DE69719798T2

DE69719798T2 - Periphäre verabreichung von glp-1 analogen und derivate zur reguleirung der fettleibigkeit

Info

Publication number: DE69719798T2
Application number: DE69719798T
Authority: DE
Inventors: D. Richard DiMARCHI; Suad Efendic
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1996-11-05
Filing date: 1997-11-04
Publication date: 2004-02-12
Anticipated expiration: 2017-11-05
Also published as: PT946191E; HUP0003314A2; WO1998019698A1; UA65549C2; US20040018975A1; NZ335995A; MY129220A; CA2271169C; US6191102B1; DK0946191T3; DE69719798D1; ATE234112T1; US6583111B1; ES2194224T3; AU5245798A; NO992557D0; EP0946191A1; HUP0003314A3; AU734042B2; IL129852A0

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Verwendung des Glucagon-ähnlichen Peptids 1 (GLP-1), Analoga und Derivate von GLP-1 in Verfahren und Zusammensetzungen, insbesondere pharmazeutischen Formulierungen, die den Gewichtsverlust fördern.
Fettsucht und speziell Fettsucht des oberen Körpers ist die häufigste Ernährungsstörurg bei den überernährten Populationen in der Welt. Mehrere Studien zeigen, daß die Verringerung des Körpergewichts das Risiko für chronische Erkrankungen dramatisch reduziert, wie Diabetes, Bluthochdruck, Hyperlipidämie, koronare Herzerkraukung und Skelettmuskelerkrankungen. Beispielsweise sind verschiedene Meßgrößen für Fettsucht, einschließlich einfachem Körpergewicht, Taille-zu-Hüfte Verhältnisse und mesenteres Fettdepot stark mit dem Risiko für einen nicht-Insulin-abhängigen Diabetes (NIDDM) korreliert, der auch als Typ II Diabetes bekannt ist. Gemäß der American Diabetes Association (1995) sind etwa 80% der NIDDM Patienten übergewichtig. Die Gewichtsreduktion ist ein spezifisches Ziel der medizinischen Behandlung von vielen chronischen Erkrankungen, einschließlich NIDDM.
Derzeitige Verfahren zur Förderung des Gewichtsverlusts sind nicht vollkmmen zufriedenstellend. Einige fettleibige Patienten können durch eine bewußte Verhaltensänderung, wie Veränderung der Nahrung und vermehrte Bewegung Gewicht verlieren. Das Versagen, einen Gewichtsverlust durch diese Verfahren zu erreichen, kann auf genetischen Faktoren beruhen, die einen erhöhten Appetit, eine Bevorzugung für sehr fetthaltige Nahrung oder eine Tendenz für einen lipogenen Metabolismus verursachen. Unglücklicherweise werden etwa 33 Milliarden Dollar pro Jahr für gewichtsreduzierende Maßnahmen ausgegeben, die Großteils sinnlos sind. Daher werden neue Verfahren und Zusammensetzungen, wie pharmazeutische Mittel die den Gewichtsverlust fördern, dringend benötigt, um die alten Ansätze zu komplementieren.
Von Glucagon-ähnlichem Peptid 1 (GLP-1) ist bekannt, daß es eine entscheidende Rolle bei der Regulation der physiologischen Reaktion auf die Nahrungsaufnahme spielt. GLP-1 wird nach der Aufnahme einer Nahrung aus Proglucagon prozessiert und in das Blut aus den endokrinen L-Zellen freigesetzt, die hauptsächlich im distalen Dünndarm und Dickdarm liegen (Nilsson et al., 1991, Krcymann et al., 1987, Mojsov et al., 1986). GLP-1 wirkt durch einen G-Protein gekuppelten Zellobertlächenrezeptor (GLP-1R) und erhöht die durch Nahrung induzierte Insulinsynthese (Fehmann et al., 1992) und Insulinfreisetzung (Fehmann et al., 1995). GLP-1 stimuliert die Insulinsekretion (insulinotrope Wirkung) und cAMP Bildung (Mojsov et al., 1992). GLP-1-(7–36)-Ainid stimuliert die Insulinfreisetzung, verringert die Glucagonsekretion und hemmt die Magensaftsekretion und Magenentleerung (Nauck, 1993, Gutniak et al., 1992). Diese gastrointestinalen Wirkungen von GLP-1 werden bei vagotomierten Individuen nicht gefunden, was auf einen zentral vermittelten Effekt deutet (Orkov et al., 1995). GLP-1 bindet mit hoher Affinität an isolierte Rattenadipozyten, aktiviert die cAMP Bildung (Valverde et al., 1993) und stimuliert die Lipogenese (Oben et al., 1991) oder die Lipolyse (Ruiz-Grande et al., 1992). GLP-1 stimuliert die Glycogensynthese, Glucoseoxidation und Lactatbildung im Rattenskelettmuskel (Villanueva et al., 1994).
m-RNA, die für den Pankreas-GLP-1-Rezeptortyp kodiert, findet sich in relativ hohen Mengen in Pankreasinselzellen, Lungen, Hypothalamus und Magen der Ratte (Billock et al., 1996). Interessanterweise wurde trotz des Wissens, daß sowohl GLP-1 als auch GLP-1 Rezeptoren im Hypothalamus gefunden werden (Krcymann et al., 1989, Kanse et al., 1988) keine zentrale Rolle für GLP-1 bestimmt bis ein kürzlicher Bericht beschrieb, daß GLP-1, welches über den intracerebroventrikulären Weg (ICV) verabreicht wird, die Nahrungsaufnahme bei Ratten nach einem Fasten deutlich hemmt (Turton et al., 1996). Der gleiche Bericht zeigt, daß nach einer ICV Verabreichung von GLP-1, c-fos, ein Marker der neuronalen Aktivierung ausschließlich im paraventrikulären Kern des Hypothalamus und im zentralen Kern der Amygdala auftritt, zwei Regionen des Gehirns mit einer primären Bedeutung bei der Regulation der Nahrungsaufnahme (Morley, 1987). ICV GLP-1 verringert auch signifikant die Nahrungsaufnahme nach einer Injektion des starken Nahrungsaufnahnestimulans Neuropeptid Y bei Tieren, die Futter zur freien Verfügung haben (Turton et al., 1996). Ein anschließender Bericht zeigt, daß GLP-1, das zentral oder peripher verabreicht wird, bei der Kontrolle der Körpertemperaturregulation beteiligt ist, aber die Nahrungsaufnahme nach einer akuten intraperitonealen Verabreichung bei Ratten nicht beeinflußt (O-Shea et al., 1996). Ein vor kurzem erschienener Artikel berichtet, daß laterale, ventrikuläre Injektionen von GLP-1 in satten Ratten eine extensive Stimulierung von Fos-ir im paraventrikulären Nukleus und parvocellulären zentralen Nukleus der Amygdala induzieren, was Turton et al. unterstützt (Rowland et al., 1996). Zusätzlich beschreiben diese Forscher eine starke Aktivierung von anderen Zentren, die bei der Regulation der Nahrungsaufnahme beteiligt sind, einschließlich des unmittelbar frühen Genproteinprodukts im Nukleus des Tractus solitarius, dein pontinen lateralen parabrachialen Nukleus, dem Basalnukleus der Striaenden und der Area postrema. GLP-1 Rezeptoren, die für peripheres GLP-1 zugänglich sind, finden sich bei der Ratte im subfornicalen Organ und in der Area postrema (Orskov et al., 1996).
Turton et al., (1996) erwähnt spezifisch, daß die Wirkungen von GLP-1 auf das Körpergewicht und die Nahrungsaufnahme nur durch die Verabreichung von GLP-1 direkt im Cerebroventriculum verursacht werden und daß die intraperitoneale Verabreichung von GLP-1, sogar bei relativ hohen Dosen, die Nahrungsaufnahme am Frühabend nicht beeinflußt und daß GLP-1 Fragmente inaktiv sind, wenn sie peripher verabreicht werden, wobei er Suzuki et al., 1989 zitiert. Solche Behauptungen schwächen die Verwendung von GLP-1 als Zusammensetzung (pharmazeutisches Mittel) zur Verringerung des Körpergewichts, da zentrale Wege, wie der ICV Weg, nicht zur Behandlung von Fettsucht bei Menschen möglich sind. Die physiologischen Effekte von GLP-1, die oben dokumentiert wurden, haben beispielsweise die nützliche Verwendung zur Behandlung von Diabetes und Fettsucht durch die Transplantation von rekombinanten Zellinien nahegelegt, die GLP-1 oder GLP oder GLP-1 Rezeptoren kodieren (WO 96/25487).
Eine weitere Veröffentlichung schwächte die Verwendung von GLP-1 durch die Interpretation des Stands der Technik, daß eine "periphere Verabreichung von GLP-1 keinen Effekt auf das Nahrungsaufnaluneverhalten hat". (WO 97/31943, Seite 3). Diese Veröffentlichung berichtete auch einen Effekt von GLP-2 auf die Nahrungsaufnahme, wenn es peripher verabreicht wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Verfahren und Zusammensetzungen, insbesondere pharmazeutische Formulierungen und Medikamente, die Glucagon-ähnliche Peptid-1-Analoga, Derivate und aktive Peptide hiervon enthalten, sind bei der Verringerung des Körpergewichts und bei der Behandlung von Fettsucht wirksam. Die Definition der Fettsucht variiert mit der geographischen Lage, dem klinischen Fokus und den sozialen Vorlieben. Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind jedoch für jedes Individuum geeignet, bei dem eine Gewichtsreduktion erwünscht ist. Die Erfindung ist nicht auf die Verwendung bei beispielsweise diabetischen Patienten beschränkt. Die periphere Verabreichung von GLP-1-(7-36)-Amid an diese dicken Patienten verursacht ziemlich überraschend und im Gegensatz zu den Schlußfolgerungen von Turton et al. (1996) eine signifikante Verringerung des Körpergewichts. Daher ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Verringerung des Körpergewichts, das die Herstellung einer Zusammensetzung mit einer Glucagon-ähnlichen Peptid 1 Verbindung und die Verabreichung an einen Patien ten umfaßt. Geeignete Glucagon-ähnliche Peptid 1 Verbindungen umfassen GLP-1, GLP-1 Analoga, GLP-1 Derivate, Agonisten des GLP-1 Rezeptors, Agonisten der GLP-1 Signaltransduktionskaskade, Verbindungen, die die Synthese von endogenem GLP-1 stimulieren, Verbindungen, die die Freisetzung von endogenem GLP-1 stimulieren und pharmazeutisch annehmbare Salze hiervoh. Es wird eine pharmazeutisch wirksame Dosis verabreicht, das heißt eine Dosis, die zur Verringerung des Körpergewichts ausreichend ist.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Verfahren und Zusammensetzungen, insbesondere Medikamente (pharmazeutische Zusammensetzungen oder Formulierungen) mittels Glucagon-ähnlichem Peptid 1, Analoga oder Derivate hiervon sind zur Verringerung des Körpergewichts und zur Behandlung von Fettsucht wirksam. Analoga und Derivate von GLP-1, die für die Ausführung der Erfindung brauchbar sind, sind die mit einer erhöhten Halbwertszeit im Vergleich zu GLP-1 und der Fähigkeit, einen Gewichtsverlust zu bewirken, wenn sie einem Individuum über einen Zeitraum verabreicht werden.
Verbindungen
GLP-1 Analoga, Derivate, Varianten, Vorläufer und Homologe sind alle für die Ausführung der Erfindung brauchbar, solange das aktive Fragment, das den Gewichtsverlust bewirkt, enthalten ist.
"GLP-1" meint GLP-1 (7–37). Im Stand der Technik wurde der Aminoterminus von GLP-1 (7–37) mit der Nummer 7 und der Carboxyterminus mit der Nummer 37 bezeichnet. Die Aminosäuresequenz von GLP-1 (7–37) ist in der Technik gut bekannt, ist aber im folgenden für die Bequemlichkeit des Lesers angegeben:
Ein "GLP-1 Analogon" ist als Molekül mit einer Modifikation im Vergleich zu GLP-1 definiert, einschließlich einer oder mehrerer Substitutionen, Deletionen, Inversionen oder Anfügungen von Aminosäuren. GLP-1 Analoga, die in der Technik bekannt sind, umfassen beispielsweise GLP-1 (7–34) und GLP-1 (7–35), GLP-1 (7–36), Val⁸-GLP-1 (7–37), Gln⁹-GLP-1 (7–37), D-Gln⁹-GLP-1 (7–37), Thr¹ ⁶-Lys¹⁸-GLP-1 (7–37) und Lys¹ ⁸-GLP-1 (7–37). Bevorzugte GLP-1 Analoga sind GLP-1 (7–34) und GLP-1 (7–35), die in US 5 118 666 A beschrieben sind und auch GLP-1 (7–36). Diese Verbindungen sind die biologisch prozessierten Formen von GLP-1 mit insulinotropen Eigenschaften. Andere GLP-1 Analoga sind in US 5 545 618 A beschrieben.
Ein "GLP-1 Derivat" wird als Molekül mit der Aminosäuresequenz von GLP-1 oder eines GLP-1 Analogons definiert, das aber zusätzlich mindestens eine chemische Modifikation von einer oder mehrerer der Aminosäureseitenketten, α-Kohlenstoffatomen, der terminalen Aminogruppe oder der terminalen Carbonsäuregruppe aufweist. Eine chemische Modifikation umfaßt die Anfügung von chemischen Resten, die Erzeugung neuer Bindungen und die Entfernung von chemischen Resten. Modifikationen an Aminosäureseitenketten umfassen eine Acylierung der Lysin ε-Aminogruppen, N-Alkylierung von Arginin, Histidin oder Lysin, Alkylierung von Carboxylgruppen von Glutaminsäure oder Asparaginsäure und eine Deaminierung von Glutamin oder Asparagin. Modifikationen der terminalen Aminogruppe umfassen Desamino-, N-Niederalkyl, N-Diniederalkyl- und N-Acylmodifikationen. Modifikationen der terminalen Carboxygruppe umfassen die Amid-, Niederalkylamid-, Dialkylamid- und Niederalkylestermodifikationen. Ein Niederalkyl ist ein C₁-C₄ Alkyl. Ferner können eine oder mehrere Seitengruppen oder Endgruppen durch Schutzgruppen geschützt werden, die dem Fachmann der Proteinchemie bekannt sind. Der α-Kohlenstoff einer Aminosäure kann mono- oder dimethyliert sein.
In der vorliegenden Erfindung besteht eine bevorzugte Gruppe an GLP-1 Analoga und Derivaten zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung aus den verschiedenen GLP-1 Molekülen, die in US 5 545 618 A beansprucht werden. Wirksame Analoga der aktiven GLP-1 Peptide 7–34, 7–35, 7–36 und 7–37 haben Aminosäuresubstitutionen an den Positionen 7–10 und/oder sind am C-Terminus verkürzt und/oder enthalten verschiedene andere Aminosäuresubstitutionen im Basispeptid. Analoga mit D-Aminosäuresubstitutionen an den Positionen 7 und 8 und/oder N-alkylierte oder N-acylierte Aminosäuren an der Position 7 sind gegenüber einem Abbau in vivo besonders resistent.
Die Analoga der Erfindung in US 5 545 618 A , die erhöhte Insulinstimulierungseigenschaften aufweisen, haben die Sequenz von nativem GLP-1, 7–34, 7–35, 7–36 oder 7–37 oder dem C-terminalen Amid hiervon mit mindestens einer Modifikation, ausgewählt aus

(a) Substitution des Lysins an Position 26 und/oder 34 durch eine neutrale Aminosäure, Arginin oder eine D-Form von Lysin und/oder des Arginins an der Position 36 durch eine neutrale Aminosäure, Lysin oder eine D-Form von Arginin,
(b) Substitution des Tryptophans an Position 31 durch eine oxidationsresistente Aminosäure,
(c) Substitution gemäß mindestens einem der folgenden Y für V an der Position 16, K für S an der Position 18, D für E an der Position 21, S für G an der Position 22, R für Q an der Position 23, R für A an der Position 24, und Q für K an der Position 26, (Unter Verwendung des Einbuchstabencodes für Aminosäuren)
(d) Substitution gemäß einer der folgenden eine alternative kleine, neutrale Aminosäure für A an der Position 8, eine alternative saure Aminosäure oder neutrale Aminosäure für E an der Position 9, eine alternative neutrale Aminosäure für G an der Position 10, und eine alternative saure Aminosäure für D an der Position 15, und
(e) Substitution des Histidins an der Position 7 durch eine alternative neutrale Aminosäure oder die D- oder Nacylierte oder N-alkylierte Form von Histidin.

In Bezug auf die Modifikationen (a), (b), (d) und (e) können die Substitutionsaminosäuren in der D-Form vorliegen. Die Substitutionsaminosäuren an der Position 7 können auch in N-acylierten oder N-alkylierten Formen vorliegen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung US 5 545 618 A Peptide, die eine erhöhte Abbauresistenz im Plasma im Vergleich zu GLP-1 (7–37) zeigen. Bei diesen Analoga sind jede der oben erwähnten verkürzten Formen von GLP-1 (7–34) bis GLP-1 (7–37) oder ihre C-terminal amidierten Formen modifiziert durch

(a) Substitution des H an der Position 7 dwch eine neutrale D- oder saure D-Aminosäure, oder
(b) Substitution des A an der Position 8 durch eine D-Aminosäure, oder
(c) beides, oder
(d) Substitution des H an der Position 7 durch eine N-acylierte oder N-alkylierte Form einer natürlich vorkommenden Aminosäure.

Daher umfassen Analoga, die gegenüber einem Abbau resistent sind, (N-Acyl (1–6C) AA)⁷ GLP-1 (7–37) und (N-Alkyl (1–6C AA)⁷ GLP-1-(7–37), worin gilt, wenn AA für einen Lysylrest steht, dann können einer oder beide Stickstoffe alkyliert oder acyliert sein, wobei AA für jeden Aminosäurerest steht, der mit der Erhaltung der Insulin-stimulierenden Aktivität verbunden ist.
Für D-Aminosäuresubstitutionen an den Positionen 7 und 8 kann der D-Rest jeder sauren oder neutralen Aminosäure an der Position 7 und jeder Aminosäure an der Position 8 verwendet werden, der ebenfalls mit der Insulin-stimulierenden Aktivität konsistent ist. Es kann entweder eine oder beide Positionen von 7 und 8 durch eine D-Aminosäure substituiert werden, wobei die D-Aminosäure an der Position 7 auch acyliert oder alkyliert werden kann. Diese modifizierten Formen sind nicht nur auf GLP-1 (7–37) anwendbar, sondern auch auf stärker verkürzte Analoga.
Daher befinden sich unter den bevorzugten Analoga der US 5 545 618 A jene, worin die (7–34), (7–35) oder (7–37) Form von GLP-1 nur durch die Substitution des Lysins an der Position 26 und/oder 34 dwch eine neutrale Aminosäure, Arginin oder der D-Form von Lysin und/oder des Arginins an der Position 36 durch eine neutrale Aminosäure, Lysin oder die D-Form von Arginin modifiziert wurde (Abschnitt (a)). Besonders bevorzugt sind die, worin die für Lysin an der Position 26 und 34 substituierte Aminosäure aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus K⁺, G, S, A, L, I, Q, R, R⁺ und M und die für Arginin an der Position 36 ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus K, K⁺, G, S, A, L, I, Q, M und R⁺ (worin ⁺ eine D-Form anzeigt).
Ebenfalls bevorzugt sind Analoga, worin die einzige Modifikation die Substitution des Tryptophans an der Position 31 dwch eine oxidationsresistente Aminosäure ist. Besonders bevorzugte Substitutionen sind ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus F, V, L, I, A und Y.
Ebenfalls bevorzugt sind die Analoga, worin die einzige Modifikation zumindest eine der in Abschnitt (c) aufgeführten Substitutionen ist. Besonders bevorzugt sind die Analoga, worin die kombinierten Substitutionen von G durch S an der Position 22, von Q und A jeweils an den Positionen 23 und 24 durch R und K an der Position 26 durch Q ausgeführt wurden oder die Substitutionen von V dwch Y an der Position 16 und S durch K an der Position 18 ausgeführt wurden oder diese Substitutionen plus D anstelle von E an der Position 21 ausgeführt wurden.
Ebenfalls bevorzugt sind Analoga, worin die einzigen Modifikationen die sind, welche in Abschnitt (d) aufgeführt sind. Besonders bevorzugt unter diesen sind jene, worin die kleine, neutrale Aminosäure, die anstelle von Alanin an der Position 8 substituiert wurde, aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus S, S⁺, GC, C⁺, Sar, A⁺, ß-Ala und Aib und/oder die saure oder neutrale Aminosäure, die anstelle von Glutamin an der Position 9 substituiert wurde, aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus E⁺, D, D⁺, Cya T, T⁺, N, N⁺, Q, Q⁺, Cit, MSo und Acetyl-K und/oder die alternative neutrale Aminosäure, die anstelle von Glycin an der Position 10 substituiert wurde, aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus S, S⁺, Y, Y⁺, T, T⁺, N, N⁺, Q, Q⁺, Cit, MSO, Acetyl-K, F und F⁺ besteht und/oder worin D anstelle von E an der Position 15 substituiert wurde.
Ebenfalls bevorzugt sind Analoga, worin nur die Position 7 verändert wurde (Abschnitt (e)). Bevorzugte Substitutionen sind die, worin die anstelle von Histidin an der Position 7 substituierte Aminosäure aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus H⁺, Y, Y⁺, F, F⁺, R, R+, Orn, Orn⁺, M, M⁺, N-Formyl-H, N-Formyl-H⁺, N-Acetyl-H, N-Acetyl-H⁺, N-Isopropyl-H, N-Isopropyl-H⁺, N-Acetyl-K, N-Acetyl-K⁺, P und P⁺.
Ebenfalls bevorzugt sind Ausführungsformen mit einer Kombination von nur zwei der oben angegebenen Klassen an modifizierten Formen zusätzlich zu folgenden spezifischen Ausführungsformen.
Die folgenden spezifischen Analoga werden bevorzugt:
(H⁺)⁷-GLP-1(7–37),
(Y)⁷-GLP-1(7–37),
(N-Acetyl-H)⁷-GLP-1(7–37),
(N-Isopropyl-H)⁷-GLP-1(7–37),
(A⁺)⁸-GLP-1(7–37),
(E⁺)⁹-GLP-1(7–37),
(D)⁹-GLP-1(7–37),
(D⁺)⁹-GLP-1(7–37),
(F⁺)¹⁰-GLP 1(7–37),
(S)²²(R)²³(R)²⁴(Q)²⁶-GLP-1(7–37),
(s)⁸(Q)⁹(Y)¹⁶(K)¹ ⁸(D)²¹-GLP-1(7–37).
Bevorzugte Formen von Analoga mit erhöhter Stabilität haben auch einen oder zumindest zwei Aminosäuremodifikationen.
Bevorzugte Substitutionen für das Histidin an der Position 7 umfassen die D-Formen von sauren oder neutralen Aminosäuren oder die D-Formen von Histidin. Bevorzugt sind P⁺, D⁺, E⁺, N⁺, Q⁺, L⁺, V⁺, I^F und H⁺.
Das Histidin an der Position 7 oder ein Ersatz (D oder L) kann auch N-alkyliert (1–6 C) oder N-acyliert (1–6 C) sein. Alkylgruppen sind gerade oder verzweigtkettige (einschließlich cyclische) Kohlenwasserstoffreste mit der angegebenen Anzahl an Kohlenstoffatomen. Acylgruppen haben die Formel RCO-, worin R für Alkyl steht. Bevorzugte Alkylgruppen sind t-Propyl, α-Propyl und Ethyl, bevorzugte Acyle sind Acetyl und Propionyl Bevorzugte Reste, die alkyliert oder acyliert sein können, umfassen P, D, E, N, Q, V, L, I, K und H entweder in der D- oder L-Form.
Bevorzugte Substitutionen anstelle von Alanin an der Position 8 sind die D-Formen von P, V, L, I und A, wobei auch die D-Formen von D, E, N, Q, K, T, S und H bevorzugt sind.
Einige spezifische Analoga zeigen sowohl eine erhöhte stimulierende Aktivität der Insulinfreisetzung als auch eine erhöhte Stabilität.
Eine bevorzugte Gruppe von GLP-1 Analoga und Derivaten zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung setzt sich aus Molekülen der folgenden Formel zusammen:
R₁-X-Glu-Gly¹⁰-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp¹⁵-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu²⁰-Y-Gly-Gln-Ala-Ala² ⁵-Lys-Z-Phe-Ile-Ala³⁰-Trp-Leu-Val-Lys-Gly³⁵-Arg-R₂ (SEQ ID Nr. 2)
und den pharmazeutisch annehmbaren Salzen hiervon, worin
R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus L-Histidin, D-Histidin, Desaminohistidin, 2-Aminohistidin, ß-Hydroxyhistidin, Homohistidin, α-Fluormethylhistidin und α-Methylhistidin,
X aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Ala, Gly, Val, Thr, Ile und α-Methyl-Ala,
Y aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Glu, Gln, Ala, Thr, Ser und Gly,
Z aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Glu, Gln, Ala, Thr, Ser und Gly, und
R₂ aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus NH₂ und Gly-OH,
mit der Maßgabe, daß die Verbindung einen isoelektrischen Punkt im Bereich von etwa 6,0 bis etwa 9,0 aufweist und ferner mit der weiteren Maßgabe, daß wenn R₁ für His steht, X für Ala steht, Y für Glu steht und Z für Glu steht, R₂ dann für NH₂ stehen muß.
Es wurden mehrere GLP-1 Analoga und Derivate mit einem isoelektrischen Punkt im Bereich von etwa 6,0 bis etwa 9,0 beschrieben und umfassen beispielsweise
GLP-1 (7–36)NH₂
Gly⁸-GLP-1 (7–36)NH₂
Gln⁹-GLP-1 (7–37)
D-Gln⁹-GLP-1 (7–37)
Acetyl-Lys⁹-GLP-1 (7–37)
Thr⁹-GLP-1 (7–37)
D-Thr⁹-GLP-1 (7–37)
Asn⁹-GLP-1 (7–37)
D-Asn⁹-GLP-1 (7–37)
Ser²²-Arg²³-Arg²⁴-Gln²⁶-GLP-1 (7–37)
Thr¹⁶-Lys¹⁸-GLP-1 (7–37)
Lys¹⁸-GLP-1 (7–37)
Arg²³-GLP-1 (7–37)
Arg²⁴-GLP-1 (7–37)
Eine weitere bevorzugte Gruppe an Wirkstoffen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist in WO 91/11457 (bezugnehmend aus US 5 545 618 ) beschrieben und umfaßt GLP-1 (7–34), GLP-1(7–35), GLP-1 (7–36) oder GLP-1 (7–37) oder die Amidform hiervon und pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon, die mindestens eine Modifikation der im folgenden aufgeführten aufweist:

(a) Substitution des Lysins an Position 26 und/oder Position 34 dwch Glycin, Serin, Cystein, Threonin, Asparagin, Glutamin, Tyrosin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Phenylalanin, Arginin oder D-Lysin oder Substitution des Arginins an der Position 36 durch Glycin, Serin, Cystein, Threonin, Asparagin, Glutamin, Tyrosin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Phenylalanin, Lysin oder D-Arginin,
(b) Substitution des Tryptophans an Position 31 durch eine oxidationsresistente Aminosäwe,
(c) Substitution von mindestens einem aus Tyrosin für Valin an der Position 16, Lysin für Serin an der Position 18, Asparaginsäure für Glutaminsäure an der Position 21, Serin für Glycin an der Position 22, Arginin für Glutamin an der Position 23, Arginin für Alanin an der Position 24, und Glutamin für Lysin an der Position 26, und
(d) Substitution von mindestens einem aus Serin oder Cystein für Alanin an der Position 8, Asparaginsäure, Glycin, Serin, Cystein, Threonin, Asparagin, Glutamin, Tyrosin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin oder Phenylalanin für Glutaminsäure an der Position 9, Serin, Cystein, Threonin, Asparagin, Glutamiin, Tyrosin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin oder Phenylalanin für Glycin an der Position 10, und Glutaminsäure für Asparaginsäure an der Position 15, und
(e) Substitution des Histidins an der Position 7 durch Glycin, Serin, Gestein, Threonin, Asparagin, Glutamin, Tyrosin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin oder Phenylalanin oder der D- oder N-acylierten oder N-alkylierten Form von Histidin, worin gilt, falls die Substitution (a), (b), (d) oder (e) ist, die substituierten Aminosäuren wahlweise in der D-Form vorliegen können und die an der Position 7 substituierten Aminosäuren wahlweise in der N-acylierten oder N-alkylierten Form vorliegen.

Da das Enzym Dipeptidylpeptidase IV (DPP IV) für die beobachtete schnelle in vivo Inaktivierung von verabreichtem GLP-1 verantwortlich sein kann (Mentlein et al., 1993) ist eine Verabreichung von GLP-1 Analoga und Derivaten bevorzugt, die gegenüber der Aktivität der DPP IV geschützt sind und die Verabreichung von Gly⁸-GLP-1 (7–36)NH₂, Val⁸-GLP-1(7–37)OH, α-Methyl-Ala⁸-GLP-1(7–36)NH₂ und Gly⁸-Gln²¹-GLP-1(7-37)OH oder pharmazeutisch annehmbarer Salze hiervon ist bevorzugter.
Die Verwendung eines in US 5 188 666 A beanspruchten Moleküls ist ebenfalls bevorzugt. Ein solches Molekül umfaBt ein Peptid mit einer der folgenden Aminosäuresequenzen
worin X für Lys und Lys-Gly stehen kann oder ein Derivat dieses Peptids und worin das Peptid ein pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz dieses Peptids sein kann, ein pharmazeutisch annehmbares Carboxylatsalz dieses Peptids, ein pharmazeutisch annehmbarer Niederalkylester dieses Peptids oder ein pharmazeutisch annehmbares Amid dieses Peptids, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus Amid, Niederalkylamid und Niederdialkylamid.
Die Erfindung US 5 188 666 A betrifft ein Peptidfragment, das insulinotrop ist und das von einer natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz abgeleitet werden kann.
Die Erfindung umfaßt eine Verbindung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus (A) einem Peptid, das die folgende Sequenz umfaßt worin X aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus

(a) Lys,
(b) Lys-Gly,
(c) Lys-Gly-Arg,
und (B) einem Derivat des Peptids, worin die Verbindung im wesentlichen frei von natürlichen Kontaminanten ist und eine insulinotrope Aktivität von GLP-1 (1–36) oder GLP-1 (1–37) übersteigt.

Die Erfindung umfaßt auch eine Verbindung die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche beateht aus:
worin X aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus

(a) Lys,
(b) Lys-Gly,
(c) Lys-Gly-Arg,
und (B) einem Derivat des Peptids, worin die Verbindung im wesentlichen frei von natürlichen Kontaminanten ist und eine insulinotrope Aktivität bei einer Konzentration von mindestens 10^–10 M aufwies.

Von besonderem Interesse sind Peptide der folgenden Formel:

(1) H₂N-X-CO-R¹ worin R¹ für OH, OM oder -NR²R³ steht, M für ein pharmazeutisch annehmbares Kation oder eine niedere verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppe steht, R² und R³ gleich oder verschieden sind und aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff und einer niederen verzweigten oder unverzweigten Alkylgruppe besteht, X für ein Peptid steht, das die folgende Sequenz umfaßt: NH₂ für die Aminogruppe des Aminoterminus von X steht und CO für die Carboxylgruppe des Carboxyterminus von X steht,
(2) die Säureadditionssalze hiervon, und
(3) die geschützten oder teilweise geschützten Derivate hiervon, worin die Verbindung eine insulinotrope Aktivität aufweist, die die insulinotrope Aktivität von GLP-1(1–36) oder GLP-1(1–37) übersteigt.

Eine weitere bevorzugte Gruppe an Molekülen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung besteht aus Verbindungen, die in US 5 512 549 A beansprucht sind, mit der allgemeinen Formel: und pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon, worin R¹ für 4-Imidazopropionyl, 4-Imidazoacetyl oder 4-Imidazoα,α-dimethylacetyl steht, R² für unverzweigtes C₆-C₁₀ Acyl steht oder fehlt, R³ für Gly-OH oder NH₂ steht und Xaa für Lys oder Arg steht.
Bevorzugtere Verbindungen der SEQ ID Nr. 4 zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind die, worin Xaa für Arg steht und R² für ein unverzweigtes C₆-C₁₀ Acyl steht.
Stark bevorzugte Verbindungen der SEQ ID Nr. 4 zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind die, worin Xaa für Arg steht, R₂ für ein unverzweigtes C₆-C₁₀ Acyl steht und R₃ für Gly-OH steht.
Noch stärker bevorzugte Verbindungen der SEQ ID Nr. 4 zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind die, worin Xaa für Arg steht, R₂ für ein unverzweigtes C₆-C₁₀ Acyl steht, R₃ für Gly-OH steht und R, für 4-Imidazopropionyl steht.
Die am meisten bevorzugte Verbindung von SEQ ID Nr. 4 zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist die, worin Xaa für Arg steht, R² für unverzweigtes C₈ Acyl steht, R³ für Gly-OH steht und R² für 4-Imidazopropionyl steht.
Die Verwendung eines in US 5 120 712 A beanspruchten Moleküls in der vorliegenden Erfindung ist äußerst bevorzugt. Ein solches Molekül umfaßt ein Peptid mit folgender Aminosäuresequenz:
und ein Derivat dieses Peptids, worin dieses Peptid ein pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz dieses Peptids sein kann, ein pharmazeutisch annehmbares Carboxylatsalz dieses Peptids, ein pharmazeutisch annehmbarer Niederalkylester dieses Peptids oder ein pharmazeutisch annehmbares Amid dieses Peptids, worin das Amid ein Amid, Niederalkylamid oder Niederdialkylamid sein kann.
Die Verwendung von GLP-1(7–36)-Amid oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon in der vorliegenden Erfindung ist äußerst bevorzugt. Die Aminosäuresequenz des GLP-1(7–36)-Amids ist
Die Verwendung von Val⁸-GLP-1(7–37)OH oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon ist in der vorliegenden Erfindung am meisten bevorzugt. Die Aminosäuresequenz von Val⁸-GLP-1(7–37)OH ist folgende:
Herstellung der Verbindungen
Verfahren zur Herstellung der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Wirkstoffe, nämlich GLP-1, einem GLP-1 Analogon oder einem GLP-1 Derivat oder jeder verwandten Verbindung einschließlich eines aktiven Fragments, die bei einer peripheren Verabreichung einen Gewichtsverlust bewirken, sind gut bekannt und in US 5 118 66 A , US 5 120 712 A und US 5 523 549 A beschrieben.
Der Aminosäureteil des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Wirkstoffs oder eines Vorläufers hiervon wird hergestellt dwch 1) synthetische Festphasenchemie, 2) Reinigung von GLP Molekülen aus natürlichen Quellen, 3) rekombinanter DNA Technology oder 4) eine Kombination dieser Verfahren.
Chemische Festphasensynthese von Polypeptiden ist in der Technik gut bekannt und kann in allgemeinen Texten im Fachgebiet gefunden werden, wie von Dugas und Penney 1981, Merrifield 1962 und Stewart und Young 1969.
Beispielsweise kann der Aminosäureteil dwch Festphasenverfahren mittels eines 430A Peptidsynthesegeräts (PE-Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404) und Synthesezyklen, die von PE-Applied Biosystems bereitgestellt werden, synthetisiert werden. BOC-Aminosäuren und andere Reagenzien sind im Handel von PE-Applied Biosystems und anderen chemischen Herstellern erhältlich. Sequentielle BOC-Chemie mittels Doppelkupplungsprotokollen werden auf die p-Methylbenzhydrylaminausgangsharze zur Herstellung der C- terminalen Carboxamide angewendet. Zur Herstellung der C-terminalen Säuren wird das entsprechende PAM Harz verwendet. Asn, Gln und Arg werden mittels vorgefertigter Hydroxybenzotriazolester gekuppelt. Die folgenden Seitenkettenschutzgruppen können verwendet werden:
Arg, Tosyl
Asp, Cyclohexyl
Glu, Cyclohexyl
Ser, Benzyl
Thr, Benzyl
Tyr, 4-Bromcarbobenzoxy
Die Abspaltung der BOC-Gruppe kann mit Trifluoressigsäure in Methylenchlorid erreicht werden. Nach der Vervollständigung der Synthese können mit wasserfreiem Fluorwasserstoff (HF), der 10 % meta-Kresol enthält, die Schutzgruppen entfernt und die Peptide vom Harz abgespalten werden. Die Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen und des Peptids vom Harz wird bei –5°C bis 5°C, vorzugsweise auf Eis für 60 Minuten durchgeführt. Nach der Entfernung des HF wird das Peptid/Harz mit Ether gewaschen und das Peptid wird mit Eisessig extrahiert und lyophilisiert.
Techniken, die dem Fachmann der Molekularbiologie gut bekannt sind, können zur Herstellung der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Wirkstoffe verwendet werden. Tatsächlich können rekombinante DNA Verfahren aufgrund einer höheren Ausbeute bevorzugt werden Die grundlegenden Schritte bei der rekombinanten Herstellung umfassen:

a) Isolierung einer natürlichen DNA Sequenz, die für ein GLP-1 Molekül der vorliegenden Erfindung kodiert oder Konstruktion einer synthetischen oder semisynthetischen DNA, die eine Sequenz für das GLP-1 Molekül kodiert,
b) Plazieren der kodierenden Sequenz in einen Expressionsvektor in einer Weise, die zur Expression der Proteine entweder alleine oder als Fusionsproteine geeignet ist,
c) Transformation einer geeigneten eukaryotischen oder prokaryotischen Wirtszelle mit dem Expressionsvektor,
d) Kultivierung der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression eines GLP-1 Moleküls erlauben, und
e) Gewinnung und Reinigung des rekombinant hergestellten GLP-1 Moleküls.

Wie vorher erwähnt können die kodierenden Sequenzen vollkommen synthetisch sein oder das Ergebnis einer Modifizierung der längeren, nativen für Glucagon kodierenden DNA sein. Eine DNA Sequenz, die für Präproglucagon kodiert, ist von Lund et al. 1982 beschrieben und kann als Ausgangsmaterial bei der semisynthetischen Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen durch die Veränderung der nativen Sequenz unter Erlangung der gewünschten Ergebnisse verwendet werden.
Synthetische Gene, deren in vitro oder in vivo Transkription und Translation zur Bildung eines GLP-1 Moleküls führt, können durch Techniken konstruiert werden, die in der Technik gut bekannt sind. Aufgrund der natürlichen Degeneriertheit des genetischen Codes erkennt der Fachmann, daß eine beträchtliche aber definierte Anzahl an DNA Sequenzen konstruiert werden kann, die für die GLP-1 Moleküle der vorliegenden Erfindung kodieren.
Die Methodik der Konstruktion von synthetischen Genen ist in der Technik gut bekannt (Brown et al., 1979). Die DNA Sequenz wird aus der gewünschten Aminosäuresequenz mittels des genetischen Codes entworfen, was leicht durch den Fachmann der Biologie sichergestellt werden kann. Einmal entworfen, kann die Sequenz an sich mittels herkömmlicher DNA Synthesegeräte hergestellt werden, wie den 380A oder 380B DNA Synthesegeräten (PE-Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404).
Um den Aminosäureteil einer in der Erfindung verwendeten Verbindung zu exprimieren, inseriert man die hergestellte synthetische DNA Sequenz in einem von vielen geeigneten rekombinanten DNA Expressionsvektoren durch die Verwendung von geeigneten Restriktionsendonukleasen (Maniatis et al., 1989). Es werden Restriktionsschnittstellen an jedes Ende der für das GLP-1 Molekül kodierenden DNA angebracht, um die Isolierung von und die Integration in in der Technik bekannte Amplifizierungs- und Expressionsvektoren zu erleichtern. Die im einzelnen verwendeten Endonukleasen werden durch das Restriktionsmuster des verwendeten Ausgangsexpressionsvek tors vorgegeben. Die Wahl der Restriktionsschnittstellen erfolgt so, daß die kodierende Sequenz mit den Kontrollsequenzen richtig orientiert wird, um eine im Leserahmen korrekte Ablesung und Expression des Proteins von Interesse zu erreichen. Die kodierende Sequenz muß so positioniert werden, daß sie im richtigen Leserahmen mit dem Promotor und der Ribosomenbindungsstelle des Expressionsvektors liegt, die beide in der Wirtszelle funktionsfähig sind, in der das Protein exprimiert werden soll.
Um eine effiziente Transkription des synthetischen Gens zu erreichen, muß das Gen funktionsfähig mit einer Promotor-Operator Region verbunden sein. Daher muß die Promotor-Operator Region des synthetischen Gens in derselben aufeinanderfolgenden Orientierung in Bezug auf das ATG Startcodon des synthetischen Gens plaziert werden.
Es ist eine Vielzalil an Expressionsvektoren in der Technik gut bekannt, die zur Transformation von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen brauchbar sind (Promega Katalog, 1992, Stratagene Katalog, 1992). Die US 4 710 473 A beschreibt ebenfalls Plasmidtransformationsvektoren aus zirkulärer DNA, die zur Expression von exogenen Genen in E. coli in hohen Mengen brauchbar sind. Diese Plasmide sind als Transformationsvektoren in rekombinanten DNA Verfahren brauchbar und

(a) verleihen dem Plasmid die Fähigkeit zur autonomen Replikation in einer Wirtzelle,
(b) kontrollieren die autonome Plasmidreplikation in Bezug zur Temperatur, bei der die Wirtszellkulturen gehalten werden,
(c) stabilisieren den Erhalt des Plasmids in den Wirtszellpopulationen,
(d) steuern die Synthese eines Proteinprodukts, das den Plasmiderhalt in einer Wirtszellpopulation anzeigt,
(e) liefern eine Reihe von Restriktionsschnittstellen, die in dem Plasmid nur einmal vorkommen, und
(f) beenden die mRNA Transkription.

Diese zirkulären DNA Plasmide sind als Vektoren in rekombinanten DNA Verfahren zur Sicherstellung von hohen Expressionsspiegeln von exogenen Genen brauchbar.
Nach der Konstruktion eines Expressionsvektors für den Aminosäureteil einer in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindung ist der nächste Schritt die Plazierung in eine geeignete Zelle und die Konstruktion einer rekombinanten Wirtszelle hierdurch, die zur Expression des Polypeptids brauchbar ist. Techniken zur Transformation von Zellen mit rekombinanten DNA Vektoren sind in der Technik gut bekannt und können in allgemeinen Literaturen, wie Maniatis et al., siehe obige Literaturstelle gefunden werden. Wirtszellen können entweder aus eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen konstruiert werden.
Prokaryotische Wirtszellen bilden im allgemeinen das Protein mit größeren Geschwindigkeiten und sind leichter zu kultivieren. Proteine, die in hohem Maß in bakteriellen Exressionssystemen exprimiert werden, aggregieren charakteristischerweise in Granula oder Einschlußkörperchen, die hohe Mengen des überexprimierten Proteins enthalten. Solche Proteinaggregate müssen typischerweise mittels in der Technik gut bekannten Verfahren gewonnen, aufgelöst, denaturiert und rückgefaltet werden (Kreuger et al., 1990, US 4 923 967 A ).
Herstellung von GLP-1 Analoga und Derivaten
Veränderungen bei einer Vorläufer GLP-1 oder GLP-1 Aminosäuresequenz unter Bildung des gewünschten GLP-1 Analogons oder GLP-1 Derivats oder eines aktiven Fragments hiervon werden durch gut bekannte Verfahren hergestellt: Chemische Modifikation, enzymatische Modifikation oder eine Kombination aus chemischen und enzymatischen Modifikationen. Die Techniken der klassischen Verfahren in der gelösten Phase und semisynthetische Verfahren können auch zur Herstellung der in der vorliegenden Erfindung verwendeten GLP-1 Moleküle brauchbar sein. Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen GLP-1 Moleküle sind dem Fachmann der Peptidchemie bekannt.
Die Anfügung einer Acylgruppe an die ε-Aminogruppe von Lys³⁴ kann mittels einer großen Vielzahl an in der Technik bekannten Verfahren erreicht werden (Bioconjugate Chem. 1990, Hashimoto et al., 1989). Beispielsweise kann ein N-Hydroxysuccinimidester der Octansäure an das Lysyl-ε-amin mittels 50% Acetonitril, in Boratpuffer angefügt werden. Das Peptid kann entweder vorher oder nach der Anfügung einer Imidazolingruppe acyliert werden. Darüberhinaus ist eine Acylierung or der enzymatischen Spaltung möglich, wenn das Peptid rekombinant hergestellt wird. Das Lysin im GLP-1 Derivat kann acyliert werden, wie dies in WO 96/29342 A beschrieben ist.
Das Vorkommen und die Herstellung einer Vielzal an geschützten, ungeschützten und teilweise geschützten natürlichen und unnatürlichen, funktionellen Analoga und Derivate von GLP-1(7–36)anύd und GLP-1(7–37) Molekülen sind beschrieben worden (LTS 5 120 712 A, US 5 545 618 A und US 5 118 666 A , Orskov et al., 1989, WO 91/11457 A).
Wahlweise können die amino- und carboxyterminalen Aminosäurereste von GLP-1 Derivaten geschützt werden oder es kann wahlweise nur eines der Enden geschützt werden. Die Reaktionen zur Ausbildung und Entfernung solcher Schutzgruppen sind in Arbeiten beschrieben, die dem Fachmann bekannt sind, beispielsweise Protective Groups in Organic Chemistry 1973, Green 1981, Schröder und Lübke, 1965. Repräsentative Aminoschutzgruppen umfassen beispielsweise Formyl, Acetyl, Isopropyl, Butoxycarbonyl, Fluorenylmethoxycarbonyl, Carbobenzyloxy und dergleichen. Repräsentative Carboxyschutzgruppen umfassen beispielsweise Benzylester, Methylester, Ethylester, t-Butylester, p-Nitrophenylester und dergleichen.
Carboxyterminale Niederalkylesterderivate von GLP-1, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden durch die Umsetzung des gewünschten C₁-C₄ Alkanols mit dem gewünschten Polypeptid in Gegenwart einer katalytischen Säure, wie Chlorwasserstoffsäure hergestellt. Geeignete Bedingungen für eine solche Alkylesterbildung umfassen eine Reaktionstemperatur von etwa 50°C und eine Reaktionszeit von etwa 1 Stunde bis etwa 3 Stunden. Ähnlich können Alkylesterderivate der Asp und/oder Glu Reste gebildet werden.
Die Herstellung eines Carboxamidderivats einer in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindung wird beispielsweise gebildet, wie dies in Stewart et al., 1984 beschrieben ist.
Eine pharmazeutisch annehmbare Salzform von GLP-1, einem GLP-1 Analogon oder einem GLP-1 Derivat kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Säuren, die herkömmlich zur Bildung von Säureadditionssalzen verwendet werden, sind anorganische Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Iodwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und dergleichen und organische Säuren, wie p-Toluolsulfonsäure, Methansulfonsäure, Oxalsäure, p-Bromphenylsulfonsäure, Kolilensäure, Bernsteinsäure, Citronensäure, Benzoesäure, Essigsäure und dergleichen. Beispiele für solche Salze umfassen Sulfat, Pyrosulfat, Bisulfat, Sulfat, Bisulfit, Phosphat, Monohydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat, Metaphosphat, Pyrophosphat, Chlorid, Bromid, Iodid, Acetat, Propionat, Decanoat, Caprylat, Acrylat, Formiat, Isobutyrat, Caproat, Heptanoat, Propiolat, Oxalat, Malonat, Succinat, Suberat, Sebacat, Fumarat, Maleat, Butin-1,4-dioat, Hexin-1,6-dioat, Benzoat, Chlorbenzoat, Methylbenzoat, Dinitrobenzoat, Hydroxybenzoat, Methoxybenzoat, Phthalat, Sulfonat, Xylolsulfonat, Phenylacetat, Phenylpropionat, Phenylbutyrat, Citrat, Lactat, γ-Hydroxybutyrat, Glycolat, Tartrat, Methansulfonat, Propansulfonat, Naphthalin-1-sulfonat, Naphthalin-2-sulfonat, Mandelat und dergleichen. Bevorzugte Säureadditionssalze sind die, die mit Mi neralsäuren gebildet werden, wie Chlorwasserstoffsäure und Bromwasserstoffsäure, und speziell Chlorwasserstoffsäure.
Basenadditionssalze umfassen die, welche von anorganischen Basen stammen, wie Ammonium- oder Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxide, -carbonate, -bicarbonate und dergleichen. Solche zur Herstellung der erfindungsgemäßen Salze brauchbaren Basen sind unter anderem Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Kaliumcarbonat und dergleichen. Die Salzformen sind besonders bevorzugt.
Ein in der vorliegenden Erfindung verwendetes GLP-1, GLP-1 Analogon oder GLP-1 Derivat kann mit einem oder mehreren Hilfsstoffen vor der Verwendung in der vorliegenden Erfindung formuliert werden. Beispielsweise kann der in der vorliegenden Erfindung verwendete Wirkstoff mit einem divalenten Metallkation durch bekannte Verfahren komplexiert werden. Solche Metallkationen umfassen beispielsweise Zn²⁺, Mn²⁺, Fe²⁺+, Co²⁺, Cd²⁺, Ni²⁺ und dergleichen.
Zusammensetzungen der Erfindung
Wahlweise kann der in der vorliegenden Erfindung verwendete Wirkstoff mit einem pharmazeutisch annehmbaren Puffer kombiniert werden und der pH kann unter Bildung einer annehmbaren Stabilität und eines zur parenteralen Verabreichung annehmbaren pH Wertes eingestellt werden.
Wahlweise können ein oder mehrere pharmazeutisch annehmbare antimikrobielle Mittel zugegeben werden. Meta-Cresol und Phenol sind bevorzugte pharmazeutisch annehmbare antimikrobielle Mittel. Es können ein oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Salze zur Einstellung der Ionenstärke oder Tonizität zugegeben werden. Es können ein oder mehrere Hilfsstoffe zugegeben werden, um die Isotonizität der Formulierung weiter einzustellen. Glycerin ist ein Beispiel für einen Hilfsstoff zur Einstellung der Isotonizität.
GLP-1 Rezeptoren und die Signaltransduktionskaskade, die durch Ligandenbindung an den GLP-1 Rezeptor ausgelöst wird sind beschrieben in WO 96/25487 A, Thorens, 1992, Thorens et al., 1993 und Widmann et al., 1994. Der GLP-1 Rezeptor ist ein Membranprotein mit sieben Transmembrandomänen, das an heterotrimere G-Proteine gekuppelt ist, die die Aktivierung des Rezeptors durch die Ligandenbindung mit der Bildung von intrazellulären sekundären Botenstoffen verbinden, speziell von cyclischem Adenosimnonophosphat (cAMP). cAMP aktiviert wiederum eine spezifische Proteinkinase, nämlich eine cAMP-abhängige Proteinkinase (Proteinkinase A, PKA). Das Enzym phosphoryliert mehrere Reaktionsschlüsselelemente, die in der Promotorregion von bestimmten Genen vorkommen. In Pankreas-b-Zellen und anderen neuroendokrinen Zellen stimuliert die Phosphorylierung von einigen spezifischen Proteinen des regulierten Sekretionswegs die Peptidsekretion durch die Stimulierung der Exocytose von sekretorischen Granula.
Es ist von verschiedenen Verbindungen bekannt, daß sie die Sekretion von endogenem GLP-1 stimulieren. Beispielsweise verursacht die Exposition von STC-1 Zellen gegenüber bestimmten Sekretionsauslösern, wie dem Adenylatcyclaseaktivator, Forskolin oder dem Proteinkinase C stimulierenden Mittel 12-O-Teteradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) eine signifikante Erhöhung der Freisetzung von GLP-1 (Abello et al., 1994). Von der STC-1 Zellinie, die von einem Intestinaltumor in transgenen Mäusen stammt, die insulinfördernde Onkogene trägt und den STC-1 Zellen ist bekannt, daß sie m-RNA Transkripte von Proglucagon enthalten, aus denen GLP-1 erzeugt wird. Andere Verbindungen, wie Somatostatin, Magensäure-hemmendes Polypeptid, Glucose-abhängiges insulinotropes Peptid, Bombesin, Calcitoningen-verwandtes Peptid, Gastrip-freisetzendes Petid, cholinerge Agonisten, ßadrenerger Agonist, Isoproterenol und der muskarinische, chlolinerge Agonist, Bethanechol verursachen bekannter maßen auch die Freisetzung von endogenem GLP-1 (Plaisancie et al., 1994, Orskov et al., 1986, Brubaker, 1991, Buchan et al., 1987).
Verabreichung der Zusammensetzungen
Die Verabreichung kann auf jeden bekannten Weg erfolgen, der für den Arzt bekanntermaßen wirksam ist, außer daß eine parenterale Verabreichung direkt in das zentrale Nervensystem kein Weg ist, der in dieser Erfindung beschrieben oder beansprucht wird. Eine periphere, parenterale Verabreichung ist bevorzugt. Die parenterale Verabreichung wird herkömmlich in der medizinischen Literatur als Injektion einer Dosisform in den Körper durch eine sterile Spritze oder eine andere mechanische Vorrichtung verstanden, wie einer Infusionspumpe. Zum Zweck der Erfindung umfassen periphere parenterale Wege intravenöse, intramuskuläre, subkutane und intraperitoneale Verabreichungswege. Die intravenösen, intramuskulären und subkutanen Verabreichungswege der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen sind bevorzugter. Intravenöse und subkutane Verabreichungswege der in der Erfindung verwendeten Verbindungen sind noch bevorzugter. Zur parenteralen Verabreichung wird ein erfindungsgemäßer Wirkstoff vorzugsweise mit destilliertem Wasser bei einem geeigneten pH kombiniert.
Bestimmte in der vorliegenden Erfindung zum Gewichtsverlust verwendeten Verbindungen können auch für eine Verabreichung über die oralen, rektalen, nasalen oder unteren Atemwegsrouten zugänglich sein, die nichtparenterale Wege sind. Von diesen nicht-parenteralen Wegen ist die Route über die unteren Atemwege zur Verabreichung der in der Endung verwendeten Peptide bevorzugt. Verschiedene Formulierungen der Peptidverbindungen über die unteren Atemwege sind beschrieben in US 5 284 656 A und US 5 364 838 A . Die WO 96/19197 A beschreibt Aerosolformulierungen von verschiedenen Peptiden, die zur Erhöhung der Absorption der in der Erfindung verwendeten Verbindungen in den unteren Atemwegen geeignet sind. Der orale Verabreichungsweg ist für die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen bevorzugt.
Zusätzliche pharmazeutische Verfahren können zur Kontrolle der Wirkdauer verwendet werden. Präparationen für eine kontrollierte Freisetzung können durch die Verwendung von Polymeren erreicht werden, um den in der vorliegenden Erfindung verwendeten Wirkstoff zu komplexieren oder zu absorbieren. Eine verlängerte Wirkdauer kann durch die Auswahl von geeigneten Makromolekülen erhalten werden, beispielsweise Polyestern, Polyaminosäuren, Polyvinylpyrrolidon, Ethylenvinylacetat, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose oder Protaminsulfat und durch die Auswahl der Konzentration von Makromolekülen, wie auch der Verfahren der Einarbeitung, um die Freisetzung zu verlängern. Ein weiteres mögliches Verfahren zur Verlängerung der Wirkdauer durch kontrolliert freisetzende Präparationen ist die Einarbeitung eines in der vorliegenden Erfindung verwendeten Wirkstoffs in Partikel aus einem polymeren Material, wie Polyestern, Polyaminosäuren, Hydrogelen, Polymilchsäure oder Ethylenvinylacetatcopolymeren. Alternativ dazu ist es anstelle der Einarbeitung der Verbindung in diese polymeren Partikel möglich eine in der vorliegenden Erfindung verwendete Verbindung in Mikrokapseln, die beispielsweise durch Koazervationstechniken oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden, beispielsweise jeweils Hydroxymethylcellulose- oder Gelatinemikrokapseln oder in kolloidalen Arzneimittelabgabesystemen, beispielsweise Liposomen, Albuminmikrokugeln, Mikroemulsionen, Nanopartikel und Nanokapseln oder in Makroemulsionen einzuschließen. Solche Techniken sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences, 1980.
Dosis
Die Dosis von GLP-1, GLP-1 Analoga oder GLP-1 Derivaten oder aktiven Fragmenten, die in einem bestimmten Individuum wirksam ist, um einen Gewichtsverlust zu verursachen, hängt von mehreren Faktoren ab, die unter anderem das Geschlecht des Patienten, das Gewicht und das Alter, die zugrundeliegenden Ursachen für die Fettsucht, den Verabreichungsweg und die Bioverfügbarkeit, die Persistenz der verabreichten Verbindung im Körper, die Formulierung und die Stärke umfassen. Wenn die Verabreichung intermittierend ist, sollte die Dosis pro Verabreichung auch das Intervall zwischen den Dosen und die Bioverfügbarkeit der verabreichten Verbindung berücksichtigen. Wenn die Verabreichung kontinuierlich ist, liegt eine geeignete Dosisate zwischen 0,25 und 6 pmol/kg Körpergewicht pro Minute, vorzugsweise von etwa 0,5 bis etwa 1,2 pmol/kg/min. Es liegt innerhalb des Wissens des Fachmanns, die Dosis und die Geschwindigkeit der Verabreichung von Zusammensetzungen einzustellen, die GLP-1, GLP-1 Analoga oder GLP-1 Derivate oder aktive Fragmente hiervon enthalten, um das gewünschte klinische Ergebnis zu erreichen, das der Gewichtsverlust ist.
"Pharmazeutisch annehmbar" meint, daß es zur Verabreichung an einem Menschen geeignet ist und keine toxischen Elemente, unerwünschten Kontaminationen oder dergleichen enthält und nicht mit der Aktivität der Wirkstoffe hierin wechselwirkt.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf ein bestimmtes Beispiel leichter verständlich, das zur Erläuterung aber nicht zur Beschränkung der Erfindung bereitgestellt wird.
Beispiel 1
Vier Patienten mit einem nicht-insulinabhängigen Diabetes mellitus (NIDDM) (3 Männer, 1 Frau, Alter: 60,2 ± 1,8 Jahre, Ausgangs-BMI: 3,5 ± 1,4 kg/m², Ausgangskörpergewicht: 97,5 ± 6,5 kg, Ausgangsverhältnis Tail-le/Hüfte: 0,946 ± 0,036, Ausgangs HbA_c: 7,1 ± 0,3 %, Blutglucose nüchtern: 7,2 ± 1,1 mM) erhalten kontinuierliche, subkutane Infusionen von GLP-1(7–36)amid für vier Wochen. Die GLP-1 Lösungen werden durch Vereinigen von 100 nmol GLP-1(7–36)amid und 0,025 ml Humanalbuminlösung (20%) und einer anschließenden Einstellung des pH mit 5 M Essigsäure auf 4 und einer schließlichen Einstellung des Volumens auf 1 ml mittels normaler Kochsalzlösung hergestellt. Die Lösung wird mit einer GLP-1 Dosisrate von 1,2 pmol/kg/Minute verabreicht. Die volumetrische Abgaberate der Minimed Pumpe (Minimed Europe, Paris) zur Verabreichung der GLP-1 Lösung beträgt 0,05 – 0,07 ml/h. Die subkutane Verabreichungsstelle ist das Abdomen.
Diese Behandlung mit GLP-1 wird mit einer zweiwöchigen intensiven Insulintherapie vor und nach der GLP-1 Infusion verglichen. Während der Insulinbehandlungsperioden wird das Insulin vor jeder Mahlzeit subkutan verabreicht (siehe Tabelle 1). Während der GLP-1 Infusion wird kein Insulin verabreicht. Sowolil während der Insulinbehandlungsperioden als auch der GLP-1 Behandlungsperiode erhalten die Patienten eine diabetische Standarddiät, die auf kalorischer Basis aus etwa 55 % Kohlenhydraten, 30 % Fett und 15 % Protein besteht. Es wird kein Bewegungsgprogramm absolviert. Die Patienten befinden sich nicht im Krankenhaus und bleiben während der gesamten Versuchsdauer ambulante Patienten.
Während der GLP-1 Behandlung verlieren die vier Patienten im Mittel 3,5 ± 1,2 kg Körpergewicht, während sie nur 1,3 ± 0,6 kg während der ersten 2 Wochen der instensiven Insulinbehandlung verlieren und nehmen im Mittel während der zweiten zwei Wochen der intensiven Insulinbehandlung zu. Alle Werte sind einzelne Werte oder Mittelwerte ± SEM (Standardabweichung des Mittelwerts). Es sind keine Daten für den Patienten MP für die zweite Insulinbehandlungsperiode erhältlich.
Tabelle 1
Insulinbehandlungsplan
Die vier Werte stellen die Menge an subkutan an jeden Patienten direkt vor den vier Mahlzeiten täglich verabreichter Insulinmenge (IE) dar. Die erste Insulinbehandlung geht der GLP-1 Behandlung voraus und die zweite Insulinbehandlung folgt 4 Wochen danach.
Tabelle 2
Patientengewicht und Gewichtsveränderung
GLP-1(7–36)amid wird durch kontinuierliche, subkutane Infusion für 4 Wochen verabreicht, wobei unmittelbar vorher und nachher für 2 Wochen eine intensive Insulintherapie erfolgt.
Zitierte Dokumente:
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Claims

Verwendung eines Agonisten des GLP-1-Rezeptors zur Herstellung eines Arzneimittels zur peripheren Verabreichung zur Verwendung bei der therapeutischen Verringerung des Körpergewichts eines Menschen.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Patient an Fettsucht leidet.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin der Patient an einem nicht-Insulinabhängigen Diabetes mellitus leidet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Agonist GLP-1 (7–34), GLP-1 (7–35), GLP-1 (7–36), GLP-1 (7–37) oder die C-terminal armidierte Form eines der vorangehenden ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Agonist GLP-1 (7–34) , GLP-1 (7–35), GLP-1 (7–36), GLP-1 (7–37) oder die C-terminal amidierte Form eines der vorangehenden ist, mit zumindest einer Modifikation, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus: (a) Substitution des Lysins an Position 26 und/oder 34 durch eine neutrale Aminosäure, Arginin oder eine D-Form von Lysin und/oder des Arginins an der Position 36 durch eine neutrale Aminosäwe, Lysin oder eine D-Form von Arginin, (b) Substitution des Tryptophans an Position 31 dwch eine oxidationsresistente Aminosäwe, (c) Substitution gemäß mindestens einem der folgenden Y für V an der Position 16, K für S an der Position 18, D für E an der Position 21, S für G an der Position 22, R für Q an der Position 23, R für A an der Position 24, und Q für K an der Position 26, (d) Substitution gemäß einer der folgenden eine alternative kleine, neutrale Aminosäwe für A an der Position 8, eine alternative saure Anünosäure oder neutrale Aminosäure für E an der Position 9, eine alternative neutrale Aminosäwe für G an der Position 10, und eine alternative saure Aminosäure für D an der Position 15, und (e) Substitution des Histidins an der Position 7 dwch eine alternative neutrale Anünosäure oder die D- oder Nacylierte oder N-alkylierte Form von Histidin.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Agonist die folgende Formel aufweist: R₁-X-Glu-Gly¹⁰-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp¹⁵- -Val-Ser-Ser-Tyr-Leu²⁰-Y-Gly-Gln-Ala-Ala²⁵-Lys-Z-Phe-Ile-A1a³⁰-Trp-Leu-Val-Lys-Gly³⁵-Arg-R₂ (SEQ ID Nr. 2) oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon, worin R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus L-Histidin, D-Histidin, Desaminohistidin, 2-Aminohistidin, ß-Hydroxyhistidin, Homohistidin, α-Fluormethylhistidin und α-Methylhistidin, X aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Ala, Gly, Val, Thr, Ile und α-Methyl-A1a, Y aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Glu, Gln, Ala, Thr, Ser und Gly, Z aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Glu, Gln, Ala, Thr, Ser und Gly, und R₂ aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus NH₂ und Gly-OH, mit der Maßgabe, daß die Verbindung einen isoelektrischen Punkt im Bereich von etwa 6,0 bis etwa 9,0 aufweist.
Verwendung nach Anspruch 6, worin der Agonist ausgewählt ist aus Gly⁸-GLP-1(7–36)NH₂, Val⁸-GLP-1(7-37)OH, α-Methyl-Ala⁸-GLP-1(7–36)NH₂, und Gly⁸-G1n²¹-GLP-1(7–37)OH.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Agonist ein acyliertes Derivat eines Agonisten ist, der in einem der Ansprüche 4 bis 6 angegeben ist.
Verwendung nach Anspruch 8, worin der Agonist an der ε-Aminogruppe eines Lysinrests acyliert ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Agonist gegenüber der Aktivität einer Dipeptidylpeptidase IV resistent ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Agonist einer ist, wie er in einem der Ansprüche 4 bis 6 angegeben ist, und mit Zink komplexiert ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Arzneimittel eine Präparation mit kontrollierter Freisetzung ist.
Verwendung nach Anspruch 12, worin die Präparation zur kontrollierten Freisetzung Partikel eines polymeren Materials aufweist.
Verwendung nach Anspruch 13, worin das polymere Material Polymilchsäure ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Arzneimitel zur Verabreichung über die unteren Atemwege vorgesehen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Arzneimittel zur oralen Verabreichung vorgesehen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Arzneimittel zur Verabreichung durch subkutane Injektion vorgesehen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin das Arzneimittel eine Zusammensetzung ist, die ein antimikrobielles Mittel umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 18, worin das antimikrobielle Mittel meta-Cresol oder Phenol ist.
Verwendung nach Anspruch 18 oder Anspruch 19, worin die Zusammensetzung ferner ein Mittel zur Einstellung der Isotonizität enthält.
Verwendung nach Anspruch 20, worin das Mittel zur Einstellung der Isotonizität Glycerin ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Agonist GLP-1(7–34), GLP-1(7–35), GLP-1(7–36) oder GLP-1(7–37) oder die Amidform hiervon und ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon ist, wobei er mindestens eine der im folgenden aufgeführten Modifikationen aufweist: (a) Substitution des Lysins an Position 26 und/oder Position 34 durch Glycin, Serin, Cystein, Threonin, Asparagin, Glutamin, Tyrosin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Phenylalanin, Arginin oder D-Lysin oder Substitution des Arginins an der Position 36 durch Glycin, Serin, Cystein, Threonin, Asparagin, Glutamin, Tyrosin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Phenylalanin, Lysin oder D-Arginin, (b) Substitution des Tryptophans an Position 31 durch eine oxidationsresistente Aminosäure, (c) Substitution von mindestens einem aus Tyrosin für Valin an der Position 16, Lysin für Serin an der Position 18, Asparaginsäure für Glutaminsäure an der Position 21, Serin für Glycin an der Position 22, Arginin für Glutamin an der Position 23, Arginin für Alanin an der Position 24, und Glutamin für Lysin an der Position 26, und (d) Substitution von mindestens einem aus Serin oder Cystein für Alanin an der Position 8, Asparaginsäure, Glycin, Serin, Cystein, Threonin, Asparagin, Glutamin, Tyrosin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin oder Phenylalanin für Glutaminsäure an der Position 9, Serin, Cystein, Threonin, Asparagin, Glutamin, Tyrosin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin oder Phenylalanin für Glycin an der Position 10, und Glutaminsäure für Asparaginsäure an der Position 15, und (e) Substitution des Histidins an der Position 7 durch Glycin, Serin, Cystein, Threonin, Asparagin, Glutamin, Tyrosin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin oder Phenylalanin oder der D- oder N-acylierten oder N-alkylierten Form von Histidin, worin gilt, falls die Substitution (a), (b), (d) oder (e) ist, die substituierten Aminosäuren wahlweise in der D-Form vorliegen können und die an der Position 7 substituierten Aminosäuren wahlweise in der N-acylierten oder N-alkylierten Form vorliegen.
Nicht-therapeutische, periphere Verabreichung eines Agonisten des GLP-1-Rezeptors zur Verringerung des Körpergewichts eines Menschen.