KR101096902B1 - 당뇨병 치료용 알기네이트-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐 및 이의 제조방법 - Google Patents

당뇨병 치료용 알기네이트-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 당뇨병 치료용 알기네이트-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 췌도 미세캡슐은 이종 췌도를 알긴산 나트륨으로 캡슐화한 후 외막을 항염증 작용을 갖는 키토산으로 코팅하여 면역장벽을 형성함으로써, 알긴산 나트륨에 의해 발생되는 염증성 면역세포들의 침착을 억제하여 이종이식에서 나타나는 면역거부 반응에서 이종 췌도세포를 보호할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 알기네이트-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐은 당뇨병 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

당뇨병 치료용 알기네이트-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐 및 이의 제조방법 {Islet microcapsule of alginate-chitosan bilayer for treating diabetes mellitus and process for preparing the same}
본 발명은 당뇨병 치료용 알기네이트-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
당뇨병은 췌장소도(췌도)에서 분비되는 호르몬인 인슐린이 부족하거나 없을 경우에 발생하는 병으로, 크게 인슐린 의존형인 제 1형 당뇨병과 인슐린 비의존형인 제 2형 당뇨병으로 나뉠 수 있다.
제 1형 당뇨병은 대개 30~40세 이전의 젊거나 어린 연령층에서 갑작스럽게 발생하고, 심한 체중감소, 의식장애 등을 호소하게 된다. 환자들은 대부분 마른 체형을 갖고 있으며, 당뇨병성 급성 합병증의 일종인 당뇨병성 케톤산혈증이 발생되기 쉽다. 또한, 제 1형 당뇨병은 췌장에서 인슐린이 거의 만들어지지 않아서 인슐린을 사용하지 않는 경우 생명의 위험을 초래하게 되므로, 반드시 인슐린의 사용과 더불어 식사조절, 적절한 운동으로 치료해야 한다.
제 2형 당뇨병은 주로 40세 이후에 많이 발생하고, 췌장의 인슐린 분비능력 이 정상보다 감소되어 있거나 인슐린 분비는 정상이지만 비만 등의 이유로 인슐린의 작용이 저하되어 나타난다. 제 2형 당뇨병은 임상증상이 뚜렷하지 않은 경우가 많으며, 초기에는 인슐린 분비의 감소에 앞서서 인슐린 저항성의 증가로 인하여 대사 장애가 나타나고, 특수한 경우 이외에는 당뇨병성 케톤산혈증을 일으키지 않는 것이 특징이다. 따라서, 초기에 식사와 운동요법에 의하여 체중을 감량하면 당뇨병이 호전되는 경우가 많다.
제 1형 당뇨병은 현재의 치료방법으로는 완치를 기대할 수 없는 만성 질환으로 일단 발생하면 일생 동안 철저한 자가관리가 필요하고, 거의 정상에 가까운 혈당조절만이 당뇨병성 만성 합병증을 예방할 수 있다. 그러나, 현재의 치료법인 인슐린 주사요법과 함께 운동요법 및 식이요법으로는 완치가 불가능하고 합병증의 위험이 여전히 존재하는 등 한계가 있다. 또한 제 1형 당뇨병 환자의 일부에서는 반복적인 저혈당 발생과 저혈당 인지능 부족으로 철저한 혈당 조절이 불가능하다. 제 2형 당뇨병 역시 최종적으로는 제 1형 당뇨병 환자와 같이 인슐린 주사요법을 수행하여야 한다. 따라서 당뇨병 환자에게서 정상에 가까운 혈당을 유지시킬 수 있는 가장 근본적이고 이상적인 치료방법으로는 인슐린의 분비가 생리적으로 조절되는 췌장 혹은 췌도 이식이라고 할 수 있다.
따라서, 최근에는 췌장 이식 및 췌도 이식을 통한 당뇨병 치료가 많이 시행되고 있다. 그러나, 췌장 이식의 경우 공여자의 절대 부족, 높은 수술 합병증, 지속적인 면역억제제의 투여를 비롯한 이식 후 관리의 어려움 등의 문제점이 있으며, 췌도 이식은 췌장 이식과 달리 비교적 간편한 수술로 합병증 없이 쉽게 이식이 가 능하며, 췌도세포에 대한 수술 전 면역조절 등을 통해 면역관용(immune tolerance)을 유발하여 면역억제제 사용에 따른 부작용의 감소를 기대할 수 있고, 분리된 췌도세포를 체외에서 배양 유지함으로써 가장 적절한 이식수술을 수행할 수 있는 장점이 있다. 그러나, 췌도 이식도 췌장 이식과 마찬가지로 공여자의 절대적 부족으로 인해 이식을 통한 당뇨병 치료에 어려움이 있다.
따라서, 췌도 이식을 통한 당뇨병 치료에 있어서 공여자의 절대적 부족 문제를 해결하기 위하여 베타세포의 시험관 내 증식방법, 성체 줄기세포인 췌관세포의 분화유도, 배아 줄기세포의 분화유도, 태아 췌도세포의 증식방법 등 다양한 인체 췌도세포의 증식방법과 함께 인간 이외의 동물 조직을 이용한 이종이식 (xenotransplantation)이 모색되고 있다.
이종이식의 공급원으로 가장 이상적이라고 알려진 동물은 돼지이다. 이는 돼지의 인슐린이 오랜 기간 인체에 부작용 없이 사용되어온 점을 비롯하여, 돼지의 인슐린 대사가 사람과 유사하고, 식용으로 널리 이용되고 있어 거부감이 적으며, 비교적 다루기가 쉽고, 많은 양의 췌도세포를 가지고 있다는 장점이 있기 때문이다. 따라서, 사람과 유사한 인슐린 대사능력이 있는 베타세포를 가진 돼지의 췌도 세포를 이종이식의 공급원으로 사용할 수 있도록 하는 연구가 세계적으로 진행되고 있다(Wang, T., et al., Successful allotransplantation of encapsulated islets in pancreatectomized canines for diabetic management without the use of immunosuppression. Transplantation, 2008. 85(3): p. 331-7; Elliott, R.B., et al., Live encapsulated porcine islets from a type 1 diabetic patient 9.5 yr after xenotransplantation. Xenotransplantation, 2007. 14(2): p. 157-61; Lijun Bai, Kathrin Maedler, Marc Donath and Bernard E. Tuch, Expression of Fas but not Fas ligand on fetal pig β cells. Xenotransplantation, 2004. 11: p. 426435).
그러나, 돼지의 췌도세포를 이용한 이종이식의 상기와 같은 장점에도 불구하고, 돼지의 췌도세포를 이식한 후 빠른 면역거부 반응이 나타나 이식한 돼지 췌도는 물론 수혜자의 건강에도 악영향을 줄 수 있다. 또한, 면역억제제를 사용하더라도 이러한 근본적인 조직적합 반응의 불일치에 의해 면역거부 반응이 나타나게 되며 면역억제제의 부작용도 심각하게 나타날 수 있다.
상기와 같은 면역억제를 극복하기 위하여, 돼지 췌도를 수혜자의 면역 체계에서 격리시키는 방법이 구상되었으며, 이의 구체적인 예로는 면역장벽(immune barrier)을 형성하는 것이고, 이의 대표적인 예로는 알긴산 캡슐이 있다.
알긴산 캡슐은 췌도를 알긴산 나트륨으로 캡슐화한 것으로 1981년에 최초로 시도되었다. 알긴산 나트륨은 갈조류에서 추출되는 물질로서, β-1,4-D-만누론산 (mannuronic acid)과 β-1,4-L-글루쿠론산(glucuronic acid)으로 구성되는 중합체로 생체적합성이 뛰어난 물질이며, 갈조류에서 추출된 물질을 정제 가공하여 순도를 높인 것을 사용한다. 하지만 정제된 순수 알긴산 나트륨에는 내인성 독소가 존재하고 있어 염증작용을 유발하는 단점이 있다. 순수 알긴산 나트륨은 Al2+을 제외한 2가 양이온(Ca2+, Ba2+)과 강하게 결합하여 고형화되는 성질이 있다. 대표적으로 Ca2+을 많이 사용하고 있다. Ca2+을 이용하면 견고함이 작기 때문에 폴리-L-리신을 외부에 한번 더 코팅하는 방법도 제시되어 사용되고 있다(Aileen King, Evaluation of Alginate Microcapsules for Use in Transplantation Of Islets of Langerhans. ACTA Universitatis Upsaliensis, 2001.). 그러나, 폴리-L-리신은 사이토카인 분비를 촉진하는 부작용이 있기 때문에 결국 캡슐 내부의 췌도가 사이토카인에 의해 파괴된다(Juste, S., et al., Effect of poly-L-lysine coating on macrophage activation by alginate-based microcapsules: assessment using a new in vitro method. J Biomed Mater Res A, 2005. 72(4): p. 389-98; Ronn, S.G., et al., Suppressor of cytokine signalling-3 expression inhibits cytokine-mediated destruction of primary mouse and rat pancreatic islets and delays allograft rejection. Diabetologia, 2008. 51(10): p. 1873-82; Aiba, S. and T.L. Creazzo, Comparison of the number of dihydropyridine receptors with the number of functional L-type calcium channels in embryonic heart. Circ Res, 1993. 72(2): p. 396-402.). 또한, Ba2+을 이용한 알긴산 나트륨 캡슐은 견고하기 때문에 폴리-L-리신을 필요로 하지 않는다. 그러나, Ba2+은 Ca2+보다 독성이 강하기 때문에 사용에 주의가 필요하다.
면역장벽의 형성, 즉 췌도를 알긴산 나트륨으로 캡슐화하는 경우 인슐린과 산소, 포도당 등의 저분자들은 쉽게 통과되지만 면역글로불린과 같은 고분자들은 통과되지 않아서 면역작용으로부터 공격 가능성이 획기적으로 줄어들게 됨으로 이 종 췌도 이식에 좋은 방법이지만, 알긴산 나트륨 캡슐 역시 재료 자체의 내인성 독소로 인해 대식세포(macrophage)나 단핵구(monocyte) 등의 면역세포들의 침착이 발생하게 된다. 또한, 알긴산 나트륨 캡슐 외막에 폴리-L-리신을 한번 더 코팅하여 6개월 이상의 장기간 동안 생체 내에 존재할 경우 대식세포와 보조 T 세포(helper T cell; CD4+ T cell), 단핵구들이 캡슐 외막에 침착하여 사이토카인과 보체를 분비하거나, 두텁게 침착되어 캡슐 내부와 외부간의 원활한 산소 및 영양분의 이동이 차단되어 캡슐 내부의 췌도에 심각한 손상을 초래하게 된다. 또한, 사이토카인 등은 저분자로서 자유롭게 캡슐 내부로 이동할 수 있으므로 캡슐 내부에 있는 췌도 세포의 사멸이 유도될 수 있다(Kobayashi, T., et al., Immune mechanisms associated with the rejection of encapsulated neonatal porcine islet xenografts. Xenotransplantation, 2006. 13(6): p. 547-59; de Groot, M., et al., Macrophage overgrowth affects neighboring nonovergrown encapsulated islets. J Surg Res, 2003. 115(2): p. 235-41; Lacy, P.E., et al., Maintenance of normoglycemia in diabetic mice by subcutaneous xenografts of encapsulated islets. Science, 1991. 254(5039): p. 1782-4.).
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 다양한 물질들을 이용하여 캡슐을 형성하거나 기존의 알긴산 나트륨의 외막에 다른 막을 코팅하는 등의 방법들이 다양하게 제시되어 왔다(Chandy, T., D.L. Mooradian, and G.H. Rao, Evaluation of modified alginate-chitosan-polyethylene glycol microcapsules for cell encapsulation. Artif Organs, 1999. 23(10): p. 894-903; Calafiore, R., et al., Standard technical procedures for microencapsulation of human islets for graft into nonimmunosuppressed patients with type 1 diabetes mellitus. Transplant Proc, 2006. 38(4): p. 1156-7; Safley, S.A., et al., Inhibition of cellular immune responses to encapsulated porcine islet xenografts by simultaneous blockade of two different costimulatory pathways. Transplantation, 2005. 79(4): p. 409-18.). 그러나, 아직까지 알긴산 나트륨에 의해 발생되는 염증성 면역세포들의 침착을 해결하지 못하고 있다.
한편, 키토산은 갑각류에서 추출되는 다당류로서, 질소가 포함되어 있으며, 물에 녹지 않는 키틴으로 최초로 존재한다. 키틴을 용해성으로 만들기 위하여 산에 반응시키게 되면 용해성을 가진 키토산이 된다. 키토산은 키틴이 20% 내외로 존재하며, 정제 및 분리가 극히 어려워 그대로 사용한다. 또한, 키토산은 pH 4.5 이하에서 녹으며, 다수의 양성 전하를 가지고 있어 음성 전하를 가진 물질과 강하게 결합하려는 특성이 있으며, 염증작용을 완화시키는 작용을 가지고 있다. 따라서, 음성 전하를 가진 물질과 강하게 결합하려는 특성과 항염증 작용을 갖는 키토산을, 알긴산 나트륨 캡슐 외막에 코팅하면 알긴산 나트륨에 의해 발생되는 염증성 면역세포들의 침착을 억제할 수 있을 것으로 생각된다.
그러나, 아직까지 알긴산 나트륨 캡슐 외막에 키토산을 코팅하여 염증성 면역세포들의 침착을 억제하기 위한 방법이나 이에 대한 연구는 전무한 상태이다.
따라서, 이종 췌도를 알긴산 나트륨으로 캡슐화한 후, 캡슐 외막에 키토산을 코팅하여 캡슐을 제조하고, 이 캡슐을 이용하여 이종이식하면 당뇨병 치료에 효과 적일 것으로 기대된다. 따라서, 알기네이트-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐에 대한 개발 및 연구의 필요성이 요구되고 있다.
본 발명자들은 대식세포와 단핵구 등의 염증성 면역세포가 알기네이트 췌도 미세캡슐 외막에 침착되는 것을 억제하기 위하여 연구하던 중, 이종 췌도를 알긴산 나트륨으로 캡슐화한 후, 캡슐 외막에 항염증 작용을 갖는 키토산을 코팅하여 알기네이트-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐을 제조하였으며, 상기 제조된 췌도 미세캡슐의 외막에 염증성 면역세포의 침착이 현저히 감소됨을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 당뇨병 치료용 알기네이트-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 당뇨병 치료용 알기네이트-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 췌도 공급원으로부터 췌도를 분리하는 단계,
2) 상기 분리한 췌도를 알긴산 나트륨 용액에 희석시키고, 이를 BaCl2 용액에 적하하여 캡슐을 형성하는 단계, 및
3) 상기 형성된 캡슐 외막에 키토산을 pH 4.5에서 코팅하는 단계를 포함하 는, 당뇨병 치료용 알기네이트-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 당뇨병 치료용 알기네이트-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐은 이종 췌도를 알긴산 나트륨으로 캡슐화한 후 외막을 항염증 작용을 갖는 키토산으로 코팅하여 면역장벽을 형성한 것을 특징으로 한다.
상기 이종 췌도는 성체 돼지로부터 분리된 췌도가 바람직하다.
본 발명에 따른 알기네이트-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐의 제조방법을 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.
상기 1)단계는 췌도 공급원으로부터 췌도를 분리하는 단계로, 췌도 공급원은 성체 돼지가 바람직하다. 이는 돼지의 인슐린 대사능력이 사람과 유사하고, 식용으로 널리 이용되고 있어 거부감이 적으며, 비교적 다루기가 쉽고, 많은 양의 췌도세포를 가지고 있기 때문이다. 성체 돼지로부터 분리한 췌도는 10% FBS를 함유한 RPMI 1640 배양액에서 1일 동안 배양한다.
상기 2)단계는 분리한 췌도를 알긴산 나트륨으로 캡슐화하는 단계로, 상기 1)단계에서 분리한 췌도를 알긴산 나트륨 용액 1㎖당 1000~100000개로 희석하여 5cc 주사기에 넣는다. 5cc 주사기를 주사기 펌프에 장착한 후 미세방울 제조기와 연결한다. 미세방울 제조기의 옆면에 준비된 공기 주입구로 이산화탄소 주입관을 연결시켜, 주사기 펌프를 15~25㎖/hr 속도로 밀어넣으면서 이산화탄소를 5~10kgf/ ㎠ 압력으로 주입한다. 알긴산 나트륨과 희석된 췌도 세포를 10mM BaCl2 용액에 적하하여 구형 캡슐을 형성한다. 형성된 캡슐을 HBSS 용액으로 세척한 후, 10% FBS를 함유한 D-MEM 배양액에서 37℃, 5% CO2 환경 하에서 하루 동안 배양한다.
상기 3)단계는 캡슐 외막에 키토산을 코팅하는 단계로, 상기 췌도를 포함한 알긴산 나트륨 캡슐을 1% 키토산 용액에 넣고 pH 4.5에서 코팅하여 키토산이 코팅된 알긴산 나트륨 캡슐을 제조한다. 상기 제조된 알기네이트-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐을 HBSS 용액으로 세척한 후 10% FBS를 함유한 RPMI 1640 배양액에서 1주일 동안 배양한다.
상기 방법으로 제조된 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐의 경우 캡슐 내부에서 췌도 생존율은 이상이 없으며, 외부자극에 의해 정상적으로 인슐린을 분비한다. 또한, 상기 제조된 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐을 당뇨병이 유발된 마우스의 복강 내에 이식한 후, 혈당변화를 측정한 결과 정상 혈당을 유지하며, 이식한 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐을 수거하여 관찰한 결과 캡슐 외막에 염증성 면역세포의 침착이 현저히 감소된다.
따라서, 본 발명에 따른 알기네이트-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐은 미세캡슐 외막에 염증성 면역세포의 침착을 효과적으로 억제하여 이종이식에서 나타나는 면역거부 반응에서 이종 췌도세포를 보호함으로써, 당뇨병 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 알기네이트-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐 내 췌도의 농도 는 1000~100000 IEq/㎖인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 알기네이트-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐은 당뇨병 치료를 필요로 하는 환자에게 이식할 수 있으며, 이식 부위로는 복강, 피하, 근육내, 내부장기, 장기 동맥/정맥의 혈관질, 뇌-척수액 또는 림프액 등이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 알기네이트-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐은 면역억제제 또는 항염증제와 조합하여 당뇨병 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 상기 면역억제제는 시클로스포린(cyclosporine), 시롤리무스(sirolimus), 라파마이신(rapamycin) 및 오르타크롤리무스(ortacrolimus)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 항염증제는 아스피린, 이부프로펜, 스테로이드 및 비스테로이성 항염증제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 면역억제제 또는 항염증제는 알기네이트-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐의 이식 후 6개월 동안, 바람직하게는 1개월 동안 투여되는 것이 좋다.
본 발명에 따른 알기네이트-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐을 수여자에게 이식하기 위해서는, 이식되는 췌도 미세캡슐의 양이 5,000~20,000 IEq/㎏(수여자의 체중)가 바람직하며, 공여자의 성별 및 췌장 상태, 수여자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 랫트 췌도 미세캡슐
1. 랫트로부터 췌도 세포의 분리
평균 200g의 SD-랫트 수컷들을 럼푼 케타민 혼합액을 이용하여 마취하였다. 랫트의 복강을 열어서 십이지장에 연결된 췌도관을 묶고, 간과 연결되는 췌도관을 절개한 후 폴리에틸렌-50(PE-50) 관을 절개된 틈에 연결하였다. 준비한 Media 199 1㎖당 콜라게나제 P 1㎎을 용해시킨 용액 8~9㎖를 PE-50을 통해 췌장으로 넣었다. 췌장을 분리하여 37℃ 수조에서 60rpm으로 25분간 흔들며 진탕하여 소화시켰다. 10% FBS(fetal bovine serum)를 함유한 Media 199로 3번 세척한 후, 500㎛의 구멍크기를 가진 체로 여과하여 일정크기 이상의 췌장 조직을 제거하였다. 췌도의 순도를 높이기 위하여 분리배지(Histopaque 1077)로 밀도차를 이용한 분리방법으로 췌도를 순수 분리하였다. 분리한 췌도는 10% FBS를 함유한 Media 199로 세척하면서 췌도 수량을 측정하였다. 그 다음 10% FBS를 함유한 RPMI 1640 배양액에서 1일 동안 배양하였다.
2. 췌도를 알긴산 나트륨으로 캡슐화
알긴산 나트륨을 KRH(krebs-ringer-hepes) 완충액에 2%의 농도로 녹인 후 Hepa 여과기로 여과시켰다. 상기 1에서 분리한 췌도 세포를 알긴산 나트륨 용액 1㎖당 1000개로 희석을 하여 5cc 주사기에 넣었다. 5cc 주사기를 주사기 펌프에 장착한 후 미세방울 제조기와 연결하였다. 미세방울 제조기의 옆면에 준비된 공기 주입구로 이산화탄소 주입관을 연결시켰다. 주사기 펌프를 20㎖/hr 속도로 밀어넣으 면서 이산화탄소를 6.0kgf/㎠ 압력으로 주입하였다. 알긴산 나트륨과 희석된 췌도 세포를 자기 교반기 위에 올려진 10mM BaCl2 용액에 적하하고 10분간 교반시키면 빠르게 고형화되면서 구형 캡슐이 형성되었다. 형성된 캡슐을 HBSS(Hank's balanced salt solution) 용액으로 2~3번 세척한 후, 10% FBS를 함유한 D-MEM 배양액에서 37℃, 5% CO2 환경 하에서 하루 동안 배양하였다.
3. 알긴산 나트륨 캡슐 외막에 키토산 코팅
상기 2에서 제조된 췌도를 포함한 알긴산 나트륨 캡슐을 pH 4.5에서 1% 키토산 용액에 넣고 10분 동안 교반하면서 배양하였다. 10분 후 키토산이 코팅된 알긴산 나트륨 캡슐을 HBSS 용액으로 세척한 후 10% FBS를 함유한 RPMI 1640 배양액에서 1주일 동안 배양하였다.
실시예 2 : 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 성체 돼지 췌도 미세캡슐
1. 성체 돼지로부터 췌도 세포의 분리
도축장에서 적출된 성체 돼지 장기를 식염수로 세척하였다. 췌장을 둘러싼 장간막을 가위로 잘라 췌장이 나오도록 하였다. 췌장 주변 손질을 마친 후 적당히 80g 내외로 췌장을 절제하였다. 절제한 췌장의 도관에 혈관 카테터를 넣은 후 20~40㎖ 장기보존액(HTK solution; histidine-tryptophan-ketoglutarate solution)을 넣은 후 4℃로 보관하면서 실험실로 옮겼다. 실험실로 옮겨온 췌장을 베타딘 용액과 항생제 용액에 각각 넣은 후 D-PBS(dulbecco's phosphate buffer solution)로 세척하였다. 췌장 도관에 연결된 카테터를 통해 2g/㎖의 콜라게나제 P 100㎖를 주입하였다. 주입 후 췌장을 4~8 등분한 후 리코르디 챔버(ricordi chamber)에 넣고, 35℃를 유지시키면서 리코르디 챔버를 서서히 흔들었다. 5~15분 사이로 소화시킨 후 4% BSA(Bovine serum albumin)를 함유한 M199를 챔버에 주입하고, 챔버 내부를 4~10℃로 유지시키면서 소화된 췌장 세포들을 250㎖ conical tube에 모은 후 2% BSA를 함유한 M199로 3번 세척하였다. 세척된 췌장 세포들을 비중 1.108의 Ficoll 용액 200㎖에 넣은 후 cobe bag에 넣었다. 1200rpm으로 cobe bag을 회전시키면서 비중 1.100과 1.060을 gradient maker beaker에서 서서히 섞으면서 넣었다. 마지막으로 HBSS 용액 100㎖를 넣은 후 5분 동안 2200rpm으로 회전시켰다. 5분후 cobe bag에서 용액들을 35㎖씩 50㎖ conical tube에 각각 받은 후, 각 튜브에서 세포들을 추출하여 DTZ(dithizone)으로 염색하였다. 각 튜브 세포 시료마다의 췌도 분포를 확인한 후, 30% 이상되는 튜브만 모아서 세척하고, 10% FBS를 함유한 RPMI 1640 배양액에서 1일 동안 배양하였다.
2. 췌도를 알긴산 나트륨으로 캡슐화
상기 1에서 분리한 췌도 세포를 알긴산 나트륨 용액 1㎖당 10000 IEq 농도로 희석한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1의 2와 동일한 방법으로 알긴산 나트륨 캡슐을 제조하였다.
3. 알긴산 나트륨 캡슐 외막에 키토산 코팅
상기 2에서 제조된 췌도를 포함한 알긴산 나트륨 캡슐을 이용하여 상기 실시예 1의 3과 동일한 방법으로 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐을 제조 하였다.
상기 실시예 1 및 2에서 제조한 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐의 제조과정은 도 1에 나타내었으며, 이들 미세캡슐의 물리적인 형태 및 특징은 주사전자현미경으로 관찰하여 도 2에 나타내었고, 이들 미세캡슐의 구멍 크기는 공초점 현미경으로 관찰하여 도 3에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐은 키토산으로 코팅되었음을 확인하였다.
또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐은 70kDa, 150kDa, 250kDa의 분자량을 지닌 FITC가 결합된 덱스트란의 캡슐 내부로의 이동이 없음을 확인하였다. 이는 면역작용에 중추적인 분자인 면역글로불린 G가 150kDa으로 캡슐 내부로 이동되지 않음을 시사한다.
비교예 1 : 랫트 췌도를 포함한 알긴산 나트륨 미세캡슐
상기 실시예 1에서 키토산 코팅 과정은 수행하지 않고, 랫트로부터 췌도를 분리하고, 분리된 췌도를 알긴산 나트륨으로 캡슐화하는 단계까지만 동일하게 수행하여 알긴산 나트륨 췌도 미세캡슐을 제조하였다.
비교예 2 : 성체 돼지 췌도를 포함한 알긴산 나트륨 미세캡슐
상기 실시예 2에서 키토산 코팅 과정은 수행하지 않고, 성체 돼지로부터 췌 도를 분리하고, 분리된 췌도를 알긴산 나트륨으로 캡슐화하는 단계까지만 동일하게 수행하여 알긴산 나트륨 췌도 미세캡슐을 제조하였다.
실험예 1 : 본 발명에 따른 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐 내의 췌도 생존율 측정(in vitro)
본 발명에 따른 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐 내의 췌도 생존율을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
상기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 췌도 미세캡슐을 제조 당일부터 14일 동안 일부 채취하여 AO/PI(acridine orange/propidium iodide)를 처리한 후, 미세캡슐 내의 췌도 생존율을 확인하였다. 대조군으로는 캡슐화하지 않은 랫트 췌도를 사용하였다.
결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 알긴산 나트륨 췌도 미세캡슐과 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐 내의 췌도 생존율은 캡슐화하지 않은 랫트 췌도에 비해 7일째까지 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. 그러나 14일째에는 캡슐화하지 않은 랫트 췌도와 거의 차이가 없음을 확인하였다.
실험예 2 : 본 발명에 따른 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐 내의 인슐린 분비능 측정(in vitro)
본 발명에 따른 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐 내의 인슐린 분비능을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1. 랫트 췌도 미세캡슐의 인슐린 분비능 측정
상기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 췌도 미세캡슐을 IEq 20개에 2.8mM 및 16.8mM의 포도당을 처리한 후, 인슐린 분비능을 측정하였다. 대조군으로는 캡슐화하지 않은 랫트 췌도를 사용하였다.
결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 캡슐화하지 않은 랫트 췌도, 알긴산 나트륨 췌도 미세캡슐 및 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐 모두 정상적으로 외부 자극에 의해 인슐린을 분비함을 확인하였다.
2. 성체 돼지 미세캡슐의 인슐린 분비능 측정
상기 실시예 2 및 비교예 2에서 제조한 췌도 미세캡슐의 인슐린 분비능을 상기 1과 동일한 방법으로 하여 측정하였다.
결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 알긴산 나트륨 췌도 미세캡슐 및 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐 모두 정상적으로 외부 자극에 의해 인슐린을 분비함을 확인하였다.
실험예 3 : 본 발명에 따른 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐이 혈당변화에 미치는 영향(in vivo)
본 발명에 따른 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐이 혈당변화에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
Balb/c 수컷 마우스에 180㎎/㎏의 스트렙토조토신을 복강주사하여 당뇨병을 유발시켰다. 당뇨병이 유발된 Balb/c 마우스를 마취시킨 다음, 복강을 1㎝ 크기로 절개하였다. 절개한 부위를 통해 상기 실시예 1~2 및 비교예 1~2에서 제조한 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐을 각각 500 IEq로 주입하여 이식하고, 절개 부위를 봉합하였다. 이식 후, 오전 9~10시 사이에 이식된 마우스의 꼬리에서 말초혈액을 수거하여 혈당기를 이용하여 혈당을 측정하였다. 대조군으로는 캡슐화하지 않은 랫트 췌도 또는 성체 돼지 췌도를 신장에 이식한 후 혈당을 측정하였다.
알긴산 나트륨-키토산 이중막의 랫트 췌도 미세캡슐을 당뇨병이 유발된 Balb/c 마우스의 복강에 이식한 후의 혈당변화는 도 7에 나타내었으며, 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 성체 돼지 췌도 미세캡슐을 당뇨병이 유발된 Balb/c 마우스의 복강에 이식한 후의 혈당변화는 도 8에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 캡슐화하지 않은 랫트 췌도를 이식한 경우 이식 후 3일부터 혈당이 급격히 올랐으나, 알긴산 나트륨 췌도 미세캡슐 및 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐을 이식한 경우에는 오랜기간 정상 혈당을 유지하는 것을 관찰하였다.
또한 도 8에 나타난 바와 같이, 캡슐화하지 않은 성체 돼지 췌도를 이식한 경우 이식 후 2일부터 혈당이 급격히 올랐으나, 알긴산 나트륨 췌도 미세캡슐 및 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐을 이식한 경우에는 오랜기간 정상 혈당을 유지하는 것을 관찰하였다.
실험예 4 : 이식한 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐을 수거하여 췌도 분석 : DTZ 염색
당뇨병이 유발된 마우스의 복강에 이식한 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐을 수거하여 캡슐 내의 베타세포의 존재 및 수거한 캡슐의 염증성 면역세포의 침착정도를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
상기 실시예 1~2 및 비교예 1~2에서 제조한 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐을 Balb/c 수컷 마우스의 복강에 이식한 후 28일, 56일, 189일 또는 혈당치가 다시 상승할 시 마우스의 복강을 절개하여 37℃의 생리식염수를 넣은 후에 다시 빼는 방법을 반복하여 이식한 미세캡슐을 수거하였다. 상기 수거한 췌도 미세캡슐을 베타세포에만 특이적으로 염색되는 DTZ 용액으로 염색한 후 관찰하여, 인슐린을 분비하는 베타세포의 존재를 1차적으로 확인하였다. 또한, 상기 수거한 췌도 미세캡슐의 염증성 면역세포의 침착 정도를 각각 캡슐마다 개수로 확인하였다.
수거한 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 랫트 췌도 미세캡슐을 DTZ 용액으로 염색하여 미세캡슐 외막에 침착된 염증성 면역세포와 미세캡슐 내부의 췌도가 염색된 것을 관찰한 결과는 도 9에 나타내었고, 염증성 면역세포가 침착되지 않은 깨끗한 미세캡슐의 수량은 도 10에 나타내었다. 또한, 수거한 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 성체 돼지 췌도 미세캡슐을 DTZ 용액으로 염색하여 미세캡슐 외막에 침착된 염증성 면역세포와 미세캡슐 내부의 췌도가 염색된 것을 관찰한 결과는 도 11에 나 타내었고, 염증성 면역세포가 침착되지 않은 깨끗한 미세캡슐의 수량은 도 12에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 수거된 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 랫트 췌도 미세캡슐은 염증세포가 침착된 것과 침착되지 않은 것이 관찰되었다(9-A). 또한, 염증세포가 침착되지 않은 캡슐 내부의 췌도는 이식 후 장기간이 지나면 일부가 사멸되는 것이 관찰되었고(9-B), 염증세포가 침착된 캡슐 내부의 췌도는 일부만 DTZ로 염색되었음을 확인하였다(9-C). 또한 도 10에 나타난 바와 같이, 수거된 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 랫트 췌도 미세캡슐의 염증세포 침착율은 알긴산 나트륨 랫트 췌도 미세캡슐과 비교하여 유의하게 차이(P<0.05)가 있음을 확인하였지만, 모두 20% 이하의 캡슐에서만 염증세포가 침착되었다.
도 11에 나타난 바와 같이, 수거된 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 성체 돼지 췌도 미세캡슐은 염증세포가 적게 침착되었고, 미세캡슐 내부의 췌도는 대부분 DTZ로 염색됨을 관찰하였다(11-A 및 11-C). 반면, 수거된 알긴산 나트륨 성체 돼지 췌도 미세캡슐은 대부분 염증세포가 침착되었고, 미세캡슐 내부의 췌도는 대부분 DTZ로 염색됨을 관찰하였다(11-B 및 11-D). 또한 도 12에 나타난 바와 같이, 수거된 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 성체 돼지 췌도 미세캡슐의 염증세포 침착율은 알긴산 나트륨 성체 돼지 췌도 미세캡슐과 비교하여 유의하게 차이(P<0.01)가 있음을 확인하였고, 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 성체 돼지 췌도 미세캡슐은 60% 이상이 침착되지 않은 반면, 알긴산 나트륨 성체 돼지 췌도 미세캡슐은 5% 미만만 침착되지 않았다.
실험예 5 : 수거된 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐의 염증세포의 침착 정도 확인
수거된 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 성체 돼지 췌도 미세캡슐에 염증세포의 침착 정도를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1. 인슐린 형광면역염색
수거된 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 성체 돼지 췌도 미세캡슐을 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액으로 고정한 후 파라핀 포매하고, 5~10㎛ 크기로 잘랐다. 절편에서 파라핀을 제거한 후 물을 다시 넣은 다음, 기니피그가 호스트인 인슐린 항체를 1:100의 비율로 희석한 용액을 조직 절편에 뿌린 후 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 1x PBS로 충분히 세척한 후 로다민(rhodamin)이 붙은 항 기니피그 항체를 2차 항체로 하여 염색하였다.
2. 마이크로파지 형광면역염색
절편에서 파라핀을 제거한 후 물을 다시 넣은 다음 랫트가 호스트인 마이크로파지 항체를 1:100의 비율로 희석한 용액을 조직 절편에 뿌린 후 10시간 동안 4℃에서 배양하였다. 1x PBS로 충분히 세척한 후 Alexa 526(yellow) 형광이 붙은 2 차 항체를 이용하여 염색하였다.
3. Masson Trichrome 염색
절편에서 파라핀을 제거한 후 물을 다시 넣은 다음 Weigert's iron hematoxylin을 첨부하고 실온에서 10분간 배양하였다. 물로 충분히 세척한 후, Biebrich scarlet acid fuchsin 용액에 절편을 넣고 20~30분 동안 실온에서 배양하였다. 물로 세척한 후 5% 수용성 텅스토인산(aqueous phosphotungstic acid)에서 3분 동안 실온에서 배양한 후, 1% 빙초산에서 3분 동안 실온에서 배양하였다. 그 다음 light green 용액에서 10분 동안 실온에서 배양하여 염색하였다.
결과는 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, 수거된 알긴산 나트륨 성체 돼지 췌도 미세캡슐 (13-A)과 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 성체 돼지 췌도 미세캡슐(13-E)을 인슐린 형광면역염색한 결과 둘다 캡슐 내부의 췌도세포가 염색됨을 확인하였다(붉은색). 그러나, 알긴산 나트륨 성체 돼지 췌도 미세캡슐 외막에는 염증세포가 침착되었으나(파란색)(13-A), 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 성체 돼지 췌도 미세캡슐에서는 염증세포가 침착되지 않음을 확인하였다(13-E).
또한, 마이크로파지 형광면역염색 결과는 알긴산 나트륨 성체 돼지 췌도 미세캡슐 외막에 침착된 염증세포가 마이크로파지 항체에 염색됨을 확인하였다(노란색)(13-B).
또한, Masson Trichrome 염색 결과는 알긴산 나트륨 성체 돼지 췌도 미세캡슐 외막에 침착된 염증세포가 푸른색(콜라겐)으로 염색된 것을 확인하였다(13-C 및 13-D).
따라서, 본 발명에 따른 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐은 염증성 면역세포들의 침착을 효과적으로 억제하여 이종이식에서 나타나는 면역거부 반응에서 이종 췌도세포를 보호할 수 있다.
본 발명에 따른 췌도 미세캡슐은 이종 췌도를 알긴산 나트륨으로 캡슐화한 후 외막을 키토산으로 코팅하여 면역장벽을 형성함으로써, 알긴산 나트륨에 의해 발생되는 염증성 면역세포들의 침착을 억제하여 이종이식에서 나타나는 면역거부 반응에서 이종 췌도세포를 보호할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 알기네이트-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐은 당뇨병 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐의 제조과정을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐을 주사전자현미경으로 관찰한 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐을 공초점 현미경으로 관찰한 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐 내의 췌도 생존율을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 랫트 췌도 미세캡슐 내의 인슐린 분비능을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 성체 돼지 췌도 미세캡슐 내의 인슐린 분비능을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 랫트 췌도 미세캡슐을 당뇨병이 유발된 Balb/c 마우스의 복강에 이식한 후의 혈당변화를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명에 따른 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 성체 돼지 췌도 미세캡슐을 당뇨병이 유발된 Balb/c 마우스의 복강에 이식한 후의 혈당변화를 나타낸 도이다.
도 9는 수거한 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 랫트 췌도 미세캡슐을 DTZ 용 액으로 염색하여 미세캡슐 외막에 침착된 염증성 면역세포와 미세캡슐 내부의 췌도가 염색된 것을 나타낸 도이다.
도 10은 수거한 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 랫트 췌도 미세캡슐을 DTZ 용액으로 염색하여 염증성 면역세포가 침착되지 않은 깨끗한 미세캡슐의 수량을 나타낸 도이다.
도 11은 수거한 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 성체 돼지 췌도 미세캡슐을 DTZ 용액으로 염색하여 미세캡슐 외막에 침착된 염증성 면역세포와 미세캡슐 내부의 췌도가 염색된 것을 나타낸 도이다.
도 12는 수거한 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 성체 돼지 췌도 미세캡슐을 DTZ 용액으로 염색하여 염증성 면역세포가 침착되지 않은 깨끗한 미세캡슐의 수량을 나타낸 도이다.
도 13은 수거된 알긴산 나트륨-키토산 이중막의 성체 돼지 췌도 미세캡슐에 염증세포 침착 정도를 형광면역염색하여 관찰한 도이다.

Claims (6)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 1) 성체 돼지로부터 췌도를 분리하는 단계,
    2) 상기 분리한 췌도를 알긴산 나트륨 용액 1㎖당 1000~100000개로 알긴산 나트륨 용액에 희석시키고, 이를 BaCl2 용액에 적하하여 알긴산 캡슐을 형성하는 단계, 및
    3) 상기 형성된 알긴산 캡슐 외막에 키토산을 pH 4.5에서 코팅하는 단계를 포함하는, 당뇨병 치료용 알기네이트-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐의 제조방법.
  5. 삭제
  6. 제 4항의 방법에 의해 제조된 당뇨병 치료용 알기네이트-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐.
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