PL191627B1 - Zastosowanie peptydu GLP-1 do wytwarzania leku do leczniczego zmniejszania masy ciała u człowieka - Google Patents

Abstract

1. Zastosowanie peptydu wykazujacego aktywnosc insulinotropowa przez oddzialywanie z receptorem GLP-1, do wytwarzania leku do obwodowego podawania w leczniczym zmniejszaniu masy ciala u czlowieka. PL PL PL

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie glukagonopodobnego peptydu-1 (GLP-1), analogów i pochodnych GLP-1, do wytwarzania leku do leczniczego zmniejszania masy ciała u człowieka.

Otyłość, zwłaszcza otyłość górnej połowy ciała, jest najczęstszym zaburzeniem odżywiania nadmiernie odżywionej populacji świata. Liczne badania wskazują, że zmniejszenie masy ciała wybitnie zmniejsza ryzyko chorób przewlekłych, takich jak cukrzyca, nadciśnienie tętnicze, hiperlipidemia, choroba niedokrwienna serca i choroby mięśniowo-kostne. Na przykład różne wskaźniki otyłości, takie jak masa ciała, stosunek obwodu pasa do obwodu bioder, odkładanie tłuszczu w krezce, wykazują wyraźną korelację z ryzykiem cukrzycy nieinsulinozależnej (non-insulin dependent diabetes mellitus NIDDM), zwanej również cukrzycą typu II. Według Amerykańskiego Towarzystwa Cukrzycy (1995), u około 80% chorych z NIDDM stwierdza się otyłość.

Leczenie wielu chorób przewlekłych, w tym NIDDM, jest ukierunkowane na zmniejszenie masy ciała.

Obecnie znane sposoby ułatwiania zmniejszania masy ciała są nie w pełni zadowalające. Niektórzy otyli pacjenci są w stanie zmniejszyć masę ciała poprzez celową zmianę zachowania, na przykład zmianę sposobu odżywiania lub ćwiczenia fizyczne. Niemożność uzyskania spadku masy ciała na tej drodze może być spowodowana czynnikami genetycznymi, wywołującymi zwiększone łaknienie i preferencję pokarmów wysokotłuszczowych lub tendencję do metabolizmu lipogennego. Niestety, jak się ocenia, wydaje się aż około 33 miliardy dolarów rocznie na sposoby i środki służące zmniejszaniu masy ciała, w znacznym stopniu zawodne. Tak więc, dla uzupełnienia znanych środków niezbędne są pilnie nowe sposoby i preparaty, takie jak środki farmaceutyczne, sprzyjające zmniejszaniu masy ciała.

Wiadomo, że glukagonopodobny peptyd-1 (GLP-1) odgrywa kluczową rolę w regulowaniu fizjologicznej reakcji na żywienie. GLP-1 tworzy się z proglukagonu i uwalnia do krwi z dokrewnych komórek L, znajdujących się głównie w dalszej części jelita cienkiego i w okrężnicy, w odpowiedzi na przyjęcie posiłku (Nilsson i wsp., 1991; Krcymann i wsp., 1987; Mojsov i wsp., 1986). GLP-1 działa poprzez sprzężony z białkiem G receptor powierzchni komórki (GLP-1R) i wzmaga wywołane przez substancje odżywcze wytwarzanie insuliny (Fehmann i wsp., 1992) i jej uwalnianie (Fehmann i wsp., 1995). GLP-1 pobudza wydzielanie insuliny (działanie insulinotropowe) i wytwarzanie cAMP (Mojsov i wsp., 1992). Amid GLP-1(7-36) pobudza uwalnianie insuliny, zmniejsza wydzielanie glukagonu i hamuje wydzielanie żołądkowe i opróżnianie żołądka (Nauck, 1993; Gutniak i wsp., 1992). U osób po wagotomii (przecięciu nerwów błędnych) nie stwierdza się tego działania żołądkowo-jelitowego GLP-1, co wskazuje na ośrodkowe pochodzenie tego działania (Orskov i wsp., 1995). GLP-1 wiąże się z dużym powinowactwem z izolowanymi komórkami tłuszczowymi szczura, pobudzając wytwarzanie cAMP (Valverde i wsp., 1993) i pobudzając lipogenezę (Oben i wsp., 1991) lub lipolizę (Ruiz-Grande i wsp., 1992). GLP-1 pobudza wytwarzanie glikogenu, utlenianie glukozy i wytwarzanie mleczanów w mięśniu szkieletowym szczura (Villanueva i wsp., 1994).

m-RNA kodujące receptor GLP-1 typu trzustkowego znajduje się u szczura we względnie dużej ilości w wysepkach trzustkowych, płucach, podwzgórzu i żołądku (Billock i wsp., 1996). Co ciekawe, mimo tego, że wiemy, że w podwzgórzu znajdują się zarówno receptory GLP-1, jak i GLP-2 (Krcymann i wsp., 1989; Kanse i wsp., 1988), nie była znana ośrodkowa rola GLP-1, aż do ostatniego doniesienia, że GLP-1 podawany do komór mózgu (drogą ICV) wyraźnie hamuje przyjmowanie pokarmu u głodzonych szczurów (Turton i wsp., 1996). W tym samym doniesieniu podano, że po podaniu ICV GLP-1, pojawia się c-fos, marker pobudzenia komórek nerwowych, wyłącznie w jądrze przykomorowym podwzgórza i w ośrodkowym jądrze ciał migdałowatych, czyli w dwóch okolicach mózgu o pierwszorzędowym znaczeniu w regulowaniu żywienia (Morley, 1987). GLP-1 podany ICV zmniejsza również znamiennie przyjmowanie pokarmu po wstrzyknięciu substancji silnie pobudzającej przyjmowanie pokarmu - neuropeptydu Y - u zwierząt otrzymujących pokarm do woli (Turton i wsp., 1996). W następnej pracy udowodniono, że GLP-1, podany ośrodkowo lub obwodowo, bierze udział w kontroli regulacji temperatury ciała, jednak nie zmienia przyjmowania pokarmu po jednorazowym podaniu dootrzewnowym u szczura (O'Shea i wsp., 1996). W niedawno opublikowanej pracy stwierdzono, że wstrzyknięcie GLP-1 do komór bocznych szczurów w stanie sytości powoduje silne pobudzenie Fos-ir w jądrze przykomorowym i ubogokomórkowym jądrze ośrodkowym ciał migdałowatych, co udowodnili Turton i wsp., Rowland i wsp., 1996). Badacze ci ponadto opisali silne pobudzenie innych ośrodków biorących udział w regulacji przyjmowania pokarmu, w tym bezpośredni wczesny białkowy produkt

PL 191 627 B1 genu w jądrze pasma samotnego, mostowym bocznym jądrze przyramiennym, jądrze podstawnym prążka krańcowego i w polu najdalszym. Receptory GLP-1, dostępne dla obwodowego GLP-1, znajdują się w narządzie podsklepieniowym i polu najdalszym szczura (Orskov i wsp., 1996).

Turton i wsp. (1996) wyszczególniają, że działanie GLP-1 na masę ciała i przyjmowanie pokarmu spowodowane jest wyłącznie bezpośrednim podawaniem GLP-1 do komór mózgu, natomiast podawanie GLP-1 dootrzewnowo, nawet we względnie wysokich dawkach, nie wpływa na wczesne żywienie fazy ciemnej, a fragmenty GLP-1 są nieczynne po podaniu obwodowym, cytując Suzuki i wsp., 1989. Stwierdzenia takie zniechęcają do zastosowania GLP-1 w postaci preparatu (środka farmaceutycznego) do zmniejszania masy ciała, ponieważ w leczeniu otyłości u ludzi niemożliwe jest zastosowanie ośrodkowej drogi podawania (na przykład ICV). Wyżej omówione efekty fizjologiczne GLP-1 doprowadziły do sugestii jego korzystnego zastosowania w leczeniu cukrzycy i otyłości poprzez przeszczepianie rekombinacyjnych linii komórkowych kodujących receptory GLP-1 lub GLP lub GLP-1; por. np. WO 96/25487. Inna praca wykazuje, że zastosowanie GLP-1 jest niewskazane, interpretując stan techniki w taki sposób, że dowodzi, że obwodowe podawanie GLP-1 nie wykazuje wpływu na zachowanie żywieniowe (WO 97/31943, str. 3). W publikacji tej omówiono również wpływ GLP-2 na przyjmowanie pokarmu po podaniu obwodowym.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie peptydu wykazującego aktywność insulinotropową przez oddziaływanie z receptorem GLP-1, do wytwarzania leku do obwodowego podawania w leczniczym zmniejszaniu masy ciała u człowieka.

Korzystnie wytwarza się lek do leczenia otyłości.

Definicja otyłości bywa różna w zależności od umiejscowienia geograficznego, celu klinicznego i preferencji społecznych. Jednakże wynalazek można zastosować dla każdej osoby, u której korzystne jest zmniejszenie masy ciała.

Korzystnie wytwarza się lek dla człowieka chorującego na cukrzycę nieinsulinozależną. Zastosowanie wynalazku nie jest jednakże ograniczone, na przykład do chorych z cukrzycą. Obwodowe podawanie amidu GLP-1(7-36) osobom otyłym nieoczekiwanie, i wbrew wnioskom Turton i wsp. (1996) powoduje istotne zmniejszenie masy ciała.

Zgodnie z wynalazkiem można stosować związki glukagonopodobnego peptydu-1, do których należą: GLP-1, analogi GLP-1, pochodne GLP-1, agoniści receptora GLP-1, agoniści kaskady transdukcji sygnału GLP-1, związki pobudzające wytwarzanie endogennego GLP-1, związki pobudzające uwalnianie endogennego GLP-1, i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole. Podaje się dawkę skuteczną farmaceutycznie, to znaczy, dawkę dostateczną do spowodowania zmniejszenia masy ciała.

Sposoby i preparaty, zwłaszcza leki (preparaty farmaceutyczne), wykorzystujące glukagonopodobny peptyd-1, jego analogi lub pochodne, są skuteczne w zmniejszaniu masy ciała i w leczeniu otyłości. Analogi i pochodne GLP-1, korzystne w zastosowaniu według niniejszego wynalazku, stanowią związki, których czas półtrwania jest dłuższy, niż GLP-1, i większa jest ich zdolność do wpływu na spadek masy ciała przy podawaniu osobie przez dany czas.

Wszystkie analogi, pochodne, odmiany, prekursory i homologi GLP-1 nadają się do zastosowania według niniejszego wynalazku, o ile zawierają czynny fragment powodujący utratę masy ciała.

GLP-1 oznacza GLP-1 (7-37). W stanie techniki końcowi aminowemu GLP-1(7-37) zwyczajowo przypisuje się numer 7, a końcowi karboksylowemu - numer 37. Sekwencja aminokwasowa GLP-1(7-37) jest dobrze znana ze stanu techniki, jednak dla wygody czytelnika przedstawiono ją poniżej:

NH2-His⁷-Ala-Glu-Gly¹⁰-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp¹⁵-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu²⁰-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala²⁵-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala³⁰-Trp-Leu-Val-Lys-Gly³⁵-Arg-Gly³⁷-COOH (SEQ ID nr 1)

Analog GLP-1 definiuje się jako cząsteczkę zawierającą modyfikację, taką jak na przykład jedno lub więcej podstawienie, delecję, inwersję lub dodanie aminokwasów w porównaniu z GLP-1. Do analogów GLP-1 znanych ze stanu techniki należą na przykład GLP-1(7-34) i GLP-1(7-35), GLP-1(7-36), Val⁸-GLP-1(7-37), Gln⁹-GLP-1(7-37), D-Gln⁹-GLP-1(7-37), Thr¹⁶-Lys¹⁸-GLP-1(7-37) i Lys¹⁸-GLP-1(7-37). Korzystne analogi GLP-1 stanowią GLP-1 (7-34) i GLP-1(7-35), opisane w patencie Stanów Zjednoczonych nr 5118666, oraz GLP-1(7-36). Związki te stanowią poddane obróbce biologicznej postacie GLP-1 o właściwościach insulinotropowych. Inne analogi GLP-1 opisano w patencie Stanów Zjednoczonych nr 5545618.

Pochodną GLP-1 definiuje się jako cząsteczkę o sekwencji aminokwasowej GLP-1 lub analogu GLP-1, lecz dodatkowo zawierającą co najmniej jedną modyfikację chemiczną jednej lub kilku

PL 191 627 B1 swych bocznych grup aminokwasowych, atomów a-węglowych, końcowych grup aminowych lub końcowych grup karboksylowych. Modyfikacja chemiczna może polegać na dodaniu cząstek chemicznych, wytworzeniu nowych wiązań i usunięciu cząstek chemicznych. Modyfikacja aminokwasowych grup bocznych może polegać na acylacji lizynowych grup e-aminowych, N-alkilacji argininy, histydyny lub lizyny, alkilacji grup kwasu glutaminowego lub asparaginowego, i dezamidacji glutaminy lub asparaginy. Do modyfikacji końca aminowego należą modyfikacje dezaminy, niższego amidu alkilowego, amidu dialkilowego i niższego estru alkilowego. Niższy alkil jest to grupa C1-C4alkilowa. Ponadto jedna lub więcej grup bocznych lub końcowych może być zabezpieczona grupami zabezpieczającymi znanymi specjalistom z dziedziny chemii białek. Atom a węgla aminokwasu może być mono- lub dimetylowany.

Według niniejszego wynalazku korzystna grupa analogów i pochodnych GLP-1 do zastosowania według niniejszego wynalazku utworzona jest z różnych cząsteczek GLP-1 zastrzeżonych w patencie Stanów Zjednoczonych nr 5545618 ('618). Skuteczne analogi czynnych peptydów GLP-1, 7-34, 7-35, 7-36 i 7-37, mają podstawienia aminokwasów w pozycjach 7-10 i/lub są okrojone na końcu C i/lub zawierają różne inne podstawienia aminokwasów w peptydzie podstawowym. Analogi zawierające podstawienia D-aminokwasowe w pozycjach 7 i 8 i/lub N-alkilowane lub N-acylowane aminokwasy w pozycji 7 są szczególnie oporne na rozpad in vivo.

Korzystnie analogami według niniejszego wynalazku są analogi wymienione w '618, wykazujące nasilone właściwości pobudzania insuliny, mające sekwencję natywnego GLP-1, 7-34, 7-35, 7-36 lub 7-37, lub ich amidu C-końcowego, a jeszcze korzystnie te, które mają co najmniej jedną modyfikację dobraną z grupy, do której należy:

(a) podstawienie obojętnego aminokwasu, argininy, lub postaci D lizyny zamiast lizyny w pozycji 26 i/lub 34 i/lub obojętnego aminokwasu, lizyny lub postaci D argininy zamiast argininy w pozycji 31;

(b) podstawienie aminokwasu opornego na utlenienie zamiast tryptofanu w pozycji 31;

(c) podstawienie według co najmniej jednego z poniższych wzorców:

Y zamiast V w pozycji 16;

K zamiast S w pozycji 18;

D zamiast E w pozycji 21;

S zamiast G w pozycji 22;

R zamiast Q w pozycji 23;

R zamiast A w pozycji 24; i

Q zamiast K w pozycji 26;

(przy zastosowaniu jednoliterowych oznaczeń aminokwasów).

(d) podstawienie zawierające co najmniej jedną z poniższych zmian: inny krótki obojętny aminokwas zamiast A w pozycji 8; inny kwaśny aminokwas lub obojętny aminokwas zamiast E w pozycji 9; inny obojętny aminokwas zamiast G w pozycji 10;

inny kwaśny aminokwas zamiast D w pozycji 15; i (e) podstawienie innego obojętnego aminokwasu lub D- lub N- acylowanej postaci histydyny w pozycji 7.

W odniesieniu do modyfikacji (a), (b), (d) i (e), podstawione aminokwasy mogą być w postaci D. Aminokwasy podstawione w pozycji 7 mogą być również w postaci N-acylowanej lub N-alkilowanej.

Według innego aspektu, w wynalazku można stosować peptydy wymienione w '618 wykazujące zwiększoną oporność na rozpad w osoczu w porównaniu z GLP-1(7-37). W tych analogach dowolna z wyżej wymienionych okrojonych postaci GLP-1(7-34) do GLP-1(7-37) lub ich C-końcowe postacie amidowane są zmodyfikowane poprzez (a) podstawienie D-obojętnego lub D-kwaśnego aminokwasu zamiast H w pozycji 7, lub (b) podstawienie D-aminokwasu zamiast A w pozycji 8, lub (c) obie powyższe zmiany, lub (d) podstawienie N-acylowanej lub N-alkilowanej postaci dowolnego naturalnie występującego aminokwasu zamiast H w pozycji 7.

Tak więc do analogów opornych na rozpad należą (N-acylowany(1-6C)AA)⁷GLP-1(7-37) i (N-alkilowany(1-6C)AA)⁷GLP-1(7-37), przy czym AA stanowi reszta lizylowa, jeden lub oba atomy azotu mogą być alkilowane lub acylowane, AA oznacza dowolny aminokwas umożliwiający zachowanie pobudzającego insulinę.

PL 191 627 B1

Do podstawień D-aminokwasów w pozycjach 7 i 8, w pozycji 7 można stosować resztę D dowolnego kwaśnego lub obojętnego aminokwasu, a w pozycji 8 - dowolny aminokwas, również umożliwiające zachowanie pobudzającego insulinę. Jedna lub obie z pozycji 7 i 8 mogą być podstawione Daminokwasem; D-aminokwas w pozycji 7 może również być acylowany lub alkilowany. Te zmodyfikowane postacie dotyczą nie tylko GLP-1(7-37), lecz również krótszych, okrojonych analogów. Tak więc, do korzystnych analogów stosowanych w wynalazku są te z wymienionych w '618, których postać (7-34), (7-35) lub (7-37) GLP-1 zmodyfikowano tylko poprzez podstawienie obojętnego aminokwasu, argininy, lub postaci D lizyny zamiast lizyny w pozycji 26 i/lub 34 i/lub obojętnego aminokwasu, lizyny lub postaci D argininy zamiast argininy w pozycji 36 (punkt (a)). Szczególnie korzystne są takie analogi, w których aminokwas podstawiony zamiast lizyny w pozycji 26 i 34 dobiera się z grupy, do której należy K⁺, G, S, A, L, I, Q, R, R⁺ i M, a zamiast argininy z grupy, do której należy K, K⁺, G, S, A, L, I, Q, M i R⁺ (przy czym ⁺ oznacza postać D).

Korzystne są również analogi, w których jedyną modyfikację stanowi podstawienie zamiast tryptofanu w pozycji 31 aminokwasu opornego na utlenienie (punkt (b)). Szczególnie korzystne podstawienia dobiera się z grupy, do której należy F, V, L, I, A i Y.

Korzystne są również takie analogi, w których jedyną modyfikację stanowi co najmniej jedna z szczególnych modyfikacji podanych w punkcie (c). Szczególnie korzystne są takie analogi, w których dokonano połączenia podstawie S zamiast G w pozycji 22, R w pozycjach 23 i 24 zamiast, odpowiednio, Q i A, i Q zamiast K w pozycji 26, lub podstawienia Y zamiast V w pozycji 16 i K zamiast S w pozycji 18, lub też powyższych podstawień oraz podstawienia D zamiast E w pozycji 21.

Korzystne są również analogi, w których jedyną modyfikację stanowi jedna z modyfikacji przedstawionych w punkcie (d). Wśród nich szczególnie korzystne są takie modyfikacje, w których drobnocząsteczkowy obojętny aminokwas podstawiony zamiast alaniny w pozycji 8 dobiera się z grupy, do której należy S, S⁺, GC, C⁺, Sar, A⁺, beta-ala i Aib; i/lub kwaśny lub obojętny aminokwas podstawiony zamiast kwasu glutaminowego w pozycji 9 dobiera się z grupy, do której należy E⁺, D, D⁺, Cya, T, T⁺, N, N⁺, Q, Q⁺, Cit, MSO i acetylo-K; i/lub zamienny obojętny aminokwas, podstawiony zamiast glicyny w pozycji 10, dobiera się z grupy, do której należy S, S⁺, Y, Y⁺, T, T⁺, N, N⁺, Q, Q⁺, Cit, MSO, acetylo-K, F i F⁺; i/lub w których zamiast E w pozycji 15 podstawiony jest D.

Korzystne są również analogi, w których zmieniono tylko pozycję 7 (punkt (e)). Korzystne podstawienia stanowią takie, w których aminokwas podstawiony zamiast histydyny w pozycji 7 dobiera się z grupy, do której należy H⁺, Y, Y⁺, F, F⁺, R, R⁺, Orn, Orn⁺, M, M⁺, N-formylo-H, N-formylo-H⁺, N-acetylo-H, N-acetylo-H⁺, N-izopropylo-H, N-izopropylo-H⁺, N-acetylo-K, N-acetylo-K⁺, P i P⁺.

Korzystne są również wykonania z połączeniem tylko dwóch z wyżej wymienionych klas postaci zmodyfikowanych, oprócz poniższych szczegółowych wykonań.

Korzystne są następujące konkretne analogi:

(H⁺)⁷-GLP-1(7-37);

(Y⁺)⁷-GLP-1(7-37);

(N-acetylo-H)⁷-GLP-1(7-37);

(N-izopropylo-H)⁷-GLP-1(7-37);

(A⁺)⁸-GLP-1(7-37);

(E⁺)⁹-GLP-1(7-37);

(D)⁹-GLP-1(7-37);

(D⁺)⁹-GLP-1(7-37);

(F⁺)¹⁰-GLP-1(7-37);

(S)²²(R)²³(R)²⁴(Q)²⁶-GLP-1(7-37);

(S)⁸(Q)⁹(Y)¹⁶(K)¹⁸(D)²¹-GLP-1(7-37).

Korzystne postacie analogów o zwiększonej stabilności również zawierają jedną, lub co najwyżej dwie, modyfikacje aminokwasowe.

Do korzystnych podstawień zamiast histydyny w pozycji 7 należą postacie D kwaśnych lub obojętnych aminokwasów lub postacie D histydyny. Korzystne są P⁺, D⁺, E⁺, N⁺, Q⁺, L⁺, V⁺, I⁺ i H⁺.

Histydyna w pozycji 7, lub jej podstawienie (D lub L) może być również N-alkilowana (1-6C) lub N-acylowana (1-6C). Grupy alkilowe stanowią reszty hydrokarbylowe o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym (w tym cykliczne) wskazanego członu C. Grupy acylowe mają wzór RCO, w którym R stanowi grupa alkilowa. Korzystne grupy alkilowe stanowią grupa t-propylowa, a-propylowa i etylowa; korzystne grupy acylowe stanowią grupa acetylowa i propionylowa. Do korzystnych reszt, które mogą być alkilowane lub acylowane, należą P, D, E, N, Q, V, L, I, K i H,w postaci D lub L.

PL 191 627 B1

Korzystne podstawienia alaniny w pozycji 8 stanowią postacie D P, V, L i A; korzystne są również postacie D D, E, N, Q, K, T, S i H.

Niektóre szczególne analogi wykazują zwiększoną aktywność pobudzania uwalniania insuliny i zwiększoną stabilność.

Do korzystnej grupy analogów i pochodnych GLP-1 do zastosowania według niniejszego wynalazku należą cząsteczki o wzorze: R1-X-Glu-Gly¹⁰-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp¹⁵-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu²⁰-Y-Gly-Gln-Ala-Ala²⁵-Lys-z-Phe-Ile-Ala³⁰-Trp-Leu-Val-Lys-Gly³⁵-Arg-R2 (SEQ ID nr 2), i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, przy czym: R1 dobiera się z grupy, do której należy L-histydyna, D-histydyna, dezamidohistydyna, 2-aminohistydyna, b-hydroksyhistydyna, homohistydyna, alfa-fluorometylohistydyna i alfa-metylohistydyna; X dobiera się z grupy, do której należy Ala, Gly, Val, Thr, Ile i alfa-metylo-Ala; Y dobiera się z grupy, do której należy Glu, Gln, Ala, Thr, Ser i Gly; Z dobiera się z grupy, do której należy Glu, Gln, Ala, Thr, Ser i Gly, a R2 dobiera się z grupy, do której należy NH2 i Gly-OH, pod warunkiem, że punkt izoelektryczny związku pozostaje w zakresie od około 6,0 do około 9,0.

Opisano wiele analogów i pochodnych GLP-1, których punkt izoelektryczny wynosi od około 6,0 do około 9,0; należą do nich na przykład:

GLP-1(7-36)NH2

Gly⁸-GLP-1(7-36)NH2

Gln⁹-GLP-1(7-37) 10 D-Gln⁹-GLP-1(7-37) acetylo-Lys⁹-GLP-1(7-37)

Thr⁹-GLP-1(7-37)

D-Thr⁹-GLP-17-37)

Asn⁹-GLP-1(7-37)

D-Asn⁹-GLP-1(7-37)

Ser²²-Arg²³-Arg²⁴Gln²⁶-GLP-1(7-37)

Thr¹⁶-Lys¹⁸-GLP-1(7-37)

Lys¹⁸-GLP-1(7-37)

Arg²³-GLP-1(7-37)

Arg²⁴-GLP-1(7-37)

Inną korzystną grupę związków czynnych do zastosowania według niniejszego wynalazku opisano w WO 91/11457 (związanym z US 5 545816); należą do niej GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP1(7-36) i GLP-1(7-37), oraz ich postacie amidowe i farmaceutycznie dopuszczalne sole, zawierające co najmniej jedną z poniższych modyfikacji:

(a) podstawienie glicyny, seryny, cysteiny, treoniny, asparaginy, glutaminy, tyrozyny, alaniny, waliny, izoleucyny, leucyny, metioniny, fenyloalaniny, argininy lub D-lizyny zamiast lizyny w pozycji 26 i/lub w pozycji 34; lub podstawienie glicyny, seryny, cysteiny, treoniny, asparaginy, glutaminy, tyrozyny, alaniny, waliny, izoleucyny, leucyny, metioniny, fenyloalaniny, lizyny lub D-argininy zamiast argininy w pozycji 36;

(b) podstawienie opornego na utlenienie aminokwasu zamiast tryptofanu w pozycji 31;

(c)co najmniej jedno z następujących podstawień: tyrozyny zamiast waliny w pozycji 16; lizyny zamiast seryny w pozycji 18; kwasu asparaginowego zamiast glutaminowego w pozycji 21; seryny zamiast glicyny w pozycji 22; argininy zamiast glutaminy w pozycji 23; argininy zamiast alaniny w pozycji 24 i glutaminy zamiast lizyny w pozycji 26; i (d) co najmniej jedno z następujących podstawień: glicyny, seryny lub cysteiny zamiast alaniny w pozycji 8; kwasu asparaginowego, glicyny, seryny, cysteiny, treoniny, asparaginy, glutaminy, tyrozyny, alaniny, waliny, izoleucyny, leucyny, metioniny lub fenyloalaniny zamiast kwasu glutaminowego w pozycji 9; seryny, cysteiny, treoniny, asparaginy, glutaminy, tyrozyny, alaniny, waliny, izoleucyny, leucyny, metioniny lub fenyloalaniny zamiast glicyny w pozycji 10; i kwasu glutaminowego zamiast asparaginowego w pozycji 15; i (e) glicyny, seryny, cysteiny, treoniny, asparaginy, glutaminy, tyrozyny, alaniny, waliny, izoleucyny, leucyny, metioniny, fenyloalaniny lub D- lub N-acylowanej lub alkilowanej postaci histydyny zamiast histydyny w pozycji 7, przy czym, w przypadku podstawień z punktów (a), (b), (d) i (e) podstawione aminokwasy mogą ewentualnie być w postaci D, natomiast aminokwasy podstawione w pozycji 7 mogą ewentualnie być w postaci N-acylowanej lub N-alkilowanej.

PL 191 627 B1

Do korzystnej grupy peptydów należą Gly⁸-GLP-1(7-36)NH2, Val⁸-GLP-1(7-37)OH, a-metyloAla⁸-GLP-1(7-36) NH2i Gly⁸-Gln²¹-GLP-1(7-37)OH.

Zwłaszcza korzystna jest grupa peptydów wymienionych wyżej, w której peptydem jest acylowana pochodna peptydu, a jeszcze korzystniejsza, w której peptyd jest acylowany w e-aminowej grupie reszty lizynowej.

Ponieważ enzym dipeptylopeptydaza IV (DPP IV) może być odpowiedzialny zaobserwowane in vivo szybkie unieczynnienie podawanego GLP-1 (Mentlein i wsp., 1993), korzystnie stosuje się peptyd oporny na działanie dipeptylopeptydazy IV.

Korzystne jest również zastosowanie w niniejszym wynalazku cząsteczki zastrzeżonej w patencie Stanów Zjednoczonych nr 5188666 ('666). Cząsteczka taka zawiera peptyd o jednej z następujących sekwencji aminokwasowych:

NH2-His⁷-Ala-Glu-Gly¹⁰-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp¹⁵-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu²⁰-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala²⁵-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala³⁰-Trp-Leu-Val-X (SEQ ID nr 3) przy czym w powyższym wzorze X może stanowić Lys i Lys-Gly; lub pochodną takiego peptydu, a peptyd może stanowić farmaceutycznie dopuszczalną kwasową sól addycyjną peptydu; farmaceutycznie dopuszczalną sól karboksylanową peptydu; farmaceutycznie dopuszczalny niższy alkiloester peptydu lub farmaceutycznie dopuszczalny amid peptydu, dobrany z grupy, do której należą: amid, niższy alkiloamid i niższy dialkiloamid. Wynalazek '666 odnosi się do fragmentu peptydowego, który jest insulinotropowy i pochodzi z naturalnie występującej sekwencji aminokwasowej.

Wynalazek zawiera związek dobrany z grupy, do której należą:

(A) peptyd zawierający sekwencję:

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X w której X dobiera się z grupy, do której należy:

(a) Lys (b) Lys-Gly (c) Lys-Gly-Arg i (B) pochodna tego peptydu, przy czym związek jest w zasadzie wolny od naturalnych zanieczyszczeń i wykazuje aktywność insulinotropową przewyższającą aktywność insulinotropową GLP-1(7-36) i GLP-1(7-37).

Wynalazek dotyczy również związku dobranego z grupy, do której należy:

(A) peptyd zawierający sekwencję:

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X w której X dobiera się z grupy, do której należy:

(a) Lys (b) Lys-Gly (c) Lys-Gly-Arg i (B) pochodna tego peptydu, przy czym związek jest w zasadzie wolny od naturalnych zanie-10 czyszczeń i wykazuje aktywność insulinotropową w stężeniu co najmniej 10^-10M.

Szczególnie korzystne są peptydy o następującym wzorze:

(1) H2N-X-C)-R¹ w którym R¹ stanowi OH, OM lub -NR²R³;

M stanowi farmaceutycznie dopuszczalny kation lub niższa rozgałęziona lub nierozgałęziona grupa alkilowa;

R²i R³są takie same lub różne i dobrane z grupy, do której należy wodór oraz rozgałęziona lub nierozgałęziona grupa alkilowa;

X stanowi peptyd zawierający sekwencję:

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg

NH² stanowi grupa aminowa końca aminowego X, a CO stanowi grupa karbonylowa końca karboksylowego X;

(2) ich kwasowe sole addycyjne; i (3) ich zabezpieczone lub częściowo zabezpieczone pochodne; przy czym związek ten wykazuje aktywność insulinotropową przekraczającą aktywność insulinotropową GLP-1(1-36) lub GLP-1(1-37).

PL 191 627 B1

Inna korzystna grupa cząsteczek do zastosowania według niniejszego wynalazku składa się ze związków zastrzeżonych w patencie Stanów Zjednoczonych nr 5512549 o ogólnym wzorze

R¹-Ala-Glu-Gly¹⁰Thr-Phe-Thr-Ser-Asp¹⁵-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu²⁰Glu-Gly-Gln-Ala-Ala²⁵-Xaa-Glu-Phe-Ile-Ala³⁰Trp-Leu-Val-Lys-Gly³⁵-Arg-R³ _R ² (SEQ ID nr 4) ₁ i ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, przy czym we wzorze R¹ może stanowić grupa ₂

4-imidazopropionylowa, 4-imidazoacetylowa lub 4-imidazowa, dimetyloacetylowa, R² może stanowić nierozgałęziona grupa C6-C10acylowa lub reszta ta może być nieobecna; R³ może stanowić Gly-OH lub NH2, a Xaa może stanowić Lys lub Arg.

Korzystniejsze związki według SEQ ID nr 4 do zastosowania według niniejszego wynalazku stanowią związki, w których Xaa stanowi Arg, a R² stanowi nierozgałęziona grupa C6-C10acylowa. Wysoce korzystne związki według SEQ ID nr 4 do zastosowania według niniejszego wynalazku stanowią związki, w których Xaa stanowi Arg, R² stanowi nierozgałęziona grupa C6-C10acylowa, a R³ stanowi Gly-OH.

Jeszcze bardziej korzystne związki według SEQ ID nr 4 do zastosowania według niniejszego ₂ wynalazku stanowią związki, w których Xaa stanowi Arg, R² stanowi nierozgałęziona grupa C6-C10acylowa, R³ stanowi Gly-OH, a R¹ stanowi grupa 4-imidazopropionylowa.

Najkorzystniejsze według SEQ ID nr 4 do zastosowania według niniejszego wynalazku stanowią związki, w których Xaa stanowi Arg, R² stanowi nierozgałęziona grupa C6-C10acylowa, R³ stanowi Gly-OH, a R¹ stanowi grupa 4-imidazopropionylowa.

Wysoce korzystne jest zastosowanie w niniejszym wynalazku cząsteczki zastrzeżonej w patencie Stanów Zjednoczonych nr 5120712. Cząsteczka taka zawiera peptyd o następującej sekwencji aminokwasowej:

NH2-His⁷-Ala-Glu-Gly¹⁰-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp¹⁵-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu²⁰-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala²⁵-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala³⁰-Trp-Leu-Val-Lys-Gly³⁵-Arg-Gly³⁷-OH (SEQ ID nr 1) i pochodne tego peptydu, przy czym peptyd ten może stanowić farmaceutycznie dopuszczalną kwasową sól addycyjną peptydu; farmaceutycznie dopuszczalną sól karboksylanową peptydu; farmaceutycznie dopuszczalny niższy alkiloester peptydu lub farmaceutycznie dopuszczalny amid peptydu, dobrany z grupy, do której należą: amid, niższy alkiloamid i niższy dialkiloamid. Zastosowanie w wynalazku amidu GLP-1(7-36) lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli jest najbardziej korzystne.

10

Sekwencja aminokwasowa amidu GLP-1(7-36) jest następująca: NH2-His⁷-Ala-Glu-Gly¹⁰-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp¹⁵-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu²⁰-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala²⁵-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala³⁰-Trp-Leu-Val-Lys-Gly³⁵-Arg-NH2 (SEQ ID nr 5).

Najkorzystniejsze jest zastosowanie w wynalazku Val⁸-GLP-1(7-37) OH lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli. Sekwencja aminokwasowa Val⁸-GLP-1(7-37)OH jest następująca:

NH2-His⁷-Val-Glu-Gly¹⁰-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp¹⁵-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu²⁰-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala²⁵-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala³⁰-Trp-Leu-Val-Lys-Gly³⁵-Arg-Gly³⁷-OH (SEQ ID nr 5).

Peptydy mogą być zmieszane z jedną lub kilkoma zarobkami przed ich zastosowaniem według wynalazku. Na przykład, związek czynny można połączyć w kompleks z dwuwartościowym kationem metalu znanymi sposobami. Do takich kationów metali należą na przykład Zn⁺⁺, Mn⁺⁺, Fe⁺⁺, Co⁺⁺, Cd⁺⁺, Ni⁺⁺ i tym podobne.

Korzystnie peptyd połączony jest w kompleks z cynkiem.

W celu uzyskania kontroli czasu działania można stosować dodatkowe sposoby farmaceutyczne.

Zgodnie z korzystnym zastosowaniem wytwarza się lek, który jest preparatem o kontrolowanym uwalnianiu.

Korzystnie taki preparat zawiera cząsteczki substancji polimerowej.

Polimery stosuje się w celu utworzenia kompleksów lub absorpcji związku czynnego. Wydłużony czas działania można osiągnąć poprzez dobór odpowiednich makrocząsteczek, na przykład poliestrów, kwasów poliaminowych, poliwinylopirolidonu, octanu etylenowinylowego, metylocelulozy, karPL 191 627 B1 boksymetylocelulozy lub siarczanu protaminy, i poprzez dobór stężenia makrocząsteczek, jak również sposobów ich włączania. Inny możliwy sposób wydłużenia czasu działania poprzez wytworzenie preparatów o kontrolowanym uwalnianiu stanowi włączenie związku czynnego do substancji polimerowych, takich jak poliestry, kwasy poliaminowe, hydrożele, kwas polimlekowy lub kopolimery etylenowo-winylooctanowe. Szczególnie korzystny jest kwas polimlekowy.

Zamiast włączania związku do tych cząstek polimerowych można zamykać związek do mikrokapsułek wytwarzanych, na przykład, poprzez koacerwację lub polimeryzację międzyfazową, na przykład, odpowiednio, do mikrokapsułek hydroksymetylocelulozowych lub żelatynowych, lub do koloidalnych systemów uwalniania leku, na przykład liposomów, mikrosfer albuminowych, mikroemulsji, nanocząsteczek i nanokapsułek, lub do makroemulsji. Sposoby te są znane specjalistom i opisane na przykład w Remington's Pharmaceutical Sciences, 1980.

Lek można podawać dowolną drogą, którą lekarz uzna za skuteczną, z tym wyjątkiem, że podawanie pozajelitowe bezpośrednio do ośrodkowego układu nerwowego nie jest drogą opisywaną ani zastrzeżoną w niniejszym wynalazku. Korzystne jest obwodowe, pozajelitowe podawanie preparatu. W piśmiennictwie medycznym pojęcie podawanie pozajelitowe oznacza zwykle wstrzyknięcie postaci dawkowej do organizmu jałową strzykawką lub innym urządzeniem mechanicznym, na przykład pompą infuzyjną. Według niniejszego wynalazku wytwarza się lek do podawania na drodze obwodowej pozajelitowej, w tym dożylnie, domięśniowo, podskórnie i dootrzewnowo. Korzystne są drogi podawania: dożylna, domięśniowa i podskórna. Jeszcze korzystniejsze są drogi podawania: dożylna i podskórna. Najkorzystniej wytwarza się lek do podawania przez podskórne iniekcje.

Do podawania pozajelitowego związek czynny korzystnie łączy się z wodą destylowaną w odpowiednim pH.

Niektóre związki według niniejszego wynalazku, powodujące utratę masy ciała, mogą również nadawać się do podawania doustnego, doodbytniczego, donosowego lub do dolnych odcinków dróg oddechowych; drogi te stanowią drogi nie-pozajelitowe. Z tych dróg nie-pozajelitowych korzystne jest podawanie peptydów do dolnych odcinków dróg oddechowych. W patentach Stanów Zjednoczonych nr 5284656 i 5364838 opisano różne preparaty związków peptydowych do podawania do dolnych odcinków dróg oddechowych. W publikacji WO96/19197 opisano preparaty aerozolowe różnych peptydów odpowiednie do zwiększania wchłaniania w dolnych odcinkach dróg oddechowych związków. Zgodnie z korzystnym wariantem wynalazku wytwarza się lek do podawania poprzez dolny odcinek dróg oddechowych oraz do podawania doustnego. Można ewentualnie dodawać jeden lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych środków o działaniu przeciwbakteryjnym, przy czym szczególnie korzystny jest metakrezol lub fenol. Dla zapewnienia izotoniczności preparatu można dodawać jedną lub więcej zaróbek. Korzystnie zaróbkę nadającą izotoniczność stanowi gliceryna.

W celu nadania odpowiedniej siły jonowej lub ciśnienia osmotycznego można dodawać jedną lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych soli.

Związek czynny według niniejszego wynalazku można ewentualnie łączyć z farmaceutycznie dopuszczalnym buforem, a pH doprowadzać do wartości zapewniającej dopuszczalną stabilność i wartość pH odpowiednią do podawania pozajelitowego.

Wytwarzanie związków

Sposoby wytwarzania związków czynnych stosowanych w wynalazku, a mianowicie GLP-1, analogu GLP-1 lub pochodnej GLP-1, i dowolnego pokrewnego związku zawierającego fragment czynny wpływający na masę ciała przy podawaniu obwodowym, są dobrze znane i opisane w patentach Stanów Zjednoczonych nr 5118666, 5120712 i 5523549.

Część aminokwasową związku czynnego stosowanego w wynalazku, lub jego prekursora, wytwarza się poprzez 1) syntezę fazy stałej 2) oczyszczanie cząsteczek GLP z naturalnych źródeł 3) rekombinacyjną technologię DNA lub 4) połączenie tych sposobów. Synteza fazy stałej polipeptydów jest dobrze znana ze stanu techniki i opisana w ogólnych publikacjach z tej dziedziny, jak na przykład: Dugas i Penney 1981; Merrifield 1962; Stewart i Young 1969.

Część aminokwasową można wytwarzać na przykład sposobami syntezy fazy stałej, stosując urządzenie do syntezy peptydów 430A (PE Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404) i cykle syntezy z firmy PE Applied Biosystems. Aminokwasy BOC i inne odczynniki są dostępne w handlu w firmie PE Applied Biosystems i innych firmach chemicznych. W celu wytworzenia karboksamidów C-końcowych do początkowych żywic p-metylobenzohydryloaminowych stosuje się sekwencyjną syntezę BOC z zastosowaniem podwójnego sprzęgania. W celu wytworzenia kwasów C-końcowych stosuje się odpowiednią żywicę PAM. Asn, Gln i Arg sprzęga się z zastosowaniem

PL 191 627 B1 wytworzonych wstępnie estrów hydroksybenzotriazolowych. Można stosować następujące grupy zabezpieczające w łańcuchu bocznym:

Arg, tosylowa

Asp, cykloheksylowa

Glu, cykloheksylowa

Ser, benzylowa

Thr, benzylowa

Tyr, 4-bromokarbobenzylowa.

Odłączenia grup zabezpieczających BOC można dokonać stosując kwas trójfluorooctowy w chlorku metylenowym. Po zakończeniu syntezy peptydy można pozbawić grup zabezpieczających i odciąć od żywicy bezwodnym fluorkiem wodoru (HF) zawierającym 10% metakrezol. Odcinanie grupy (grup) zabezpieczających łańcucha bocznego i peptydu od żywicy prowadzi się w temperaturze od -5°C do 5°C, korzystnie, na lodzie, przez 60 minut. Po usunięciu HF peptyd/żywicę płucze się eterem, peptyd ekstrahuje lodowym kwasem octowym i liofilizuje.

Do wytwarzania związku czynnego stosowanego w wynalazku można stosować sposoby znane specjalistom z zakresu rekombinacyjnej technologii DNA. Sposoby rekombinacyjne DNA mogą być bardziej korzystne z uwagi na większą wydajność. Podstawowe etapy wytwarzania rekombinacyjnego są następujące:

a) izolowanie naturalnej sekwencji DNA, kodującej cząsteczkę GLP-1 do stosowania w wynalazku lub wytwarzanie syntetycznego lub półsyntetycznego DNA kodującego sekwencję cząsteczki DNA,

b) wprowadzenie sekwencji kodującej do wektora ekspresyjnego w sposób odpowiedni dla ekspresji białek, samych lub w postaci białek fuzyjnych;

c) transformacji odpowiedniej eukariotycznej lub prokariotycznej komórki-gospodarza wektorem ekspresyjnym

d) hodowli transformowanej komórki-gospodarza w warunkach umożliwiających ekspresję cząsteczki GLP-1, i

e) odzyskiwania i oczyszczania wytworzonej rekombinacyjnie cząsteczki GLP-1.

Jak stwierdzono uprzednio, sekwencje kodujące mogą być w pełni syntetyczne lub stanowić wynik modyfikacji większych cząsteczek natywnego DNA kodującego glukagon. Sekwencję DNA kodującą preproglukagon przedstawili Lund i wsp., (1982) i można ją stosować jako substancję początkową w półsyntetycznym wytwarzaniu związków do stosowania w wynalazku poprzez zmianę sekwencji natywnej dla osiągnięcia korzystnych wyników. Sposobami znanymi ze stanu techniki można wytwarzać geny syntetyczne, których transkrypcja i translacja in vitro lub in vivo powoduje wytwarzanie cząsteczki GLP-1. Ze względu na naturalną degenerację kodu genetycznego, specjalista stwierdzi, że można wytwarzać dużą, lecz ograniczoną liczbę sekwencji DNA kodujących cząsteczki GLP-1 do stosowania w wynalazku.

Sposób wytwarzania syntetycznych genów jest znany ze stanu techniki (Brown i wsp., 1979). Sekwencję DNA określa się na podstawie korzystnej sekwencji aminokwasowej z zastosowaniem kodu genetycznego, który łatwo oznaczy biolog. Po dokonaniu określenia samą sekwencję można wytwarzać stosując konwencjonalne urządzenie do syntezy DNA, na przykład Model 380A lub 380B (PE Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404).

W celu uzyskania ekspresji części aminokwasowej związku do stosowania w wynalazku, syntetyczną sekwencję DNA, wytworzoną sposobami inżynierii genetycznej, wprowadza się do dowolnego z wielu odpowiednich rekombinacyjnych wektorów ekspresyjnych DNA z zastosowaniem odpowiednich endonukleaz restrykcyjnych (Maniatis i wsp., 1989). W celu ułatwienia izolowania z wektorów ekspresyjnych znanych ze stanu techniki, wprowadzania do takich wektorów i powielania DNA z ich użyciem, na każdy koniec DNA kodującego cząsteczkę GLP-1 wprowadza się miejsca cięcia endonukleazy restrykcyjnej. Konkretna zastosowana endonukleaza będzie zależeć od wzorca cięcia endonukleazy restrykcyjnej zastosowanego macierzystego wektora ekspresyjnego. Miejsca restrykcyjne dobiera się w taki sposób, aby uzyskać odpowiednią orientację sekwencji kodującej względem sekwencji kontrolnych, zapewniając w ten sposób właściwy odczyt w ramce i ekspresję korzystnego białka. Sekwencja kodująca musi być umieszczona w taki sposób, aby znajdować się w odpowiedniej ramce odczytu z promotorem i miejscem wiązania rybosomu wektora ekspresyjnego, przy czym zarówno promotor, jak i rybosom są czynne w komórce-gospodarzu, w której uzyskuje się ekspresję białka.

W celu zapewnienia skutecznej transkrypcji genu syntetycznego musi on być połączony w sposób umożliwiający działanie z regionem promotora-operatora. Tak więc, region promotoraPL 191 627 B1 operatora genu syntetycznego umieszcza się w tej samej orientacji sekwencyjnej w odniesieniu do kodonu start ATG genu syntetycznego.

Ze stanu techniki znane są liczne wektory ekspresyjne, nadające się do transformacji komórek eukariotycznych i prokariotycznych (por. katalog Promega 1992 i katalog Stratagene 1992). Opisano również, w patencie Stanów Zjednoczonych nr 4710473, plazmidowe wektory transformacyjne utworzone z kolistego DNA, korzystne do uzyskiwania wysokiego poziomu ekspresji genów egzogennych w E. coli. Plazmidy te są korzystne jako wektory transformacyjne w sposobach rekombinacji DNA i (a) nadają plazmidowi zdolność do autonomicznej replikacji w komórce-gospodarzu;

(b) kontrolują autonomiczną replikację w zależności od temperatury, w której utrzymywane są hodowle komórek-gospodarzy;

(c) stabilizują utrzymanie plazmidu w populacji komórek-gospodarzy;

(d) kierują syntezą produktu białkowego, wskazującego na utrzymywanie się plazmidu w populacji komórek-gospodarzy;

(e) dostarczają seryjnych miejsc rozpoznawania endonukleazy restrykcyjnej swoistej dla plazmidu, i (f) kończą transkrypcję mRNA.

Te koliste plazmidy DNA są korzystne jako wektory w sposobach rekombinacji DNA w celu zapewnienia wysokiego poziomu ekspresji genu egzogennego.

Po wytworzeniu wektora ekspresyjnego dla części aminokwasowej związku do stosowania w wynalazku, następnym etapem jest wprowadzenie wektora do odpowiedniej komórki i w ten sposób wytworzenie rekombinacyjnej komórki-gospodarza, korzystnej dla uzyskania ekspresji polipeptydu. Sposoby transformacji komórek rekombinacyjnymi wektorami DNA są znane ze stanu techniki i opisano je w takich publikacjach ogólnych, jak na przykład Maniatis i wsp., jw. Komórki-gospodarzy można wytwarzać z komórek eukariotycznych lub prokariotycznych.

Prokariotyczne komórki-gospodarze wytwarzają zwykle białko z większą prędkością i są łatwiejsze w hodowli. Białka wytworzone w układach wysokiego poziomu ekspresji bakteryjnej cechują się agregacją w granulkach lub ciałkach wtrętowych, zawierających wysoki poziom białka, które uległo nadmiernej ekspresji. Takie agregaty białkowe typowo należy zebrać, rozpuścić, denaturować i odtworzyć ich strukturę z zastosowaniem sposobów znanych ze stanu techniki (Kreuger i wsp., 1990; patent Stanów Zjednoczonych nr 4923967).

Wytwarzanie analogów i pochodnych GLP-1

Zmian prekursorowego GLP-1 lub sekwencji aminokwasowej GLP-1, w celu wytworzenia analogu lub pochodnej GLP-1 lub ich aktywnego fragmentu, dokonuje się sposobami znanymi ze stanu techniki, takimi jak modyfikacja chemiczna, modyfikacja enzymatyczna lub połączenie modyfikacji chemicznej i enzymatycznej. Do wytwarzania cząsteczek GLP-1 do stosowania w wynalazku korzystne mogą być także klasyczne sposoby fazowe i sposoby półsyntetyczne. Sposoby wytwarzania cząsteczek GLP-1 do stosowania w wynalazku są znane specjalistom.

Dodania grupy acylowej do grupy aminowej epsilon Lys³⁴ można dokonać stosując jeden z wielu sposobów znanych ze stanu techniki (Bioconjugate Chem. 1990; Hashimoto i wsp., 1989). Można na przykład dodawać ester N-hydroksy-bursztynoimidowy kwasu oktanoilowego do aminy lizylo-epsilon, stosując 50% acetonitryl w buforze boranowym. Acylacji peptydu można dokonywać przed lub po dodaniu grupy imidazolowej. Ponadto, jeżeli peptyd wytwarza się rekombinacyjnie, możliwa jest acylacja przed cięciem enzymatycznym. Można również dokonywać acylacji lizyny w pochodnej GLP-1, jak to opisano w WO 96/29342.

Uprzednio opisywano istnienie i sposoby wytwarzania wielu zabezpieczonych, niezabezpieczonych i częściowo zabezpieczonych, naturalnych i nienaturalnych, czynnościowych analogów i pochodnych cząsteczek amidu GLP-1(7-36) i GLP-1(7-37) (patenty Stanów Zjednoczonych nr 5120712; 5545618 i 5118666; Orskov i wsp., 1989; WO 91/11457).

Ewentualnie reszty aminokwasowe końca aminowego i karboksylowego pochodnych GLP-1 mogą być zabezpieczone, lub ewentualnie tylko jeden z końców jest zabezpieczony. Reakcje tworzenia i usuwania takich grup zabezpieczających opisano w publikacjach znanych specjalistom, jak na przykład Protective Groups in Organie Chemistry 1973; Green 1981; Schroder i Lϋbke, 1965. Do przykładowych grup aminozabezpieczających należą na przykład grupa formylowa, acetylowa, izopropylowa, butoksykarbonylowa, fluorenylometoksykarbonylowa, karbobenzoksylowa i tym podobne. Do przykładowych grup karboksyzabezpieczających należą na przykład ester benzylowy, ester metylowy, ester etylowy, ester t-butylowy, ester p-nitrofenylowy i tym podobne.

PL 191 627 B1

Karboksykońcowe pochodne GLP-1 z niższym estrem alkilowym do stosowania w wynalazku wytwarza się poprzez poddanie reakcji odpowiedniego (C1-C4)alkanolu z odpowiednim polipeptydem w obecności kwasu katalitycznego, takiego jak kwas solny. Odpowiednie warunki takiej reakcji wytwarzania estru alkilowego stanowią: temperatura reakcji około 50°C i czas reakcji od około 1 godziny do około 3 godzin. Podobnie można wytwarzać pochodne estru alkilowego reszt Asp i/lub Glu.

Wytwarzanie pochodnej karboksyamidowej związku do stosowania w wynalazku prowadzi się na przykład w sposób opisany przez Stewart i wsp., 1984.

Według niniejszego wynalazku można stosować farmaceutycznie dopuszczalną sól GLP-1, analogu GLP-1 lub pochodnej GLP-1. Do kwasów stosowanych zwykle do wytwarzania kwasowych soli addycyjnych należą kwasy nieorganiczne, takie jak kwas solny, bromowodorowy, jodowodorowy, siarkowy, fosforowy i tym podobne, i kwasy organiczne, takie jak kwas p-toluenosulfonowy, metanosulfonowy, szczawiowy, p-bromofenylosulfonowy, węglowy, bursztynowy, cytrynowy, benzoesowy, octowy i tym podobne. Przykłady takich soli stanowią siarczan, pirosiarczan, dwusiarczan, siarczyn, dwusiarczyn, fosforan, jednowodorofosforan, dwuwodorofosforan, metafosforan, pirofosforan, chlorek, bromek, jodek, octan, propionian, dekanoesan, kaprylan, akrylan, mrówczan, izomaślan, kapronian, heptanoesan, propiolan, szczawian, malonian, bursztynian, cykloheptanian, sebacynian, fumaran, maleinian, butyno-1,4-dioesan, heksyno-1,6-dioesan, benzoesan, chlorobenzoesan, metylobenzoesan, dinitrobenzoesan, hydroksybenzoesan, metoksybenzoesan, ftalan, sulfonian, ksylenosulfonian, fenylooctan, fenylopropionian, fenylomaślan, cytrynian, mleczan, gamma-hydroksymaślan, glikolan, winian, metanosulfonian, propanosulfonian, naftaleno-1-sulfonian, naftaleno-2-sulfonian, migdalan i tym podobne. Korzystne kwasowe sole addycyjne stanowią sole wytworzone z kwasów nieorganicznych, takich jak kwas solny i bromowodorowy, zwłaszcza kwas solny.

Do zasadowych soli addycyjnych należą sole pochodzące z zasad nieorganicznych, takich jak wodorotlenki amonowe, alkaliczne lub metali ziem alkalicznych, węglany, dwuwęglany i tym podobne. Do takich zasad korzystnych do wytwarzania soli do stosowania w wynalazku należą wodorotlenek sodowy, wodorotlenek potasowy, wodorotlenek amonowy, węglan potasowy i tym podobne. Szczególnie korzystne są postacie soli.

Receptory GLP-1 i kaskadę trandsukcji sygnału zapoczątkowaną przez wiązanie ligandu z receptorem GLP-1 opisano w WO96/25487; Thorens, 1992; Thorens i wsp., 1993; Widman i wsp., 1994. Receptor GLP-1 jest białkiem błonowym z siedmioma domenami przezbłonowymi, sprzężonym z heterotrimerycznymi białkami G, stanowiącymi połączenie pomiędzy aktywacją receptora przez związanie ligandu a wytwarzaniem wewnątrzkomórkowych przekaźników drugiego rzędu, zwłaszcza cyklicznego monofosforanu (cAMP). cAMP z kolei aktywuje swoistą kinazę białkową, zależną od cAMP kinazę białkową (kinaza białkowa A, PKA). Enzym ten powoduje fosforylację pewnej liczby kluczowych elementów reakcji, znajdujących się w regionie promotora niektórych genów. W komórkach b trzustki i innych komórkach neuroendokrynnych fosforylacja pewnych swoistych białek regulowanego szlaku wydzielania pobudza wydzielanie peptydu poprzez pobudzanie egzocytozy granulek wydzielniczych. Znanych jest wiele związków pobudzających wydzielanie endogennego GLP-1. Na przykład, ekspozycja komórek STC-1 na niektóre substancje pobudzające wydzielanie, jak na przykład substancja aktywująca cyklazę adenylową - forskolina - lub substancja pobudzająca kinazę C - 12-O-tetradekanoilofobolo-13-octan (TPA), powoduje istotne zwiększenie uwalniania GLP-1 (Abello i wsp., 1994). Wiadomo, że linia komórkowa STC-1, pochodząca z guza jelit myszy transgenicznych posiadających onkogeny zwiększające wydzielanie insuliny, oraz komórki STC-1, zawierają transkrypty m-RNA proglukagonu, z którego wytwarza się GLP-1. Wiadomo także, że niektóre związki, takie jak somatostatyna, polipeptyd hamujący wydzielanie soku żołądkowego, zależny od glukozy peptyd insulinotropowy, bombezyna, peptyd związany z genem kalcytoniny, peptyd uwalniający gastrynę, agoniści cholinergiczni, agonista b-adrenergiczny, izoproterenol i muskarynowy agonista cholinergiczny - betanechol - powodują uwalnianie endogennego GLP-1 (Plaisancie i wsp., 1994; Orskov i wsp., 1986; Brubaker, 1991; Buchan i wsp., 1987).

Dawka

Dawka GLP-1, analogu GLP-1, pochodnej GLP-1 lub fragmentu czynnego, skuteczna u danego osobnika dla spowodowania spadku masy ciała, zależy od wielu czynników, takich jak płeć, masa ciała i wiek osobnika, przyczyny otyłości, droga podawania i biodostępność, utrzymywanie się podanego związku w organizmie, rodzaju preparatu i siły jego działania. Przy podawaniu nieciągłym dawka jednorazowa powinna również uwzględniać odstęp między dawkami i biodostępność podawanego związku. Przy podawaniu ciągłym korzystna prędkość podawania wynosi od 0,25 do 6 pmol/kg masy

PL 191 627 B1 ciała/min., korzystniej, od około 0,5 do około 1,2 pmol/kg/min. Lekarz jest w stanie dostosować dawkę i prędkość podawania preparatów zawierających GLP-1, analogi GLP-1 lub pochodne GLP-1, lub ich aktywne fragmenty, w taki sposób, aby osiągnąć zamierzone działanie kliniczne, to znaczy zmniejszenie masy ciała.

Preparat farmaceutycznie dopuszczalny oznacza nadający się do podawania ludziom, to znaczy, nie zawierający elementów toksycznych, niepożądanych zanieczyszczeń lub tym podobnych, i nie zaburzający aktywności znajdujących się w nim związków czynnych.

Niniejszy wynalazek będzie łatwiejszy do zrozumienia w odniesieniu do konkretnego przykładu, który podajemy w celu zilustrowania, nie zaś ograniczenia niniejszego wynalazku.

Przykład 1

Czterem pacjentom z cukrzycą nieinsulinozależną (NIDDM) (3 mężczyznom, 1 kobiecie, wiek: 60,2±1,8 lat, początkowy BMI: 33,5±1,4 kg/m², początkowa masa ciała: 97,5±6,5 kg; początkowy stosunek obwodu pasa do obwodu bioder: 0,946±0,036, początkowa : 7,1±0,3%; poziom glukozy na czczo: 7,2±1,1mM) podawano ciągły podskórny wlew amidu GLP-1(7-36) przez cztery tygodnie. Roztwory GLP-1 wytworzono poprzez połączenie 100 nmol amidu GLP-1(7-36) i 0,025 ml roztworu albuminy ludzkiej (20%) i doprowadzenie pH do 4 z zastosowaniem 5 molowego kwasu octowego, i na koniec doprowadzenie objętości do 1ml z użyciem soli fizjologicznej. Roztwór podawano z prędkością podawania GLP-1 1,2 pmol/kg/min. Wolumetryczna prędkość podawania pompą Minimed (Minimed Europe, Paris), stosowaną do podawania roztworu GLP-1, wynosiła 0,05-0,07 ml/h. Miejsce podawania podskórnego stanowił brzuch.

To leczenie GLP-1 porównano z dwoma tygodniami intensywnego leczenia insuliną przed i po wlewie GLP-1. W okresach leczenia insuliną insulinę podawano podskórnie przed każdym posiłkiem (por. Tabela 1). W czasie wlewu GLP-1 nie podawano insuliny. Zarówno w czasie obu okresów leczenia insuliną, jak i w czasie leczenia GLP-1, chorzy przestrzegali standardowej diety cukrzycowej, utworzonej z około 55% węglowodanów, 30% tłuszczu i 15% białka (w przeliczeniu na kalorie). Nie prowadzono ćwiczeń fizycznych u tych chorych. Chorzy nie byli hospitalizowani - przez cały czas trwania badania pozostawali pacjentami ambulatoryjnymi.

W czasie leczenia GLP-1 czterech chorych straciło średnio po 3,5±1,2 kg masy ciała, podczas gdy w czasie pierwszych dwóch tygodni leczenia insuliną stracili zaledwie 1,3±0,6 kg, a w czasie drugich dwóch tygodni leczenia insuliną średnio przybyli na wadze. Wszystkie wartości są wartościami indywidualnymi, lub średnią ±SEM (błąd standardowy średniej). Brak jest danych dla pacjenta MP z drugiego okresu leczenia insuliną.

Tabel a 1

Schemat leczenia insuliną. Cztery wartości oznaczają ilość insuliny podawanej podskórnie (IU) każdemu pacjentowi bezpośrednio przed każdym z czterech posiłków dziennie. Pierwszy okres leczenia insuliną miał miejsce przed, a drugi -po 4 tygodniach leczenia GLP-1

Pacjent	Pierwszy okres leczenia insuliną (2 tygodnie)	Drugi okres leczenia insuliną (2 tygodnie)
VN	47; 39; 35; 53	21; 20; 28; 26
NW	12; 13; 11; 12	11; 10; 12; 12
HF	11; 10; 12; 56	11; 10; 12; 12
MP	20; 14; 34; 30

PL 191 627 B1

Tabel a 2

Masa ciała chorych i zmiana masy ciała. Amid GLP-1(7-36) podawano przez ciągły wlew podskórny przez 4 tygodnie, bezpośrednio po i przed dwutygodniowymi okresami leczenia insuliną

Masa ciała (kg)	Zmiana masy ciała (kg)
Pajent	Początek	Pierwsze 2 tyg. insuliny	GLP-1 4 tyg.	Drugie 2 tyg. insuliny	Pierwsze 2 tyg. insuliny	GLP-1 4 tyg.	Drugie 2 tyg. insuliny
VN	101,5	99,0	92,0	95,0	-2,5	-7,0	3,0
NW	113,0	111,0	108,0	108,0	-2,0	-3,0	0,0
HF	94,0	93,5	91,5	91,5	-0,5	-2,0	0,0
MP	82,0	81,9	80,0	-	-0,1	-1,9	-
	97,5±6,5	96,4±6,0	92,9±5,8	98,2±5,0	-1,3±0,6	-3,5±1,2	+ 1,0±1,0

Cytowane piśmiennictwo

Poniższe publikacje zawierają informacje ułatwiające zastosowanie wynalazku; patenty Stanów

Zjednoczonych włącza się przez przywołanie w Stanach Zjednoczonych.

Abello, J., et al., Endocrinol. 139:2011-2017 (1994)

American Diabetes Association, Detection and Management of Lipid Disorders in Diabetes,

Consensus Statement, Diabetes Care 16:86-93 (1995)

American Diabetes Association, Standards of Medical Care for patients with Diabetes Mellitus,

Consensus Statement, Diabetes Care 18:8-15 (1995)

Billock, H.P i wsp., Endocrinology 137:2968-2978 (1996)

Boconjugate Chem, Chemical Modifications of Proteins; History and Applications str. 1, 2-12 (1990)

Brown, i wsp., Methods in Enzymology, Academic Press, N.Y., 68:109-251 (1979)

Brubaker, P.L, Endocrinol. 128:3175-3182 (1991)

Buchan, A.M.J., i wsp., Gastroenterol. 93:791-800 (1987)

Dugas, H , i Penney, C., Bioorganic Chemistry, Springer-Verlag, New York, str. 54-92 (1981) Fehmann, H.-C., i wsp., Endocrinology 130:159-166 (1992)

Fehmann, H.-C., i wsp., Endocr. Rev. 16:390-410 (1995)

Green, T,H., Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, New York (1981)

Gutniak M., i wsp., New England J. Med. 326:1316-1322 (1992)

Hashimoto i wsp., Pharmaceutical Res. 6 (2):171-176 (1989)

Kanse, S.M., i wsp., FEBS Lett, 241 209-212 (1988)

Krcymann B., i wsp., Lancet 2:1300-1303 (1987)

Krcymann, i wsp., Brain Research 502:325-331 (1989)

Kreuger, i wsp., w: Protein Folding, pod red. Gierasch i King, str. 136-192, American Association for the Advancement of Science Publication No. 89-18S, Washington, D.C. (1990)

Lund, i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79:395-349 (1982)

Maniatis i wsp., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory

Press, N.Y., t. 1-3 (1989)

Mentlein. R.,i wsp., Eur. J. Biochem., 214:829-835 (1993)

Merrifield, J.M., Chem. Soc., 85:2199 (1962)

Mojsov, S. i wsp., J. Biol. Chem. 261: 11880-11889 (1986)

Mojsov, S., Int. J. Peptide Protein Research, 90:333393 (1992)

Morley, J.E., Endocr. Rev. 8:256-287 (1987)

Nauck, M. A. i wsp., J. Clin. Invest. 91:301-307 (1993)

Nilsson, 0., i wsp., Endocrinol. 129:139-148 (1991)

Oben, J. i wsp., J Endocrinol. 130:267-272 (1991)

Orskov, C., i wsp., Endocrinol. 119:1467-1475 (1986)

Orskov, C., i wsp., J. Biol. Chem. 264 (22):12826-12829 (1969)

Orskov, C., i wsp., Diabetologia 38 (Supl. 1, 25 Abstrakt):A39 (1995)

Orskov, C., i wsp., Diabetes 45:832-835 (1995)

PL 191 627 B1

O' Shea, i wsp., NeuroReport 7:830-832 (1996)

Plaisancie, P., wsp., Endocrinol, 135:2398-2403 (1994)

The Promega Biological Research Products Catalogue, Promega Corp., 2800 Woods Hollow

Road, Madison, WI, 53711-5399 (1992) Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, Londyn i Nowy Jork (1973)

Remington's Pharmaceutical Sciences (1980)

Rowland, N.E., i wsp., Nutrition 12:626-639 (1996)

Ruiz-Grande, C.,i wsp., Peptides 13:13-16 (1992)

Schroder i Lϋbke The Peptides, t. 2, Academic Press, Londyn i Nowy Jork (1965)

Stewart i Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman, SanFrancisco str. 29-66 (1969) Stewart, J. M., i wsp., Solid Phase Peptide Synthesis, PierceChemical Company Press, (1989) The Stratagene Cloning Systems Catalogue, Stratagene Corp.,

11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA, 92037 (1992)

Suzuki S., i wsp., Endocrinol. 125:3109-3114 (1989)

Thorens, B, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8642-8645 (1992)

Thorens, B.,i wsp., Diabetes 42:1678-1682 (1993)

Turtan, M.D., i wsp., Nature 379:69-72 (1996)

Patent Stanów Zjednoczonych nr 4,710,473 Patent Stanów Zjednoczonych nr 4 923, 967 Patent Stanów Zjednoczonych nr 5118,666 Patent Stanów Zjednoczonych nr 5,120,712 Patent Stanów Zjednoczonych nr 5,284,656 Patent Stanów Zjednoczonych nr 5,364,838 Patent Stanów Zjednoczonych nr 5,512,549 Patent Stanów Zjednoczonych nr 5,523,549 Patent Stanów Zjednoczonych nr 5,545,618 Valverde, I., i wsp., Endocrinology 132:75-79 (1993)

Villanueva, M.L., i wsp., Diabetologia37:1163-1166(1994)

Widmann, C., i wsp., Mol. Pharmacol. 45:1029-1035 (1994)

WO91/11457 (Buckley, D.I.,i wsp., opublikowane 8sierpnia 1991)

WO96/19197

WO 96/25487 (Thorens, B.i wsp., opublikowane 22 sierpnia 1996)

WO96/29342

WO97/31943 (Thim, L, i wsp., opublikowane 9 września 1997)

Claims (23)

1. Zastosowanie peptydu wykazującego aktywność insulinotropową przez oddziaływanie z receptorem GLP-1, do wytwarzania leku do obwodowego podawania w leczniczym zmniejszaniu masy ciała u człowieka.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wytwarza się lek do leczenia otyłości.

3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wytwarza się lek dla człowieka chorującego na cukrzycę nieinsulinozależną.

4. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że wytwarza się lek dla człowieka chorującego na cukrzycę nieinsulinozależną.

5. Zastosowanie według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, znamienne tym, że peptyd wybiera się spośród GLP-1(7-34), GLP- 1 (7-35), GLP-1(7-36), GLP-1(7-37) lub ich postaci amidu C-końcowego.

6. Zastosowanie według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, znamienne tym, że peptyd wybiera się spośród GLP-1(7-34), GLP- 1(7-35), GLP-1(7-36), GLP-1(7-37) lub ich postaci amidu C-końcowego z co najmniejjedną modyfikacją wybranąz grupy obejmującej:

(a) podstawienie obojętnego aminokwasu, argininy, lub postaci D lizyny zamiast lizyny w pozycji 26 i/lub 34 i/lub obojętnego aminokwasu, lizyny lub postaci D argininy zamiast argininy w pozycji 36;

(b) podstawienie aminokwasu opornego na utlenienie zamiast tryptofanu w pozycji 31;

(c) podstawienie według co najmniej jednego z poniższych wzorców:

Y zamiast V w pozycji 16;

PL 191 627 B1

K zamiast S w pozycji 18;

D zamiast E w pozycji 21;

S zamiast G w pozycji 22;

R zamiast Q w pozycji 23;

R zamiast A w pozycji 24; i Q zamiast K w pozycji 26;

(d) podstawienie zawierające co najmniej jedną z poniższych zmian: inny krótki obojętny aminokwas zamiast A w pozycji 8; inny kwaśny aminokwas lub obojętny aminokwas zamiast E w pozycji 9; inny obojętny aminokwas zamiast G w pozycji 10;

inny kwaśny aminokwas zamiast D w pozycji 15; i (e) podstawienie innego obojętnego aminokwasu lub D- lub N-acylowanej postaci histydyny w pozycji 7.

7. Zastosowanie według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, znamienne tym, że peptyd ma wzór:

R1-X-Glu-Gly¹⁰-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp¹⁵-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu²⁰-Y-Gly-Gln-Ala-Ala²⁵-Lys-Z-Phe-Ile-Ala³⁰-Trp-Leu-Val-Lys-Gly³⁵-Arg-R2 (SEQ ID nr 2)i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, przy czym:

R1 dobiera się z grupy, do której należy L-histydyna, D-histydyna, dezamidohistydyna, 2-aminohistydyna, b-hydroksyhistydyna, homohistydyna, alfa-fluorometylohistydyna i alfa-metylohistydyna;

X dobiera się z grupy, do której należy Ala, Gly, Val, Thr, Ile i alfa-metylo-Ala;

Y dobiera się z grupy, do której należy Glu, Gln, Ala, Thr, Ser i Gly;

Z dobiera się z grupy, do której należy Glu, Gln, Ala, Thr, Ser i Gly;

a R2 dobiera się z grupy, do której należy NH2 i Gly-OH;

pod warunkiem, że punkt izoelektryczny związku pozostaje w zakresie od około 6,0 do około 9,0.

8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że peptyd wybiera się spośród Gly⁸-GLP-1 (7-36)NH2, Val⁸-GLP-1(7-37)OH, a-metylo-Ala⁸-GLP-1(7-36)NH2 i Gly⁸-Gln²¹-GLP-1(7-37)OH.

9. Zastosowanie według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, znamienne tym, że peptydem jest acylowana pochodna peptydu określonego w zastrz. 5, albo 6, albo 7.

10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że peptyd jest acylowany w e-aminowej grupie reszty lizynowej.

11. Zastosowanie według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, znamienne tym, że peptyd jest oporny na działanie dipeptylopeptydazy IV.

12. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienne tym, że peptyd określony w zastrz. 5, albo 6, albo 7, jest połączony w kompleks z cynkiem.

13. Zastosowanie według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, znamienne tym, żelek jest preparatem o kontrolowanym uwalnianiu.

14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że preparat o kontrolowanym uwalnianiu zawiera cząsteczki substancji polimerowej.

15. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że substancją polimerową jest kwas polimlekowy.

16. Zastosowanie według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, znamienne tym, że lek jest do podawania poprzez dolny odcinek dróg oddechowych.

17. Zastosowanie według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, znamienne tym, że lek jest do podawania doustnego.

18. Zastosowanie według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, znamienne tym, że lek jest do podawania poprzez podskórne iniekcje.

19. Zastosowanie według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, znamienne tym, że lek jest kompozycją zawierającą środki przeciwbakteryjne.

20. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że środkiem przeciwbakteryjnym jest metakrezol lub fenol.

21. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że kompozycja zawiera dodatkowo zaróbkę nadającą izotoniczność.

22. Zastosowanie według zastrz. 21, znamienne tym, że zaróbką jest gliceryna.

23. Zastosowanie według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, znamienne tym, że peptyd wybiera się spośród GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP-1(7-36), GLP-1(7-37) lub ich postaci amidowej, i ich farmaceutycznie akceptowalnych soli z co najmniej jedną modyfikacją wybraną z grupy obejmującej:

PL 191 627 B1 (a) podstawienie glicyny, seryny,cysteiny, treoniny, asparaginy, glutaminy, tyrozyny, alaniny, waliny, izoleucyny, leucyny, metioniny, fenyloalaniny, argininy lub D-lizyny zamiast lizyny w pozycji 26 i/lub w pozycji 34; lub podstawienie glicyny, seryny, cysteiny, treoniny, asparaginy, glutaminy, tyrozyny,alaniny,waliny,izoleucyny, leucyny, metioniny,fenyloalaniny,lizyny lub D-argininy zamiast argininy w pozycji 36;

(b) podstawienie opornego na utlenienieaminokwasuzamiast tryptofanu w pozycji 31;

(c) co najmniej jedno z następujących podstawień: tyrozyny zamiast waliny w pozycji 16; lizyny zamiast seryny w pozycji 18; kwasu asparaginowego zamiast glutaminowego w pozycji 21; seryny zamiast glicyny w pozycji 22; argininy zamiast glutaminy w pozycji 23; argininy zamiast alaniny w pozycji 24 i glutaminy zamiast lizyny w pozycji 26; i (d) co najmniej jedno z następujących podstawień: glicyny, serynylubcysteinyzamiastalaniny w pozycji 8; kwasu asparaginowego,glicyny,seryny,cysteiny,treoniny, asparaginy, glutaminy, tyrozyny, alaniny, waliny, izoleucyny, leucyny, metioniny lub fenyloalaniny zamiast kwasu glutaminowego w pozycji 9;seryny,cysteiny,treoniny, asparaginy, glutaminy, tyrozyny, alaniny, waliny, izoleucyny, leucyny, metioniny lub fenyloalaniny zamiast glicyny w pozycji 10; i kwasu glutaminowego zamiast asparaginowego w pozycji 15; i (e) podstawienie glicyny, seryny, cysteiny, treoniny, asparaginy, glutaminy, tyrozyny, alaniny, waliny, izoleucyny, leucyny, metioniny, fenyloalaniny lub D-lub N-acylowanej lub alkilowanej postaci histydyny zamiast histydyny w pozycji 7, przy czym, w przypadku podstawień z punktów (a), (b), (d) i (e) podstawione aminokwasy mogą ewentualnie być w postaci D, natomiast aminokwasy podstawione w pozycji 7 mogą ewentualnie być w postaci N-acylowanej lub N-alkilowanej.