KR20230108085A - 홍합접착단백질을 포함하는 생체접착용 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

홍합접착단백질을 포함하는 생체접착용 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 홍합접착단백질; 및 폴리아크릴산 및 폴리메타크릴산 중 적어도 하나를 포함하고; 상기 홍합접착단백질은 상기 폴리아크릴산 및 폴리메타크릴산 중 적어도 하나와 아마이드 결합으로 연결되며, 삼차원 그물구조를 갖는 것인, 생체접착용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

홍합접착단백질을 포함하는 생체접착용 조성물 및 이의 제조방법{BIOADHESIVE COMPOSITION COMPRISING MUSSEL ADHESIVE PROTEIN AND PREPARAITON METHOD THEREOF}
본 발명은 홍합접착단백질을 포함하는 생체접착용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 홍합접착단백질을 포함하는 생의학적 응용이 가능한 생체접착용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
생체접착제는 생물의 세포막, 세포벽, 지질, 단백질, DNA, 성장인자, 세포, 조직 등과 같은 다양한 생물시료에 부착 특성을 갖는 물질을 말하며, 조직접착제, 지혈제, 조직공학용 지지체(scaffold), 약물전달용 담체(drug delivery carrier), 조직충진제(tissue augmentation), 상처 치료제, 또는 유착방지제 등의 다양한 생의학적 응용이 가능하다.
이러한 생체접착제는 강력한 접착능력 및 가교능력이 필요하고, 오랜 기간 생체 내에서 그 기능을 유지해야 한다. 현재 상용화 또는 실용화되고 있는 생체접착제로는 시아노아크릴레이트(cyanoacrylate) 순간 접착제, 피브린 글루(fibrin glue), 젤라틴 글루(gelatin glue), 및 폴리우레탄계 접착제 등이 있다.
그러나, 합성 고분자를 이용한 생체접착제의 경우, 생체 내의 수용액이 있는 상태에서 매우 약한 접착력을 보이며, 시아노아크릴레이트 계열 생체접착제의 경우, 인체에 면역 반응 등의 부작용을 일으키는 것이 큰 한계로 지적되고 있다.
또한, 피브린 계열의 생체접착제의 경우, 인체에 면역 반응 등의 부작용은 적지만, 가격이 비싸면서도 접착력이 매우 낮기 때문에 사용에 한계가 있으며, 젤라틴 생체접착제의 경우 가교제로 사용되는 포르말린(formalin)이나 글루타알데하이드(glutaraldehyde)가 생체 내의 단백질과도 가교 반응을 일으켜 조직 독성을 일으키는 문제가 있고, 폴리우레탄계 생체접착제의 경우에는, 합성원료인 방향족 디아이소시아네이트(diisocyanate)가 생체 독성이 있다는 문제가 있다.
반면, 해양 생명체인 홍합(mussel)은 접착 단백질(adhesive proteins)을 생산 및 분비함으로써 홍합 자신을 바다 속의 바위와 같은 젖은 고체표면에 단단히 부착할 수 있어, 파도의 충격이나 바닷물의 부력 효과에 영향을 받지 않는다. 홍합접착단백질은 강력한 자연 접착제로 알려져 있으며, 화학 합성 접착제와 비교하였을 때 대부분 에폭시 수지보다 약 두 배 정도의 높은 인장강도를 나타내면서도 휘어질 수 있는 유연성을 지니고 있다.
또한, 홍합접착단백질은 플라스틱, 유리, 금속, 테플론 및 생체물질 등의 다양한 표면에 접착할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 아직까지 화학접착제 개발에서 미완의 과제로 남아 있는 젖은 표면에서의 접착도 몇 분 안에 가능하다.
더욱이, 홍합접착단백질은 인간세포를 공격하거나 면역반응을 일으키지 않는 것으로 알려져 수술시 생체 조직의 접착이나 부러진 치아의 접착 등 의료분야에 응용 가능성이 크다. 상기 홍합접착단백질은 세포의 표면 접착에도 이용될 수 있는데, 세포의 표면 접착 기술은 세포 배양 및 조직 공학 분야에 필요한 매우 중요한 기술 중의 하나로, 세포의 증식 및 분화를 촉진시키는 데 매우 중요하다.
이에, 홍합접착단백질을 이용한 다양한 생의학적 응용이 요구된다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 생체접착 테이프 또는 필름으로 사용될 수 있으며, 분해 시간을 조절할 수 있는 홍합접착단백질을 포함하는 생체접착용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 생체접착용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 홍합접착단백질; 및 폴리아크릴산 및 폴리메타크릴산 중 적어도 하나를 포함하고; 상기 홍합접착단백질은 상기 폴리아크릴산 및 폴리메타크릴산 중 적어도 하나와 아마이드 결합으로 연결되며, 삼차원 그물구조를 갖는 것인, 생체접착용 조성물을 제공한다.
상기 홍합접착단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 홍합접착단백질은 티로신 잔기가 카테콜 화합물로 변환된 것; 홍합접착단백질의 표면에 카테콜 유도체가 도입된 것; 또는 이들 모두를 포함할 수 있다.
상기 카테콜 화합물은 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA), 도파 o-퀴논(Dopa o-quinone), 토파(2,4,5-trihydroxyphenylalanine, TOPA), 토파 퀴논(Topa quinone) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 생체접착용 조성물은, 상기 홍합접착단백질 및 폴리아크릴산이 아마이드 결합된 것인 제1 성분, 또는 상기 홍합접착단백질 및 폴리메타크릴산이 아마이드 결합된 것인 제2 성분, 또는 상기 제1 성분과 제2 성분이 혼합된 것일 수 있다.
상기 제1 성분 또는 제2 성분은, 홍합접착단백질 대 폴리아크릴산 또는 폴리메타크릴산이 1 : 1 내지 5의 질량비로 포함되는 것일 수 있다.
상기 제1 성분 또는 제2 성분은, 홍합접착단백질 대 폴리아크릴산 또는 폴리메타크릴산이 1 : 2.5 내지 3.5의 질량비로 포함되는 것일 수 있다.
상기 제1 성분: 제2 성분은 3 : 1 내지 1:3 의 질량비로 혼합되는 것일 수 있다.
상기 생체접착용 조성물은 건조 상태에서는 비접착성 및 비분해성이며, 젖은 상태에서는 접착성 및 생분해성을 나타내는 것일 수 있다.
상기 생체접착용 조성물은 필름, 단면 또는 양면 테이프, 또는 하이드로겔일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 홍합접착단백질을 포함하는 용액에 아크릴산 N-하이드로숙신이미드 에스터 및 메타크릴 무수물 중 적어도 하나를 포함하는 용액을 혼합한 혼합용액 제조 단계; (b) 상기 혼합용액에 광개시제를 용해시키는 단계; (c) 상기 혼합용액에 아크릴산 단량체 및 메타크릴산 단량체 중 적어도 하나를 첨가하는 단계; 및 (d) 상기 혼합용액을 경화시키는 단계;를 포함하는 생체접착용 조성물의 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 (a-1) 홍합접착단백질을 포함하는 용액에 아크릴산 N-하이드로숙신이미드 에스터를 포함하는 용액을 혼합한 제1 혼합용액 및 홍합접착단백질을 포함하는 용액에 메타크릴 무수물을 포함하는 용액을 혼합한 제2 혼합용액을 제조하는 단계; (b-1) 상기 제1 혼합용액 및 제2 혼합용액 각각에 광개시제를 용해시키는 단계; (c-1) 상기 제1 혼합용액에 아크릴산 단량체를 첨가하고, 상기 제2 혼합용액에 메타크릴산 단량체를 첨가하는 단계; 및 (d-1) 상기 제1 혼합용액 및 제2 혼합용액을 혼합한 후 경화시키는 단계;를 포함하는 생체접착용 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 광개시제는 α-케토글루타르산일 수 있다.
상기 홍합접착단백질은 혼합용액 전체 중량을 기준으로 7 내지 15 중량%로 포함되는 것일 수 있다.
상기 아크릴산 N-하이드로숙신이미드 에스터 및 메타크릴 무수물 중 적어도 하나는 혼합용액 전체 중량을 기준으로 0.6 내지 2.0 중량%로 포함되는 것일 수 있다.
상기 광개시제는 혼합용액 전체 중량을 기준으로 0.1 내지 0.4 중량%로 포함되는 것일 수 있다.
상기 (d-1) 단계는, 상기 제1 혼합용액: 제2 혼합용액을 3 : 1 내지 1:3 의 질량비로 혼합하는 단계인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 생체접착용 조성물은 홍합접착단백질과 폴리(메타)아크릴산이 아마이드 결합으로 연결되어 3차원 그물구조로 형성된 것으로서, 건조 상태에서는 비접착성 및 비분해성이며, 젖은 상태에서는 생체접착 능력이 우수하고, 생체 효소에 의해 생분해될 수 있는 생체접착 테이프 또는 필름으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 생체접착용 조성물은 두 개의 홍합접착단백질에 폴리(메타)아크릴을 각각 가교시킨 후 이들의 혼합비를 조절함으로써, 분해 시간을 조절할 수 있고, 유독성의 (메타)아크릴산 단량체가 침출되지 않으므로 생체안정성이 뛰어나며, 세포독성이 없거나 매우 낮으므로 생체접착이 필요한 다양한 생의학적 응용에 적용이 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 생체 접착용 조성물은 양면 접착 테이프 또는 필름으로 사용될 수 있고, 생체재료 기반의 조직 접합제로 사용할 수 있으며, 체내 신호 전달 및 약물 투여를 위한 시한성 전자 회로 등을 붙여, 부착 후 기관의 정상화 및 주기적인 약물 투여를 추가적인 시술 없이 이뤄낼 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 홍합접착백질 및 폴리아크릴산이 아마이드 결합된 제1 성분을 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에 따른 홍합접착단백질 및 폴리메타크릴산이 아마이드 결합된 제2 성분을 도식화한 것이다.
도 3은 (a) 종래 홍합접착단백질(FP-151) 과 (b) 실시예 2에서 제조된 메타아크릴레이션된 홍합접착단백질의 MALDI 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 (a) 종래 홍합접착단백질(FP-151) 과 (b) 실시예 2에서 제조된 메타아크릴레이션된 홍합접착단백질의 FT-IR 데이터를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1 내지 3에 따라 제조된 생체접착용 조성물의 분해도 데이터를 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예 1 내지 3에 따라 제조된 생체접착용 조성물의 접착력을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 생체접착용 조성물의 세포독성을 평가한 결과로, 도 7(a)는 마이크로 플레이트 흡광 분광광도계를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정한 CCK-8 테스트 결과를 그래프로 나타낸 것이며, 도 7(b)는 Live-dead assay를 진행하여 세포의 생존을 확인한 결과이다(생존 세포는 초록, 사망 세포는 적색임).
도 8은 본 발명의 실시예 1 내지 5에 따라 제조된 생체접착용 조성물의 건조 상태를 확인한 이미지이다.
하기의 설명에서는 본 발명의 실시예를 이해하는데 필요한 부분만이 설명되며, 그 이외 부분의 설명은 본 발명의 요지를 흩트리지 않는 범위에서 생략될 수 있다는 점에 유의하여야 한다.
이하에서 설명되는 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념으로 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 바람직한 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명은 홍합접착단백질; 및 폴리아크릴산 및 폴리메타크릴산 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 홍합접착단백질은 상기 폴리아크릴산 및 폴리메타크릴산 중 적어도 하나와 아마이드 결합으로 연결되며, 삼차원 그물구조를 갖는 것인, 생체접착용 조성물을 제공한다.
상기 홍합접착단백질은 홍합의 족사에서 유래한 단백질로, 바람직하게는 미틸러스 에둘리스(Mytilus edulis), 미틸러스 갈로프로빈시얼리스(Mytilus galloprovincialis) 또는 미틸러스 코루스커스(Mytilus coruscus) 에서 유래한 홍합접착단백질 또는 이의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 홍합접착단백질은 상기 홍합 종에서 각각 유래한 Mefp(Mytilus edulis foot protein)-1, Mgfp(Mytilus galloprovincialis foot protein)-1, Mcfp(Mytilus coruscus foot protein)-1, Mefp-2, Mefp-3, Mgfp-3 및 Mgfp-5 또는 이의 변이체를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 fp(foot protein)-1 (서열번호 1), fp-2 (서열번호 4), fp-3 (서열번호 5), fp-4 (서열번호 6), fp-5 (서열번호 7), 및 fp-6 (서열번호 8)로 이루어진 군에서 선택된 단백질, 또는 2종 이상의 단백질이 연결되어 있는 융합 단백질, 또는 상기 단백질의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 홍합접착단백질은 국제공개번호 제 WO2006/107183호 또는 제WO2005/092920호에 기재된 모든 홍합접착단백질을 포함한다. 바람직하게는, 상기 홍합접착단백질은 fp-151(서열번호 9), fp-131(서열번호 10), fp-353(서열번호 11), fp-153(서열번호 12) 및 fp-351(서열번호 13)로 이루어진 군에서 선택된 융합 단백질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 홍합접착단백질은 fp-1 에서 80번 정도 반복되는 데카펩타이드(서열번호 2)가 1 내지 12회 또는 그 이상으로 연속하여 연결된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 홍합접착단백질은 fp-1에서 80번 정도 반복되는 데카펩타이드(서열번호 2)가 1 내지 12회 또는 그 이상으로 연속하여 연결된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 서열번호 2의 데카펩타이드가 12회 연속하여 연결된 fp-1 variant 폴리펩타이드(서열번호 3)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 홍합접착단백질은 fp-151의 변이체(서열번호 15)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 서열번호 15의 단백질 서열은 서열번호 9와 대비하여 링커 서열 등이 제외된 서열이다. 구체적으로, 서열번호 14로 표시되는 fp-1 변이체 서열 사이에 서열번호 16으로 표시되는 Mgfp-5의 서열을 융합한 융합 단백질 서열이다. 보다 더 구체적으로, 본 발명의 홍합접착단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명은 또한 위 언급된 홍합접착단백질들의 특성을 유지할 수 있는 보존적 아미노산 서열을 포함하는 범위에서 홍합접착단백질은 변형될 수 있다. 즉, 실질적으로 동등한 효과를 나타내는 상기 서열번호들의 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 더 바람직하게는 90%이상, 즉, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열은 또한 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.
상기 홍합접착단백질은 티로신 잔기가 카테콜 화합물로 변환된 것; 홍합접착단백질의 표면에 카테콜 유도체가 도입된 것; 또는 이들 모두를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 홍합접착단백질은 티로신 잔기가 카테콜 화합물로 변환된 것이 바람직하고, 전체 티로신 잔기의 10 ~ 100%가 카테콜 화합물로 변환된 것이 바람직하다. 대부분의 홍합접착단백질의 전체 아미노산 서열에서 티로신이 차지하는 비중은 약 1 ~ 50 %일 수 있다. 홍합접착단백질 내의 티로신은 수화과정을 통하여 OH기가 첨가되어 카테콜 화합물인 도파(DOPA)로 변환될 수 있다.
그러나 대장균에서 생산된 홍합접착단백질은 티로신 잔기들이 변환되어 있지 않으므로, 별도의 효소 및 화학적 처리 방법에 의하여 티로신을 도파로 변환시키는 수정 반응을 수행하는 것이 바람직하다. 홍합접착단백질에 포함된 티로신 잔기를 도파로 수정하는 방법은 당업계에 알려진 방법을 사용할 수 있으며 특별히 제한되지 않는다.
상기 카테콜 화합물은 디하이드록시기를 포함하는 화합물로, 가교작용을 통해 홍합접착단백질에 접착력을 부여하는 화합물을 의미한다. 구체적으로 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA), 도파 o-퀴논(Dopa o-quinone), 토파(2,4,5-trihydroxyphenylalanine, TOPA), 토파 퀴논(Topa quinone) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명에서 홍합접착단백질의 변이체(mutants)는 바람직하게는 홍합접착단백질의 접착력을 유지하는 전제하에 상기 홍합접착단백질의 카르복실말단이나 아미노말단에 추가적인 서열을 포함하거나 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 변환된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 홍합접착단백질의 카르복실말단 또는 아미노말단에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것이거나 홍합접착단백질을 이루는 타이로신 잔기 총수의 1 내지 100%, 바람직하게는 5 내지 100%가 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌(DOPA)로 변환된 것일 수 있다.
상기 홍합접착단백질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 외부 유전자를 발현할 수 있는 용도로 제작된 통상의 벡터에 발현 가능하도록 삽입하여, 유전공학적인 방법으로 대량 생산할 수 있다. 상기 벡터는 단백질을 생산하기 위한 숙주세포의 종류 및 특성에 따라 적절히 선택하거나, 신규로 제작할 수 있다. 상기 벡터를 숙주세포에 형질전환하는 방법 및 형질전환체로부터 재조합 단백질을 생산하는 방법은 통상의 방법으로 용이하게 실시할 수 있다. 상기한 벡터의 선택, 제작, 형질전환 및 재조합 단백질의 발현 등의 방법은, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시할 수 있으며, 통상의 방법에서 일부의 변형도 본 발명에 포함된다.
본 발명에 따른 생체접착용 조성물은 홍합접착단백질; 및 폴리아크릴산 및 폴리메타크릴산 중 적어도 하나를 포함하며, 구체적으로 상기 홍합접착단백질 및 폴리아크릴산이 아마이드 결합된 것인 제1 성분, 또는 상기 홍합접착단백질 및 폴리메타크릴산이 아마이드 결합된 것인 제2 성분, 또는 상기 제1 성분과 제2 성분이 혼합된 것 일 수 있다.
상기 제1 성분 또는 제2 성분은 홍합접착단백질 대 폴리아크릴산 또는 폴리메타크릴산은 1 : 1 내지 5의 질량비, 바람직하게는 1 : 2.5 내지 3.5의 질량비, 보다 더 바람직하게는 1:3의 질량비로 포함되는 것일 수 있다. 상기 홍합접착단백질 대 폴리아크릴산 또는 폴리메타크릴산의 함량비(질량비)를 조절하여 제조되는 조성물의 물성을 조절할 수 있다.
본 발명의 생체접착제 조성물 중의 홍합접착단백질에 대하여 폴리아크릴산 또는 폴리메타크릴산의 함량이 상기범위 미만이면, 조성물 내에 잔량의 단백질 결정이 남아있게 되며, 필름 및 테이프 등으로 제조 시, 필름의 유연성이 저하될 수 있으며, 예컨대 부러지거나 깨질 수 있고, 고가의 단백질이 미반응으로 버려지게 되므로 경제성이 떨어진다. 한편, 폴리아크릴산 또는 폴리메타크릴산의 함량이 상기 범위를 초과하면 조성물 중의 폴리아크릴산 또는 폴리메타크릴산의 비율이 너무 높아 홍합접착단백질의 도파민 잔기의 수중 부착력을 저해할 수 있으며, 접착력이 떨어질 수 있다.
반면, 폴리아크릴산 또는 폴리메타크릴산의 함량이 상기 범위로 포함되는 경우 조성물 내에 미반응 단백질이 존재하지 않으므로 조성물의 유연성과 인장강도가 뛰어난 필름 및 테이프 등으로 제조할 수 있으며, 제조된 조성물은 홍합접착단백질의 도파민 잔기에 의한 수중 부착력이 최대화되고, 생분해성이 우수하면서도 세포독성은 없거나 매우 낮은 조성물을 제조할 수 있다.
본 발명의 생체 접착용 조성물은, 상기 제1 성분 또는 제2 성분을 각각 따로, 예컨대 제1 성분: 제2성분은 10:0 또는 0:10의 질량비로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 생체접착용 조성물은, 상기 제1 성분 및 제2 성분이 혼합된 것일 수 있으며, 상기 제1 성분: 제2 성분은 9 : 1 내지 1:9 의 질량비, 바람직하게는 3 : 1 내지 1:3 의 질량비, 보다 더 바람직하게는 1: 1 의 질량비로 혼합되어 사용되는 것일 수 있다. 이 경우, 본 발명의 생체접착용 조성물은 상기 제1 성분 및 제2 성분의 혼합비(질량비)를 조절하여 필름 및 테이프 등으로 제조하여 생체 내에 접착 시에 분해시간을 조절 할 수 있다. 또한, 상기 혼합비 내에서 홍합접착단백질이 최대화 되면서 결정화 되지 않으며, 단백질이 낭비되지 않게 될 수 있다.
본 발명에 따른 홍합접착단백질; 및 폴리아크릴산 및 폴리메타크릴산 중 적어도 하나는 아마이드로 결합된 삼차원 그물구조의 생체접착용 조성물로서, 건조 상태에서는 접착력을 나타내지 않으며, 비분해성이나, 젖은(습윤) 상태에서는 접착성 및 생분해성을 나타낼 수 있다. 습윤 상태에서는 조성물 중의 홍합접착단백질과 폴리아크릴 또는 폴리메타크릴 사이의 반데르발스 힘, 친수성 인력과 홍합접착단백질의 카테콜 잔기, 예컨대 도파민 잔기의 수중 접착력 등이 함께 작용하여 접착력을 향상시킨다.
또한, 본 발명에 따른 홍합접착단백질; 및 폴리아크릴산 및 폴리메타크릴산 중 적어도 하나는 아마이드로 결합된 삼차원 그물구조의 생체접착용 조성물로서, 생체 내에서 생체 효소에 의해 생분해될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 생체접착용 조성물은 생분해되는 경우에도 조성물로부터 아크릴 단량체가 분리되거나, 용출되지 않으므로 세포독성이 없으므로 안정성이 뛰어나다.
본 발명에 따른 상기 생체접착용 조성물은 필름, 단면 또는 양면 테이프 또는 하이드로겔 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 생체접착이 요구되는 생의학적 용도에 유용하게 적용할 수 있다. 예컨대 생체재료 기반의 조직접합체로 사용될 수 있고, 체내 신호전달 및 약물 투여를 위해 생체 내에 장착되는 장치를 생체 내에 고정하기 위한 양면접착 테이프로서 적용이 가능하다.
또한, 본 발명은 (a) 홍합접착단백질을 포함하는 용액에 아크릴산 N-하이드로숙신이미드 에스터 및 메타크릴 무수물 중 적어도 하나를 포함하는 용액을 혼합한 혼합용액 제조 단계; (b) 상기 혼합용액에 광개시제를 용해시키는 단계; (c) 상기 혼합용액에 아크릴산 단량체 및 메타크릴산 단량체 중 적어도 하나를 첨가하는 단계; 및 (d) 상기 혼합용액을 경화시키는 단계;를 포함하는 생체접착용 조성물의 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 생체접착용 조성물의 제조방법은 (a-1) 홍합접착단백질을 포함하는 용액에 아크릴산 N-하이드로숙신이미드 에스터를 포함하는 용액을 혼합한 제1 혼합용액, 및 홍합접착단백질을 포함하는 용액에 메타크릴 무수물을 포함하는 용액을 혼합한 제2 혼합용액을 각각 제조하는 단계; (b-1) 상기 제1 혼합용액 및 제2 혼합용액 각각에 광개시제를 용해시키는 단계; (c-1) 상기 제1 혼합용액에 아크릴산 단량체를 첨가하고, 상기 제2 혼합용액에 메타크릴산 단량체를 첨가하는 단계; 및 (d-1) 상기 제1 혼합용액 및 제2 혼합용액을 혼합한 후 경화시키는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 홍합접착단백질은 앞에서 정의한 바와 같다.
본 발명에 있어서, 상기 아크릴산 N-하이드로숙신이미드 에스터는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이며, 상기 메타크릴 무수물은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 일 수 있다.
[화학식 1]
[화학식 2]
본 발명에 있어서, 상기 광개시제는 α-케토글루타르산일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 폴리아크릴산을 형성시킬 수 있는 것이면 가능하다.
본 발명에 있어서, α-케토글루타르산은 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물일 수 있다.
[화학식 3]
본 발명에 의하면 상기 아크릴산 단량체는 하기 화학식 4로 표시되는 화합물이며, 상기 메타크릴산 단량체는 하기 화학식 5로 표시되는 화합물일 수 있다.
[화학식 4]
[화학식 5]
본 발명에 의하면, 상기 (d)단계 또는 (d-1)단계의 경화는 광경화일 수 있으며, 바람직하게는 200 내지 300 nm 광의 조사, 예컨대 254 nm 광의 조사일 수 있다. 상기 광조사와 광개시제에 의해 아크릴산 단량체로부터 폴리아크릴산이 형성되거나, 메타크릴산 단량체로부터 폴리메타크릴산이 형성되며, 홍합접착단백질;과 폴리아크릴산 또는 폴리메타크릴산 사이에는 아마이드 결합이 형성된다.
본 발명에 따른 홍합접착단백질;과 폴리아크릴산 및 폴리메타크릴산 중 적어도 하나는 아마이드 결합을 통해 3차원 그물구조를 갖으며, 이를 도식화하여 도 1 및 도 2에 나타내었다.
구체적으로, 상기 도 1은 홍합접착백질 및 폴리아크릴산이 아마이드 결합된 것인 제1 성분을 도식화하여 나타낸 것이며, 도 2는 홍합접착단백질 및 폴리메타크릴산이 아마이드 결합된 것인 제2 성분을 도식화하여 나타낸 것이다.
본 발명에 의하면, 상기 홍합접착단백질은 혼합용액 전체 중량을 기준으로 7 내지 15 중량%로 포함되며, 홍합접착단백질 대 아크릴산 단량체 또는 메타크릴산 단량체는 1 : 1 내지 5의 질량비, 바람직하게는 1 : 2.5 내지 3.5의 질량비, 보다 더 바람직하게는 1 : 3의 질량비로 포함되는 것일 수 있다.
상기 홍합접착단백질은 혼합용액 전체 중량을 기준으로 상기 범위로 포함되는 경우, 생체 접착력이 우수한 효과가 있다. 또한, 상기 홍합접착단백질 대 아크릴산 단량체 또는 메타크릴산 단량체의 비율이 상기 범위인 경우, 건조 상태 또는 젖은(습윤) 상태 모두에서 우수한 기계적 물성, 예컨대 인장력이 뛰어나면서도 생체접착능력이 우수한 생체접착용 필름 또는 양면테이프를 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 광개시제는 혼합용액 전체 중량을 기준으로 0.1 내지 0.4 중량%로 포함되는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.2 내지 0.3 중량%로 포함되는 것일 수 있다.
상기 광개시제는 반응 시 촉매로서, 혼합용액 전체 중량을 기준으로 상기 범위로 포함되는 경우, 상기 홍합접착단백질과 아크릴산 N-하이드로숙신이미드 에스터 또는 메타크릴 무수물과의 반응이 용이할 수 있다.
본 발명에 있어서, 아크릴산 N-하이드로숙신이미드 에스터 및 메타크릴 무수물 중 적어도 하나는 혼합용액 전체 중량을 기준으로 0.6 내지 2.0 중량%로 포함되는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.8 내지 1.5 중량%로 포함될 수 있다. 아크릴산 N-하이드로숙신이미드 에스터 및 메타크릴 무수물 중 적어도 하나의 함량이 상기 범위 미만이면, 3차원 그물구조가 조밀하지 못하고, 기공 크기가 커 인장력이 저하된 필름 또는 테이프가 제조될 수 있으며, 상기 범위를 초과하면 3차원 그물구조가 너무 조밀하여 탄성력이 낮으면서 접착력은 저하된 필름 또는 테이프가 제조될 수 있다. 반면, 상기 범위로 포함되는 경우, 인장력이 우수하고, 접착력이 특히 향상되므로 특히 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 제1 혼합용액 또는 상기 제2 혼합용액은 각각 따로 제조되어 사용될 수 있으며, 예컨대 상기 제1 혼합용액: 제2 혼합용액은 10:0 또는 0:10의 질량비로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 제1 혼합용액 및 제2 혼합용액은 상기 제1 혼합용액: 제2 혼합용액을 9 : 1 내지 1:9 의 질량비, 바람직하게는 3 : 1 내지 1:3 의 질량비, 보다 더 바람직하게는 1: 1 의 질량비로 혼합할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 생체접착용 조성물은 상기 제1 혼합용액 및 제2 혼합용액의 혼합비(질량비)를 조절하여 필름 및 테이프 등으로 제조하여 생체 내에 접착 시에 분해시간을 조절 할 수 있다. 또한, 상기 혼합비 내에서 홍합접착단백질이 최대화 되면서 결정화 되지 않으며, 단백질이 낭비되지 않게 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 광개시제는 혼합용액 전체 중량을 기준으로 0.1 내지 0.4 중량%로 포함되는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.2 내지 0.3 중량%로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 생체접착용 조성물의 제조방법은 상기 (d)단계에서 혼합용액을 경화시킨 후 또는 (d-1)단계에서와 같이 제1 혼합용액 및 제2 혼합용액을 혼합하고 경화시킨 후에 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 생체접착용 조성물은 건조 상태에서는 비접착성 및 비분해성이며, 젖은 상태에서는 접착성을 나타낸다. 또한, 생체 효소를 포함하는 젖은 조건, 예컨대 콜라게나아제 존재 하의 젖은 상태에서는 생분해성을 나타낼 수 있다. 그러나, 상기 생분해는 홍합접착단백질 결합 부분이 생분해되는 것이며, 독성의 아크릴산 단량체 또는 메타크릴산 단량체를 배출하지는 않으므로 세포 독성이 없으며, 생체적합성은 유지된다.
본 발명의 생체접착용 조성물은 광범위한 유망한 접착성 재료로 필름, 단면 또는 양면 접착 테이프 또는 하이드로겔로 제조될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 생체접착용 조성물은 웨어러블 전자 제품, 인공 피부, 슈퍼 커패시터의 로봇 공학, 에너지 저장 재료, 생체 전극, 이식 가능한 전류 측정 바이오 센서, 전기 자극 약물 방출 장치 및 신경 보철물 등의 접착제로서 유용하게 활용될 수 있다.
이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 일 구현예를 이용하여 설명한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 갖는 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에서 설명된 실시예는 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이런 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호범위는 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
제조예
제조예 1: 홍합접착단백질 제조
서열번호 9의 홍합접착단백질(fp-151)은 자연에 존재하는 홍합접착단백질 fp-1 중에서 80 번 정도 반복되는 10개의 아미노산으로 구성된 데카펩타이드(decapeptide)가 대장균에서 발현될 수 있도록 6개의 데카펩타이드로 이루어진 fp-1 변이체를 합성하고, 2 개의 fp-1 변이체 사이에 Mgfp-5의 유전자(Genbank No. AAS00463 또는 AY521220)를 넣은 후, 대장균에서 생산되었다 (D.S. Hwang et. al., Biomaterials 28, 3560-3568, 2007). 다음으로 서열번호 9의 홍합접착단백질(fp-151)에 버섯 티로시나아제를 이용한 in vitro 효소 반응을 통해 홍합접착단백질의 티로신을 도파로 변환시켜 카테콜 DOPA 잔기가 도입된 홍합접착단백질을 제조하였다.
제조예 2: 홍합접착단백질 제조
서열번호 9의 홍합접착단백질(fp-151)은 자연에 존재하는 홍합접착단백질 fp-1 중에서 80 번 정도 반복되는 10개의 아미노산으로 구성된 데카펩타이드(decapeptide)가 대장균에서 발현될 수 있도록 6개의 데카펩타이드로 이루어진 fp-1 변이체를 합성하고, 2 개의 fp-1 변이체 사이에 Mgfp-5의 유전자(Genbank No. AAS00463 또는 AY521220)를 넣은 후, 대장균에서 생산되었다 (D.S. Hwang et. al., Biomaterials 28, 3560-3568, 2007).
실시예
실시예 1. 제1 성분 제조
탈이온수에 상기 제조예 1에 제조된 카테콜 DOPA 잔기가 도입된 홍합접착단백질 10 중량%, 아크릴산 N-하이드로숙신이미드 에스터 1 중량%, 광개시제로서 α-케토글루타르산 0.2 중량%의 농도로 용해시킨 다음, 아크릴산을 20 중량%의 농도로 첨가하고 혼합하여 제1 혼합용액을 제조하였다. 제1 혼합용액을 0.4 ㎛의 멸균 주사기 필터로 여과하고, 석영 몰드에 부었다. 다음으로 자외선(UV) 램프를 이용하여 254 nm의 파장, 10 W의 전력으로 30분 동안 경화시켰다.
실시예 2. 제2 성분 제조
버퍼용액(pH 7.5의 pbs)에 상기 제조예 2에 따라 제조된 홍합접착단백질 0.1 중량%의 농도로 용해시킨 후, 메타크릴 무수물을 상기 홍합접착단백질 1g 당 2ml를 첨가하고, 40 ℃의 워터 배스에서 1시간 동안 120 rpm으로 스터링 하며 반응시킨다. 4번 Dialysis bag (Spectra/Por 4 dialysis membrane Standard RC Tubing) 에 넣고 40 워터 배스에서 하루동안 D.W 에 Dialysis 하고, 홍합접착단백질에 메타크릴기가 도입된 홍합접착단백질을 동결건조하여 홍합접착단백질의 티로신을 도파로 변환시켜 카테콜 DOPA 잔기가 도입된 홍합접착단백질을 제조하였다. 탈이온수에 상기 카테콜 DOPA 잔기가 도입된 홍합접착단백질 10 중량%, 광개시제로서 α-케토글루타르산 0.2 중량%의 농도로 용해시킨 다음, 메타크릴산을 30 중량%의 농도로 첨가하하고 혼합하여 제2 혼합용액을 제조하였다. 제2 혼합용액을 0.4 ㎛의 멸균 주사기 필터로 여과하고, 석영 몰드에 부었다. 다음으로 자외선(UV) 램프를 이용하여 254 nm의 파장, 10 W의 전력으로 1시간 동안 경화시켰다.
실시예 3. 제1 성분 및 제2 성분의 혼합(1: 1 질량비)
상기 실시예 1에 따라 제조된 제1 혼합용액과 상기 실시예 2에 따라 제조된 제2 홉합용액을 1:1의 질량비로 혼합한 혼합용액을 0.4 ㎛의 멸균 주사기 필터로 여과하고, 석영 몰드에 부었다. 다음으로 자외선(UV) 램프를 이용하여 254 nm의 파장, 10 W의 전력으로 30분 동안 경화시켰다.
실시예 4. 제1 성분 및 제2 성분의 혼합(1: 3 질량비)
상기 실시예 1에 따라 제조된 제1 혼합용액과 상기 실시예 2에 따라 제조된 제2 홉합용액을 1:3의 질량비로 혼합한 혼합용액을 0.4 ㎛의 멸균 주사기 필터로 여과하고, 석영 몰드에 부었다. 다음으로 자외선(UV) 램프를 이용하여 254 nm의 파장, 10 W의 전력으로 30분 동안 경화시켰다.
실시예 5. 제1 성분 및 제2 성분의 혼합(3: 1 질량비)
상기 실시예 1에 따라 제조된 제1 혼합용액과 상기 실시예 2에 따라 제조된 제2 홉합용액을 3:1의 질량비로 혼합한 혼합용액을 0.4 ㎛의 멸균 주사기 필터로 여과하고, 석영 몰드에 부었다. 다음으로 자외선(UV) 램프를 이용하여 254 nm의 파장, 10 W의 전력으로 30분 동안 경화시켰다.
시험예
시험예 1. MALDI 질량 분석
종래의 홍합접착단백질 (fp-151)과 실시예 2에서 제조된 홍합접착단백질에 메타크릴기가 도입되어 메타아크릴레이션된 홍합접착단백질을 결정화하여 maldi plate에 놓고 분자량을 검사하였으며, 이를 도 3에 나타내있다.
도 3은 (a) 종래 홍합접착단백질(FP-151) 과 (b) 실시예 2에서 제조된 메타아크릴레이션된 홍합접착단백질의 MALDI 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3을 참조하면, 큰 피크에서의 평균 분자량이 22.6 kDa 에서 27.5 kDa 으로 증가한 것으로 보아 홍합접착단백질이 메타아크릴레이션 됨을 확인하였다.
시험예 2. FT-IR 분석
종래의 홍합접착단백질 (fp-151)과 실시예 2에서 제조된 홍합접착단백질에 메타크릴기가 도입되어 메타아크릴레이션된 홍합접착단백질을 결정화하여 FT-IR을 측정하였으며, 이를 도 4에 나타내었다.
도 4를 참조하면, 젤라틴을 젤라틴 메타 아크릴레이트로 변화 시켰을 때 확인하는 1710cm-1 에서의 피크 변화를 통해 실시예 2에 따른 홍합 접착단백질이 메타아크릴레이션 되었음을 확인하였다.
시험예 3. 분해도 테스트
실시예 1 내지 3에 따라 제조된 접착제 조성물을 가로 세로 1cm, 높이 0.5mm로 준비하였다.
0.01% 농도의 collagenase 와 0.01% 농도의 lysozyme 이 들어있는 pbs 용액 10ml 에 상기 준비된 실시예 1 내지 3에 따라 제조된 접착제 조성물을 넣어 최대 2주 간 온도 37도의 incubator 에 배치 한 후 회수 하였다. 상기 pbs 용액에 집어 넣기 전의 건조된 무게와 회수 후 동결건조 한 무게를 비교하여 잔존량을 % 로 확인하였으며, 이를 도 5에 나타내었다.
시험예 4. 접착력 테스트
실시예 1 내지 3에 따라 제조된 접착제 조성물과 대조군으로 시아노 아크릴, 피브린 글루를 준비하였다. 실시예 1 내지 3에 따라 제조된 접척제 조성물은 가로 세로 1cm, 높이 0.5mm로 준비하였고, 시아노 아크릴과 피브린글루는 300ul 씩 사용하였다. 아크릴 플레이트에 돼지 피부를 가로 세로 1cm 로 잘라 붙이고 돼지 피부 사이에 접착제를 붙인 후 pbs 에 4시간 둔 후, shear stress 와 interfacial stress 를 측정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6을 참조하면, 본 발명에 따른 접착제 조성물은 모두 인체에 사용이 힘든 시아노 아크릴에 비해 접착력이 떨어졌지만, 시판중인 피브린 글루에 비해 뛰어난 접착력을 보여주는 것을 확인할 수 있었다.
시험예 5. 세포독성 테스트
24-웰 조직배양 플레이트에 HaCaT 세포를 웰당 5Х104 세포의 밀도로 접종한 다음 밤새 배양하였다. 세포를 Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose 용액에 용해시킨 2% 실시예 3의 조성물 용액으로 처리하였다. 세포를 1일 동안 배양한 뒤, DMEM에 용해시킨 5% CCK-8 (Dojindo Laboratories, Tokyo, Japan) 시약을 각 웰에 첨가하고, 세포를 3시간 동안 배양한 뒤, 마이크로 플레이트 흡광 분광광도계를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 같은 조건하에서 Live-dead assay를 수행하여 세포독성을 평가하였으며(생존 세포는 초록, 사망 세포는 적색임), 이를 도 7에 나타내었다.
도 7(a)는 마이크로 플레이트 흡광 분광광도계를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정한 CCK-8 테스트 결과를 그래프로 나타낸 것이며, 도 7(b)는 Live-dead assay를 진행하여 세포의 생존을 확인한 결과이다(생존 세포는 초록, 사망 세포는 적색임).
도 7(a)에 나타낸 바와 같이, CCK-8 테스트에서 세포 생존률이 70% 이상으로 나타났다. 또한, 도 7(b)에 나타낸 바와 같이, 적색은 거의 관찰되지 않았다. 이를 통해 본 발명에 따른 생체접착용 조성물은 세포독성이 매우 낮음을 확인되었다. 또한, 이러한 결과는 아크릴 단량체의 침출은 일어나지 않음을 시사한다.
시험예 6. 접착제 형성 확인
실시예 1 내지 5에 따라 제조된 생체접착용 조성물로부터 제1 성분과 제2 성분의 다양한 농도 변화(제1 성분: 제2 성분=10:0, 3:1, 1:1, 1:3, 0:10)에서 접착제로 형성이 가능한 것을 확인할 수 있었으며, 이를 도 8에 나타내었다.
이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자 또는 해당 기술 분야에 통상의 지식을 갖는 자라면, 후술될 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 기술 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명의 기술적 범위는 명세서의 상세한 설명에 기재된 내용으로 한정되는 것이 아니라 청구범위에 의해 정하여져야만 할 것이다.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Bioadhesive tape comprising mussel adhesive protein and preparation method thereof <130> POSTECH1-90P <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 800 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-1 <400> 1 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 50 55 60 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 65 70 75 80 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 85 90 95 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 100 105 110 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 115 120 125 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 130 135 140 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 145 150 155 160 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 165 170 175 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 180 185 190 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 195 200 205 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 210 215 220 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 225 230 235 240 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 245 250 255 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 260 265 270 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 275 280 285 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 290 295 300 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 305 310 315 320 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 325 330 335 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 340 345 350 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 355 360 365 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 370 375 380 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 385 390 395 400 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 405 410 415 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 420 425 430 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 435 440 445 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 450 455 460 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 465 470 475 480 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 485 490 495 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 500 505 510 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 515 520 525 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 530 535 540 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 545 550 555 560 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 565 570 575 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 580 585 590 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 595 600 605 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 610 615 620 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 625 630 635 640 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 645 650 655 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 660 665 670 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 675 680 685 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 690 695 700 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 705 710 715 720 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 725 730 735 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 740 745 750 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 755 760 765 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 770 775 780 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 785 790 795 800 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-1 variant <400> 2 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-1 variant <400> 3 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 50 55 60 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 65 70 75 80 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 85 90 95 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 100 105 110 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 115 120 <210> 4 <211> 472 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-2 <400> 4 Leu Phe Ser Phe Phe Leu Leu Leu Thr Cys Thr Gln Leu Cys Leu Gly 1 5 10 15 Thr Asn Arg Pro Asp Tyr Asn Asp Asp Glu Glu Asp Asp Tyr Lys Pro 20 25 30 Pro Val Tyr Lys Pro Ser Pro Ser Lys Tyr Arg Pro Val Asn Pro Cys 35 40 45 Leu Lys Lys Pro Cys Lys Tyr Asn Gly Val Cys Lys Pro Arg Gly Gly 50 55 60 Ser Tyr Lys Cys Phe Cys Lys Gly Gly Tyr Tyr Gly Tyr Asn Cys Asn 65 70 75 80 Leu Lys Asn Ala Cys Lys Pro Asn Gln Cys Lys Asn Lys Ser Arg Cys 85 90 95 Val Pro Val Gly Lys Thr Phe Lys Cys Val Cys Arg Asn Gly Asn Phe 100 105 110 Gly Arg Leu Cys Glu Lys Asn Val Cys Ser Pro Asn Pro Cys Lys Asn 115 120 125 Asn Gly Lys Cys Ser Pro Leu Gly Lys Thr Gly Tyr Lys Cys Thr Cys 130 135 140 Ser Gly Gly Tyr Thr Gly Pro Arg Cys Glu Val His Ala Cys Lys Pro 145 150 155 160 Asn Pro Cys Lys Asn Lys Gly Arg Cys Phe Pro Asp Gly Lys Thr Gly 165 170 175 Tyr Lys Cys Arg Cys Val Asp Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Gln Glu 180 185 190 Asn Ala Cys Lys Pro Asn Pro Cys Ser Asn Gly Gly Thr Cys Ser Ala 195 200 205 Asp Lys Phe Gly Asp Tyr Ser Cys Glu Cys Arg Pro Gly Tyr Phe Gly 210 215 220 Pro Glu Cys Glu Arg Tyr Val Cys Ala Pro Asn Pro Cys Lys Asn Gly 225 230 235 240 Gly Ile Cys Ser Ser Asp Gly Ser Gly Gly Tyr Arg Cys Arg Cys Lys 245 250 255 Gly Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Lys Val Asn Val Cys Lys Pro Thr 260 265 270 Pro Cys Lys Asn Ser Gly Arg Cys Val Asn Lys Gly Ser Ser Tyr Asn 275 280 285 Cys Ile Cys Lys Gly Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Gly Glu Asn Val 290 295 300 Cys Lys Pro Asn Pro Cys Gln Asn Arg Gly Arg Cys Tyr Pro Asp Asn 305 310 315 320 Ser Asp Asp Gly Phe Lys Cys Arg Cys Val Gly Gly Tyr Lys Gly Pro 325 330 335 Thr Cys Glu Asp Lys Pro Asn Pro Cys Asn Thr Lys Pro Cys Lys Asn 340 345 350 Gly Gly Lys Cys Asn Tyr Asn Gly Lys Ile Tyr Thr Cys Lys Cys Ala 355 360 365 Tyr Gly Trp Arg Gly Arg His Cys Thr Asp Lys Ala Tyr Lys Pro Asn 370 375 380 Pro Cys Val Val Ser Lys Pro Cys Lys Asn Arg Gly Lys Cys Ile Trp 385 390 395 400 Asn Gly Lys Ala Tyr Arg Cys Lys Cys Ala Tyr Gly Tyr Gly Gly Arg 405 410 415 His Cys Thr Lys Lys Ser Tyr Lys Lys Asn Pro Cys Ala Ser Arg Pro 420 425 430 Cys Lys Asn Arg Gly Lys Cys Thr Asp Lys Gly Asn Gly Tyr Val Cys 435 440 445 Lys Cys Ala Arg Gly Tyr Ser Gly Arg Tyr Cys Ser Leu Lys Ser Pro 450 455 460 Pro Ser Tyr Asp Asp Asp Glu Tyr 465 470 <210> 5 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-3 <400> 5 Pro Trp Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr 1 5 10 15 Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys 20 25 30 Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 Gly Ser 50 <210> 6 <211> 750 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-4 <400> 6 Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Glu Pro Ser Gly Tyr Ala Asn Ile Gly His 1 5 10 15 Arg Arg Tyr Tyr Glu Arg Ala Ile Ser Phe His Arg His Ser His Val 20 25 30 His Gly His His Leu Leu His Arg His Val His Arg His Ser Val Leu 35 40 45 His Gly His Val His Met His Arg Val Ser His Arg Ile Met His Arg 50 55 60 His Arg Val Leu His Gly His Val His Arg His Arg Val Leu His Asn 65 70 75 80 His Val His Arg His Ser Val Leu His Gly His Val His Arg His Arg 85 90 95 Val Leu His Arg His Val His Arg His Asn Val Leu His Gly His Val 100 105 110 His Arg His Arg Val Leu His Lys His Val His Asn His Arg Val Leu 115 120 125 His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His Val His Arg 130 135 140 His Gln Val Leu His Lys His Val His Asn His Arg Val Leu His Lys 145 150 155 160 His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His Val His Thr His Arg 165 170 175 Val Leu His Lys His Val His Lys His Arg Val Leu His Lys His Leu 180 185 190 His Lys His Gln Val Leu His Gly His Ile His Thr His Arg Val Leu 195 200 205 His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His Val His Thr 210 215 220 His Arg Val Leu His Lys His Val His Lys His Arg Val Leu His Lys 225 230 235 240 His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His Val His Met His Arg 245 250 255 Val Leu His Lys His Val His Lys His Arg Val Leu His Lys His Val 260 265 270 His Lys His His Val Val His Lys His Val His Ser His Arg Val Leu 275 280 285 His Lys His Val His Lys His Arg Val Glu His Gln His Val His Lys 290 295 300 His His Val Leu His Arg His Val His Ser His His Val Val His Ser 305 310 315 320 His Val His Lys His Arg Val Val His Ser His Val His Lys His Asn 325 330 335 Val Val His Ser His Val His Arg His Gln Ile Leu His Arg His Val 340 345 350 His Arg His Gln Val Val His Arg His Val His Arg His Leu Ile Ala 355 360 365 His Arg His Ile His Ser His Gln Ala Ala Val His Arg His Val His 370 375 380 Thr His Phe Glu Gly Asn Phe Asn Asp Asp Gly Thr Asp Val Asn Leu 385 390 395 400 Arg Ile Arg His Gly Ile Ile Tyr Phe Gly Gly Asn Thr Tyr Arg Leu 405 410 415 Ser Gly Gly Arg Arg Arg Phe Met Thr Leu Trp Gln Glu Cys Leu Glu 420 425 430 Ser Tyr Gly Asp Ser Asp Glu Cys Phe Val Gln Leu Leu Glu Gly Asn 435 440 445 Gln His Leu Phe Thr Val Val Gln Gly His His Ser Thr Ser Phe Arg 450 455 460 Ser Asp Leu Ser Asn Asp Leu His Pro Asp Asn Asn Ile Glu Gln Ile 465 470 475 480 Ala Asn Asp His Val Asn Asp Ile Ala Gln Ser Thr Asp Gly Asp Ile 485 490 495 Asn Asp Phe Ala Asp Thr His Tyr Asn Asp Val Ala Pro Ile Ala Asp 500 505 510 Val His Val Asp Asn Ile Ala Gln Thr Ala Asp Asn His Val Lys Asn 515 520 525 Ile Ala Gln Thr Ala His His His Val Asn Asp Val Ala Gln Ile Ala 530 535 540 Asp Asp His Val Asn Asp Ile Gly Gln Thr Ala Tyr Asp His Val Asn 545 550 555 560 Asn Ile Gly Gln Thr Ala Asp Asp His Val Asn Asp Ile Ala Gln Thr 565 570 575 Ala Asp Asp His Val Asn Ala Ile Ala Gln Thr Ala Asp Asp His Val 580 585 590 Asn Ala Ile Ala Gln Thr Ala Asp Asp His Val Asn Asp Ile Gly Asp 595 600 605 Thr Ala Asn Ser His Ile Val Arg Val Gln Gly Val Ala Lys Asn His 610 615 620 Leu Tyr Gly Ile Asn Lys Ala Ile Gly Lys His Ile Gln His Leu Lys 625 630 635 640 Asp Val Ser Asn Arg His Ile Glu Lys Leu Asn Asn His Ala Thr Lys 645 650 655 Asn Leu Leu Gln Ser Ala Leu Gln His Lys Gln Gln Thr Ile Glu Arg 660 665 670 Glu Ile Gln His Lys Arg His Leu Ser Glu Lys Glu Asp Ile Asn Leu 675 680 685 Gln His Glu Asn Ala Met Lys Ser Lys Val Ser Tyr Asp Gly Pro Val 690 695 700 Phe Asn Glu Lys Val Ser Val Val Ser Asn Gln Gly Ser Tyr Asn Glu 705 710 715 720 Lys Val Pro Val Leu Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Asn Gly Lys Val Ser 725 730 735 Ala Leu Ser Asp Gln Gly Ser Tyr Asn Glu Gly Tyr Ala Tyr 740 745 750 <210> 7 <211> 82 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-5 <400> 7 Lys His His His His His His Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr 1 5 10 15 Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly 20 25 30 Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys 35 40 45 Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys 50 55 60 Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Ser Ser <210> 8 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-6 <400> 8 Ile Ala Ala Leu Cys Gly Ile Val Lys Ser Ile Asp Ser Asp Asp Ser 1 5 10 15 Asp Tyr Asp Tyr Lys Gly Arg Gly Tyr Cys Thr Asn Lys Gly Cys Arg 20 25 30 Ser Gly Tyr Asn Tyr Phe Gly Asn Lys Gly Tyr Cys Lys Tyr Gly Glu 35 40 45 Lys Ser Tyr Thr Tyr Asn Cys Asn Ser Tyr Ala Gly Cys Cys Leu Pro 50 55 60 Arg Asn Pro Tyr Gly Lys Leu Lys Tyr Tyr Cys Thr Asn Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Cys Pro Asn Asn Tyr Tyr Phe Tyr Asn Asn Lys Gly Tyr Tyr Tyr Leu 85 90 95 Glu His His His His His His 100 <210> 9 <211> 199 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-151 <400> 9 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Trp Ser Ser 50 55 60 Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His 65 70 75 80 Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly 85 90 95 Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser 100 105 110 Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly 115 120 125 Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 130 135 140 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 145 150 155 160 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 165 170 175 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 180 185 190 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Leu 195 <210> 10 <211> 171 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-131 <400> 10 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Trp Ala Asp 50 55 60 Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly Asn 65 70 75 80 Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn Asn 85 90 95 Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Gly Ser Ala Lys 100 105 110 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 115 120 125 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 130 135 140 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 145 150 155 160 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Leu 165 170 <210> 11 <211> 175 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-353 <400> 11 Pro Trp Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr 1 5 10 15 Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys 20 25 30 Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 Pro Trp Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr 50 55 60 Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly 65 70 75 80 Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys 85 90 95 Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr 100 105 110 His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ala 115 120 125 Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly 130 135 140 Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn 145 150 155 160 Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Gly Ser 165 170 175 <210> 12 <211> 187 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-153 <400> 12 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Trp Ser Ser 50 55 60 Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His 65 70 75 80 Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly 85 90 95 Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser 100 105 110 Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly 115 120 125 Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ala Asp Tyr Tyr Gly 130 135 140 Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg 145 150 155 160 Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys 165 170 175 Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Gly Ser 180 185 <210> 13 <211> 187 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-351 <400> 13 Pro Trp Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr 1 5 10 15 Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys 20 25 30 Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 Pro Trp Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr 50 55 60 Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly 65 70 75 80 Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys 85 90 95 Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr 100 105 110 His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ala 115 120 125 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 130 135 140 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro 145 150 155 160 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 165 170 175 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 180 185 <210> 14 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-1 variant <400> 14 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 50 55 60 <210> 15 <211> 196 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-151 variant <400> 15 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu 50 55 60 Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly 65 70 75 80 Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr 85 90 95 Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys 100 105 110 Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys 115 120 125 Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 130 135 140 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 165 170 175 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 180 185 190 Pro Thr Tyr Lys 195 <210> 16 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mgfp-5 <400> 16 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His 1 5 10 15 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser 65 70 75

Claims (20)

  1. 홍합접착단백질; 및
    폴리아크릴산 및 폴리메타크릴산 중 적어도 하나를 포함하고;
    상기 홍합접착단백질은 상기 폴리아크릴산 및 폴리메타크릴산 중 적어도 하나와 아마이드 결합으로 연결되며,
    삼차원 그물구조를 갖는 것인, 생체접착용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 홍합접착단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 생체접착용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    홍합접착단백질은 티로신 잔기가 카테콜 화합물로 변환된 것; 홍합접착단백질의 표면에 카테콜 유도체가 도입된 것; 또는 이들 모두를 포함하는 것인, 생체접착용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    카테콜 화합물은 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA), 도파 o-퀴논(Dopa o-quinone), 토파(2,4,5-trihydroxyphenylalanine, TOPA), 토파 퀴논(Topa quinone) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것인, 생체접착용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 생체접착용 조성물은,
    상기 홍합접착단백질 및 폴리아크릴산이 아마이드 결합된 것인 제1 성분, 또는 상기 홍합접착단백질 및 폴리메타크릴산이 아마이드 결합된 것인 제2 성분, 또는 상기 제1 성분과 제2 성분이 혼합된 것인, 생체접착용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    제1 성분 또는 제2 성분은,
    홍합접착단백질 대 폴리아크릴산 또는 폴리메타크릴산이 1 : 1 내지 5의 질량비로 포함되는 것인, 생체접착용 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    제1 성분 또는 제2 성분은,
    홍합접착단백질 대 폴리아크릴산 또는 폴리메타크릴산이 1 : 2.5 내지 3.5의 질량비로 포함되는 것인, 생체접착용 조성물.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 제1 성분 : 제2 성분은 3 : 1 내지 1:3 의 질량비로 혼합되는 것인, 생체정착용 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 생체접착용 조성물은 건조 상태에서는 비접착성 및 비분해성이며, 젖은 상태에서는 접착성 및 생분해성을 나타내는 것인, 생체접착용 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    생체접착용 조성물은 필름, 단면 또는 양면 테이프, 또는 하이드로겔인, 생체접착용 조성물.
  11. (a) 홍합접착단백질을 포함하는 용액에 아크릴산 N-하이드로숙신이미드 에스터 및 메타크릴 무수물 중 적어도 하나를 포함하는 용액을 혼합한 혼합용액 제조 단계;
    (b) 상기 혼합용액에 광개시제를 용해시키는 단계;
    (c) 상기 혼합용액에 아크릴산 단량체 및 메타크릴산 단량체 중 적어도 하나를 첨가하는 단계; 및
    (d) 상기 혼합용액을 경화시키는 단계;를 포함하는 생체접착용 조성물의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 생체접착용 조성물의 제조방법은,
    (a-1) 홍합접착단백질을 포함하는 용액에 아크릴산 N-하이드로숙신이미드 에스터를 포함하는 용액을 혼합한 제1 혼합용액 및 홍합접착단백질을 포함하는 용액에 메타크릴 무수물을 포함하는 용액을 혼합한 제2 혼합용액을 각각 제조하는 단계;
    (b-1) 상기 제1 혼합용액 및 제2 혼합용액 각각에 광개시제를 용해시키는 단계;
    (c-1) 상기 제1 혼합용액에 아크릴산 단량체를 첨가하고, 상기 제2 혼합용액에 메타크릴산 단량체를 첨가하는 단계; 및
    (d-1) 상기 제1 혼합용액 및 제2 혼합용액을 혼합한 후 경화시키는 단계;를 포함하는 생체접착용 조성물의 제조방법.
  13. 제11항에 있어서,
    광개시제는 α-케토글루타르산인, 생체접착용 조성물의 제조방법.
  14. 제11항에 있어서,
    홍합접착단백질은 혼합용액 전체 중량을 기준으로 7 내지 15 중량%로 포함되는 것인, 생체접착용 조성물의 제조방법.
  15. 제11항에 있어서,
    아크릴산 N-하이드로숙신이미드 에스터 및 메타크릴 무수물 중 적어도 하나는 혼합용액 전체 중량을 기준으로 0.6 내지 2.0 중량%로 포함되는 것인, 생체접착용 조성물의 제조방법.
  16. 제11항에 있어서,
    광개시제는 혼합용액 전체 중량을 기준으로 0.1 내지 0.4 중량%로 포함되는 것인, 생체접착용 조성물의 제조방법.
  17. 제12항에 있어서,
    상기 (d-1) 단계는,
    상기 제1 혼합용액: 제2 혼합용액을 3 : 1 내지 1:3 의 질량비로 혼합하는 단계인 것인, 생체접착용 조성물의 제조방법.
  18. 제11항에 있어서,
    상기 생체접착용 조성물은 건조 상태에서는 비접착성 및 비분해성이며, 젖은 상태에서는 접착성 및 생분해성을 나타내는 것인, 생체접착용 조성물의 제조방법.
  19. 제11항에 있어서,
    상기 홍합접착단백질은 티로신 잔기가 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA), 도파 o-퀴논(Dopa o-quinone), 토파(2,4,5-trihydroxyphenylalanine, TOPA), 토파 퀴논(Topa quinone) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 카테콜 화합물로 변환된 것인, 생체접착용 조성물의 제조방법.
  20. 제11항에 있어서,
    상기 홍합접착단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 생체접착용 조성물의 제조방법.
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