Estados Unidos N.2 5565350 e 5731181 de Kmiec, descrevem vetores mutacionais que contém cadeias complementares em que urna primeira cadeia compreende análogos ribonucleotidicos que formam pares de bases de Watson-Crick com desoxirribonucleótidos de urna segunda cadeia. A Patente dos Estados Unidos N.2 6004804 de Kumar e Metz descreve certos melhoramentos em vetores mutacionais dúplices, incluindo urna variante em que a regiáo mutadora está presente em apenas urna das duas cadeias. A utilizagäo de vetores mutacionais do tipo Kmiec em sistemas de mamífero está descrita na patente U.S. 5760012 e em conjunto com transportadores macromoleculares na Publicagäo Internacional de Patente WO 98/49350 de Kren et al., e no pedido de patente dos Estados Unidos relacionado, com o n.2 de série 09/108006. Descrigöes adicionáis da utilizagäo de vetores mutacionais do tipo Kmiec podem ser encontradas em Cole-Strauss et al., 1996, Science 273:1386; Kren et al., 1998, Nature Med. £:285; e Bandyopadhyay et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:10163. A utilizagäo de vetores de mutagáo do tipo Kmiec em células vegetáis está descrita ñas Publicagöes Internacionais de Patente WO 99/25853 de Pioneer Hi-Bred International, WO 99/07865 de Kimeragen, Inc. e WO 98/54330 de Zeneca Ltd. As publicagöes científicas que descrevem a utilizagäo de vetores do tipo Kmiec em plantas incluem Beetham et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 9_6:8774 e Zhu, et al., 1999, Proc. Nati. Acad. Sei. USA 96:8768. A utilizagäo de vetores mutacionais do tipo Kmiec e suas variantes, que tém cadeia dupla, está descrita na Patente dos Estados Unidos N.2 6004804 de Kumar e Metz. O pedido de Kumar e Metz ensina, Inter alia, que os vetores do tipo Kmiec e suas variantes podem ser utilizados em células bacterianas. A utilizagäo de oligodesoxinucleótidos de cadeia simples como vetores mutacionais para efetuar alteragöes num gene cromossómico na levedura S. cerevisiae foi descrita em relatórios do laboratorio do Dr. F. Sherman, Yale University. Moerschell et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:524-528 e Yamamoto et al., 1992, Yeast _8:935-948. O comprimento ótimo dos vetores mutacionais utilizados nestes estudos era de 50 nucleótidos.

Num relatório isolado relativo ä utilizagäo de um polinucleótido de 160 nucleótidos de cadeia simples e dupla para tentar fazer alteragöes num gene cromossómico pode encontrar-se em Hunger-Bertling, 1990, Mol. Cell. Biochem. j/2 :107-116. Os resultados para polinucleót idos de cadeia simples foram ambiguos porque apenas foi analisado o produto das experiencias utilizando polinucleótidos de cadeia dupla. A utilizagäo de um fragmento de ADN em cadeia simples de 488 pares de bases para fazer alteragöes genéticas especificas no gene regulador da condutáncia transmembranar na fibrose cistica foi relatada por Goncz et al., 1998, Hum. Mol. Genetics 7_:1913; e Kunzelmann et al., 1996, Gene Ther. _3:8 5 9.

Utilizaram-se oligodesoxinucleótidos de cadeia simples de cerca de 40 nucleótidos de comprimento em células de mamífero como controlo para estudos de genes epissómicos em que o oligodesoxinucleótido foi ligado covalentemente a um oligonucleótido que forma um tríplice e em que o oligodesoxinucleótido sozinho resultou em taxas de alteragáo genética predeterminada do gene epissómico de cerca de 1 por 5xl04', ou menos. Chan et al., 1999, J. Biol. Chem. 74:11541. Encontra-se um relatório anterior da utilizagäo de oligodesoxinucleótidos de cadeia simples para fazer alteragöes predeterminadas num gene epissómico numa célula de mamífero em Campbell et al., 1989, The New Biologist _1:223.

Um aspeto da divulgagáo refere-se a oligodesoxinucleótidos que foram modificados através da ligagäo de um corante de indocarbocianina. Os corantes de indocarbocianina sao conhecidos como excelentes fluoróforos. A síntese de cianoetil-N, N-diisopropilfosforoamiditos de indocarbocianina bloqueados que sao adequados para utilizagäo em síntese de nucleótidos em fase sólida está descrita ñas Patentes dos Estados Unidos N.2 5556959 e 5808044.

Um segundo aspeto da divulgagáo refere-se a urna composigáo compreendendo um oligonucleótido de cadeia simples que codifica urna alteragáo genética predeterminada e um transportador macromolecular que compreende um ligando para um recetor na superficie da célula alvo. Urna composigáo compreendendo urna poli-L-lisina, um ligando para o recetor de asialoglicoproteínas e um oligodesoxinucleótido anti-sentido com entre 21 e 24 nucleótidos está descrita na Publicagáo Internacional de Patente WO 93/04701.

Um terceiro aspeto da divulgagáo refere-se a urna modificagäo de um oligodesoxinucleótido através da ligagäo de um nucleótido ligado em 3'-3'. A Patente dos Estados Unidos N.2 5750669 ensina um tal oligodesoxinucleótido modificado. A citagäo ou identificagäo de qualquer referencia na Secgäo 2, ou em qualquer secgäo no presente pedido nao deverá ser entendida como urna admissáo de que essa referencia está disponível como anterioridade relativamente á presente invengáo.

3. SUMARIO DA INVENgÁO A presente invengáo baseia-se na verificagáo inesperada de que oligodesoxinucleótidos de cadeia simples, particularmente quando apropriadamente modificados ou colocados numa composigáo com um transportador macromolecular adequado, podem ser táo ou mais eficazes para efetuar alteragóes genéticas predeterminadas em genes alvo em células como os vetores da arte anterior, i.e., vetores mutacionais do tipo Kmiec. Um oligodesoxinucleótido de cadeia simples adequado para utilizagáo de acordo com a presente invengáo é denominado daqui em diante um vetor mutacional oligodesoxinucleótídico de cadeia simples ou um SSOMV (do inglés, "Single Stranded Oligodeoxynucleotide Mutational Vector".

Numa concretizagáo a divulgagáo proporciona urna composigáo para utilizagáo para efetuar alteragóes dos genes cromossómicos de células de animáis, e.g. de mamífero, consistindo no oligodesoxinucleótido que codifica a alteragáo genética e um transportador macromolecular. O transportador pode ser um policatiáo, urna vesícula lipídica de núcleo aquoso ou urna nanoesfera lipídica. Numa outra concretizagáo que é adequada para utilizagáo in vivo, o transportador compreende adicionalmente um ligando que se liga a um recetor da superficie celular que é internalizado, tal como um ligando para um recetor do fosso revestido de clatrina, e.g., o recetor de asialoglicoproteínas, o recetor de ácido fólico ou o recetor de transferina. Em concretizagóes preferidas o oligodesoxinucleótido é modificado pela ligagáo de substituintes bloqueadores a 3' e 5' tais como um nucleótido de citosina ligado em 3'-3' e um corante de indocarbocianina ligado em 5'. Numa concretizagáo alternativa a modificagáo pode consistir na substituigáo da ligagáo fosfodiéster internucleótidos mais a 3' e/ou mais a 5' por urna ligagäo nao hidrolisável tal como urna ligagäo fosforotioatodiéster ou urna ligagäo fosforamidato.

Numa segunda concretizagäo a divulgagäo proporciona a modificagäo dos nucleótidos das extremidades 3' e 5' do oligodesoxinucleótido que codifica a alteragäo genética predeterminada. A invengäo baseia-se aínda na verificagäo inesperada de que determinadas destas modificagöes näo bloqueiam a eficácia do oligodesoxinucleótido produzir alteragóes genéticas. Urna destas concretizagóes é a combinagäo de um nucleótido de citosina ligado em 3'-3' e um corante de indocarbocianina ligado em 5'. Assim modificados, os oligodesoxinucleótidos säo mais de 50 vezes mais eficazes do que os oligodesoxinucleótidos näo modificados correspondentes quando utilizados para efetuar alteragóes genéticas em células bacterianas.

Numa terceira concretizagäo a divulgagäo proporciona compostos e métodos para a introdugäo de urna alteragäo genética predeterminada numa célula vegetal através da introdugäo de um oligodesoxinucleótido que codifica a alteragäo genética predeterminada no núcleo de urna célula vegetal.

Em concretizagóes preferidas o oligodesoxinucleótido é modificado pela ligagäo de substituintes bloqueadores a 3' e 5' tais como um nucleótido de citosina ligado em 3'-3' e um corante de indocarbocianina ligado em 5'. Numa concretizagäo alternativa a modificagäo pode consistir na substituigäo da ligagäo fosfodiéster internucleótidos mais a 3' e mais a 5' por urna ligagäo näo hidrolisável tal como urna ligagäo fosforotioatodiéster ou urna ligagäo fosforamidato. Alternativamente, um corante de indocarbocianina ligado a 5' e urna ligagäo näo hidrolisável na ligagäo fosfodiéster internucleótidos mais a 3' podem ser utilizados aínda numa terceira concretizagäo. A presente invengäo pode ser entendida mais inteiramente por referencia ä descrigäo detalhada e exemplos ilustrativos de concretizagóes específicas que se seguem.

4. DESCRIgÁO DETALHADA DA INVENgÁO A sequéncia do SSOMV é baseada nos mesmos principios que os vetores mutacionais da arte anterior. A sequéncia do SSOMV contém duas regiöes que sao homologas da sequéncia alvo separadas por urna regiáo que contém a alteragáo genética desejada, denominada a "regiáo mutadora". A regiáo mutadora pode ter urna sequéncia que tem o mesmo comprimento que a sequéncia que separa as regiöes homologas na sequéncia alvo, mas possuindo urna sequéncia diferente. Essa regiáo mutadora provoca urna substituigáo. Alternativamente, as regiöes homologas no SSOMV podem ser contiguas urna em relagáo á outra, embora as regiöes no gene alvo que possuem a mesma sequéncia estejam separadas por um, dois ou mais nucleótidos. Este SSOMV provoca urna delegáo no gene alvo dos nucleótidos que estáo ausentes no SSOMV. Igualmente, a sequéncia do gene alvo que é idéntica ás regiöes homologas pode estar adjacente no gene alvo mas separada por um, dois ou mais nucleótidos na sequéncia do SSOMV. Este SSOMV provoca urna insergáo na sequéncia do gene alvo.

Os nucleótidos do SSOMV sáo desoxirribonucleótidos que estáo ligados por ligagöes fosfodiéster náo modificadas exceto a ligagáo internucleótidos no terminal 3' e/ou no terminal 5' ou alternativamente as duas ligagöes internucleótidos do terminal 3' e/ou do terminal 5', que podem ser fosforotioato ou fosforamidato. Como aquí se utiliza, urna ligagáo internucleótidos é a ligagáo entre nucleótidos do SSOMV e náo incluí a ligagáo entre o nucleótido da extremidade 3' ou o nucleótido da extremidade 5' e um substituinte bloqueante, vejase adiante. 0 comprimento do SSOMV depende do tipo de célula em que o gene alvo está localizado. Quando o gene alvo é um gene cromossómico de urna célula animal, e.g. , urna célula de mamífero ou de ave, o SSOMV tem entre 25 e 65 nucleótidos, preferivelmente entre 31 e 59 desoxinucleótidos e mais preferivelmente entre 34 e 48 desoxinucleótidos. 0 comprimento total das regiöes homologas é usualmente o comprimento do SSOMV menos um, dois ou trés nucleótidos. Um nucleótido mutador pode ser introduzido em mais do que urna posigáo no SSOMV, o que resulta em mais do que duas regiöes homologas no SSOMV. Quer hajam duas ou mais regiöes homologas, os comprimentos de pelo menos duas das regiöes homologas deveráo ser de pelo menos 8 desoxinucleótidos cada um.

Para células procariotas, o comprimento do SSOMV está entre 15 e 41 desoxinucleótidos. 0 comprimento preferido do oligodesoxinucleótido para utilizagáo em procariotas depende do tipo de grupo protetor a 3' que se utiliza. Quando o substituinte protetor a 3' é urna desoxicitidina ligada em 3'-3', o oligonucleótido tem preferivelmente entre cerca de 21 e 28 desoxinucleótidos, sendo de outro modo o comprimento ótimo entre 25 e 35 desoxinucleótidos. Os comprimentos das regiöes de homología sao, deste modo, um comprimento total de pelo menos 14 desoxinucleótidos e pelo menos duas regiöes de homología deveráo ter comprimentos de pelo menos 7 desoxinucleótidos cada urna.

Para células vegetáis, o comprimento do SSOMV está entre 21 e 55 desoxinucleótidos e os comprimentos das regiöes de homología sao, deste modo, um comprimento total de pelo menos 20 desoxinucleótidos e pelo menos duas regiöes de homología deveráo ter comprimentos de pelo menos 8 desoxinucleótidos cada urna.

Dentro destas gamas o comprimento ótimo do oligodesoxinucleótido é determinado pelo teor de GC, sendo tanto menor o comprimento ótimo do oligodesoxinucleótido quanto maior o teor de GC. Contudo, é preferido um teor de GC superior a 50%. O SSOMV pode ser utilizado com qualquer tipo de célula animal, e.g., urna célula de mamífero, urna célula de ave, urna célula de inseto, urna célula de peixe ou urna célula de verme (nemátodo). O SSOMV pode também ser utilizado em qualquer tipo de célula vegetal. Adicionalmente, o SSOMV pode ser utilizado com qualquer tipo de célula bacteriana, e.g., células bacterianas Gram-positivas ou células bacterianas Gram-negativas. Exemplos de tipos de bactérias incluem, Salmonella, E. coli, Pseudomonas, Rostani, etc. Náo é importante se as células estáo em replicagáo ativa ou se o gene alvo está transcricionalmente ativo. Contudo, quando o gene alvo está localizado numa bactéria é importante que a bactéria seja RecA+.

Assim, a maioria das estirpes de bactérias vulgarmente utilizadas em trabalhos de ADN recombinante nao sao adequadas para utilizagao na presente invengáo porque essas bactérias sao RecA~ de modo a reduzir a instabilidade genética dos plasmídeos clonados. Adicionalmente, em células bacterianas o gene alvo pode estar localizado num plasmídeo ou num cromossoma bacteriano artificial (BAC, do inglés "Bacterial Artificial Chromosome"), assim como no cromossoma bacteriano. 0 SSOMV pode ser desenhado para ser complementar a cada urna das cadeias codificante ou nao codificante do gene alvo. Quando a mutagao desejada é urna substituigao de urna única base, prefere-se que o nucleótido mutador seja urna pirimidina. Na medida em que seja consistente com o facto de se conseguir o resultado funcional desejado prefere-se que tanto o nucleótido mutador como o nucleótido alvo na cadeia complementar sejam pirimidinas. Sao particularmente preferidos os SSOMV que codificam mutagöes de transversáo, i.e., um nucleótido mutador C ou T fica mal emparelhado, respetivamente, com um nucleótido C ou T na cadeia complementar.

Em adigáo ao oligodesoxinucleótido, o SSOMV pode conter um substituinte bloqueador a 5' que é ligado aos carbonos do terminal 5' através de um ligante. A química do ligante nao é crítica para além do seu comprimento, que deverá preferivelmente ser de pelo menos 6 átomos de comprimento e de que o ligante dever ser flexível. A química do substituinte bloqueador a 5' para células de mamífero, de ave ou vegetáis nao é crítica para além do peso molecular que deverá ser inferior a cerca de 1000 daltons. Podem utilizar-se urna variedade de substituintes nao tóxicos, como biotina, colesterol ou outros esteroides ou um corante fluorescente catiónico nao intercalante. Para utilizagáo em sistemas bacterianos, contudo, o substituinte bloqueador possui um efeito importante sobre a eficiencia do SSOMV e é preferivelmente urna indocarbocianina substituida com 3,3,3',3'-tetrametil-N,N'-oxialquilo . Sao particularmente preferidos como reagentes para preparar os SSOMV os reagentes comercializados como Cy3™ e Cy5™ pela Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, que sao fosforoamiditos bloqueados que após incorporagáo num oligonucleótido originam cortantes de indomonocarbocianina e indodicarbocianina substituidas com 3,3,3', 3'-tetrametil-N,N'-isopropilo, respetivamente. Quando a indocarbocianina é substituida com N-oxialquilo pode ser convenientemente ligada ao terminal 5' do oligodesoxinucleótido através de um fosfodiéster com um fosfato no terminal 5'. A guimica do ligante corante entre o corante e o oligodesoxinucleótido nao é critica e é escolhida por conveniencia da sintese. Quando é utilizado o fosforamidito comercialmente disponivel Cy3 como dirigido a modificagäo resultante a 5' consiste num substituinte bloqueador e num ligante juntos que sao urna N-hidroxipropil, N'-fosfatidilpropil-3,3,3',3'-tetrametilindomonocarbocianina.

Numa concretizagäo alternativa, o corante de indocarbocianina, e.g., fosforamidato Cy3, pode ser ligado ao oligodesoxinucleótido após o oligodesoxinucleótido ter sido sintetizado.

Na concretizagäo preferida o corante de indocarbocianina é tetrassubstituido ñas posigóes 3 e 3' dos anéis indole. Sem limitagäo quanto ä teoría, estas substituigóes impedem o corante de ser um corante intercalante. A identidade dos substituintes nestas posigóes nao é crítica. 0 SSOMV pode, em adigäo, ter um substituinte bloqueador a 3'. Novamente, a química do substituinte bloqueador a 3' nao é crítica, para além da nao toxicidade e do peso molecular inferior a cerca de 1000, quando o gene alvo está localizado numa célula nao bacteriana. Contudo, quando o gene alvo está localizado numa célula bacteriana o substituinte bloqueador a 3' preferido é um denominado nucleótido invertido, i.e., um nucleótido que está ligado através de um fosfodiéster nao substituido em 3'-3', como é ensinado na Patente dos Estados Unidos N.2 5750669. Numa concretizagäo mais preferida o nucleótido invertido é urna timidina ou mais preferivelmente urna desoxicitidina. Para utilizagáo em células bacterianas, a combinagäo de um substituinte bloqueador a 5' Cy3 e um substituinte bloqueador a 3' de desoxicitidina invertida, é particularmente preferida pois as duas modificagöes possuem um efeito sinérgico sobre a eficácia do SSOMV. O SSOMV com as modificagöes acima referidas pode ser sintetizado por síntese convencional de nucleótidos em fase sólida. O SSOMV pode ser introduzido na célula contendo o gene alvo pelas mesmas técnicas que sao utilizadas para introduzir os vetores mutacionais do tipo Kmiec em células animáis e vegetáis. Para células bacterianas, um método preferido para a introdugäo do SSOMV é por eletroporagäo.

Para utilizagäo com células animáis, incluindo células de mamífero e de ave, o método preferido de entrega na célula é utilizando um transportador macromolecular protetor. Os reagentes de transfecgäo lipossómica comercialmente disponíveis tais como Lipofectamine™ e Superfect™ sao desenhados de modo a que o ácido nucleico a transfectar seja electrostáticamente aderente a superficie exposta do lipossoma. Estes transportadores näo säo täo preferidos como os transportadores macromoleculares protetores. Os transportadores macromoleculares protetores adequados säo divulgados ñas Publicagöes Internacionais de Patente WO 98/49350 e WO 99/40789 e em Bandyopadhyay et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:10163.

Um transportador macromolecular particularmente preferido é urna vesícula lipídica de núcleo aquoso ou um lipossoma em que o SSOMV é aprisionado no núcleo aquoso. Estas vesículas säo feitas tomando um filme lipídico isento de solventes e adicionando urna solugäo aquosa do SSOMV, seguindo-se agitagäo com vórtex, extrusäo ou passagem através de urna membrana de microfiltragäo. Numa concretizagäo preferida os constituintes lipidíeos säo urna mistura de dioleoílfosfatidilcolina/ dioleoíIfosfatidilserina/ galactocerebrósido numa razäo de 1:1:0,16. Outros transportadores incluem policatiöes, tais como polietilenoimina, possuindo urn peso molecular entre 500 daltons e 1,3 Md, senso adequada urna espécie de 25 kd e nanoesferas lipídicas, em que o SSOMV é proporcionado na forma de um sal lipófilo.

Quando os SSOMV säo utilizados para introduzir alteragöes genéticas em células de mamífero e de ave, prefere-se que o transportador macromolecular compreenda aínda um ligando para um recetor da superficie celular que seja internalizado. Os recetores adequados säo os recetores que säo internalizados pela via do fosso revestido de clatrina, tais como o recetor de asialoglicoproteínas, o recetor do fator de crescimento epidérmico e o recetor de transferina. Sao também adequados os recetores que sao internalizados através da via caveolar tais como o recetor de ácido fólico. 0 galactocerebrósido é um ligando para o recetor de asialoglicoproteinas. Como aquí se utiliza, um recetor internalizável é um recetor que é internalizado pela via do fosso revestido de clatrina ou pela via caveolar. 0 SSOMV pode ser utilizado para qualquer finalidade em que os vetores mutacionais da arte anterior tenham sido empregues. As utilizagóes especificas incluem a cura de doengas genéticas por inversáo da doenga que causa urna lesáo genética; estas doengas incluem por exemplo hemofilia, deficiencia de antitripsina i e doenga de Crigler-Najjar e outras doengas ensinadas na Publicagáo Internacional de Patente WO 98/49350.

Alternativamente, o SSOMV pode ser utilizado para modificar plantas com a finalidade descrita na publicagáo de patente WO 99/07865.

Urna utilizagáo adicional dos SSOMV em plantas é a geragáo de plantas resistentes a herbicidas por meios que evitam ter que introduzir um gene estranho ou heterólogo numa planta agrícola. Tem particular interesse a resistencia ao herbicida glifosato (ROUNDUP®). A identidade das mutagöes que conferem resistencia ao glifosato pode ser encontrada ñas Publicagöes Internacionais de Patente WO 99/25853 e WO 97/04103.

Alternativamente, o SSOMV pode ser utilizado para modificar bactérias. A utilizagáo de SSOMV para manipulagáo genética de bactérias é particularmente valiosa nos campos da produgáo de antibióticos e na construgáo de bactérias específicamente atenuadas para a produgáo de vacinas. Em ambas as aplicagóes anteriores é importante que os genes de resistencia aos antibióticos nao permanegam na bactéria final modificada. Aínda adicionalmente, o SSOMV pode ser utilizado em combinagäo com um cromossoma bacteriano artificial (BAC) para modificar um gene alvo de qualquer espécie que tenha sido clonado num BAC. Pode ser incorporado um fragmento muito maior do que o gene alvo. O BAC possuindo o gene alvo clonado é colocado num hospedeiro bacteriano e é introduzida urna alteragáo genética predeterminada de acordo com a invengäo. Urn subclone do BAC possuindo a alteragáo genética predeterminada pode ser identificado e a insergáo pode ser removida para posterior utilizagáo. A presente invengäo permite fazer alteragöes predeterminadas sem o tempo e despesa inerentes ä sua obtengáo fazendo fragmentos de PCR e inserindo os fragmentos de novo no gene original.

5. EXEMPLO 1: TRATAMENTO DO RATO GUNN 0 rato Gunn contém urna mutagáo no gene da UDP-glucuronosiltransferase, que é o mesmo gene que está mutado na Doenga de Crigler-Najjar. Roy-Chowdhury et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:18294; Iyanangi et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:21302. No rato Gunn existe urna mutagáo no nucleótido 1206 que eliminou urna G. Foi construido um SSOMV de 35 nucleótidos, denominado CN3-35UP, correspondente á cadeia anti-sentido, para inverter a mutagáo, que tem a seguinte sequéncia: 5'-ATCATCGGCAGTCATTT C CAGGACATTCAGGGTCA-3' (SEQ ID NO:1). O CN3-35LOW, um segundo SSOMV que corresponde á cadeia de sentido direto, tem a seguinte sequéncia: 5'-TGACCCTGAATGTCCTG G AAATGACTGCCGATGAT-3' (SEQ ID NO:2). O nucleótido mutador está a negrito. O CN3-35UP (2 animáis) e o CN3-35LOW modificados com 5'Cy3 e dC em 3'-3' e o CN3-35UP náo modificado, foram formulados numa vesícula lipídica de núcleo aquoso possuindo constituintes lipidíeos de dioleoílfosfatidilcolina/ dioleoíifosfatidilserina/galactocerebrósido numa razáo de 1:1:0,16. Utilizaram-se aproximadamente 2,0 mi de dextrose a 5% contendo 500 pg do SSOMV para hidratar 2 mg de lípido e as vesículas foram depois extrudidas com um diámetro de 0,5 pm. A eficiencia da encapsulagáo foi de 80%. Um grupo de controlo positivo foi tratado com MV do tipo Kmiec (2 animáis) dadas numa quantidade equimolar no mesmo transportador. Os ratos, pesando 250 gramas, foram tratados em cinco dias consecutivos com 300 pg de SSOMV ou com o transportador. Os níveis de bilirrubina sérica resultantes foram os seguintes, em mg/dl.

Os dados demonstram que tanto os SSOMV modificados como os nao modificados e que tanto as sequéncias de sentido direto como as anti-sentido, foram pelo menos equivalentes e que nos pontos temporais mais longinquos o SSOMV pareceu superior aos vetores mutacionais do tipo Kmiec.

6. EXEMPLO 2: MODIFICAgAO DO GENE DA UDP-GLUCURONOSILTRANSFERASE HUMANA 0 exemplo seguinte mostra que um SSOMV nao modificado num transportador macromolecular pode ser utilizado para introduzir urna alteragáo genética especifica numa célula de mamífero num meio artificial com taxas que estáo dentro de um fator de 3 do que se observa com vetores mutacionais tipo Kmiec de ADN/2'OMeARN. Os dados mostram adicionalmente que modificagóes mínimas, como de urna única ligagáo fosforotioato, podem resultar em taxas inteiramente comparáveis.

Um grupo de pessoas Amish tém Doenga de Crigler-Najjar resultante de urna substituigäo C A no nucleótido 222 do gene da UDP-Glucuronosiltransferase. A mutagäo resulta na conversäo de um codäo TAC (Tyr) num codäo de paragem (stop) TAA. Foi desenhado um SSOMV para introduzir a mutagäo que causa a doenga numa linha celular de carcinoma hepatocelular humano, HuH-7. Um SSOMV de 35 nucleótidos, designado por CNAM3-35UP, ou corresponde ä cadeia anti-sentido e tern a seguinte sequéncia: 5'-GGGTACGTCTTCAAGGT T TAAAATGCTCCGTCTCT-3' (SEQ ID NO:3). 0 nucleótido mutador está em negrito.

Deram-se as células HuH-7 a 106/cm2 300 μΐ feitos num transportador de acordo com o método do Exemplo 1 contendo CNAM3-35UP, CNAM3-35UP modificado de várias maneiras ou uma quantidade equimolar de um vetor mutacional do tipo Kmiec de 82 nucleótidos. As células foram colhidas e o fragmento génico relevante foi amplificado por PCR, clonado e analisado por hibridagäo específica de alelos de acordo com os métodos de Bandyopadhyay, supra. Observaram-se as seguintes taxas de conversäo: SSOMV näo modificado 6% SSOMV 5'Cy3 15% SSOMV dC 3' -3' 5% SSOMV 5'Cy3, dC 3' -3' 15% SSOMV 5' fos'tioato 16% 3' fos'tioato 12% MV tipo Kmiec 14%

Estes dados demonstram que na presenga de um transportador macromolecular, os SSOMV modificados foram täo eficazes como vetores mutacionais do tipo Kmiec, e que os SSOMV näo modificados foram eficazes dentro de um fator de 3.

7. EXEMPLO 3: CONVERSÄO DE RESISTENCIA A CANAMICINA NUM BAC 0 exemplo que se segue mostra que os SSOMV modificados sao mais eficazes do que vetores mutacionais Kmiec de ADN/2'0MeARN em células bacterianas.

Um gene de resistencia a canamicina foi inativado pela insergäo de um codäo de paragem ATG em enquadramento. A resistencia a canamicina é recuperada convertendo o terceiro nucleótido numa C, i.e., efetuando uma transversäo no terceiro nucleótido .

A sequéncia de urn SSOMV de 41 nt que corresponde ä cadeia de sentido direto para a recuperagáo da resistencia a canamicina é como se segue: 5'-GTGGAGAGGCTATTCGGCTA C GACTGGGCACAACAGACAAT-3' (SEQ ID NO: 4). 0 nucleótido mutador está a negrito.

Para gerar pBACKans, inseriu-se um ligante BamHI no local Smal único de pKans, e o fragmento BamHI-HindlII de 1,3-kb resultante, contendo o gene mutante da canamicina foi inserido nos locáis BamHI/HindiII do vetor de clonagem de BAC pBeloBACll (Genome Systems, Inc., St. Louis, MO) . As estirpes de Escherichia coli MC1061 e DH10B foram transformadas com pBACKans, selecionadas em placas de cloranfenicol LB, e tornadas eletrocompetentes.

Quarenta μΐ de células eletrocompetentes foram eletroporadas com entre 5 e 10 pg de SSOMV utilizando as seguintes condigöes: 25 kV/cm, 200 ohms, 25 microfarads.

Adicionou-se 1 mL de SOC äs células imediatamente após a electroporagäo e cresceu-se a cultura durante 1 hora enquanto agitando a 372C. Adicionaram-se 4 mL de LB+ cloranfenicol (final de 12,5 pg/mL) e cresceram-se as culturas durante mais 2 horas enquanto agitando a 37 2C. Plaquearam-se diluigöes apropriadas da cultura em placas de LB-cloranfenicol para avallar a viabilidade e em placas de LB-canamicina para avallar a conversäo. A frequéncia da conversáo foi calculada dividindo o número de colonias resistentes a canamicina/mL pelo número de colonias resistentes a cloranfenicol/mL. A taxa de conversáo observada com o SSOMV de 25 nucleótidos modificado 5'Cy3, dC 3' -3' correspondía a cerca de 1 conversáo por 100 bactérias sobreviventes.

As taxas de conversáo relativas foram: MV Kmiec de 68 nt w/ ligante de 2'OMeARN 0,04 MV Kmiec de 68 nt w/ligante de ADN 0,004 SSOMV de 41 nt w/3',5' fos'tioato 0,4 SSOMV de 35 nt w/3',5' fos'tioato 4,0 SSOMV de 29 nt w/3',5' fos'tioato 0,9 SSOMV de 25 nt w/3',5' fos'tioato 1,0 SSOMV de 41 nt w/dC 3' -3' ,5'Cy3 2,0 SSOMV de 35 nt w/dC 3' -3' ,5'Cy3 2,9 SSOMV de 35 nt w/dC 3' -3' , 2,5 SSOMV de 35 nt w/5'Cy3 2,5 SSOMV de 29 nt w/dC 3' -3' ,5'Cy3 4,2 SSOMV de 25 nt w/dC 3' -3' ,5'Cy3 42,0 SSOMV de 25 nt w/dC 3' -3' 1,3 SSOMV de 25 nt w/5'Cy3 1,8 SSOMV de 25 nt w/3'fos'tioato,5'Cy3 8,4 SSOMV de 35 nt w/3'fos'tioato,5'Cy3 10,2

Estes dados demonstram que a taxa de conversáo do SSOMV ótimo era entre 103 e 104 maior do que a do vetor mutacional do tipo Kmiec.

8. EXEMPLO 4: A UTILIZAgÄO DE UM SSOMV SEM UM TRANSPORTADOR PROTETOR NUMA CÉLULA DE MAMÍFERO - RESISTENCIA A HIGROMICINA

Este exemplo mostra a modificagäo de urna célula mamífero utilizando SSOMV modificado na ausencia de um transportador macromolecular protetor. Os SSOMV modificados foram capazes de introduzir a modificagäo genética a urna taxa que era entre 15 e 30 vezes maior do que a dos vetores mutacionais do tipo Kmiec. Este exemplo utiliza o mesmo gene que se utilizou no Exemplo 3; contudo, é expresso na linha celular HuH-7.

Um clone de células HuH7 contendo urna copia integrada de forma estável do gene da canamicina mutante num vetor contendo IRES (pIRESKan-) foi gerado sob selegáo por higromicina. As células foram cultivadas em DMEM de levado teor de glucose/ FBS a 10% contendo 100 mg/ml de higromicina para manter urna elevada expressáo a partir da construgáo integrada. Vinte e quatro horas antes da transfecgáo semearam-se as células a urna densidade de 1,0 xlO6 células numa placa de 100 mm. Duas horas antes da transfecgáo o meio de crescimento foi substituido por 10 mi de Opti-MEM™. Diluíram-se 40 microgramas de oligonucleótido e 40 mi (80 pg) de Lipofectamine” em tubos separados contendo 200 mi de Opti-MEM pH 8,5. A Lipofectamine é entáo adicionada ao oligonucleótido, mistura-se através de urna pipeta e incuba-se ä temperatura ambiente durante 30 minutos antes da adigáo de 3,6 ml de Opti-MEM pH 8,5. O meio é aspirado das células e substituido pelos 4 mi de mistura de transfecgáo. As células sáo incubadas durante 2 horas a 37 °C antes da mistura de transfecgáo ser substituida por meios de crescimento padráo. Dois dias após a transfecgáo as células sáo divididas por 2 placas de 100 mm em 10 mi de meio contendo 450 mg/ml de G418. O meio contendo G418 é substituido diariamente durante 10 dias, depois duas vezes por semana até as colonias serem visíveis macroscópicamente (16-18 dias após transfecgáo). Os clones sáo recolhidos aproximadamente 21 dias após a transfecgáo e expandidos para análise molecular.

As taxas de fundo do desenvolvimento de resistencia a higromicina é de cerca de 1 por 106. Quando foram empregues vetores mutacionais do tipo Kmiec náo houve aumento no número de colonias resistentes. A análise da sequéncia de urna de 5 colonias mostrou que tinha obtido a mutagäo específica. As mutagöes nas outras 4 colonias näo puderam ser identificadas. Quando se utilizou um SSOMV w/dC 3' -3' ,5'Cy3 de 41 nucleótidos, as taxas de desenvolvimento de colonias resistentes a higromicina aumentou entre 15 e 30 vezes, i.e., para cerca de 3 por 105. A análise da sequéncia destas colonias mostrou que entre 100% e 80% das colonias tinha a alteragäo genética correta. Experiencias com SSOMV w/dC 3' -3' ,5'Cy3 de 35 nt ou w/3'fosfortioato 5'Cy3 ou w/duas ligagöes fosforotioato em cada urna das extremidades 3', 5', mostraram taxas de desenvolvimento de resistencia a higromicina que eram cerca de metade da taxa do SSOMV modificado de 41 nucleótidos.

9. EXEMPLO 5: A UTILIZAQÁO DE UM SSOMV SEM UM TRANSPORTADOR

PROTETOR NUMA CÉLULA DE MAMÍFERO - TIROSINASE

Este exemplo mostra que numa linha celular de mamífero um SSOMV näo modificado sem um transportador protetor pode ser superior tanto ao SSOMV modificado a com 5'Cy3/dC 3' -3' como superior a vetores mutacionais do tipo Kmiec de ADN/2'OMe ARN.

Estas experiencias utilizam Melan-c, urna linha celular melanocítica murina possuindo urna mutagäo C G no codäo 82 do gene da tirosinase, que cria urna paragem em enquadramento. Bennett, et al., 1989, Development 105:379. Foi desenhado um SSOMV de 35 nucleótidos que corresponde ä sequéncia de codificagäo e tem a seguinte sequéncia: 5'-CCCCAAATCCAAACTTA C AGTTTCCGCAGTTGAAA-3' (SEQ ID NO: 5). O nucleótido mutador está em negrito.

As células Melan-c foram cultivadas em meio RPMI contendo 10% de soro fetal bovino, 12-miristato-13-acetato de forbol (PMA) 100 nM e b-mercaptoetanol 0,1 mM (Gibco, Bethesda, MD). Dois dias antes da transfecgäo, as células foram semeadas a urna densidade de 0,5-1,5 xlO5 células/pogo numa placa de 6 seis pogos e reenchida com meio fresco 24 horas antes da transfecgäo. Cinco a dez microgramas (220-440 nM) dos oligonucleótidos foram incubados com 6-9 pg de Superfectin™ em 0,1 mi de TE (TRIS 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM) durante 30 min ä temperatura ambiente. A mistura de transfecgäo foi adicionada äs células contendo 0,9 ml de meio de crescimento DMEM de elevado teor de glucose contendo 10% de soro e PMA 100 nM. Após 6-18 horas, as células foram lavadas com solugäo salina tamponada com fosfato e alimentadas com 2 ml do meio DMEM. As células foram monitoradas quanto a urna alteragäo na pigmentagáo por microscopía. 0 número de eventos de conversäo foi determinado por contagem do número de células pigmentadas ou agrupamentos de células 5 a 8 dias após a transfecgäo.

As taxas de conversäo albino tipo selvagem (pigmentadas) por 105 células foram como se segue: MV tipo Kmiec 1 SSOMV näo modificado 5 SSOMV w/3',5' fos'tioato 6 SSOMV w/dC 3' -3' 2 SSOMV w/5' Cy3 3 SSOMV w/dC 3' -3' , 5'Cy3 1

10. EXEMPLO 6: A UTILIZAgÁO DE UM SSOMV MODIFICADO EM PLANTAS

Este exemplo refere-se ä utilizagäo de um SSOMV para introduzir urna mutagäo Ser Asn na posigáo 653 da aceto-hidroxiácido-sintase (também conhecida como acetolatato-sintase) de Arabodopsis thaliana. A mutagäo requer que um codäo AGT seja convertido num codäo AAT e introduz resistencia a herbicidas de imidazolina assim como a herbicidas de sulfonilureia.

Sintetizaram-se um SSOMV de 25 nucleótidos e um SSOMV de 35 nucleótidos possuindo modificagóes com dC 3' -3' e 5'Cy3 e que tinham as seguintes sequéncias, respetivamente: 5'-

CGATCCCGA A TGGTGGCACTTT-3' (SEQ ID NO: 6), 5'-GTTGCCGATCCCGA A TGGTGGCACTTTCAACG-3' (SEQ ID NO: 7). 0 nucleótido mutador está em negrito.

Preparou-se urna populagäo celular desagregada de A. thaliana plaqueada a 106 por placa e submeteu-se a introdugäo biolística do SSOMV ou de um MV do tipo Kmiec possuindo a mesma sequéncia. Placas de controlo utilizando um plasmídeo determinaram que a eficiencia do sistema biolístico é de cerca de urna entrega por 200 de células plaqueadas. Após dois meses de selegäo com Imazaquin™ 10 μΜ, cada uma das populagöes celulares tratadas biolisticamente apresentava uma taxa de fundo corrigida de resistencia a Imazaquina de cerca de 1 por IO3 células em que os vetores mutacionais foram introduzidos com sucesso.

11. EXEMPLO 7: PREPARAgÁO DE PEI CONJUGADO COM FOLATO

Este exemplo descreve a preparagáo de PEI conjugado com folato que é adequado para utilizagáo como um transportador macromolecular na invengäo. Ácido fólico (4,4 mg, 10 pmol) em tampáo de fosfato de sodio (1,5 mL, 133 mM, pH 4,5) foi tratado com 200 pL de piridina e cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC, 15,5 mg, 98 pmol) e incubou-se ä temperatura ambiente durante 1 hora. A solugáo de folato ativada (1,7 mL) foi adicionada a uma solugáo aquosa de polietilenoimina (25 kDa, 24,55 mg/mL; 1,02 mL) e incubou-se durante 3 dias ä TA com agitagao suave. A polietilenoimina conjugada foi purificada por diálise contra água através de uma membrana de limite de exclusáo de PM de 12 kDa. O produto foi positivo para aminas no ensaio da ninidrina e para folato por absorváncia de UV com máximos a 259, 289 e 368 nm. O acoplamento foi de cerca de 1-2 porgöes de folato por 1000 aminas, o que é equivalente a 1-2 folatos por molécula de PEI. A presente invengäo näo se pretende limitada em ámbito pelas concretizagöes especificas aquí descritas. De facto, várias modificagöes da invengäo em adigäo äs aquí descritas seráo evidentes para os peritos na especialidade a partir da descrigáo anterior e das figuras anexas. Essas modificagöes pretendem-se dentro do ámbito das reivindicagöes anexas.

LISTAGEM DE SEQUENCIAS <110> Valigen (US), Inc.

<120> Vetores mutacionais oligodesoxinucleotídicos de cadeia simples <130> NRS/FP6701668 <140> EP <141> 2000-08-25 <140> EP 00959442.5 <141> 2000-08-25 <150> PCT/US00/23457 <151> 2000-08-25 <150> US 09/384,960 <151> 1999-08-27 <160> 7 <170> FastSEQ for Windows Versäo 3.0

<210> 1 <211> 35 <212> ADN <213> Sequéncia Artificial <220> <223> vetor mutacional oligodesoxinucleotidico de cadera simples <400> 1 atcatcggca gtcatttcca ggacattcag ggtca 35

<210> 2 <211> 35 <212> ADN <213> Sequéncia Artificial <220> <223> vetor mutacional oligodesoxinucleotidico de cadera simples <400> 2 tgaccctgaa tgtcctggaa atgactgccg atgat 35

<210> 3 <211> 35 <212> ADN <213> Sequéncia Artificial <220> <223> vetor mutacional oligodesoxinucleotidico de cadera simples <400> 3 gggtacgtct tcaaggttta aaatgctccg tctct 35

<210> 4 <211> 41 <212> ADN <213> Sequéncia Artificial <220> <223> vetor mutacional oligodesoxinucleotidico de cadera simples <400> 4 gtggagaggc tattcggcta cgactgggca caacagacaa t 41 <210> 5 <211> 35

<212> ADN <213> Sequencia Artificial <220> <223> vetor mutacional oligodesoxinucleotidico de cadeia simples <400> 5 ccccaaatcc aaacttacag tttccgcagt tgaaa 35

<210> 6 <211> 22 <212> ADN <213> Sequencia Artificial <220> <223> vetor mutacional oligodesoxinucleotidico de cadeia simples <400> 6 cgatcccgaa tggtggcact tt 22

<210> 7 <211> 32 <212> ADN <213> Sequencia Artificial <220> <223> vetor mutacional oligodesoxinucleotidico de cadeia simples <400> 7 gttgccgatc ccgaatggtg gcactttcaa eg 32

Lisboa, 2015-07-02

Claims

REIVINDICALES 1. Utilizagäo in vitro de um composto para efetuar urna alteragäo genética predeterminada num gene cromossómico alvo de urna célula animal, em que o composto é um oligodesoxinucleótido de cadeia simples possuindo um nucleótido na extremidade 3', um nucleótido na extremidade 5', possuindo pelo menos 25 desoxinucleótidos e nao mais de 65 desoxinucleótidos, e possuindo urna sequéncia compreendendo pelo menos duas regiöes, cada urna com pelo menos 8 desoxinucleótidos, que sao idénticas, respetivamente, a pelo menos duas regiöes do gene cromossómico alvo, regiöes essas que, juntas, tém pelo menos 24 nucleótidos de comprimento, e regiöes essas que estäo separadas por pelo menos um nucleótido na sequéncia do gene alvo e na sequéncia do oligodesoxinucleótido por urna regiäo mutadora possuindo urna sequéncia que tem o mesmo comprimento que a sequéncia que separa as regiöes homologas na sequéncia alvo, mas possuindo urna sequéncia diferente.
2. Utilizagäo de um composto para efetuar urna alteragäo genética predeterminada num gene alvo numa célula vegetal, em que o composto é um oligodesoxinucleótido de cadeia simples possuindo um nucleótido na extremidade 3' e um nucleótido na extremidade 5', possuindo pelo menos 21 desoxinucleótidos e näo mais de 55 desoxinucleótidos; e possuindo urna sequéncia compreendendo pelo menos duas regiöes, cada urna com pelo menos 8 desoxinucleótidos, que säo idénticas, respetivamente, a pelo menos duas regiöes do gene alvo, regiöes essas que, juntas, tém pelo menos 20 nucleótidos de comprimento, e regiöes essas que estäo separadas por pelo menos um nucleótido na sequéncia do gene alvo e na sequéncia do oligodesoxinucleót ido por urna regiäo mutadora possuindo urna sequéncia que tem o mesmo comprimento que a sequéncia que separa as regiöes homologas na sequéncia alvo, mas possuindo urna sequéncia diferente.
3. Utilizagäo in vitro de urna composigäo para efetuar urna alteragäo genética predeterminada num gene cromossómico alvo de urna célula animal, a referida composigäo compreendendo: (a) um composto para efetuar urna alteragäo genética predeterminada num gene cromossómico alvo de urna célula animal, em que o composto é um oligodesoxinucleótido de cadeia simples possuindo um nucleótido na extremidade 3', um nucleótido na extremidade 5', possuindo pelo menos 25 desoxinucleótidos e nao mais de 65 desoxinucleótidos, e possuindo urna sequéncia compreendendo pelo menos duas regiöes, cada urna com pelo menos 8 desoxinucleótidos, que sao idénticas, respetivamente, a pelo menos duas regiöes do gene cromossómico alvo, regiöes essas que, juntas, tém pelo menos 24 nucleótidos de comprimento, e regiöes essas que estáo separadas por pelo menos um nucleótido na sequéncia do gene alvo e na sequéncia do oligodesoxinucleótido por urna regiáo mutadora possuindo urna sequéncia que tem o mesmo comprimento que a sequéncia que separa as regiöes homologas na sequéncia alvo, mas possuindo urna sequéncia diferente, e (b) um transportador macromolecular selecionado do grupo que consiste em (i) urna vesícula lipídica de núcleo aquoso, em que o núcleo aquoso contém o oligodesoxinucleótido de cadeia simples, (ii) urna nanoesfera lipídica, que compreende um sal lipófilo do oligodesoxinucleótido de cadeia simples, e (iii) um policatiäo possuindo um peso molecular médio de entre 500 daltons e 1,3 Md em que o policatiäo forma urn sal com o oligodesoxinucleótido de cadeia simples.
4. Utilizagäo da reivindicagáo 3, em que o comprimento do oligodesoxinucleótido de cadeia simples é de pelo menos 31 desoxinucleótidos e nao mais de 59 desoxinucleótidos.
5. Utilizagäo da reivindicagáo 3, em que o transportador macromolecular compreende adicionalmente um ligando para um recetor internalizável da célula, ligando esse que está ligado ä superficie do transportador macromolecular.
6. Utilizagäo da reivindicagáo 5, em que o recetor é selecionado do grupo que consiste em, o recetor de asialoglicoproteínas, o recetor de transíerrina, o recetor do ácido fólico e o recetor do fator de crescimento epidérmico.
7. Utilizagäo de qualquer uma das reivindicagöes 1-3, em que a ligagäo internucleótidos ligada ao nucleótido da extremidade 3' e/ou ao nucleótido da extremidade 5' é uma ligagäo fosforotioato.
8. Utilizagäo de qualquer uma das reivindicagöes 1-3, em que o hidroxilo 5' do nucleótido da extremidade 5' está ligado a urn substituinte bloqueador a 5' e/ou o hidroxilo 3' do nucleótido da extremidade 3' está ligado a um substituinte bloqueador a 3'
9. Utilizagäo da reivindicagáo 8, em que o substituinte bloqueador a 5' é um corante de indocarbocianina 3,3,3',3'-tetrassubstituída e substituida com Ν' -hidroxialquilo, que está ligado ao hidroxilo 5' através de um ligante, opcionalmente, o corante de indocarbocianina e o ligante, juntos, sáo uma N-hidroxipropil, Ν' -fosfatidilpropil-3,3,31,3 1 -tetrametilindomonocarbocianina; ou opcionalmente em que a ligagäo internucleótidos ligada ao nucleótido da extremidade 3' é uma ligagäo fosforotioato.
10. Utilizagäo da reivindicagáo 8, em que o substituinte bloqueador a 3' é um nucleótido bloqueador que está ligado em 3'-3' ao hidroxilo 3' do nucleótido da extremidade 3'.
11. Utilizagäo da reivindicagáo 7, em que a ligagäo internucleótidos ligada ao nucleótido da extremidade 5' é uma ligagäo fosforotioato e/ou em que a ligagäo internucleótidos ligada ao nucleótido da extremidade 3' é uma ligagäo fosforotioato ou em que um nucleótido de desoxicitidina ou timidina está ligado em 3'-3' ao hidroxilo 3' do nucleótido da extremidade 3' ou ambos.
12. Utilizagäo de acordo com a reivindicagáo 2, em que o hidroxilo 5' do nucleótido da extremidade 5' está ligado a um substituinte bloqueador a 5' e o hidroxilo 3' do nucleótido da extremidade 3' está ligado a um substituinte bloqueador a 3' e; em que (a) o substituinte bloqueador a 5' é um corante de indocarbocianina 3,3,3' , 3'-tetra-substituída e substituida com Ν' -hidroxialquilo, que está ligado através de um ligante ao hidroxilo 5' do nucleótido da extremidade 5', opcionalmente em que o corante de indocarbocianina e o ligante, juntos, sao urna N-hidroxipropil, Ν' -fosfatidilpropil-3,3,31,31 -tetrametilindomonocarbocianina; e (b) o substituinte bloqueador a 3' é urna um nucleótido bloqueador, opcionalmente desoxicitidina ou timidina, que está ligado 3'-3' ao hidroxilo 3' do nucleótido da extremidade 3' e; opcionalmente, o oligodesoxinucleótidos de cadeia simples tem pelo menos 25 desoxinucleótidos e nao mais do que 35 desoxinucleótidos de comprimento.
13. Utilizagäo de acordo com a reivindicagáo 2 em que (a) o hidroxilo 5' do nucleótido da extremidade 5' está ligado a um substituinte bloqueador a 5' opcionalmente um corante de indocarbocianina 3,3,3',3'-tetrassubstituída e substituida com N'-hidroxialquilo, que está ligado através de um ligante ao hidroxilo 5' do nucleótido da extremidade 5 ' ; e (b) a ligagáo internucleótidos ligada ao nucleótido da extremidade 3' é urna ligagáo fosforotioato.
14. Utilizagäo da reivindicagáo 1 ou 3, em que a célula animal é selecionada do grupo que consiste em urna célula de mamífero, urna célula de ave, urna célula de inseto, urna célula de verme e urna célula de peixe.
15. Composigáo para utilizagäo num método terapéutico para efetuar urna alteragáo genética predeterminada num gene cromossómico alvo num tecido, opcionalmente o fígado, de um individuo mamífero, compreendendo urna quantidade eficaz de urna composigáo, composigáo essa que compreende: (a) um oligodesoxinucleótido de cadeia simples possuindo um nucleótido na extremidade 3', um nucleótido na extremidade 5', possuindo pelo menos 25 desoxinucleótidos e nao mais de 65 desoxinucleótidos, e possuindo urna sequéncia compreendendo pelo menos duas regióes, cada urna com pelo menos 8 desoxinucleótidos, que sao idénticas, respetivamente, a pelo menos duas regióes do gene cromossómico alvo, regióes essas que, juntas, tém pelo menos 24 nucleótidos de comprimento, e regióes essas que estäo separadas por pelo menos um nucleótido na sequéncia do gene cromossómico alvo e na sequéncia do oligodesoxinucleótido por urna regido mutadora possuindo urna sequéncia que tem o mesmo comprimento que a sequéncia que separa as regiöes homologas na sequéncia alvo, mas possuindo urna sequéncia diferente; e (b) um transportador macromolecular selecionado entre o grupo que consiste em (i) urna vesícula lipídica de núcleo aquoso, em que o núcleo aquoso contém o oligodesoxinucleótido de cadeia simples, (ii) urna nanoesfera lipídica, que compreende um sal lipófilo do oligodesoxinucleótido de cadeia simples, e (iii) um policatiäo possuindo um peso molecular médio de entre 500 daltons e 1,3 Md em que o policatiäo forma urn sal com o oligodesoxinucleótido de cadeia simples. Lisboa, 2015-07-02