CN105732795A - 一种获得人类甲胎蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种获得人类甲胎蛋白的方法，是把人类甲胎蛋白基因克隆到昆虫细胞的表达载体pFastBac 1、pFastBac Dual或pFastBac1?Gus中，并转化DH10Bac后，获得含有人类甲胎蛋白基因的Bacmid，把Bacmid转染昆虫细胞2～4天后分泌人类甲胎蛋白到培养基中，分泌人类甲胎蛋白经经镍柱和凝胶色谱柱对纯化后可得到活性与从人胚胎血提取的甲胎蛋白相当。本发明利用Sf9、Sf21昆虫细胞真核表达可得到活性较好的人类甲胎蛋白。

Description

一种获得人类甲胎蛋白的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及基因工程及蛋白质工程，尤其涉及一种获得人类甲胎蛋白的方法。
背景技术
甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)是肝癌发生时早期表达的特异性蛋白质，70～80％肝癌病人在发病期间都有AFP基因高表达的特征。AFP基因在胎儿发育过程开放表达，而在人出生两年后基本处于关闭状态，但是成人发生肝癌时，AFP的基因重新被激活而大量表达，因而AFP被用作诊断肝癌的金标准，AFP在临床上认为是肝癌的经典肿瘤标记物。
AFP与人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)的序列相似率为60％，虽然，这两个蛋白的序列相似率很高，但它们的功能完全不同。HSA是血液系统的重要组分，具有结合和运输内源性及外源性物质等生理功能，而AFP具有运输一些类固醇类、脂肪酸类等的功能外，还有促进细胞生长，抑制机体的免疫应答等功能。近二十年来，多个血清白蛋白结构已被解析，但AFP结构一直没被解析。AFP是人类发现的第一个具有临床应用价值的肿瘤标志物，AFP晶体结构的未解析，很大程度上阻碍人们了解AFP的致癌机理及开发抗肝癌药物。
目前，经检索尚未见关于从人体以外途径获得人类甲胎蛋白方法的报道。
发明内容
本发明的目的是提供了一种获得人类甲胎蛋白的方法，利用昆虫细胞真核表达系统表达人类甲胎蛋白，该表达的人类甲胎蛋白活性较好，可以用于甲胎蛋白的结晶及结构解析，及人类甲胎蛋白与其他蛋白的体外相互作用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种获得人类甲胎蛋白的方法，其中：把人类甲胎蛋白全长基因克隆到昆虫细胞表达载体,转化DH10Bac后，获得含有人类甲胎蛋白基因的Bacmid；把Bacmid转染昆虫细胞后，把培养转染昆虫细胞的培养基浓缩纯化获得人类甲胎蛋白。
本发明获得人类甲胎蛋白的方法，具体包括以下步骤：
(1)重组AFP/Bac质粒的获得：
a、根据人类甲胎蛋白全长基因(Gen Bank:NM_001134)，在其N端加上Xba I酶切位点，C端加上6×His标签和Xho I酶切位点，具体合成的AFP基因如序列表中SEQ ID NO:1所示；把合成基因用Xba I和Xho I双酶切，用T4DNA连接酶连接到昆虫表达载体pFastBac 1或pFastBac Dual(Invitrogen)或pFastBac 1-Gus中，转化DH5α细胞后提取质粒验证。图1中，第三泳道是连接好的pFastBac 1-AFP质粒，第二泳道用Xba I和Xho I双酶切验证，2000bp处有AFP大小的片段，说明连接正确；
b、把连接好的质粒转化DH10Bac细胞，并涂在含有卡那霉素，庆大霉素、四环素、IPGT及X-gal组合的LB培养基平板上，培养10～12h后提取重组AFP/Bac质粒；图1中第四泳道是获得重组AFP/Bac质粒；
(2)表达人类甲胎蛋白的昆虫杆状病毒的获得：
a、溶液A：把5～20μL重组AFP/Bac质粒添加到80～100μL的SFX-Insect昆虫细胞培养基(HyClone)中，混匀；
b、溶液B：把8～16μL脂质体Cellfectin Ⅱ(Invitrogen)添加到80～100μL的SFX-Insect昆虫细胞培养基(HyClone)中，混匀；
c、溶液C：把溶液B加入到溶液A中混合，在室温孵育30～45min；加入1～3mLSFX-Insect昆虫细胞培养基到溶液B与溶液A的混合液中，混匀，获得溶液C；
d、将溶液C滴到昆虫细胞表面，25～30℃培养3～6h，弃去溶液C，向昆虫细胞中加入6～10mL含双抗的SFX-Insect昆虫细胞培养基(SFX-Insect培养基为HyClone公司产品；双抗为碧云天公司产品)，25～30℃潮湿条件孵育7～9d后，获得表达人类甲胎蛋白的昆虫杆状病毒；
(3)人类甲胎蛋白的在昆虫细胞中的表达
将表达人类甲胎蛋白的昆虫杆状病毒按体积比1：50～200接种到昆虫细胞中，悬浮培养48～96h后，收集培养基，把培养基过镍柱和凝胶柱(superdex 200)纯化，即可得到人类甲胎蛋白。
(4)表达人类的甲胎蛋白能促进细胞增殖
[3H]掺入法测定人类的甲胎蛋白促进NIH 3T3的增殖能力。用一定量的(0-80mg/L)AFP处理NIH 3T3细胞24h，细胞增殖能力明显提高22～125％，sf9、sf21昆虫细胞真核表达的人类甲胎蛋白相当于从胚胎血提取的甲胎蛋白促细胞增殖能力的96％～98％，而血清白蛋白却没有显著促进细胞增殖能力(图3)。
进一步地，所述昆虫细胞为Sf9昆虫细胞或Sf21昆虫细胞。
进一步地，所述含双抗的SFX-Insect昆虫细胞培养基中，双抗与SFX-Insect昆虫细胞培养基的体积比为1：100。
进一步地，所述步骤(1)中的卡那霉素，庆大霉素、四环素、IPGT及X-gal五个成分按体积比1:1.5:2:1:4组成混合溶液，混合溶液按体积比1:1000添加到LB培养基中。
进一步地，获得的表达蛋白分子量为65-75KD，与从人胚胎血提取的甲胎蛋白活性类似度为96％～98％。
本发明获得的昆虫细胞表达的人类甲胎蛋白活性较好，纯度较高，表达蛋白可以应用于甲胎蛋白的结晶及结构解析，及人类甲胎蛋白与其他蛋白的体外相互作用，为AFP分子的结晶及结构解析提供物质保障。
附图说明
图1：含人类甲胎蛋白基因的昆虫表达载体(AFP/Bac)电泳图。1：Marker；2:重组质粒pFastBac 1-AFP用Xba I和Xho I双酶切验证，2000bp处有AFP大小的片段，说明连接正确；3：重组质粒pFastBac 1-AFP；4：含AFP的重组昆虫病毒表达载体Bacmid。
图2：昆虫表达的人类甲胎蛋白的SDS-PAGE电泳图。1：protein Marker；2：纯化后的未变性(未加还原剂和未煮沸样品)人类甲胎蛋白；3：纯化后的变性(加还原剂和煮沸样品)人类甲胎蛋白。
图3：[3H]掺入法测定人类的甲胎蛋白促进NIH 3T3的增殖能力。用一定量的(0-80mg/L)处理NIH 3T3细胞24h，细胞增殖能力明显提高22～125％，sf9、sf21昆虫细胞表达的人类的甲胎蛋白相当于从胚胎血提取的甲胎蛋白促细胞增殖能力的96％～98％，而血清白蛋白却没有显著促进细胞增殖能力。
具体实施方式
实施例一 利用Sf9昆虫细胞真核、pFastBac1载体表达的人类甲胎蛋白的方法
1.人类甲胎蛋白基因(AFP)与pFastBac1载体经限制性内切酶双酶切后连接，把含载体pFastBac1-AFP的E.coli DH5α菌，按1∶100的比例转接于100mL含氨苄青霉素的培养基中，37℃振荡培养过夜，提取表达质粒。
2.鉴定正确的重组质粒pFastBac1-AFP转化到E.coli DH10Bac中，把连接好的质粒转化DH10Bac细胞，并涂在含有卡那霉素，庆大霉素、四环素、IPGT及X-gal组合的LB培养基平板上(五个成分按比例1:1.5:2:1:4组成混合溶液，混合溶液按体积比1:1000添加到LB培养基中)，进行蓝白斑筛选，利用白斑扩增得到昆虫病毒表达载体Bacmid。
3.昆虫病毒表达载体Bacmid的转染：
a、转染前，先将处于对数生长期的大约密度为2×106个/mL Sf9昆虫细胞，均匀放置于平板中，每个孔中加入2mL昆虫细胞培养基，27℃静置1h，让细胞贴壁，在显微镜下观察到细胞要80％铺满平板。
b、同时准备以下溶液，溶液A：把5～20μL重组AFP/Bac添加到100μL的SFX-Insect昆虫细胞培养基，混匀。溶液B：每次转染，把8～16μL脂质体Cellfectin Ⅱ添加到100μL的SFX-Insect昆虫细胞培养基中，混匀。再把溶液B加入到溶液A中混合，在室温孵育30min。弃去平板中的培养基，注意不要吸出细胞。加入2mL SFX-Insect昆虫细胞培养基到脂质体Cellfectin Ⅱ与AFP/Bac混合液中，混匀后移至Sf9细胞表面，27℃培养5h。弃去脂质体Cellfectin Ⅱ与AFP/Bac混合液，向细胞中加入8mL含双抗的SFX-Insect昆虫细胞培养基，27℃潮湿条件孵育7d后，提取P1病毒株，把P1病毒株按1∶500扩增，7d后获得P2病毒株，同样方法获得P3病毒株。
4.重组蛋白的表达用P3病毒感染处于对数生长期的Sf9细胞(大约细胞密度为2×106个/mL)，接种量为1∶100，摇床转速为100r/min，温度为27℃，48～72h后收获蛋白。
5.重组蛋白分离纯化和鉴定由于蛋白为分泌表达，所以将培养基与细胞混合物8000r/min离心5min后，取上清浓缩后换溶液，溶液为HBS buffer(10mMHepes,pH 7.2,150mM NaCl)。再高速13 000r/min离心60min后，挂镍柱，用300mmol/L的咪唑冲洗。最后用凝胶色谱(AKAT，spudex200柱)纯化，流动相为HBS buffer(10mM Hepes,pH 7.2,150mM NaCl)，流速为1mL/min。纯化的重组表达人类的甲胎蛋白SDS-PAGE电泳图如图2所示，未变性(未加还原剂和未煮沸样品)人类甲胎蛋白电泳条带显现倾斜，分子量大约67KD。纯化后的变性(加还原剂和煮沸样品)人类甲胎蛋白电泳分子量大约70KD，与全长甲胎蛋白分子量相符。
6.[3H]掺入法测定人类的甲胎蛋白促进NIH 3T3的增殖能力。用一定量的(0-80mg/L)本实施例重组表达人类的甲胎蛋白处理NIH 3T3细胞24h，细胞增殖能力明显提高22～124％，一定量的(0-80mg/L)从胚胎血提取的甲胎蛋白促细胞增殖能力大约是21～120％，因此本实施例sf9昆虫细胞表达的人类甲胎蛋白在促进NIH 3T3细胞增殖能力是人胚胎血提取的甲胎蛋白的97％(图3)。
实施例二 利用Sf9昆虫细胞真核、pFastBac Dual载体表达的人类甲胎蛋白的方法
1.人类甲胎蛋白基因与pFastBac Dual载体经限制性内切酶双酶切后连接，把连接好的载体转化到E.coli DH10Bac，获得表达人类甲胎蛋白的Bacmid.把该Bacmid转染Sf9昆虫细胞。
2.转染前，先将处于对数生长期的大约密度为2×106个/mL Sf9昆虫细胞，均匀放置于平板中，每个孔中加入2mL昆虫细胞培养基，27℃静置1h，让细胞贴壁，在显微镜下观察到细胞要80％铺满平板。
同时准备以下溶液，溶液A：把5μL重组AFP/Bac添加到100μL的SFX-Insect昆虫细胞培养基，混匀。溶液B：每次转染，把16μL脂质体CellfectinⅡ添加到100μL的SFX-Insect昆虫细胞培养基中，混匀。再把溶液B加入到溶液A中混合，在室温孵育30min。弃去平板中的培养基，注意不要吸出细胞。加入2mL SFX-Insect昆虫细胞培养基到脂质体Cellfectin Ⅱ与AFP/Bac混合液中，混匀后移至Sf9细胞表面，28℃培养5h。弃去脂质体Cellfectin Ⅱ与AFP/Bac混合液，向细胞中加入8mL含双抗的SFX-Insect昆虫细胞培养基，28℃潮湿条件孵育7d后，提取P1病毒株，把P1病毒株按1∶500扩增，5～9d后获得P2病毒株，同样方法获得P3病毒株。
3.重组蛋白的表达用P3病毒感染处于对数生长期的Sf9细胞(大约细胞密度为2×106个/mL)，接种量为1∶100，摇床转速为150r/min，温度为28℃，48～96h后收获蛋白。
4.纯化过程与实施例一相同。
5.[3H]掺入法测定本实施例方法表达的人类甲胎蛋白促进NIH 3T3的增殖能力相当于人胚胎血提取的甲胎蛋白的96％。
实施例三 利用Sf21昆虫细胞真核、pFastBac 1载体表达的人类甲胎蛋白的方法
1.人类甲胎蛋白基因与pFastBac 1载体经限制性内切酶双酶切后连接，把连接好的载体转化到E.coli DH10Bac，获得表达人类甲胎蛋白的Bacmid.把该Bacmid转染Sf21昆虫细胞。
2.转染前，先将处于对数生长期的大约密度为1～3×106个/mL Sf21昆虫细胞，均匀放置于平板中，每个孔中加入2mL昆虫细胞培养基，27℃静置1h，让细胞贴壁，在显微镜下观察到细胞要80％铺满平板。
同时准备以下溶液，溶液A：把5～20μL重组AFP/Bac加到100μL的SFX-Insect昆虫细胞培养基，混匀。溶液B：每次转染，把8～16μL脂质体Cellfectin Ⅱ添加到100μL的SFX-Insect昆虫细胞培养基中，混匀。再把溶液B加入到溶液A中混合，在室温孵育30min。弃去平板中的培养基，注意不要吸出细胞。加入2mL SFX-Insect昆虫细胞培养基到脂质体Cellfectin Ⅱ与AFP/Bac混合液中，混匀后移至Sf21细胞表面，27℃培养5h。弃去脂质体Cellfectin Ⅱ与AFP/Bac混合液，向细胞中加入8mL含双抗的SFX-Insect昆虫细胞培养基，28℃潮湿条件孵育7d后，提取P1病毒株，把P1病毒株按1∶500扩增，5～9d后获得P2病毒株，同样方法获得P3病毒株。
3.重组蛋白的表达用P3病毒感染处于对数生长期的Sf21细胞(大约细胞密度为2×106个/mL)，接种量为1∶100，摇床转速为150r/min，温度为28℃，48～96h后收获蛋白。
4.纯化过程与实施例一相同。
5.[3H]掺入法测定本实施方法表达的人类甲胎蛋白促进NIH 3T3的增殖能力相当于人胚胎血提取的甲胎蛋白的98％(图3)。
实施例四 利用Sf21昆虫细胞真核、pFastBac Dual载体表达的人类甲胎蛋白的方法
1.人类甲胎蛋白基因与pFastBac Dual载体经限制性内切酶双酶切后连接，把连接好的载体转化到E.coli DH10Bac，获得表达人类甲胎蛋白的Bacmid.把该Bacmid转染Sf21昆虫细胞。
2.转染前，先将处于对数生长期的大约密度为2～3×106个/mL Sf21昆虫细胞，均匀放置于平板中，每个孔中加入2mL昆虫细胞培养基，27℃静置1h，让细胞贴壁，在显微镜下观察到细胞要80％铺满平板。
同时准备以下溶液，溶液A：把5～15μL重组AFP/Bac加到100μL的SFX-Insect昆虫细胞培养基，混匀。溶液B：每次转染，把10～16μL脂质体Cellfectin Ⅱ加到100μL的SFX-Insect昆虫细胞培养基中，混匀。再把溶液B加入到溶液A中混合，在室温孵育30min。弃去平板中的培养基，注意不要吸出细胞。加入2mL SFX-Insect昆虫细胞培养基到脂质体Cellfectin Ⅱ与AFP/Bac混合液中，混匀后移至Sf21细胞表面，27℃培养5h。弃去脂质体Cellfectin Ⅱ与AFP/Bac混合液，向细胞中加入8mL含双抗的SFX-Insect昆虫细胞培养基，28℃潮湿条件孵育7d后，提取P1病毒株，把P1病毒株按1∶500扩增，5～9d后获得P2病毒株，同样方法获得P3病毒株。
3.重组蛋白的表达用P3病毒感染处于对数生长期的Sf21细胞(大约细胞密度为2×106个/mL)，接种量为1∶100，摇床转速为150r/min，温度为28℃，48～96h后收获蛋白。
4.纯化过程与实施例一相同。
5.[3H]掺入法测定本实施例方法表达的人类甲胎蛋白促进NIH 3T3的增殖能力相当于人胚胎血提取的甲胎蛋白的98％(图3)。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims (7)

1.一种获得人类甲胎蛋白的方法，其特征在于：把人类甲胎蛋白全长基因克隆到昆虫细胞表达载体,转化DH10Bac后，获得含有人类甲胎蛋白基因的Bacmid；把Bacmid转染昆虫细胞后，把培养转染昆虫细胞的培养基浓缩纯化获得人类甲胎蛋白。
2.如权利要求1所述的获得人类甲胎蛋白的方法，其特征在于具体包括以下步骤：
(1)重组AFP/Bac质粒的获得
a、把人类甲胎蛋白全长基因克隆到昆虫细胞表达载体pFastBac 1、pFastBac Dual或pFastBac1-Gus中，转化DH5α细胞后提取质粒；
b、把连接好的质粒转化DH10Bac细胞，并涂在含有卡那霉素，庆大霉素、四环素、IPGT及X-gal组合的LB培养基平板上，培养10～12h后提取重组AFP/Bac质粒；
(2)表达人类甲胎蛋白的昆虫杆状病毒的获得
a、溶液A：把5～20μL重组AFP/Bac质粒添加到80～100μL的SFX-Insect昆虫细胞培养基中，混匀；
b、溶液B：把8～16μL脂质体CellfectinⅡ添加到80～100μL的SFX-Insect昆虫细胞培养基中，混匀；
c、溶液C：把溶液B加入到溶液A中混合，在室温孵育30～45min；加入1～3mLSFX-Insect昆虫细胞培养基到溶液B与溶液A的混合液中，混匀，获得溶液C；
d、将溶液C滴到昆虫细胞表面，25～30℃培养3～6h，弃去溶液C，向昆虫细胞中加入6～10mL含双抗的SFX-Insect昆虫细胞培养基，25～30℃潮湿条件抚育7～9d后，获得表达人类甲胎蛋白的昆虫杆状病毒；
(3)人类甲胎蛋白的在昆虫细胞中的表达
将表达人类甲胎蛋白的昆虫杆状病毒按体积比1：50～200接种到昆虫细胞中，悬浮培养48～96h后，收集培养基，把培养基过镍柱和凝胶柱纯化，即可得到人类甲胎蛋白。
3.如权利要求2所述的获得人类甲胎蛋白的方法，其特征在于：所述昆虫细胞为Sf9昆虫细胞或Sf21昆虫细胞。
4.如权利要求2所述的获得人类甲胎蛋白的方法，其特征在于：所述含双抗的SFX-Insect昆虫细胞培养基中，双抗与SFX-Insect昆虫细胞培养基的体积比为1：100。
5.如权利要求2所述的获得人类甲胎蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的卡那霉素，庆大霉素、四环素、IPGT及X-gal五个成分按体积比1:1.5:2:1:4组成混合溶液，混合溶液按体积比1:1000添加到LB培养基中。
6.如权利要求1所述的获得人类甲胎蛋白的方法，其特征在于：获得的表达蛋白分子量为65-75KD，与从人胚胎血提取的甲胎蛋白活性类似度为96％～98％。
7.如权利要求1所述的获得人类甲胎蛋白的方法，其特征在于：获得的表达蛋白可以应用于甲胎蛋白的结晶及结构解析，及人类甲胎蛋白与其他蛋白的体外相互作用。
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