CN103755811B - 一种afp重组蛋白和体外高效重组表达的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及AFP重组蛋白和体外高效重组表达的方法，具体涉及一种人工信号肽‑AFP‑609aa‑6his的重组蛋白和哺乳动物瞬时表达系统体外高效重组表达方法，其DNA序列如SEQ ID NO:1所示，a.优化AFP重组蛋白DNA序列,b.将重组蛋白基因通过双酶切克隆到pcDNA3.1+载体中，构建pcDNA3.1+‑AFP表达质粒，并进行质粒抽提，c.将抽提得到的pcDNA3.1+‑AFP质粒用PEI转染进CHO‑S悬浮细胞进行重组蛋白的表达，d.7天后分离纯化得到的重组蛋白。本发明通过大规模瞬时悬浮CHO‑S表达系统制备的人工合成带有6HIS标签的AFP蛋白活性跟天然AFP蛋白相近，且得到的纯度较高，内毒素含量低，无动物源性蛋白的污染，可以有望作为肝癌免疫治疗的肿瘤抗原疫苗。

Description

一种AFP重组蛋白和体外高效重组表达的方法

[技术领域]

本发明涉及AFP重组蛋白和体外重组高效表达的方法，具体涉及一种人工信号肽-AFP-609aa-6his的重组蛋白和哺乳动物瞬时表达系统体外重组表达方法。

[背景技术]

原发性肝细胞癌(primary hepatocellular carcinoma,PHC，简称肝癌)是常见的恶性肿瘤之一，全球年发病病例大约为120万人。目前，肝癌治疗的总体疗效仍很不理想，临床上肝癌的治疗方法主要有外科切除、肝移植等。外科切除的病人的复发率很高，术后3年复发率为50%，5年复发率为70%。肝移植治疗，尤其是活体肝移植虽然取得了一定的进展，但却面临着供体来源缺乏等问题。因此，临床上迫切需要研究和发展新的治疗肝癌的方法。近年来，随着免疫学和分子生物学基础理论研究的迅猛发展，以及人们对肝癌细胞生物学特性认识的加深，肝癌免疫治疗成为新的肿瘤治疗方法。目前已知的可能成为肝癌免疫治疗的靶抗原有：AFP、MAGE家族、HBV/HCV病毒抗原，以及一些癌基因（myc、fos、ras）等。

AFP是人体胎儿期血液中出现的一种特殊蛋白质。它在胎儿的肝细胞内合成。AFP在成人血清中含量极微，但在肝细胞功能发生异常，特别在患有原发性肝细胞癌时，血清中又可出现AFP升高，所以临床上常常借助AFP的检查作为原发性肝细胞癌的辅助诊断。50%～80%的肝癌患者表达AFP，并且在血清中的浓度可能超过1mg/ml。在人体发育过程中，T细胞库内针对AFP的特异性CTL克隆并未清除，适当条件和方法可以将之激活，Butterfield等将4条AFP表位肽包裹在不完全福氏佐剂里，对6例HLA A2.1阳性、表达AFP的HCC病人进行皮内免疫，5例病人对其中的3条表位肽显示了AFP肽特异性T细胞扩增。基础研究表明，DC是体内功能最强的专职抗原递呈细胞，但由于肝癌患者体内DC大多数处于不成熟状态,其功能存在障碍，诱导同种异体淋巴细胞增殖的能力降低。通过体外诱导DC成熟，并负载AFP来源的表位肽，激活特异性CTL杀伤肝癌细胞的能力。

哺乳动物表达系统在蛋白的起始信号、加工、分泌、糖基化方面具有独特优势，适合表达完整的大分子蛋白。由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质。由于近几年生物技术公司对哺乳动物表达系统的研发，相应的已经推出了较好的表达系统，大大提高了外源蛋白在哺乳系统里的表达量。随着悬浮系统的日益成熟化，现在大规模瞬时表达外源蛋白已经成功，目前已经能达到mg至g级别。中国仓鼠卵巢细胞CHO作为表达宿主，其优势有以下几点：遗传背景清楚，生理代谢稳定；与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确；基因转移和载体表达系统完善；耐受剪切力，便于大规模培养；被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞。DNA序列的密码子优化是一项基因优化技术，通过优化重组蛋白AFP在CHO系统中的DNA序列，从而提高在CHO系统中的表达量。

[发明内容]

为了能够大规模的制备高纯度的AFP蛋白，本发明提供一种人工信号肽-AFP-609aa-6his的重组蛋白及其制备的方法。

为实现上述目的，设计一种人工信号肽-AFP-609aa-6his的重组蛋白，其特征在于其DNA序列如SEQ ID NO:1所示。其DNA序列在CHO细胞中的表达量增高25倍。

人工信号肽的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还包括一种用哺乳动物瞬时表达系统体外表达所述重组蛋白的方法，包括重组蛋白基因的合成，

其特征在于该方法包含以下步骤：

a.将重组蛋白基因通过双酶切克隆到pcDNA3.1+载体中，构建pcDNA3.1+-AFP表达质粒，并进行质粒抽提，

b.将抽提得到的pcDNA3.1+-AFP质粒用PEI转染进CHO-S悬浮细胞进行重组蛋白的表达，

c.7天后分离纯化得到的重组蛋白

合成所述重组蛋白是在诱导型启动子的控制下表达的。

上述的重组蛋白能应用于肝癌治疗药物。

本发明主要包含五个方面的内容：（1）优化重组AFP在CHO中表达的DNA序列（2）利用基因合成技术，合成重组AFP DNA序列，然后将序列克隆到pcDNA3.1+载体中，构建pcDNA3.1+-AFP质粒，大规模制备pcDNA3.1+-AFP质粒；（3）使用CHO悬浮表达系统表达重组AFP蛋白；（4）使用Ni－NTA柱从悬浮细胞上清液中分离纯化重组AFP蛋白。（5）将纯化后AFP蛋白刺激树突状细胞（dendritic cells,DC）,用活化后的DC细胞将T细胞激活，形成CTL杀伤HepG2细胞，用MTT法检测杀伤率。

本发明目的通过大规模瞬时悬浮CHO-S表达系统制备的人工合成AFP蛋白活性跟天然AFP蛋白相近，且得到的纯度较高，内毒素含量低，无动物源性蛋白的污染，可以有望作为肝癌免疫治疗的肿瘤抗原疫苗。

[附图说明]

图1是哺乳动物表达系统的质粒pcDNA3.1+图谱，

图2是pcDNA3.1+-AFP的酶切鉴定琼脂糖电泳图，

图3是SDS-PAGE分析纯化后重组AFP蛋白图，

图4是Western-blot分析纯化后重组AFP蛋白图，

图5是MTT法检测经CTL处理的HepG2细胞生长数据图。

图1中的图谱的具体信息为：

CMV启动子（CMV promoter）:bases232-819

T7启动子/引物绑定位点（T7promoter/priming site）:bases863-882多克隆位点（Mutiple cloning site）:bases895-1010

反链的引物结合位点（pcDNA3.1/BGH reverse priming site）:bases1022-1039

BGH多腺苷酸序列（BGH polyadenylation sequence）:bases1028-1252

f1复制起始位点（f1origin）:bases1298-1726

sv40早期启动子和复制起始位点（SV40early promoter and origin）:bases1731-2074

新霉素抗性基因(开放读码框)Neomycin resistance gene(ORF):bases2136-2930

SV40多腺苷酸信号（SV40polyadenylation signal）:bases3104-3234

PUC复制起始位点（pUC origin）:bases3617-4287(互补链complementarystrand)

氨卡青霉素抗性基因Ampicillin resistance gene(bla):bases4432-5428（互补链complementary strand)

开放读码框（ORF）:bases4432-5292(互补链complementary strand)

核糖体结合位点（Ribosome binding site）:bases5300-5304(互补链complementary strand)

Bla启动子Bla promoter(P3):bases5327-5333(互补链complementarystrand)

[具体实施方式]

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。本申请中的生产设备都是本领域的常用设备，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

1.研究材料：重组质粒pUC57-AFP为外包服务公司提供；DNA marker、限制性内切酶、T4连接酶等均购于Takara；pcDNA3.1+、CHO-S和Ni-NTA树脂均为Invitrogen公司产品；CHO-S细胞培养基FreeStyle CHO均为Gibco的产品。PEI为Polysciences产品。

2.工作流程：

（1）优化重组AFP在CHO中的DNA表达序列：主要在转录、翻译以及蛋白折叠三个方面进行优化。转录效率优化：优化GC含量；SD序列；TATA框；终止信号；CpG二核苷酸含量。翻译效率优化：优化密码子在CHO中的偏好性；mRNA二级结构；PolyA早期信号；抑制位点；RNA不稳定基序。蛋白折叠效率优化：优化RNA二级结构；密码子上下文关联；密码子与反密码子交互作用。

（2）将优化的DNA序列交由外包服务公司合成，构建重组质粒pUC57-AFP，酶切位点为HindⅢ和EcoR I。

（3）通过HindⅢ和EcoR I双酶切pUC57-AFP，将切下的AFP通过T4连接酶插入至同样由HindⅢ和EcoR I双酶切的pcDNA3.1+，构建成表达载体pcDNA3.1+-AFP。

（4）制备感受态DH5α，转化pcDNA3.1+-AFP，平铺在LB Amp+培养板，37℃孵箱过夜。挑3个单克隆，置5ml LB培养液中，37℃快摇过夜。小抽5ml培养物并且用小量抽提产物酶切鉴定，选取阳性克隆的培养物。选取一个阳性克隆进行500ml过夜扩增培养，然后把菌液倒进无菌离心管中，4℃离心，6000g离心15分钟。按照大抽试剂盒标准操作流程进程质粒大抽，最后得到2.5mg无菌，高超螺旋，低内毒素，A260/280=1.82的高质量的质粒。HindⅢ和EcoR I，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果显示片段准确。电泳结果在2000bp处有外源片段，表明了重组转移质粒构建成功，如图2所示。

（5）转染前24h，接种1L密度为0.8x10^6/ml悬浮细胞CHO-S。转染当天，细胞计数，确保细胞密度为2x10^6/ml可以进行转染。准备DNA-PEI混合物，室温静置10min后，将混合物加入到细胞中，放入37℃、5％CO₂孵箱培养。24h后，添加TN1。培养六天后，取出细胞悬液。

（6）细胞悬液进行离心，过滤。将上清液利用Ni-NTA柱分离纯化获得相应的蛋白质，并通过SDS-PAGE以及Western blot分析纯蛋白纯度。结果在70kD处有条带并且纯度达到了95%以上，表明了重组AFP蛋白表达成功如图3和图4所示。

（7）应用血细胞分离机采集健康供者外周血单个核细胞30ml。采用Ficoll密度梯度分离的方法分离单个核细胞（PBMC）。用生理盐水洗涤细胞，洗涤后的PBMC悬浮于1640无血清培养基中，置于六孔板中，每孔2ml，细胞浓度为2x10^6/ml。37℃、5％CO₂孵箱培养2h，保留贴壁细胞，收集非贴壁细胞，作为淋巴细胞，冻存。每孔加入含有1000u／m1rhGM-CSF、50ng／ml IL-4RPMI-1640培养液2m1，37℃、5％CO₂孵箱培养。第五天加入纯化后0，50，100，150ug/ml rAFP刺激DC,24小时后加入TNF-a刺激DC趋化成熟。第七天收集细胞，然后用生理盐水连续洗涤三次。

（8）收集DC细胞作为刺激细胞。复苏冻存的非贴壁细胞作为反应细胞。将反应细胞与刺激细胞按20：l比例混合接种于24孔板，每孔l m1，37℃、5％CO₂培养5d，收集的细胞即为效应细胞。收集对数生长期的HepG2细胞作为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按20：1比例混合接种于96孔板，终体积200u l。同时设单一靶细胞组，单一效应细胞，每组设3复孔。37℃、5％CO₂培养24h后，加入MTT(终浓度0.5mg/m1)，37℃、5％CO₂培养4h，1000rpm／min离心5min，吸弃200ul上清，补入150ul DMSO，振荡10min，充分溶解蓝色沉淀后，用酶联免疫检测仪在490nm处检测A490值。根据吸光度值，计算细胞存活率。细胞存活率=[实验组A均值－背景组A均值]/[空白组A均值－背景组A均值]×100%。其结果如图5所示。

Claims (3)

1.一种用哺乳动物细胞瞬时表达系统体外表达人工信号肽-AFP-609aa-6his的重组蛋白的方法，

包括所述重组蛋白基因的合成，

编码所述重组蛋白的碱基序列如SEQ ID NO:1所示，

其特征在于该方法包含以下步骤：

a.将重组蛋白基因通过双酶切克隆到pcDNA3.1+载体中，构建pcDNA3.1+-AFP表达质粒，并进行质粒抽提，

b.将抽提得到的pcDNA3.1+-AFP质粒用PEI转染进CHO-S悬浮细胞进行重组蛋白的表达，

c.7天后分离纯化得到重组蛋白。

2.根据权利要求1中的方法，其特征在于合成所述重组蛋白是在诱导型启动子的控制下表达的。

3.根据权利要求1中的方法，其特征在于编码所述人工信号肽的碱基序列如SEQID NO:2所示。