DE69815707T2

DE69815707T2 - Behandlung von krebs durch verwendung von zytokin-exprimierender polynukleotiden und zusammensetzungen dafür

Info

Publication number: DE69815707T2
Application number: DE69815707T
Authority: DE
Inventors: Holly Horton; Suezanne Parker; Marston Manthorpe; Philip Felgner
Original assignee: Vical Inc
Current assignee: Fresh Tracks Therapeutics Inc
Priority date: 1997-11-20
Filing date: 1998-11-20
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2018-11-21
Also published as: EP1987845A2; EP1987845A3; ATE550042T1; CA2309766A1; US20070225243A1; US7470675B2; EP1987845B1; CA2309766C; WO1999026663A2; DE69815707D1; ATE243045T1; EP1032428B1; US7268120B1; EP1032428A2; WO1999026663A3; JP2001523480A; CA2641217A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Polynucleotidkonstrukts, umfassend ein Polynucleotid, das für ein Cytokin kodiert, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs bei Säugetieren. Allgemein stellt die Erfindung Verfahren zur Behandlung von Krebs bei einem Säugetier durch Verabreichen eines Polynucleotidkonstrukts bereit, das ein für ein Cytokin kodierendes Polynucleotid umfasst. Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Methodologie zur selektiven Transfektion maligner Zellen mit Polynucleotiden, die therapeutische oder prophylaktische Moleküle exprimieren, in Säugetieren, die intrakavitäre Tumoren tragen. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Methodologie für die Suppression der intrakavitären Dissemination maligner Zellen, z. B. der intraperitonealen Dissemination.
Beschreibung verwandter Gebiete
Es wurde gezeigt, dass Cytokine sowohl in präklinischen Tiermodellen als auch bei Menschen starke Anti-Tumor-Wirkung entfalten können. Insbesondere wurden Interferone (IFN) für die Behandlung einiger menschlicher Krankheiten untersucht.
Die IFN sind eine Familie von Cytokinen mit hochwirksamen antiviralen, antiproliferativen und immunmodulatorischen Aktivitäten und spielen eine wichtige Rolle in der Abwehrreaktion des Körpers auf Viren, Bakterien und Tumoren (Baron, S., et al., JAMA 266, 1375 (1991)). Auf der Basis von Antigenität, biochemischen Eigenschaften und Produzentenzellen wurden die IFN in zwei Klassen eingeteilt – Interferon vom Typ I und Interferon vom Typ II. IFNα, IFNβ, IFNω und IFNτ sind Typ I-IFN und binden sich an den gleichen α/β-Rezeptor (Pestka, S., Ann. Rev. Biochem. 56, 727 (1987)). IFNα und IFNβ werden nach viraler Infektion natürlich in zahlreichen Zellen exprimiert. IFNγ wird durch aktivierte T-Lymphozyten und natürliche Killerzellen (NK-Zellen) produziert. Man ist der Ansicht, dass IFNω Hormonaktivität besitzt; es spielt eine wichtige Rolle in der Schwangerschaft von Rindern, Schafen und verwandten Wiederkäuern (Imakawa, K. et al., Nature 330, 377 (1987); Stewart, H. J. et al., J. Endocrinology 115, R13 (1987)). Aufgrund der pleiotropen Aktivitäten von IFN wurden diese Cytokine wegen ihrer therapeutischen Wirksamkeit bei einigen Krankheiten, insbesondere Karzinomen und viralen infektiösen Krankheiten, untersucht.
IFNω wurde unabhängig von drei unterschiedlichen Forscherteams im Jahr 1985 entdeckt (Capon, D. J. et al. Molec. Cell. Biol. 5, 768–779 (1985); Feinstein, S. et al., Molec. Cell. Biol. 5, 510 (1985); und Haptmann und Swetly, Nucl. Acids Res. 13, 4739–4797 (1985)). Im Gegensatz zu IFNα, für das zumindest 14 unterschiedliche funktionelle Nicht-Allel-Gene im Menschen identifiziert wurden, wird IFNω durch ein einziges funktionelles Gen kodiert. Man geht davon aus, dass IFNω-Gene in den meisten Säugetieren vorhanden sind, sie wurden aber in Hunden, Ratten oder Mäusen nicht festgestellt. Das reife IFNω-Polypeptid besteht aus 172 Aminosäuren, und es weist 60% Sequenzhomologie mit den Human- FNα auf. Infolge der Sequenzähnlichkeit mit IFNα wurde IFNω ursprünglich als Mitglied einer Unterfamilie IFNα angesehen und als IFNα-_II bezeichnet. IFNω ist eine signifikante Komponente (~ 10 %) von aus Leukozyten stammendem Human-IFN, dem natürlichen Gemisch von IFN, das nach viraler Infektion produziert wird (Adolf, G. et al., Virology 175, 410 (1990)). Es wurde gezeigt, dass sich IFNω an den gleichen α/β-Rezeptor bindet wie IFNα (Flores, I. et al., J. Biol. Chem. 266, 19875–19877 (1991)) und ähnliche biologische Aktivität wie IFNα besitzt, z. B. antiproliferative Aktivität gegen Tumorzellen in vitro (Kubes, M. et al., J. Interferon Research 14, 57 (1994)) und immunmodulatorische Aktivität (Nieroda et al., Molec. Cell. Differentiation 4, 335–351 (1996)).
Rekombinantes IFNα-Polypeptid wurde zur Verwendung in Menschen für Haarzellenleukämie, durch AIDS verursachtes Kaposi-Sarkom, malignes Melanom, chronische Hepatitis B und C, chronische myeloische Leukämie und Condylomata acuminata genehmigt (Baron, S. et al., JAMA 266, 1375 (1991)). Für jede dieser Indikationen muss jedoch IFNα-Polypeptid infolge der kurzen Halbwertszeit (Stunden) des Polypeptids im Serum wiederholt, häufig täglich, über lange Zeiträume verabreicht werden, um wirkungsvolle Serumwerte aufrechtzuerhalten (Friedman, Interferons: A Primer, Academic Press, New York, S. 104–107 (1981); Galvani und Cawley, Cytokine Therapy, Cambridge University Press, Cambridge, S. 114–115 (1992)). Somit ist trotz der klinischen Vorteile für viele Krankheitszustände die Verwendung von IFNα-Polypeptid bei den meisten Patienten mit akuten und chronischen Nebenwirkungen verbunden (Jones, Cancer 57, 1709–1715 (1986); und Quesda et al., Blood 68, 493– 497 (1986)). Der Schweregrad der unerwünschten Reaktionen korreliert mit den Spitzenwerten von IFN im Serum.
IFNα-Gene enthaltende virale oder Plasmidvektoren wurde in der Ex-vivo-Therapie zur Behandlung von Mäusetumoren verwendet. Beispielsweise wurden Tumorzellen in vitro mit ein IFNα-Gen enthaltenden viralen oder Plasmidvektoren transfiziert und die transfizierten Tumorzellen in Mäuse injiziert (Belldegrun, A. et al., J. Natl. Cancer Inst. 85, 207–216 (1993); Gerrantini, M. et al., Cancer Research 53, 1107–1112 (1993); Ferrantini, M. et al., J. Immunology 153, 4604–4615 (1994); Kaido, T. et al., Int. J. Cancer 60, 221–229 (1995); Ogura, H. et al., Cancer Research 50, 5102–5106 (1990); Santodonato, L. et al., Human Gene Therapy 7, 1–10 (1996); Santodonato, L. et al., Gene Therapy 4, 1246–1255 (1997)). In einer weiteren Ex-vivo-Studie wurden Zervikalkarzinom- und Leukämiezellen mit einem das IFN-Konsens-Gen enthaltenden viralen Vektor transfiziert, und die transfizierten Zellen wurden in Mäuse injiziert (Zhang, J. -F. et al., Cancer Gene Therapy 3, 31–38 (1996)). In allen diesen Ex-vivo-Studien wurde ein variierendes Ausmaß an Anti-Tumor-Wirksamkeit, z. B. Tumorrückbildung und/oder Überleben über längere Zeiträume, beobachtet.
IFN-Gene enthaltende virale oder Plasmidvektoren wurden auch für die In-vivo-Therapie Tumor-tragender Mäuse verwendet. Beispielsweise wurde ein das IFN-Konsens-Gen enthaltende virale Vektor in Mäuse injiziert, die MDA-MB-435-Brustkrebs, Hamster-Melanom oder K562-Leukämie in transplantierter Form aufwiesen, und Tumorrückbildung beobachtet (Zhang, J. -F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4513– 4518 (1996)). In einer ähnlichen Studie wurde ein Plasmidvektor, der mit kationi schem Lipid komplexiertes Human-IFNβ-Gen enthielt, intrakranial in ein Humangliom tragende Mäuse injiziert und Tumorrückbildung festgestellt (Yagi, K. et al., Biochemistry and Molecular Biology International 32, 167–171 (1994)). In einem Mäusemodell von Nierenzellenkarzinom wurde aufgezeigt, dass die direkte intratumorale Injektion eines IL-2-Plasmid-DNA-Lipid-Komplexes zur vollständigen Tumorrückbildung und einer signifikanten tumorspezifischen CTL-Reaktionszunahme der Überlebensrate führt (Saffran et al., Cancer Gene Therapy 5, 321–330 (1998)).
Cytokin-Gene enthaltende Plasmidvektoren führen Berichten zufolge auch zu systemischen Werten des kodierten Cytokins und in manchen Fällen zu biologischen Wirkungen, die für jedes Cytokin in Mäusen charakteristisch sind. Beispielsweise bewirkte die intramuskuläre Injektion von Plasmid-DNA, die entweder für TGFβ, IL-2, IL-4, IL-5 oder IFNα kodiert, physiologisch signifikante Mengen in der systemischen Zirkulation des entsprechenden Cytokin-Polypeptids. Die US-Patente 4.897.255, 4.946.787, 5.049.386, 5.459.127, 5.589.466, 5.693.622, 5.580.859, 5.703.055 sowie PCT/US94/06069 (Veröffentlichungsnummer WO 94/29469) liefern kationische Lipide zur Verwendung beim Transfizieren von DNA in Zellen und Säugetiere. Die US-Patente 5.589.466, 5.693.622, 5.580.859, 5.703.055 sowie PCT/US94/06069 (Veröffentlichungsnummer WO 94/29469) stellen Verfahren für die Zufuhr von Komplexen aus DNA und kationischen Lipiden an Säugetiere bereit.
Es wurde auch eine Phase I-Studie des direkten Gentransfers eines MHC Klasse I-Gens in Patienten mit metastatischem Melanom durchgeführt (Stopeck, A. T. et al., Journal of Clinical Oncology 15(1), 341–349 (1997)). Außerdem fanden direkte intratumorale Injektion von IL-2-Plasmid (Yankauckas, M. A. et al., Journal of Cellular Biochemistry S21A, 429 (1995); Huang, N. et al., Gene Therapy 3, 980–987 (1996)) sowie In-vivo-Gentherapie, bestehend aus einer kombinierten Behandlung mit Herpes simplex-Thymidin-Kinase/Ganglovir und IL-2 (Coll, J -L. et al., Gene Therapy 4, 1160– 1166 (1997)) statt. Bramson et al. berichten über die In-vitro- und die In-vivo-Produktion von biologisch aktivem IL-2 (Bramson, J. et al., Human Gene Therapy 7, 333– 342 (1996)). Die Transfektion von Tumorzellen mit IL-2- und IL-6-Plasmid-DNA wurde ebenfalls durchgeführt (Belldegrun, A. et al., Journal of the National Cancer Institute 85(3), 207–216 (1993); Porgador, A. et al., Cancer Research 52, 3679–3686 (1992)). Außerdem wurden Vektoren und Zusammensetzungen für Gen-Therapiestrategien gegen feste Tumoren geoffenbart (WO 97/00085).
Obwohl einige vitale Vektoren, die in der Ex-vivo- und In-vivo-Krebstherapie in Mäusemodellen zum Einsatz kommen, Anti-Tumor-Wirksamkeit aufweisen, könnte die Verwendung viraler Vektoren zur Bereitstellung von IFN-exprimierenden Genen in vivo antivirale Immunreaktionen oder die virale Intregration in Wirtchromosomen induzieren, was das Aufbrechen wesentlicher Wirtgene oder die Aktivierung von Onkogenen hervorruft (Ross et al., Human Gene Therapy 7, 1781–1790 (1996)).
Für die Behandlung multipler metastatischer Karzinome eines Körperhohlraums werden Laparaskopie (Childers et al., Gynecol. Oncol. 59, 25–22 (1995)), Katheterisierung (Naumann et al., Gynecol. Oncol. 50, 291–293 (1993) oder andere Zugriffsverfahren eingesetzt (Almadrones et al., Semin. Oncol. Nurs. 11, 194–202 (1995)). Die Behandlung erfolgt üblicherweise durch chirurgische Entfernung primärer und großer metastatischer Tumoren und durch postoperative Chemotherapie (Kigwawa et al., Am. J. Clin. Oncol. 17, 230–233 (1994); Markman et al., J. Clin. Oncol. 10, 1485–1491 (1992)) oder mittels Strahlentherapie (Fjeld et al., Acta. Obstet. Gynecol. Scand. Suppl. 155, 105–111 (1992)). Das Wiederauftreten von Tumoren wird durch Magnetresonanz-Abbildung (Forstner et al., Radiology 196, 715–720 (1995), Aszites-Zytologie (Clement, Am. J. Clin. Pathol. 103, 673–676 (1995); Forstner et al., Radiology 196, 715–720 (1995) und Blutanalysen (Forstner et al., Radiology 196, 715–720 (1995)) überwacht. Viele intraperitoneale (i. p.) Karzinome wie z. B. Eierstockkrebs metastasieren über das Lymphsystem in Richtung Lunge und andere lebenswichtige Organe, und die Überlebenschancen solcher Patienten sind sehr gering (Kataoka et al., Nippon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi 46, 337–344 (1994); Hamilton, Curr. Probl. Cancer 16, 1–57 (1992)).
Eierstockkrebs beim Menschen wird häufig in einem fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert, wenn die Wirksamkeit chirurgischer Eingriffe und der Chemotherapie beschränkt ist. Der Mangel effizienter Behandlungsoptionen für Patienten im fortgeschrittenen Stadium rechtfertigt die Entwicklung neuer Behandlungsmodalitäten für dieser Krankheit. Es wurden zahlreiche Versuche unternommen, eine wirkungsvolle Immuntherapie zur Behandlung von Eierstockkrebs zu entwickeln.
Die frühen Arbeiten auf diesem Gebiet betreffen Mäusestudien, in denen aus Bakterien abgeleitete Immunstimulanzien, z. B. Bacillus Calmette-Guerin (BCG) und Corynebacterium parvum, i. p. als nichtspezifische Aktivatoren des Immunsystems injiziert wurden (Knapp und Berkowitz, Am. J. Obstet. Gyneol. 128, 782–786 (1977); Bast et al., J. Immunol. 123, 1945–1951 (1979); Vanhaelen et al., Cancer Research 41, 980– 983 (1981); und Berek et al., Cancer Research 44, 1871–1875 (1984)). Diese Studien führten im Allgemeinen zu einer nichtspezifischen Immunreaktion, die oft das Wachstum späterer Tumoren nicht verhinderte. Wenn die bakteriellen Antigene mehr als 24 Stunden nach der Tumorzellen-Impfung injiziert wurden, trat eine minimale Antitumor-Response auf, was nahe legte, dass die Behandlung von Eierstockkrebspatienten im fortgeschrittenen Stadium mit dieser Therapie nicht wirkungsvoll wäre.
Kürzlich erfolgte Studien bei Mäusen und Menschen umfassten die i. p.- oder intravenöse (i. v.) Verabreichtung von Cytokinproteinen als spezifischere Aktivatoren der Immunreaktion (Adachi et al., Cancer Immunol. Immunother. 37, 1–6 (1993); Lissoni et al., Tumori 78, 118–120 (1992)). Die Behandlung von Mäuse-Eierstocktumoren mit einer Kombination von rekombinanten IL-2- und GM-CSF-Proteinen übte sich positiv auf die Hemmung von Aszites-Produktion aus; IL-2 war jedoch nur dann wirkungsvoll, wenn es mit GM-CSF kombiniert wurde (Kikuchi et al., Cancer Immunol. Immunother. 43, 257–261 (1996)). Ebenso konnte die Kombination von IL-2 und Lymphokinen-aktivierten Killerzellen (LAK-Zellen) i. p. Sarkome in Mäusen reduzieren, während IL-2-Protein alleine nicht wirkungsvoll war (Ottow et al., Cellular Immunology 104, 366–376 (1987)). Klinische Versuche am Menschen zur Bewertung von IL-2- Proteintherapie von Eierstockkrebspatienten deuteten auf einige Anti-Tumor-Wirkungen hin (Chapman et al., Investigational New Drugs 6, 179–188 (1988); West et al., N. Engl. J. Med. 316, 898–905 (1987); Lotze et al., Arch. Surg. 121, 1373–1379 (1986); Benedetti Panici et al., Cancer Treatment Review 16A, 123–127 (1989); Bellen et al., Gynecol. Oncol. 34, 407412 (1989); Urba et al., J. Natl. Cancer Inst. 81, 602–611 (1989); Stewart et al., Cancer Res. 50, 6302–6310 (1990); Steis et al., J. Clin. Oncol. 8, 1618–1629 (1990); Lissoni et al., Tumori, 78, 118–120 (1992); Sparano et al., J. of Immunotherapy 16, 216–223 (1994); Freedman et al., J. of Immunotherapy 16, 198–210 (1994); Edwards et al., J. Clin. Oncol. 15, 3399–3407 (1997)).
In letzter Zeit durchgeführte Studien umfassten die Injektion von DNA-Konstrukten, die für „Selbstmord"-Gene kodieren, und anschließend die Behandlung mit Prodrugs. Dieser Ansatz führte zur erfolgreichen Rückbildung einiger kleiner Tumoren, war jedoch in Bezug auf größere Tumormassen weniger erfolgreich (Szala et al., Gene Therapy 3, 1025–1031 (1996); Sugaya et al., Hum. Gene Ther. 7, 223–230 (1996)). In einer weiteren Studie bewirkte die Liposomen-mediierte EIA-Gentherapie für Mäuse mit Eierstockkarzinom, die HER-2/neu überexprimieren, reduzierte Mortalität unter diesen Tumor-tragenden Mäusen (Yu et al., Oncogene 11, 1383–1388 (1995)). Ebenso wurde die erfolgreiche Behandlung von Mäuse-Eierstockkarzinom (MOT) unter Anwendung von Cisplatin-induziertem Gentransfer von für IFNγ kodierenden DNA-Konstrukten mittels i. p. Injektion geoffenbart (Son, Cancer Gene Therapy 4, 391–396 (1997)). Diese Studie deckte aber auf, dass Tumoren nur schwach auf das IFNγ-Gen oder Cisplatin alleine reagierten – ein Indiz dafür, dass die Wirksamkeit der auf Cisplatin beruhenden Gentherapie hauptsächlich auf die erhöhte Sensibilisierung von Cisplatin-exponierten Tumorzellen gegenüber der Transfektion durch das IFNγ-Gen zurückzuführen ist (Son, Cancer Gene Therapy, 4, 391–396 (1997)).
Klarerweise besteht die Notwendigkeit, hochqualitative therapeutische Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von Säugetierkrebs zu entwickeln. Außerdem ist ein In-vivo-Zufuhrsystem für IFNω erforderlich. Die Anmelden zeigen hierin, dass die maligne Zelldissemination in Körperhohlräumen, z. B. in der Bauchfellhöhle während des fortgeschrittenen Stadiums von Eierstockkrebs, einfach durch Verabreichen von nur zwei bis sechs Dosen einer Polynucleotid-Formulierung direkt in den Körperhohlraum unterdrückt werden kann. Diese Behandlung verursacht die selektive Transfektion maligner Zellen und anschließend die langfristige lokale Produktion einer wirksamen Menge therapeutischer Moleküle.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Verwendung eines Polynucleotidkonstrukts, das ein für ein Cytokin kodierendes Polynucleotid umfasst, bei der Herstellung eines Medikamets zur Behandlung von Krebs durch In-vivo-Verabreichung des Polynucleotidkonstrukts in ein Gewebe eines Säugetiers, das an Krebs leidet. Das Polynucleotidkonstrukt wird in vivo in die Zellen des Säugetiers inkorporiert und eine therapeutisch wirksame Menge eines Cytokins in vivo produziert und den Tumorzellen zugeführt. Kombinationen von für Cytokin kodierenden Polynucleotiden können verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines nichtinfektiösen, nichtintegrativen Polynucleotidkonstrukts für die Herstellung eines Medikaments, umfassend ein Polynucleotid, das aus der Gruppe bestehend aus (a) einem Polynucleotid, das unter strengen Bedingungen an die Nucleotidsequenz der SEQ.-ID Nr. 7 oder deren Komplement hybridisiert, worin die Polynucleotidsequenz für ein Polypeptid kodiert, das antiproliferative Aktivität aufweist, wenn es in vitro NIH-OVCAR3-Zellen zugesetzt wird; (b) einem Polynucleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die mit Ausnahme zumindest einer, aber nicht mehr als 20 Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen oder -Insertionen identisch mit den Aminosäuren -23 bis 172 oder 1 bis 172 in SEQ.-ID Nr. 8 ist, worin das Polypeptid antiproliferative Aktivität aufweist, wenn es in vitro NIH-OVCAR3-Zellen zugesetzt wird; und (c) einem Polynucleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuren 86–172 in SEQ.-ID Nr. 8 umfasst, worin das Polypeptid antiproliferative Aktivität aufweist, wenn es in vitro NIH-OVCAR3-Zellen zugesetzt ist; sowie beliebigen Elementen der obigen Gruppe, komplexiert mit einer oder mehreren kationischen Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus kationischen Lipiden, kationischen Peptiden, kationischen Proteinen, kationischen Polymeren und Gemischen davon, ausgewählt ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung (zwecks Herstellung eines Medikaments) eines Komplexes eines Polynucleotids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) einem Polynucleotid, das unter strengen Bedingungen an die Nucleotidsequenz von SEQ.-ID Nr. 7 oder deren Komplement hybridisiert, worin die Polynucleotidsequenz für ein Polypeptid kodiert, das antiproliferative Aktivität aufweist, wenn es in vitro NIH-OVCAR3-Zellen zugesetzt wird; (b) einem Polynucleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die mit Ausnahme zumindest einer, aber nicht mehr als 20 Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen oder -Insertionen identisch mit den Aminosäuren -23 bis 172 oder 1 bis 172 in SEQ.-ID Nr. 8 ist, worin das Polypeptid antiproliferative Aktivität aufweist, wenn es in vitro NIH-OVCAR3-Zellen zugesetzt wird; und (c) einem Polynucleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuren 86–172 in SEQ.-ID Nr. 8 umfasst, worin das Polypeptid antiproliferative Aktivität aufweist, wenn es in vitro NIH-OVCAR3-Zellen zugesetzt wird, mit einer oder mehreren kationischen Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus kationischen Lipiden, kationischen Peptiden, kationischen Proteinen, kationischen Polymeren und Gemischen davon.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines nichtinfektiösen, nichtintegrativen Polynucleotidkonstrukts, das ein für ein Cytokin kodierendes Polynucleotid oder ein aktives Fragment davon umfasst, bei der Herstellung eines Medikamets zur Behandlung von Krebs in einem Säugetier, umfassend die Verabreichung des Polynucleotidkonstrukts in ein Gewebe des Säugetiers, sodass das Polynucleotid in vivo expri miert wird und dass das Cytokin oder ein aktives Fragment davon systemisch einem Tumorgewebe in einer Menge zugeführt wird, die zur Krebsbehandlung geeignet ist.
Die Erfindung bietet ferner die Verwendung eines nichtinfektiösen, nichtintegrativen Polynucleotidkonstrukts, das ein für ein Cytokin kodierendes Polynucleotid umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IFNω, IFNα und einer Kombination davon, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs in einem Säugetier, umfassend die Verabreichung des nichtinfektiösen, nichtintegrativen Polynucleotidkonstrukts in ein Gewebe des Säugetiers, sodass das Polynucleotid oder ein aktives Fragment davon exprimiert wird und dass das Cytokin lokal einem Tumorgewebe in einer Menge zugeführt wird, die zur Krebsbehandlung geeignet ist. Vorzugsweise ist das Polynucleotidkonstrukt mit einem kationischen Vehikel komplexiert, noch bevorzugter kann das kationische Vehikel ein kationisches Lipid sein, und am bevorzugtesten kann das kationische Lipid mit einem neutralen Lipid vermischt sein.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum selektiven Transfizieren maligner Zellen in einem Körperhohlraum eines Tumor tragenden Säugetiers, umfassend die Verabreichung zumindest eines nichtinfektiösen, nichtintegrativen Polynucleotids, das mit einem kationischen Vehikel komplexiert ist, in den Körperhohlraum, sodass das Polynucleotid im Wesentlichen in den malignen Zellen des Körperhohlraums exprimiert wird. Vorzugsweise umfasst das kationische Vehikel eines oder mehrere kationische Lipide, noch bevorzugter umfasst das kationische Vehikel ein Gemisch aus kationischem und neutralem Lipid. In einer bevorzugten Ausführungsform dient die Erfindung dazu, peritoneale Dissemniation maligner Zellen in einem Tumor tragenden Säugetier zu supprimieren. Insbesondere kann das Säugetier Eierstockkrebs oder Metastasen von Eierstockkrebs aufweisen. Bevorzugte Polynucleotide können für Cytokine oder aktive Fragmente davon kodieren. Am bevorzugtesten kann das Polynucleotid für IL-2 oder ein aktives Fragment davon kodieren.
Im Vergleich zur Injektion von rekombinanten Cytokin-Polynucleotiden besitzen die hierin beschriebenen Verfahren einige wichtige Vorteile. Die Erfindung zeigt, dass die In-vivo-Transfektion von Zellen mit kodierendem Polynucleotid, wie z. B. IL-2 oder IFNω, zu Serumwertendes entsprechenden Cytokins führt, die therapeutische Wirkungen aufweisen und trotzdem unter den maximalen Serumwerten liegen, die bei der Injektion von Cytokin-Polynucleotiden üblicherweise erforderlich sind. Außerdem kann die Injektion häufiger hoher Dosen von Cytokin-Polynucleotiden zu stark beeinträchtigenden Nebenwirkungen führen. Die Verfahren der Erfindung liefern eine Cytokintherapie, die weniger häufige Injektionen von für Cytokin kodierenden Nucleinsäuren vorsieht. Die Injektion von für Cytokine kodierenden Polynucleotidkonstrukten ergibt lange andauernde, niedrige Werte an biologisch aktiven Cytokinen, die nützliche Wirkungen entfalten und unerwünschte Nebenwirkungen minimieren.
Im Vergleich zur Zufuhr von Cytokin-Genen über virale Gen-Zufuhrvektoren ist das vorliegende Verfahren mit einigen signifikanten Vorteilen verbunden. Die Injektion nichtviraler Vektoren des vorliegenden Verfahrens induziert keine signifikante Toxizität oder pathologische Immunreaktionen, wie dies z. B. in Mäusen, Schweinen und Affen beschrieben ist (Parker et al., Human Gene Therapy 6, 575–590 (1995); San et al., Human Gene Therapy 4, 781–788 (1993)). Somit ist ein nichtviraler Vektor sicherer und kann wiederholt injiziert werden.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
Ein genauerer Überblick über die Erfindung und ihre zahlreichen Vorteile ergibt sich unter Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung und die beiliegenden Abbildungen.
1 zeigt die Plasmidkarte von VR4151 (SEQ.-ID Nr. 4). Der unmittelbar frühe Zytomegalievirus-Gen-Promotorverstärker und untranslatierte 5'-Sequenzen (5'UTR + Intron A) treiben die Expression der Human-1FNω-Kodiersequenz an. Die Transkrip tionsterminatorregion enthält Polyadenylierungs- und Terminationssignale aus dem Kaninchen-β-Globin-Gen.
2 zeigt die Pharmakokinetik von hIFNω im Serum von C57BL/6-Mäusen ( 2A) und unbehaarten Mäusen (2B) nach einer einzigen intramuskulären (i. m.) Injektion von hIFNω-Plasmid-DNA (VR4151). Mäuse wurden i. m. mit 100 μg VR4151 injiziert. Nach der i. m. Injektion wurde den Mäusen täglich Blut entnommen und das Serum gesammelt und mittels eines ELISA auf hIFNω-Polynucleotid untersucht. Jeder Punkt stellt einen Mittelwert von vier Mäusen dar. In C57BL/6-Mäusen resultierte die einzelne i. m. Injektion in Spitzenserumwerten von 254 pg/ml am Tag 6 nach der Injektion, wobei Serumwerte 14 Tage nach der Injektion noch nachweisbar waren (50 pg/ml; 2A). In unbehaarten Mäusen führte die einzige i. m. Injektion zu Spitzenserumwerten von 648 pg/ml am Tag 7, und Serumwerte waren 14 Tage nach der Injektion noch immer nachweisbar (134 pg/ml; 2B).
3 veranschaulicht, dass systemische mIFNα-Behandlung das Tumorvorlumen reduziert (3A, 3C und 3E) und die Überlebensrate in drei Mäusetumormodellen erhöht (3B, 3D und 3F). C57BL/6-Mäuse mit subkutanem B16F10-Melanom (3A und 3B), subkutanem Gliom 261 (3C und 3D) oder DBA/2-Mäuse mit subkutanem Cloudman-Melanom (3E und 3F) wurden mit 100 μg VR411 (mIFNα-Plasmid) oder VR1055 (Vergleichsplasmid) zweimal wöchentlich drei Wochen lang, beginnend an Tag 4 nach der Tumorzelleninjektion, injiziert (n = 8–10 Mäuse pro Gruppe).
4 zeigt, dass Behandlung mit systemischer mIFNα-, mIL-2- oder mIL-12-Plasmid-DNA das Tumorvolumen reduziert (4A) und dass die Behandlung mit mIFNα- oder mIL-12-Plasmid-DNA die Überlebensrate im subkutanen B16F10-Melanom-Modell erhöht (4B). C57BL/6-Mäuse mit subkutanem B16F10-Melanom wurden mit 100 μg VR411 (mIFNα), VR4001 (mIL-12), VR1110 (mIL-2) oder VR1012 (Vergleichsplasmid) zweimal wöchentlich drei Wochen lang injiziert (n = 15–16 Mäuse pro Gruppe).
5 veranschaulicht, dass die i. m. Verabreichung von hIFNω-pDNA das Tumorvolumen reduziert (5A) und die Überlebensrate in unbehaarten Mäusen mit Human-A431-Epidermoid-Karzinomtumoren erhöht (5B). Mäuse mit Human-A431-Tumoren zwischen 30 und 80 mm³ wurden i. m. mit 200 μg VR4151 (hIFNω-Plasmid) oder VR1055 (Vergleichsplasmid) zweimal wöchentlich drei Wochen lang injiziert (n = 15).
6 zeigt, dass die i. m. Verabreichung von mIFNω-pDNA die B16F10-Melanom-Lungenmetastasen in C57BU5-Mäusen reduziert. Mäuse mit Lungenmetastasen von B16F10-Melanom wurden mit 100 μg VR4111 oder VR1055 zweimal wöchentlich drei Wochen lang i. m. injiziert, beginnend am Tag 4 nach der Tumorzelleninjektion (n = 10 Mäuse pro Gruppe). „TNTC" bedeutet „zu zahlreich, um gezählt werden zu können" (festgestellt in der Vergleichsgruppe).
7 veranschaulicht, dass die i. m. Verabreichung von mIFNα-pDNA das intradermale M5076-Primärtumorwachstum (7A) sowie Lebermetastasen (7B) in C57BL/6-Mäusen mit Mäuse-M5076-Retikulumzellen-Sarkomazellen reduziert. Mäuse mit M5076-Tumoren wurden mit 100 μg VR4111 oder VR1055 zweimal wöchentlich drei Wochen lang i. m. injiziert, beginnend am Tag 4 nach der Tumorzelleninjektion (n = 10–13 Mäuse pro Gruppe).
8 liefert einen Vergleich unterschiedlicher Dosierungen und Häufigkeiten der mIFNα-pDNA-Verabreichung im subkutanen B16F10-Melanom-Modell. C57BL/6-Mäuse mit subkutanem B16F10-Melanom wurden mit 50 μg oder 100 μg VR4111 oder VR1055 zweimal wöchentlich drei Wochen lang i. m. injiziert, beginnend am Tag 4 nach der Tumorzelleninjektion (n = 10 Mäuse pro Gruppe). Alle mit 100 μg VR4111 behandelten Gruppen zeigten in allen untersuchten Behandlungen ab Tag 21 eine signifikante Reduktion des Tumorwachstums (p = 0,003) und eine signifikante Verbesserung der Überlebensrate (p < 0,008) (8A und 8B). In mit 50 μg VR4111 behandelten Mäusen war in den Gruppen von Mäusen, die zweimal pro Woche oder einmal pro Woche injiziert wurden, das Tumorwachstum ab Tag 21 signifikant reduziert (p = 0,005) und die Überlebensrate signifikant erhöht (p < 0,003). Die Gruppe, die jede zweite Woche mit 50 μg VR4111 injiziert wurde, unterschied sich nicht signifikant von den Mäusen, die das Vergleichsplasmid erhielten (8C und 8D).
9 veranschaulicht die Ergebnisse von Experimenten, deren Ziel die Bestimmung der Rolle von NK- und T-Zellen in der Anti-Tumor-Response aufgrund der mIFNα-Plasmid-DNA ist. Unbehaarte Mäuse (T-Zellen-defizient; 9A und 9B), beige, unbehaarte Mäuse (NK- und T-Zellen-defizient; 9C und 9D) mit subkutanen B16-F10-Melanomtumoren wurden mit 100 μg VR4111 oder VR1055 zweimal wöchentlich drei Wochen lang i. m. injiziert, beginnend am Tag 4 nach der Tumorzelleninjektion (n = 15 Mäuse pro Gruppe). Man stellte keine signifikante Reduzktion des Tumorvolumens oder Erhöhung der Überlebensrate im Falle unbehaarter oder unbehaarter beiger Mäuse (mit VR4111 behandelt) fest – in Indikator dafür, dass T-Zellen an der mIFNα-Anti-Tumor-Response beteiligt sind.
10 zeigt die Ergebnisse von Experimenten, deren Ziel die Bewertung der Rolle von CD4⁺-T-Zellen an der mIFNα-DNA-Anti-Tumor-Response ist. Zwecks Schwund an CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen wurden C57BL/6-Mäuse mit subkutanen B16F10-Melanomtumoren mit 500 μg AntiCD4-mAb (Klon GK1.5, Ratten-IgG; American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA) oder Anti-CD8-mAb (Klon 2.43, Ratten-IgG; ATCC, Rockville, MD, USA) einen Tag nach jeder i. m. Injektion von 100 μg VR-4111 oder VF1055 zweimal wöchentlich drei Wochen lang i. p. injiziert (n = 10 Mäuse pro Gruppe). Die mIFNα-Plasmid-DNA-Therapie konnte das Tumorwachstum signifikant reduzieren (p = 0,002) und die Überlebensrate steigern (p = 0,008) – sowohl von normalen Mäusen als auch von CD4⁺-T-Zellen-defizienten Mäusen, was nahe legt, dass CD4⁺-T-Zellen für die Response nicht erforderlich waren. Im Gegensatz dazu besaßen CD8⁺-T-Zellen-defiziente Mäuse und jene mit injiziertem VR4111 Tumorvolumina und Überlebensraten, die sich nicht signifikant von mit Vergleichsplasmid-DNA behandelten Mäusen unterschieden – ein Indikator dafür, dass CD8^–-T-Zellen in der Anti-Tumor-Response erforderlich sind.
11 zeigt, dass intratumorale hIFNω- (VR4151) und hIFNα- (VR4112) Behandlung das Tumorvolumen im Human-A375-Melanom-Modell (11A) und im Human-NIH-OVCAR3 (11 B) in nakcten Mäusen reduziert. Mäuse mit subkutanem Tumor erhielten direkte intratumorale Injektionen eines Komplexes von DNA : DMRIE/ DOPE (1 : 1 DNA-Lipid Masseverhältnis, 100 μg Plasmid-DNA) sechs aufeinander folgende Tage lang, gefolgt von weiteren fünf Behandlungen jeden zweiten Tag über insgesamt elf Injektionen (A375-Melanom-Modell) oder jeden zweiten Tag über insgesamt elf Injektionen (NIH-OVCAR3-Eierstockkrebs-Modell).
12 veranschaulicht, dass Behandlung mit intratumoraler mIFNα- (VR4101) Plasmid-DNA das Tumorvolumen reduziert (12A) und die Überlebensrate (12B) im subkutanen B16F10-Melanom-Modell in C57BU6-Mäusen erhöht. Die Mäuse erhielten eine subkutane Implantation von 10⁴ B16F10-Zellen in die Flanke. Beginnend mit Tag 12 nach der Tumorimplantation erhielten die Mäuse sechs aufeinander folgende intratumorale Injektionen eines Komplexes von pDNA : DMRIE/DOPE (1 : 1 DNA-DMRIE Masseverhältnis, 100 μg Plasmid-DNA).
13 zeigt die Luciferase-Aktivität in peritonealem Gewebe und MOT-Aszites in Mäusen nach der i. p. Injektion von Lucerfase-DNA-Lipid-Komplex. Die Ergebnisse weisen hohe Werte an Reporter-Gen-Expression in Aszites, jedoch niedrige Werte in peritonealem Gewebe auf. MOT-Tumor-tragende C3H/HeN-Mäuse erhielten i. p. Injektionen eins Komplexes von pDNA : DMRIE/DOPE (1 : 1 DNA : DMRIE Masseverhältnis, 100 μg Plasmid-DNA) an Tagen 5 und 6 nach der Tumorzellenimplantation. Die Gewebe wurden einen Tag (13A) oder drei Tage (13B) nach der DNA : Lipid-Injektion gesammelt.
14 stellt die Serumwerte von IL-2 nach i. p. Injektion von IL-2-pDNA oder Protein in MOT-Tumor tragenden Mäusen dar. Die Serumwerte von IL-2 waren viel niedriger als die Werte in Aszites. Aszites und Serum wurden nach vier Stunden an den Tagen 1, 2, 3, 6 und 10 nach DNA- oder Proteininjektion gesammelt (fünf Mäuse für jeden Zeitpunkt) und auf mIL-2-Polynucleotid unter Verwendung eines ELISA analysiert.
15 zeigt eine signifikante Reduktion des MOT-Tumorwachstums (p = 0,01; 15A) und eine erhöhte Überlebensrate (p = 0,004; 15B) von Mäusen, die mit i. p. Injektionen von IL-2-pDNA : Lipid an Tagen 5–10 nach der Tumorzelleninjektion behandelt wurden. Die DNA war entweder in einem 1 : 1- (15A und 15B) oder in einem 5 : 1- (15C und 15D) DNA-DMRIE-Masseverhältnis (100 μg pDNA) komplexiert. Plasmid-DNA ohne Lipid war nicht wirkungsvoll (15E und 15F).
16 veranschaulicht, dass Behandlung mit i. p. Injektionen von mIL-2-Plasmid-DNA (VR1110) : Lipid das Tumorwachstum hemmt (16A) und die Überlebensrate (16B) im MOT-Tumormodell in C3H/HeN-Mäusen erhöht. MOT-Tumor tragende Mäuse erhielten drei i. p. Injektionen eines Komplexes von pDNA : DMRIE/DOPE (1 : 1 DNA : DMRIE-Masseverhältnis, 100 μg Plasmid-DNA) im Abstand von zwei Tagen.
17 zeigt eine signifkante Reduktion des MOT-Tumorwachstums und erhöhte Überlebensrate von Mäusen, die mit i. p. Injektion von IL-2-DNA : Lipid und anschließendes Debulking von Tumoraszites behandelt wurden. MOT-Tumor tragende Mäuse erhielten sechs aufeinander folgende i. p. Injektionen eines Komplexes von pDNA: DMRIE/DOPE (1 : 1 DNA : DMRIE-Masseverhältnis, 100 μg pDNA) und wurden vier Tage nach der letzten DNA : Lipid-Injektion Debulking von 5 ml Tumoraszites unterzogen (n = 10).
18 zeigt die Dosis-Response von mIL-2-pDNA (VR1110) : Lipid-Behandlung im MOT-Tumormodell. C3H/HeN-Mäuse mit MOT-Tumor wurden mit 25, 50 oder 100 μg VR1110 : DMRIE/DOPE an Tagen 5, 8 und 11 nach der MOT-Tumorzelleninjektion injiziert. In mit 50 oder 100 μg VR1110 behandelten Mäusen war am Tag 15 nach der Tumorzelleninjektion gegenüber dem Vergleich das Tumorwachstum signifikant reduziert (p = 0,002) und die Überlebensrate signifikant erhöht (p = 0,01). Tumor tragende Mäuse, die mit 25 μg VR1110 : Lipid behandelt wurden, unterschieden sich nicht signifikant von den Vergleichsmäusen – weder in Bezug auf das Tumorvolumen noch in Bezug auf die Überlebensrate (n = 15).
19 veranschaulicht das Cytokinprofil von Eierstocktumor-Aszites im C3H/HeN-Mäuse-MOT-Tumormodell nach mIL-2-pDNA-(VR1110) : Lipid-Behandlung. Mäuse erhielten i. p. Injektionen eines Komplexes von pDNA/DMRIE/DOPE (1 : 1 DNA/DMRIE Masseverhältnis, 100 μg Plasmid-DNA) an Tagen 5, 8 und 11 nach der Tumorzellenimplantation. Zwei Tage nach jeder Injektion wurden die Mäuse getötet (fünf Mäuse für jeden Zeitpunkt) und die Aszites gesammelt und auf Cytokinen-Konzentration analysiert. Der Wert an IL-2 (Tage 7, 10 und 13) sowie IFNγ und GM-CSF)Tage 10 und 13) waren deutlich höher, was den Schluss nahe legt, dass IL-2 die IFNγ- und GM-CSF-Produktion hochreguliert.
20 zeigt, dass die Behandlung mit i. p. Injektionen an mIFNα-pDNA (VR111) : Lipid die Überlebensrate (20B) im MOT-Tumormodell in C3H/HeN-Mäusen erhöht. MOT-Tumor tragende Mäuse erhielten jeden zweiten Tag drei i. p. Injektionen eines Komplexes von pDNA : DMRIE/DOPE (1 : 1 DNA : DMRIE Masseverhältnis, 100 μg Plasmid-DNA).
Ausführliche Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Verwendung zumindest eines Polynucleotidkonstrukts, umfassend zumindest ein Polynucleotid, das für zumindest ein Cytokin kodiert, oder zumindest ein aktives Fragment davon, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs durch In-vivo-Verabreichung des Polynucleotidkonstrukts in ein Nicht-Tumor-Gewebe eines an Krebs leidenden Säugetiers. Das Polynucleotidkonstrukt wird in die Zellen des Säugetiers in vivo inkorporiert und eine therapeutisch wirksame Menge eines Cytokins in vivo produziert und den Tumorzellen zugeführt. Kombinationen von für Cytokin kodierenden Polynucleotiden können verabreicht werden.
Die Erfindung bietet somit die Verwendung eines nichtinfektiösen, nichtintegrativen Polynucleotidkonstrukts, umfassend ein Polynucleotid, das aus der Gruppe bestehend aus (a) einem Polynucleotid, das unter strengen Bedingungen an die Nucleotidsequenz der SEQ.-ID Nr. 7 oder deren Komplement hybridisiert, worin die Polynucleotidsequenz für ein Polypeptid kodiert, das antiproliferative Aktivität aufweist, wenn es in vitro NIH-OVCAR3-Zellen zugesetzt wird; (b) einem Polynucleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die mit Ausnahme zumindest einer, aber nicht mehr als 20 Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen oder -Insertionen identisch mit den Aminosäuren -23 bis 172 oder 1 bis 172 in SEQ.-ID Nr. 8 ist, worin das Polypeptid antiproliferative Aktivität aufweist, wenn es in vitro NIH-OVCAR3-Zellen zugesetzt ist; und (c) einem Polynucleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das Aminosäuren 86–172 in SEQ.-ID Nr. 8 umfasst, worin das Polypeptid antiproliferative Aktivität aufweist, wenn es in vitro NIH-OVCAR3-Zellen zugesetzt ist; und einer oder mehreren kationischen Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus kationischen Lipiden, kationischen Peptiden, kationischen Proteinen, kationischen Polymeren und Gemischen davon, ausgewählt ist. Das nichtinfektiöse, nichtintegrative Polynucleotidkonstrukt kann dazu dienen, alle Funktionen der vorliegenden Erfindung zu erfüllen.
Die Erfindung betrifft überdies die Verwendung (zwecks Herstellung eines Medikaments) eines Komplexes eines Polynucleotids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) einem Polynucleotid, das unter strengen Bedingungen an die Nucleotidsequenz der SEQ.-ID Nr. 7 oder deren Komplement hybridisiert, worin die Polynucleotidsequenz für ein Polypeptid kodiert, das antiproliferative Aktivität aufweist, wenn es in vitro NIH-OVCAR3-Zellen zugesetzt wird; (b) einem Polynucleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die mit Ausnahme zumindest einer, aber nicht mehr als 20 Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen oder -Insertionen identisch mit den Aminosäuren -23 bis 172 oder 1 bis 172 in SEQ.-ID Nr. 8 ist, worin das Polypeptid antiproliferative Aktivität aufweist, wenn es in vitro NIH-OVCAR3-Zellen zugesetzt ist; und (c) einem Polynucleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuren 86–172 in SEQ.-ID Nr. 8 umfasst, worin das Polypeptid antiproliferative Aktivität aufweist, wenn es in vitro NIH-OVCAR3-Zellen zugesetzt ist; mit einer oder mehreren kationischen Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus kationischen Lipiden, kationischen Peptiden, kationischen Proteinen, kationischen Polymeren und Gemischen davon, ausgewählt ist.
Das hierin verwendete Polynucleotidkonstrukt kann ein Polynucleotid, das unter strengen Bedingungen an die Nucleotidsequenz von SEQ.-ID Nr. 7 oder deren Komplement hybridisiert, worin die Polynucleotidsequenz für ein Polypeptid kodiert, das antiproliferative Aktivität aufweist, wenn es NIH-OVCAR3-Zellen in vitro zugesetzt ist, und eine oder mehrere kationische Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus kationischen Lipiden, kationischen Peptiden, kationischen Proteinen, kationischen Polymeren und Gemischen davon, umfassen. Alternativ dazu kann das hierin verwendete Polynucleotidkonstrukt ein Polynucleotidkonstrukt sein, das ein Polynucleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die mit Ausnahme zumindest einer, aber nicht mehr als 20 Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen oder -Insertionen mit den Aminosäuren -23 bis 172 oder 1 bis 172 in SEQ.-ID Nr. 8 identisch ist, worin das Polypeptid antiproliferative Aktivität aufweist, wenn es NIH-OVCAR3-Zellen in vitro zugesetzt ist, und eine oder mehrere kationische Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus kationischen Lipiden, kationischen Peptiden, kationischen Proteinen, kationischen Polymeren und Gemischen davon, umfasst. Alternativ dazu kann das hierin verwendete Polynucleotidkonstrukt ein Polynucleotidkonstrukt sein, das ein Polynucleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuren 86–172 in SEQ.-ID Nr. 8 umfasst, worin das Polypeptid antiproliferative Aktivität aufweist, wenn es. NIH-OVCAR3-Zellen in vitro zugesetzt ist, und eine oder mehrere kationische Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus kationischen Lipiden, kationischen Peptiden, kationischen Proteinen, kationischen Polymeren und Gemischen davon, umfasst.
Zumindest ein hierin verwendetes Polynucleotidkonstrukt umfasst zumindest ein Polynucleotid, das für ein IFNω kodiert, oder ein aktives Fragment davon. Vorzugsweise enthält das Polynucleotidkonstrukt ein Polynucleotid, das für ein Human-IFNω kodiert. Noch bevorzugter kodieren die Nucleotide 1 bis 585 in SEQ.-ID Nr. 7 (entsprechen den Aminosäuren -23 bis 172 in SEQ.-ID Nr. 8) oder die Nucleotide 70 bis 585 in SEQ.-ID Nr. 7 (entsprechen den Aminosäuren 1 bis 172 in SEQ.-ID Nr. 8) für IFNω. Am bevorzugtesten ist das Polynucleotidkonstrukt VR4151 in SEQ.-ID Nr. 4. Das Polynucleotidkonstrukt kann mit einer oder mehreren kationischen Verbindungen komplexiert sein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus kationischen Lipiden, kationischen Peptiden, kationischen Proteinen, kationischen Polymeren und Gemischen davon. Vorzugsweise ist das Polynucleotidkonstrukt mit einem oder mehreren kationischen Lipiden komplexiert. Noch bevorzugter ist das Polynucleotidkonstrukt mit einem oder mehreren kationischen Lipiden sowie einem oder mehreren neutralen Lipiden komplexiert. Noch bevorzugter ist das kationische Lipid (±)-N-(2-Hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)-1-propaniminiumbromid (DMRIE) und das neutrale Lipid 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamin (DOPE), sodass das Masseverhältnis des Polynucleotidkonstrukts zum Lipid von etwa 10 : 1 bis etwa 0,5 : 1 reicht. Noch bevorzugter reicht das Masseverhältnis des Polynucleotidkonstrukts zum Lipid von etwa 5 : 1 bis etwa 1 : 1. Noch bevorzugter beträgt das Masseverhältnis des Polynucleotidkonstrukts zum Lipid etwa 5 : 1.
Für Cytokin kodierende Plasmide sind hierin VR4102 (hIFNα im VR1012-Vektor; SEQ.-ID Nr. 1), VR4112 (hIFNα im VR1055-Vektor; SEQ.-ID Nr. 2), VR4150 (hIFNω im VR1012-Vektor; SEQ.-ID Nr. 3), VR4151 (hIFNω im VR1055-Vektor; SEQ.-ID Nr. 4), VR4101 (mIFNα im VR1012-Vektor; SEQ.-ID Nr. 5), VR4111 (mIFNα im VR1055- Vektor; SEQ.-ID Nr. 6), VR1110 (mIL-2 im VR1012-Vektor), VR1103 (hIL-2 im VR-1012-Vektor; SEQ.-ID Nr. 25), VR4001 (mIL-12 im VR1033-Vektor) und VR1700 (mGM-CSF im VR1012-Vektor).
Beispiele für Cytokin kodierende cDNA sind hierin die cDNA für hIFNω (SEQ.-ID Nr. 7), die cDNA für hIFNω (SEQ.-ID Nr. 9), die cDNA für mIFNα (SEQ.-ID Nr. 11), die cDNA für hIL-2 (SEQ.-ID Nr. 13 und der kodierende Abschnitt von SEQ.-ID Nr. 25), die cDNA für mIL-2 (z. B. wie in Kashima et al., Nature 313, 402–404 (1985) offenbart, welche Veröffentlichung hierin durch Verweis aufgenommen ist), die cDNA für mIL-12 (siehe z. B. Tone et al., Eur. J. Immunol. 26, 1222–1227 (1996), welche Veröffentlichung hierin durch Verweis aufgenommen ist) und die cDNA für mGM-CSF (siehe z. B. Gough et al., EMBO J. 4, 645–653 (1985), welche Veröffentlichung hierin durch Verweis aufgenommen ist). Die hierin besprochenen Cytokinpolypeptide sind z. B. hIFNω (SEQ.-ID Nr. 8), hIFNα (SEQ.-ID Nr. 10), mIFNα (SEQ.-ID Nr. 12) und hIL-2 (SEQ.-ID Nr. 14 und SEQ.-ID Nr. 26).
Unter „strengen Bedingungen" ist hierin eine Hybridisierung durch Inkubation über Nacht bei 42°C in einer Lösung, umfassend 50% Formamid, 5 × SSC (750 mM NaCl, 15 mM Trinatirumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat und 20 μg/ml denaturierte, geschorene Lachssperma-DNA, gefolgt von wiederholtem Waschen der Filter (zumindest dreimal) in 0,1 × SSC und 0,1% Natriumdodecylsulfat (w/v) 20 Minuten lang bei etwa 65°C, zu versehen.
Unter „aktivem Fragment" versteht man hierin ein Fragment eines Cytokins, das die antiproliferative Aktivität des reifen Cytokins oder Cytokins voller Länge aufweist. Beispielsweise ist ein hIFNω voller Länge in den Aminosäuren -23 bis 172 von SEQ.-ID Nr. 8 ausgebildet. Das entsprechende reife hIFNω ist in den Aminosäuren 1 bis 172 von SEQ.-ID Nr. 8 ausgebildet. Aktive Fragmente von hIFNω sind u. a. ein Polypeptid, das die Aminosäuren 86 bis 172 in SEQ.-ID Nr. 8 umfasst, ein Polypeptid, das die Aminosäuren 41 bis 172 in SEQ.-ID Nr. 8 umfasst, und ein Polypeptid, das die Aminosäuren 21 bis 172 in SEQ.-ID Nr. 8 umfasst. Ein hIFNω voller Länge ist in den Aminosäuren -23 bis 166 von SEQ.-ID Nr. 10 ausgebildet. Das entsprechende reife hIFNω ist in den Aminosäuren 1 bis 166 von SEQ.-ID Nr. 10 ausgebildet. Aktive Fragmente von hIFNα sind u. a. ein Polypeptid, das die Aminosäuren 83 bis 166 in SEQ.-ID Nr. 10 umfasst, ein Polypeptid, das die Aminosäuren 62 bis 166 in SEQ.-ID Nr. 10 umfasst, ein Polypeptid, das die Aminosäuren 41 bis 166 in SEQ.-ID Nr. 10 umfasst, und ein Polypeptid, das die Aminosäuren 21 bis 166 in SEQ Nr. 10 umfasst. hIL-2 voller Länge ist in den Aminosäuren -20 bis 133 von SEQ.-ID Nr. 14 ausgebildet. Das entsprechende reife hIL-2 ist in den Aminosäuren 1 bis 133 von SEQ.-ID Nr. 14 ausgebildet. Aktive Fragmente von hIL-2 sind u. a. ein Polypeptid, das die Aminosäuren 58 bis 105 in SEQ.-ID Nr. 14 umfasst, und ein Polypeptid, das die Aminosäuren 20 bis 126 in SEQ.-ID Nr. 14 umfasst.
Tests der antiproliferativen Aktivität in vitro sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Beispielsweise kann ein geeigneter Antiproliferationstest darin bestehen, kultivierte Zellen, z. B. Human-Eierstock-N1H-OVCAR3-Zellen (ATCC, Rockville, MD, USA), mit Überständen aus Human-Melanom-UM449-Zellen, transfiziert mit dem Polynucleotidkonstrukt, das ein für IFNω kodierendes Polynucleotid oder ein aktives Fragment davon enthält, zu behandeln. In diesem Antiproliferationstest werden NIH-OVCAR3-Zellen in 96-Napf-Gewebekulturplatten kultiviert und ausplattiert. Die Platten werden 24 Stunden lang bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO₂ inkubiert. 20 μl Gewebekulturüberstände aus transfizierten UM449-Zellen werden jeweils zwei Näpfen zugesetzt. Ein IFN-Referenzstandard (z. B. Human-Leukozyten-IFN, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) ist in jedem Assay enthalten. Die Zellen werden mit den Testproben oder dem IFN-Standard weitere 72 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Um die Wirkung auf die Zellproliferation zu quantifizieren werden 50 μl XTT/ ECR-Substrat (Cell Proliferation Kit, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA) jedem Napf zugesetzt und die Platten weitere 24 Stunden lang bei 37°C vor der Messung der OD₄₉₀ inkubiert. Es können andere Zelllinien im Antiproliferationstest verwendet werden. Beispielsweise können beliebige der in Tabelle 1 angeführten Zellen verwendet werden. Ein weiterer geeigneter Antiproliferationstest ist der von Nieroda et al. (Mol. Cell. Differentiation 4, 335–351 (1996)).
Bei der Verwendung eines Polynucleotidkonstrukts, das ein für ein Cytokin kodierendes Polynucleotid umfasst, zur Herstellung eines Krebsmedikaments kann das Polynucleotid lokal, systemisch oder intrakavitär zugeführt werden. Gemäß der Ausführungsform der „systemischen Zufuhr" werden ein oder mehrere Polynucleotidkonstrukte, die ein oder mehrere für ein oder mehrere Cytokine kodierende Polynucleotide umfassen, in ein Gewebe verabreicht, sodass das Polynucleotid als Cytokin in vivo exprimiert wird und in den Blutkreislauf freigesetzt wird, damit eine therapeutisch wirksame Menge des Cytokins systemisch dem Tumor zugeführt wird. In dieser Ausführungsform kann das Polynucleotidkonstrukt innerhalb von Ex-vivo-Zellen verabreicht oder mit Ex-vivo-Zellmaterial assoziiert sein. Vorzugsweise ist das Cytokin ein IFNω, IFNα, IFNτ, IFNγ, IFNβ, IL-1, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, GM-CSF oder jede Kombination davon bzw. jede Kombination eines oder mehrerer dieser Cytokine und eines oder mehrerer weiterer Cytokine. Noch bevorzugter ist das Cytokin ein IFNα, IFNω, IL-2 oder IL-12. Am bevorzugtesten ist das Cytokin ein IFNα oder IFNω. Beispiele für die Kombinationen sind ein für IFNω und ein IFNα kodierendes Polynucleotid; ein für ein IFNω und ein IL-2 kodierendes Polynucleotid; ein für ein IFNα und ein IL-2 kodierendes Polynucleotid; und ein für ein IFNω, ein IFNα und ein IL-2 kodierendes Polynucleotid. Noch bevorzugter enthält das Polynucleotidkonstrukt ein Polynucleotid, das für ein IFNω und/oder ein IFNα kodiert. Noch bevorzugter enthält das Polynucleotidkonstrukt ein für ein Human-IFNω und/oder ein Human-IFNα kodierendes Polynucleotid. Noch bevorzugter kodiert das Polynucleotid für ein Human-IFNω. Vorzugsweise wird das Polynucleotidkonstrukt frei von Ex-vivo-Zellen und frei von Ex-vivo-Zellmaterial verabreicht.
In dieser Ausführungsform kann die Verabreichung in Gewebe erfolgen, das z. B. Muskel, Haut, Gehirn, Lunge, Leber, Milz, Knochenmark, Thymusdrüse, Herz, Lymphknoten, Blut, Knochen, Knorpel, Bauchspeicheldrüse, Niere, Gallenblase, Ma gen, Darm, Hoden, Eierstock, Gebärmutter, Rectum, Nervensystem, Auge, Drüse oder Bindegewebe ist. Vorzugsweise erfolgt die Verabreichung in Muskelgewebe, d. h. in Skelettmuskel, glatten Muskel oder Myokard, und das Polynucleotidkonstrukt ist nackt. Am bevorzugtesten ist der Muskel Skelettmuskel. Für Polynucleotidkonstrukte, in denen das für ein Cytokin kodierendes Polynucleotid DNA ist, kann die DNA operabel mit einem zellspezifischen Promotor verbunden sein, der substanzielle Transkription der DNA nur in vorbestimmten Zellen lenkt.
Unter „nackt" ist hierin zu verstehen, dass das Polynucleotidkonstrukt frei von Assoziation mit jedem auf dem Gebiet bekannten Zufuhrvehikel ist, das den Eintritt in Zellen erleichtern kann, z. B. frei von Transfektion erleichternden Proteinen, viralen Teilchen, Liposomen, kationischen Lipiden und Calciumphosphat-Fällungsmitteln.
Unter „Ex-vivo"-Zellen sind hierin Zellen zu verstehen, in die das Polynucleotidkonstrukt eingeführt wird, z. B. durch Transfektion, Lipoektion, Elektroporation, Beschuss oder Mikroinjektion. Die das Polynucleotidkonstrukt enthaltenden Zellen werden dann in vivo in Säugetiergewebe verabreicht. Solche Ex-vivo-Polynucleotidkonstrukte sind Fachleuten auf dem Gebiet allgemein bekannt. Siehe z. B. Belldegrun, A. et al., J. Natl. Cancer Inst. 85, 207–216 (1993); Ferrantini, M. et al., Cancer Research 53, 1107–1112 (1993); Ferrantini, M. et al., J. Immunology 153, 4604–4615 (1994); Kaido, T. et al., Int. J. Cancer 60, 221–229 (1995); Ogura, N. et al., Cancer Research 50, 5102–5106 (1990); Santodonato, L. et al., Human Gene Therapy 7, 1–10 (1996); Santodonato, L. et al., Gene Therapy 4, 1246–1255 (1997); und Zhang, J. -F. et al., Cancer Gene Therapy 3, 31–38 (1996).
Das Polynucleotidkonstrukt wird in „zellfreier" Weise verabreicht, wenn die Zufuhr unabhängig erfolgt, d. h. frei von Ex-vivo-Zellen oder Ex-vivo-Zellmaterial.
Bei der Verwendung eines Polynucleotid zur Herstellung eines Medikaments zur Krebsbehandlung durch eine der oben geoffenbarten Ausführungsformen kann jedes für ein IFNω kodierende Polynucleotid oder aktives Fragment davon verwendet werden. Beispielsweise kann das Polynucleotidkonstrukt ein Konstrukt sein, das ein Polynucleotid, das unter strengen Bedingungen an die Nucleotidsequenz von SEQ.-ID Nr. 7 oder deren Komplement hybridisiert, worin die Polynucleotidsequenz für ein Polypeptid kodiert, das antiproliferative Aktivität aufweist, wenn es NIH-OVCAR3-Zellen in vitro zugesetzt ist, und eine oder mehrere kationische Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus kationischen Lipiden, kationischen Peptiden, kationischen Proteinen, kationischen Polymeren und Gemischen davon, umfasst. Alternativ dazu kann das Konstrukt ein Polynucleotidkonstrukt sein, das ein Polynucleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die mit Ausnahme einer, aber nicht mehr als 20 Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen oder -Insertionen mit den Aminosäuren -23 bis 172 oder 1 bis 172 in SEQ.-ID Nr. 8 identisch ist, worin das Polypeptid antiproliferative Aktivität besitzt, wenn es NIH-OVCAR3-Zellen in vitro zugesetzt ist, und eine oder mehrere kationische Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus kationischen Lipiden, kationischen Peptiden, kationischen Proteinen, kationischen Polymeren und Gemischen davon, umfasst. Alternativ dazu kann das hierin verwendete Polynucleotidkonstrukt ein Polynucleotidkonstrukt sein, das ein Polynucleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuren 86–172 in SEQ.-ID Nr. 8 umfasst, worin das Polypeptid antiproliferative Aktivität aufweist, wenn es NIH-OVCAR3-Zellen in vitro zugesetzt ist, und eine oder mehrere kationische Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus kationischen Lipiden, kationischen Peptiden, kationischen Proteinen, kationischen Polymeren und Gemischen davon, umfasst. Vorzugsweise kodieren die Nucleotide 1 bis 585 in SEQ.-ID Nr. 7 (entsprechen den Aminosäuren -23 bis 172 in SEQ.-ID Nr. 8) oder die Nucleotide 70 bis 585 in SEQ.-ID Nr. 7 (entsprechen den Aminosäuren 1 bis 172 in SEQ.-ID Nr. 8) für IFNω. Noch bevorzugter ist das Polynucleotidkonstrukt VR4151.
Bei der Verwendung eines Polynucleotids zur Herstellung eines Medikaments zur Krebsbehandlung kann jedes beliebige für IFNα kodierende Polynucleotid oder akti ve Fragment davon verwendet werden. Beispielsweise kann das Polynucleotidkonstrukt ein Konstrukt sein, das ein Polynucleotid, das unter strengen Bedingungen an die Nucleotidsequenz von SEQ.-ID Nr. 9 oder deren Komplement hybridisiert, worin die Polynucleotidsequenz für ein Polypeptid kodiert, das antiproliferative Aktivität aufweist, wenn es in vitro NIH-OVCAR3-Zellen zugesetzt ist, und eine oder mehrere kationische Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus kationischen Lipiden, kationischen Peptiden, kationischen Proteinen, kationischen Polymeren und Gemischen davon, umfasst. Alternativ dazu kann das Konstrukt ein Polynucleotidkonstrukt sein, umfassend ein Polynucleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die mit Ausnahme zumindest einer, aber nicht mehr als 20 Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen oder -Insertionen mit den Aminosäuren -23 bis 166 oder 1 bis 166 in SEQ.-ID Nr. 10 identisch ist, worin das Polypeptid antiproliferative Aktivität aufweist, wenn es in vitro NIH-OVCAR3-Zellen zugesetzt ist, und eine oder mehrere kationische Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus kationischen Lipiden, kationischen Peptiden, kationischen Proteinen, kationischen Polymeren und Gemischen davon. Alternativ dazu kann das Konstrukt ein Polynucleotidkonstrukt sein, umfassend ein Polynucleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuren 83 bis 166 in SEQ.-ID Nr. 10 umfasst, worin das Polypeptid antiproliferative Aktivität aufweist, wenn es in vitro NIH-OVCAR3-Zellen zugesetzt ist, und eine oder mehrere kationische Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus kationischen Lipiden, kationischen Peptiden, kationischen Proteinen, kationischen Polymeren und Gemischen davon. Vorzugsweise kodieren die Nucleotide 1 bis 567 in SEQ.-ID Nr. 9 (entsprechen den Aminosäuren -23 bis 166 in SEQ.-ID Nr. 10) oder Nucleotide 1 bis 567 in SEQ.-ID Nr. 9 (entsprechen den Aminosäuren 1 bis 166 in SEQ.-ID Nr. 10) für IFNω. Noch bevorzugter ist das Polynucleotidkonstrukt VR4112.
Für Polynucleotidkonstrukte, die kein für IFNω kodierendes Polynucleotid enthalten, ist das Polynucleotidkonstrukt vorzugsweise ein zellfreies Konstrukt. Für Polynucleotidkonstrukte, die ein für IFNω kodierendes Polynucleotid enthalten, kann das Poly nucleotidkonstrukt entweder innerhalb von Ex-vivo-Zellen oder frei von Ex-vivo-Zellen oder Ex-vivo-Zellmaterial verabreicht werden. Vorzugsweise wird das Polynucleotidkonstrukt frei von Ex-vivo-Zellen oder Ex-vivo-Zellmaterial verabreicht.
Gemäß der Ausführungsform der „lokalen Zufuhr" oder „intrakavitären Zufuhr" ist das Polynucleotidkonstrukt vorzugsweise mit einer oder mehreren kationischen Verbindungen komplexiert. Noch bevorzugter wird das Polynucleotidkonstrukt mit einem oder mehreren kationischen Lipiden mittels ionischer Wechselwirkung komplexiert. Im Allgemeinen kontaktiert dieser Komplex dann die Zellmembran und wird in die Zelle transfiziert. Dieser Transfektionsmechanismus wird als „Lipofektion" bezeichnet und ist eine hochwirksame Transfektionsmethode (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413–7417 (1987); und Felgner et al., Nature 337, 387–388 (1989)). Noch bevorzugter ist das Polynucleotidkonstrukt mit einem oder mehrere kationischen Lipiden und einem oder mehreren neutralen Lipiden komplexiert.
Für die Zwecke der Erfindung bezieht sich Lipid auf eine synthetische oder natürlich vorkommende Verbindung, die sowohl einen lipophilen Bereich als auch einen polaren Bereich besitzt (üblicherweise als Kopfgruppe bezeichnet). Bevorzugte kationische Verbindungen sind kationische Lipide. Kationische Lipide sind in den US-Patenten 4.897.355, 4.946.787, 5.049.386, 5.264.618, 5.279.833, 5.334.761, 5.429.127, 5.459.127, 5.589.466, 5.676.954, 5.693.622, 5.580.859, 5.703.055 und 5.578.475 sowie in WO 04/9469, WO 95/14381, 95/14651, 95/17373, 96/26179, 96/40962, 96/40963, 96/41873 und 97/00241 und den dort angeführten Publikationen beschrieben. Wie in den oben angeführten Patenten und Patentanmeldungen veranschaulicht, umfassen kationische Lipide strukturelle Merkmale, die in einer Vielzahl an molekularen Kernklassen vorhanden sein können.
Beispiele für kationische Lipide sind 5-Carboxyspermylglycindioctadecylamid (DOGS) und Dipalmitoyl-phosphatidylethanolamin-5-carboxyspermylamid (DPPES). Kationische Cholesterinderivate kommen ebenfalls in Frage, z. B. {3β-[N,N',N'-Dime thylamino)ethan]-carbomoyl}-cholesterin (DC-Chol). Dimethyldioctdecylammoniumbromid (DDAB), N-(3-Aminopropyl)-N,N-(bis(2-tetradecyloxyethyl))-N-methylammoniumbromid (PA-DEMO), N-(3-Aminopropyl)-N,N-(bis-(2-dodecyloxyethyl))-N-methylammoniumbromid (PA-DELO), N,N,N-Tris-(2-dodecyloxy)ethyl-N-(3-amino)propylammoniumbromid (PA-TELO) und N¹-(3-Aminopropyl)((2-dodecy)ethyi)-N²-(2-dodecyloxy)ethyl-1-piperazinaminiumbromid (GA-LOE-BP) können hierin ebenfalls verwendet werden.
Kationische Nicht-Diether-Lipide wie z. B. DL-1,2-Dioleoyl-3-dimethylaminopropyl-β-hydroxyethylammonium (DORT-Diester), 1-0-Oleyl-2-oleoyl-3-dimethylaminopropyl-β-hydroxyethylammonium (DORT-Ester/Ether) sowie ihre Salze unterstützen die Invivo-Gen-Zufuhr. Bevorzugte kationische Lipide umfassen Gruppen, die über ein Heteroatom an der quaternären Ammoniumgruppe in der Kopfgrunne befestigt sind. Ein Glycyl-Spacer kann den Linker mit der Hydroxylgruppe verbinden.
Bevorzugte kationische Lipide sind 3,5-(N,N-Dilysyl)-diaminobenzoyl-3-(DL-1,2-dioleoyl-dimethylaminopropyl-β-hydroxyethalamin) (DLYS-DABA-DORT-Diester), 3,5-(N,N-Di-lysyl)diaminobenzoylglycyl-3-(DL-1,2-dioleoyldimethylaminopropyl-β-hydroxyethylamin) (DLYS-DABA-GLY-DORI-Diester) und (±)-N-(2-Hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)-1-propaniminiumbromid (DMRIE).
Ferner vorzuziehen sind (±)-N,N-Dimethyl-N-[2-(spermincarboxamido)ethyl]-2,3-bis-(dioloyloxy)-1-propaniminiumpentahydrochlorid (DOSPA), (±)-N-(2-Aminoethyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)-1-propaniminiumbromid (β-Aminoethyl-DMRIE oder β-AE-DMRIE) (Wheeler et al., Biochim Biophys. Acta 1280, 1–11 (1996)) und (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(dodecyloxy)-1-propaniminiumbromid (GAP-DLRIE) (Wheeler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11454–11459 (1996)), die aus DMRIE entwickelt wurden.
Andere Beispiele von aus DMRIE abgeleiteten kationischen Lipiden, die sich hierin eignen, sind (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-(bis-decyloxy)-1-propanaminiumbromid (GAP-DDRIE), (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)-1-propanaminiumbromid (GAP-DMRIE), (±)-N-((N''-Methyl)-N'-ureyl)propyl-N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)1-1 propanaminiumbromid (GMU-DMRIE), (±)-N-(2-Hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(dodecyloxy)-1-propanaminiumbromid (DLRIE) und (±)-N-(2-Hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis([Z)-9-octadecenyloxy)propyl-1-propaniminiumbromid (HP-DORIE).
Die Lipide der Lipid enthaltenden Formulierung können ein kationischs Lipid alleine umfassen oder außerdem ein neutrales Lipid wie z. B. Cardiolipin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Dioleoylphosphatidylcholin, Dioleoylphosphatidylethanolamin, 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamin (DOPE), Sphingomyelin sowie Mono-, Di- oder Triacylglycerin umfassen. Andere Additive wie z. B. Cholesterin, Fettsäure, Gangliosid, Glykolipid, Neobee, Niosom, Prostaglandin, Sphingolipid sowie beliebige andere natürliche oder synthetische Amphiphile können ebenfalls verwendet werden. Ein bevorzugtes Molverhältnis zwischen kationischem Lipid und neutralem Lipid in diesen Lipid enthaltenden Formulierungen reicht von etwa 9 : 1 bis zu etwa 1 : 9; ein äquimolekulares Verhältnis ist besonders vorzuziehen. Die Lipid enthaltende Formulierung kann überdies ein Lysolipid (z. B. Lysophosphatidyicholin, Lysophosphatidylethanolamin oder eine Lysoform eines kationischen Lipids) umfassen.
Noch bevorzugter ist das kationische Lipid (±)-N-(2-Hydroxyethyel)-N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)-1-propaniminiumbromid (DMRIE) und das neutrale Lipid 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamin (DOPE), sodass das Masseverhältnis zwischen dem Polynucleotidkonstrukt und Lipid von etwa 10 : 1 bis etwa 0,5 : 1 reicht. Noch bevorzugter reicht das Masseverhältnis zwischen Polynucleotidkonstrukt und Lipid von etwa 5 : 1 bis etwa 1 : 1. Noch bevorzugter beträgt das Masseverhältnis zwischen Polynucleotidkonstrukt und Lipid etwa 5 : 1.
Die Lipid enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in einem Komplex mit dem Polynucleotidkonstrukt der Erfindung kann auch kationisches Lipid gemeinsam mit einer wirksamen Menge eines Lysophosphatids umfassen. Das Lysophosphatid kann eine neutrale oder eine negative Kopfgruppe enthalten. Lysophosphatidylcholin und Lysophosphatidylethanolamin sind vorzuziehen, und 1-Oleoyllysophosphatidylcholin ist besonders vorzuziehen. Lysophosphatidlipide sind günstigerweise in der Lipd enthaltenden Formulierung in einerm Verhältnis zwischen Lysolipid und kationischem Lipid von 1 : 2 enthalten. Lysoformen eines kationischen Lipids können auch dazu verwendet werden, die Polynucleotid-Zufuhr zu verstärken. Diese Lysoformen sind günstigerweise in wirksamen Mengen bis zu etwa 1/3 des gesamten kationischen Lipids in den Lipid enthaltenden Formulierungen vorhanden.
In einer Formulierung zur Herstellung von DNA : Lipid-Komplexen kann das kationische Lipid in einer Konzentration von zwischen etwa 0,1 Mol-% und etwa 100 Mol-%, vorzugsweise zwischen etwa 5 Mol-% und 100 Mol-%, am bevorzugtesten zwischen etwa 20 Mol-% und 100 Mol-%, bezogen auf andere in der Formulierung enthaltene Formulierungskomponenten vorhanden sein. Das neutrale Lipid kann in einer Konzentration zwischen 0 und etwa 99,9 Mol-%, vor zwischen 0 und etwa 95 Mol-%, noch bevorzugter zwischen 0 und etwa 80 Mol-%, vorhanden sein. Um Lipidvesikel mit einer positiven Nettoladung zu produzieren, muss die Menge der positiv geladenen Komponente über jene der negativ geladenen Komponente hinausgehen. Das negativ geladene Lipid kann in einer Menge zwischen 0 und etwa 49 Mol-%, vorzugsweise zwischen 0 und etwa 80 Mol-%, noch bevorzugter zwischen 0 und etwa 50 Mol-%, vorhanden sein.
Das zuzuführende Polynucleotid kann in einem Puffer vor der Vermischung mit Lipidvesikeln solubilisiert werden. Geeignete Puffer sind z. B. Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS), herkömmliche Salzlösung, Tris-Puffer und Natriumphosphatvesikel (100–150 mM sind vorzuziehen). Unlösliche Polynucleotide können in einer schwa chen Säure oder Base solubilisiert und dann bis zum. erwünschten Volumen mit einem neutralen Puffer wie etwa PBS verdünnt werden. Der pH-Wert des Puffers wird entsprechend eingestellt, und außerdem kann ein pharmazeutisch annehmbares Additiv im Puffer verwendet werden, um für angemessene Osmolarität innerhalb des Lipidvesikels zu sorgen.
Eine Lipidlösung, die zumindest ein amphiphiles Lipid umfasst, kann sich spontan bilden, um primäre Lipdvesikel mit heterogener Größe zu erzeugen. Daher werden gemäß eurem bevorzugten Verfahren die Lipide der Lipid enthaltenden Formulierung, die zumindest ein kationisches Lipid umfasst, durch Verdünnung in einem Lösungsmittel wie z. B. Chloroform hergestellt und das Gemisch bis zur Trockenheit als Film auf der Innenfläche eines Glasgefäßes verdampft. Nach Suspension in einem wässrige Lösungsmittel bilden sich die amphiphilen Lipidmoleküle zu primären Lipidvesikeln. Diese können mittels eines Ausfrierverfahrens bis zu einem ausgewählten mittleren Durchmesser reduziert werden. Vesikel einheitlicher Größe können vor der Medikamentenzufuhr gemäß auf dem Gebiet bekannter Verfahren zur Vesikelproduktion gebildet werden; ein Beispiel dafür ist die Ultraschallbehandlung einer Lipidlösung nach dem Verfahren von Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US 84, 7413-7417 (1987) und gemäß US-Patent 5.264.618.
Der Ausdruck „Säugetier" bezieht sich hierin auf ein einzelnes oder mehrere Säugetiere und umfasst u. a. Menschen; Primaten wie z. B. Menschenaffen, Affen, Orang-Utan und Schimpansen; hundeartige Tiere wie z. B. Hunde und Wölfe; katzenartige Tiere wie z. B. Katzen, Löwen und Tiger; pferdeartige Tiere wie z. B. Pferde, Esel, Wild, Zebras und Giraffen; und Bären. Vorzugsweise ist das Säugetier ein Mensch.
Die Tumorzellbildung und das Tumorzellwachstum – auch als „Transformation" bezeichnet – beschreibt die Bildung und Vermehrung von Zellen, die ihre Fähigkeit eingebüßt haben, die Zellteilung zu steuern, d. h. die zu Krebszellen wurden. „Maligne Zellen" sind als Zellen definiert, die ihrer Fähigkeit zur Steuerung des Zellteilungszyk lus verlustig gegangen sind, was zu einem transformierten oder kanzerösen Phänotyp führt.
Der Ausdruck „Nicht-Tumorgewebe" beschreibt hierin u. a. keinen Tumor tragende Gewebe wie z. B. Muskel, Gehirn, Lunge, Leber, Milz, Knochenmark, Thymusdrüse, Herz, Lymphen, Blut, Knochen, Knorpel, Bauchspeicheldrüse, Niere, Gallenblase, Magen, Darm, Hoden, Eierstock, Gebärmutter, Rectum, Nervensystem, Auge, Drüse oder Bindegewebe. Vorzugsweise ist das Nicht-Tumorgewebe Muskel.
Vorzugsweise wird das Polynucleotidkonstrukt dem Zwischenraum eines Tumors oder von Nicht-Tumorgeweben zugeführt. Unter „Zwischenraum" oder „Interstitium" ist hierin die interzelluläre, flüssige Mukopolysaccharid-Matrix entlang der Retikulumfasern von Organgeweben, entlang der elastischen Fasern in den Wänden von Gefäßen oder Kammern, entlang der Kollagenfasern von Fasergeweben oder dieselbe Matrix innerhalb von Muskelzellen einhüllendem Bindegewebe oder in den Knochenlücken zu verstehen. Es handelt sich ebenso um den Raum, den das Plasma des Blutkreislaufs und die Lymphflüssigkeit der Lymphkanäle einnimmt.
Die Polynucleotide der Erfindung können zur Behandlung verschiedener Säugetierkrebse oder -tumoren verwendet werden. Beispiele für Säugetierkarzinome oder -tumoren, die mit den Polynucleotiden der Erfindung behandelt werden können, sind u. a. feste Tumoren, kutane Tumoren, Melanom, malignes Melanom, Nierenzellenkarzinom, kolorektales Karzinom, Kolonkarzinom, hepatische Metastasen von fortgeschrittenem kolorektalem Karzinom, Lymphome (z. B. Drüsenymphom), malignes Lymphom, Kaposi-Sarkom, Prostatakarzinom, Nierenkarzinom, Eierstockkarzinom, Lungenkarzinom, Kopf- und Halskarzinom, Pankreaskarzinom, Mesenterialkarzinom, Magenkrebs, Rektalkarzinom, Blasenkarzinom, Leukämie (z. B. Haarzellenleukämie und chronische myeolische Leukämie), Brustkrebs, Nicht-Melanom-Hautkrebs (z. B. Plattenepithelkarzinom und Basalzellenkarzinom), Hämangiom, multiples Myelom und Gliom. Vorzugsweise ist der Krebs Melanom, Eierstockkarzinom oder Metastasen davon.
Unter „Behandlung" ist hierin die Reduktion der Tumorgröße, die Verlangsamung der Rate der Metastasenbildung und/oder die Verlangsamung des Tumorwachstums und/oder keine Verschlechterung des Krankheitszustands über einen bestimmten Zeitraum zu verstehen.
Eine Ausführungsform zur systemischen Zufuhr kann besonders zur Behandlung nichtlokalisierter Tumoren (d. h. Leukämie oder Metastasen einer Vielzahl an Tumoren) oder in einer Krankheitskategorie in Frage kommen, die möglicherweise auf kontinuierliche Exposition auf systemischem Wege anspricht (d. h. Myelom, chronische myeolische Leukämie), Lymphom). Eine Ausführungsform mit lokaler Zufuhr kann besonders zur Behandlung eines Krankheitszustands sinnvoll sein, der möglicherweise auf hohe lokale Konzentration anspricht (d. h. Nierenzellenkarzinom, Melanom).
Eine zusätzliche Ausführungsform der Erfindung betrifft die Kombination der Verwendungszwecke der Erfindung mit einer oder mehreren weiteren Krebstherapien, z. B. mit Knochenmarkstransplantation, Nabelschnurblutzellen-Transplantation, chirurgischen Eingriffen, Chemotherapie, Strahlentherapie und Immuntherapie. Das Polynucleotidkonstrukt oder die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung kann vor dem Beginn einer oder mehrerer der zusätzlichen Krebstherapien, während des Verlaufs einer oder mehrerer der zusätzlichen Krebstherapien und nach dem Ende einer oder mehrerer der zusätzlichen Krebstherapien verabreicht werden.
Typen von Knochenmarkstransplantationen sind u. a. analoge Knochenmarkstransplantationen und heterologe (d. h. aus einem Donor stammende) Knochenmarkstransplantationen.
Beispiele für chirurgische Eingriffe sind u. a. Eingriffe betreffend Brustkrebs, Prostatakarzinom, Kolonkarzinom, Hirnkarzinom sowie Kopf- und Halskarzinom.
Chemotherapeutische Mittel sind u. a. Alkylierungsmittel, z. B. Mechlorethamin, Cyclophosphamid, Ifosfamid, Melphalan, Chlorambucil, Dicarbazin, Streptazocin, Armustin, Lomustin, Semustin, Chlorzotocin, Busulfan Triethylenmelamin, Thiotepa, Hexamethylmelamin; Antimetaboliten, z. B. Methotrexat; Pyrimidinanaloge, z. B. Fluoruracil, 5-Fluoruracil, Floxuridin (5'Fluor-2'-desoxyuridin), Idoxuridin, Cytarabin, Phosphonoacetyl-L-aspartat, 5-Azacytidin, Azaribin, 6-Azauridin, Pyrazofuran, 3-Deazauridin und Acivicin; Purinanaloge, z. B. Thioguanin, Mercaptopurin, Azathioprin, Pentostatin, Erythrohydroxynonyladenin; Vincaalkaloide, z. B. Vincristin und Vinblastin; Epipodophyllotoxine, z. B. Etoposid und Teniposid, Antibiotika, z. B. Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Bleomycin, Sulfat, Plicamycin und Mitomycin; Enzyme, z. B. L-Asparaginase; Platin-Koordinationskomplexe, z. B. Cisplatin und Carboplatin; Hydroxyharnstoft, Procarbazin, Mitotan; und Hormone oder verwandte Mittel, z. B. Adrenocorticosteroide, z. B. Prednison und Prednisolon; Aminoglutethimid; Progestine, z. B. Hydroxyprogesteroncaproat, Medroxyprogesteronacetat, Megesterolacetat, Östrogene und Androgene, z. B. Diethylstilbestrol, Fluoxymesteron und Ethynylestradiol, Anti-Östrogene, z. B. Tamoxifen, und Gonadotropin-freisetzende Hormonanaloge wie z. B. Leuprolin.
Aus den hierin verwendeten Polynucleotiden können Sets (Kits) konstruiert werden, um bei der Behandlung von Krebs zum Einsatz zu kommen, umfassend ein Verabreichungsmittel und ein Behältermittel, das ein oder mehrere Cytokin exprimierende Polynucleotidkonstrukte in einer sterilen Umgebung enthält. Ebenso bereitgestellt werden hierin Sets zu Verwendung bei der Behandlung von Krebs, umfassend ein Verabreichungsmittel und ein Behältermittel, das ein oder mehrere Cytokin exprimierende Polynucleotidkonstrukte sowie eine oder mehrer kationische Verbindungen in einer sterilen Umgebung enthält. Beispiele für kationische Verbindungen sind oben angeführt. Die Cytokin exprimierenden Polynucleotidkonstrukte und die kationischen Verbindungen können im gleichen Behältermittel vorliegen, oder die kationischen Verbindungen können im gleichen Behältermittel oder in getrennten Behältermitteln vorhanden sein. Vorzugsweise liegt das Polynucleotidkonstrukt in einer Menge von 1 ng bis 20 mg vor.
Das Behältermittel kann ein Behältermittel aus Glas oder Kunststoff oder aus Kunststoff- oder Papierstreifen sein. In einer Ausführungsform bezieht sich das Behältermittel auf eine Spritze, und das Verabreichungsmittel ist ein Kolben. In einer weiteren Ausführungsform ist das Verabreichungsmittel ein Katheter.
Das Cytokin, für das das Polynucleotidkonstrukt des Sets der Erfindung kodiert, kann ein IFNω und ein oder mehrer zusätzliche Cytokine, z. B. beliebige der hierin beschriebenen Cytokine, sein. Vorzugsweise ist das Cytokin IFNω und/oder ein IFNα. Das Konstrukt kann in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung vorliegen und kann einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten. Pharmazeutische Zusammensetzungen sind oben beschrieben. Das Set kann außerdem einen pharmazeutisch annehmbaren Träger in einem getrennten Behältermittel umfassen.
Das Set kann außerdem ein Anleitungsblatt zur Verabreichung der Zusammensetzung an ein Säugetier umfassen. Die Komponenten der Polynucleotid-Zusammensetzung sind vorzugsweise als flüssige Lösung, z. B. als Suspension, Lösung oder Emulsion; oder in lyophilisierter Form, z. B. als Trockenpulver oder Kuchen, bereitgestellt. Wenn das Polynucleotidkonstrukt in lyophilisierter Form vorliegt, umfasst das Set vorzugsweise ein Behältermittel, das ein geeignetes Vehikel enthält, z. B. steriles Pyrogen-freies Wasser, zwecks Rekonstitution des lyophilisierten Polynucleotidkonstrukts, oder jeden hierin beschriebenen Puffer, z. B. PBS, herkömmliche Salzlösung, Tris-Puffer und Natriumphosphat-Vehikel.
Der Ausdruck „Cytokin" bezieht sich auf Polypeptide, u. a. Interleukine (z. B. IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL- 17 und IL-18), α-Interferone (z. B. IFNα), β-Interferone (z. B. IFNα), γ-Interferone (z. B. IFNγ, ω-Interferon (IFNω), τ-Interferone (IFNτ), Kolonie-stimulierender Faktor (CSF, z. B. CSF-1, CSF-2 und CSF-3), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGF, z. B. saurer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4 und FGF-5), transformierender Wachstumsfaktor (TGF, z. B. TGFα und TGFβ), Thrombozyten-Wachstumsfaktor (PDGF), Tumornekrosefaktoren (TNF, z. B. TNF-α und TNF-β) und Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren (IGF, z. B. IGF-I und IGF-II).
Unter „Polypeptid" ist hierin jedes beliebige Translationsprodukt eines Polynucleotids zu verstehen – ungeachtet der Größe des Translationsprodukts und gleichgültig ob das Translationsprodukt posttranslational modifiziert (z. B. glykosyliert) ist oder nicht.
Das Polynucleotidkonstrukt der Erfindung, ob es mit kationischem Vehikel komplexiert ist oder nicht, kann durch jede beliebige Form der Verabreichung zugeführt werden, z. B. intramuskulär, subkutan, intravenös, transdermal, intranasal, durch Inhalation oder transmukosal (d. h. über eine Schleimhaut). Ebenso kann die pharmazeutische Zusammensetzung der Endung über jeden geeigneten Weg verabreicht werden, z. B. intramuskulär, in den Tumor oder in der Nähe des Tumors, in einen Hohlraum (z. B. intraperitoneal), subkutan, intravenös, transdermal, intranasal, durch Inhalation oder transmukosal (d. h. über eine Schleimhaut).
Jede beliebige Verabreichungsweise ist geeignet, sofern sie die Expression eines oder mehrerer Cyotkine in einer Menge ermöglicht, die ausreicht, um die Tumorigenität des von Krebs befallenen Säugetiers zu senken. Beispiele dafür sind Nadelinjektion, Katheterinfusion, biolistische Injektoren, Teilchenbeschleuniger (d. h. „Gen-Pistolen"), pneumatische „nadellose" Injektoren (z. B. MedEJet, PedoJet, Bioject), Gelschaum-Schwammdepots, andere im Handel erhältliche Depotmaterialien, osmotische Pumpen (z. B. Alza-Minipumpen), orale oder suppositorial feste pharmazeuti sche Formulierungen (in Tabletten- oder Pillenform) sowie Dekantier- oder topische Anwendungen wie z. B. Chirurgie. Bevorzugte Verfahren sind Nadelinjektion und Katheterinfusion.
Ein „Polynucleotidkonstrukt" ist ein Polynucleotidmolekül, das genetische Information für das Kodieren eines oder mehrerer Moleküle, vorzugsweise von Cytokinen, trägt. Das den Zellen in vivo zugeführte Polynucleotidmaterial kann in jeder beliebigen Form vorliegen. Es kann die gesamte Sequenz oder nur ein funktionell aktives Fragment eines Cytokin-Gens enthalten.
Das Polynucleotidkonstrukt umfasst zumindest ein Polynucleotid (z. B. DNA, RNA, Ribozym, Thiophosphat oder eine andere modifizierte Nucleinsäure), das für ein oder mehrere Moleküle kodiert. Bevorzugte Moleküle sind Cytokine. Das Polynucleotid kann in linearer, kreisrunder (z. B. Plasmid) oder verzweigter Form sowie in doppel- oder einzelstrangiger Form vorliegen. Das Polynucleotid kann eine herkömmliche Phosphodiesterbindung oder eine nicht herkömmliche Bindung (z. B. eine Amidbindung wie im Fall von Peptidnucleinsäure (PNA)) aufweisen. Die Auswahl des für ein Cytokin kodierenden Polynucleotids hängt von der erwünschten Kinetik und der Dauer der Expression ab. Wenn Langzeitzufuhr des Polynucleotidkonstrukts erwünscht ist, ist das bevorzuge Polynucleotid DNA. Wenn hingegen Kurzzeitzufuhr erwünscht ist, ist das bevorzugte Polynucleotid mRNA. RNA wird rasch in Polypeptid translatiert, aber durch die Zielzelle schneller als DNA abgebaut. Im Allgemeinen halten aufgrund der höheren Resistenz runder DNA-Moleküle gegenüber Nucleasen runde DNA-Moleküle länger als lineare Polynucleotide, und es ist auch weniger wahrscheinlich, dass die insertionale Mutation durch Integration in das Zielgenom bewirken.
In einer Ausführungsform ist die für ein oder mehrere Cytokine kodierende Polynucleotidsequenz RNA. Am bevorzugtesten ist die RNA Messenger-RNA (mRNA). Verfahren zum Einführen von RNA-Sequenzen in Säugetierzellen sind in US-Patent 5.580.859 beschrieben. Ein viraler α-Vektor, ein nichtinfektiöser Vektor, der sich zur Verabreichung von RNA eignet, kann auch zum Einsetzen von RNA in Säugetierzellen verwendet werden. Verfahren zur In-vivo-Einführung von α-viralen Vektoren in Säugetiergewebe sind in Altman-Hamamdzic, S. et al., Gene Therapy 4, 815–822 (1997) beschrieben. Vorzugsweise ist die für ein oder mehrere Cytokina kodierende Polynucleotidsequenz DNA. In einem DNA-Konstrukt ist ein Pomotor vorzugsweise operabel mit dem für ein Cytokin kodierenden Polynucleotid verbunden. Der Promotor kann ein zellspezifischer Promotor sein, der die substanzielle Transkription der DNA nur in vorbestimmten Zellen lenkt. Andere Transkriptionssteuerelemente können neben einem Promotor im Polynucleotidkonstrukt vorhanden sein, um zellspezifische Transkription der DNA zu lenken.
Eine operable Verbindung ist eine Verbindung, in der die für ein Cytokin kodierende Polynucleotidsequenz mit einer oder mehreren regulatorischen Sequenzen solcherart verknüpft ist, dass die Expression der Cytokinsequenz unter dem Einfluss oder der Steuerung der regulatorischen Sequenzen) steht. Zwei DNA-Sequenzen (z. B. die Kodiersequenz und eine Promotorregionsequenz, die am 5'-Ende der Kodiersequenz verbunden ist) sind operabel verbunden, wenn die Induktion von Promotorfunktion zur Transkription von für das erwünschte Polypeptid kodierender mRNA führt und wenn die Beschaffenheit der Bindung zwischen den zwei DNA-Sequenzen nicht (1) zur Einführung einer Rasterverschiebungsmuation führt, (2) nicht die Fähigkeit der regulatorischen Expressionssequenzen beeinträchtigt, die Expression des Polypeptids, der Antisense-RNA, zu lenken oder (3) nicht die Fähigkeit des DNA-Templats einschränkt, transkribiert zu werden. Somit würde eine Promotorregion operabel mit einer DNA-Sequenz verbunden sein, wenn der Promotor zur Beeinflussung der Transkription dieser DNA-Sequenz fähig wäre.
Vorzugsweise ist das Polynucleotidkonstrukt ein kreisrundes oder linearisiertes Plasmid, das eine nichtinfektiöse Nucleotidsequenz enthält. Ein linearisiertes Plasmid ist ein Plasmid, das zuvor kreisrund war, aber linearisiert wurde, z. B. durch Spaltung mit einer Restriktions-Endonuclease. Die für ein Cytokin. kodierende Polynucleotidsequenz kann eine Sequenz umfassen, die die Sekretion des Polypeptids lenkt.
Unter „nichtinfektiös" ist hierin zu verstehen, dass das Polynucleotidkonstrukt Säugetierzellen nicht infiziert. Somit kann das Polynucleotidkonstrukt funktionelle Sequenzen aus Nicht-Säugetierspezies (z. B. viral oder bakteriell) enthalten, doch das Konstukt enthält keine Nicht-Säugetier-Nucleotidsequenzen, die die Infektion des Konstrukts in Säugetierzellen vereinfachen.
Unter „nichtintegrativ" ist hierin zu verstehen, dass das Polynucleotidkonstrukt nicht in das Genom von Säugetierzellen integriert. Das Konstrukt kann eine nichtreplizierende DNA-Sequenz oder spezifische replizierende Sequenzen sein, die genetisch konstruiert sind, um die Fähigkeit zur Integration in das Genom nicht aufzuweisen. Das Polynucleotidkonstrukt enthält keine funktionellen Sequenzen, die die Integration der für Cytokin kodierenden Polynucleotidsequenz in das Genom von Säugetierzellen vereinfachen.
Das Polynucleotidkonstrukt ist aus Komponenten gebildet, wo unterschiedliche auswählbare Gene, Ursprünge, Promotoren, Introns, untranslatierte (UT) 5'-Sequenz, Terminatoren, Polyadenylierungssignale, 3'-UT-Sequenz und Leaderpeptide usw. miteinander verbunden werden, um den erwünschten Vektor zu erzeugen. Die genaue Beschaffenheit der für die Gen-Expression erforderlichen regulatorischen Regionen kann zwischen Spezies von Zelltypen variieren, enthält aber im Allgemeinen je nach Bedarf nichttranskribierende 5'- und nichttranslatierende (nichtkodierende) 5'-Sequenzen, die an der Initiation von Transkription bzw. Translation beteiligt sind, z. B. die TATA-Box, die Capping-Sequenz, die CAAT-Sequenz u. dgl., wobei jene Elemente, die für die Promotorsequenz notwendig sind, durch die Promotoren der Erfindung bereitgestellt werden. Solche transkriptionalen Steuersequenzen können auch Enhancersequenzen oder stromauf gelegene Aktivatorsequenzen enthalten.
Das Polynucleotidkonstrukt kann ein Expressionsvektor sein. Ein typischer Säugetier-Expressionsvektor enthält das Promotorelement, das die Initiation der Transkription von mRNA mediiert, die Polypeptidkodiersequenz und Signale, die für die Termination der Transkription und Polyadenylierung des Transkripts notwendig sind. Weitere Elemente sind Enhancer, Kozak-equenzen und intervenierende Sequenzen, die von Donor- und Akzeptorstellen für das RNA-Spleißen flankiert sind. Hochwirksame Transkription kann mit den frühen und späten Promotoren aus SV40, langen endständigen Wiederholungen (LTRS) aus Retroviren wie z. B. RSV, HTLVI, HIVI, MPSV und dem unmittelbar frühen Promotor des Zytomegalievirus (CMV IEP) erreicht werden. Jedoch können auch zelluläre Elemente verwendet werden (z. B. der Human-Actinpromotor, Metallothionein-Promotor). In Menschen ist CMV IEP vorzuziehen. Geeignete Expressionsvektoren zur Verwendung bei der Durchführung der Erfindung sind z. B. Vektoren wie etwa PSVL und PMSG (Pharmacia, Uppsala, Schweden), pRSVcat (ATCC 37.152), pSV''dhfr (ATCC 37.146) und pBC12MI (ATCC 67.109), VR1012, VR1055 sowie pcDNA3 (Invitrogen, San Francisco, CA, USA). Alle Formen von DNA (ob replizierend oder nichtreplizierend), die nicht in das Genom integriert werden und exprimierbar sind, liegen innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung.
Der die DNA-Sequenz (oder die entsprechende RNA-Sequenz) enthaltende Vektor, der gemäß der Erfindung verwendet werden kann, kann ein eukaryotischer Expressionsvektor sein. Techniken zum Erhalten von Expression exogener DNA- oder RNA-Sequenzen in einem Wirt sind bekannt. Siehe z. B. Korman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2150–2154 (1987).
Die Sekretion eines Cytokins aus einer Zelle kann durch eine Leader- oder sekretorische Signalsequenz erleichtert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird entweder die native Leadersequenz eines Cytokins oder ein funktionelles Derivat dieser Sequenz verwendet, das die Fähigkeit beibehält, die Sekretion des Peptids, das operabel mit ihr verbunden ist, zu lenken. Alternativ dazu kann man eine heterologe Säugetier-Leadersequenz oder ein funktionelles Derivat davon verwenden. Beispielsweise kann die Leadersequenz der Wildform mit der Leadersequenz eines Humangewebe-Plasminogenaktivators oder Mäuse-β-Glucoronidase substituiert sein.
Für die Verwendungszwecke der Erfindung kann ein einzelnes Polynucleotidkonstrukt, das mehr als eine Polynucleotidsequenz enthält, die für ein oder mehrere Moleküle kodieren, oder mehr als ein Polynucleotidkonstrukt, die jeweils Polynucleotidsequenzen enthalten, die für ein oder mehrere Moleküle kodieren, gemeinsam oder aufeinander folgend injiziert werden. Beispielsweise kann ein einzelnes Polynucleotidkonstrukt, das ein für ein Interferon kodierendes Polynucleotid und ein weiteres für ein zusätzliches Cytokin oder ein immunmodulatorisches Molekül kodierendes Polynucleotid (d. h. MHC-Klasse I-Antigen, Tumorantigen oder co-stimulierendes Molekül) enthält, injiziert werden. Alternativ dazu können zwei Polynucleotidkonstrukte injiziert werden, wobei eines für ein Cytokin kodiert, um die Anti-Tumor-Wirksamkeit des anderen Genprodukts zu steigern. Beispielsweis kann ein IFNω, IFNα, IL-12 oder IL-2 exprimierendes Polynucleotidkonstrukt mit einem für ein unterschiedliches Cytokin kodierenden Polynucleotidkonstrukt gemeinsam injiziert werden. Genauer gesagt könnte ein IL-2 exprimierendes Plasmid mit einem G-CSF oder GM-CSF exprimierenden Plasmid gemeinsam injiziert werden. Alternativ dazu könnten zunächst ein oder mehrere Plasmide und ein oder mehrere andere Plasmide anschließend in verschiedenen Zeitintervallen verabreicht werden. Die Kombination der Erfindung mit therapeutischen Mitteln wie z. B. Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK) und Tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TIL) ist ebenfalls denkbar.
Es ist zu beachten, dass einige Aminosäuresequenzen der hierin beschriebenen Polypeptide ohne signifikante Auswirkung auf die funktionelle Aktivität der Polypeptide variiert werden können. Wenn an solche Sequenzdifferenzen gedacht wird, sollte man sich daran erinnern, dass es kritische Bereiche auf dem Polypeptid gibt, die die Aktivität bestimmen. Solche Variationen enthalten Deletionen, Insertionen, Inversio nen, Wiederholungen und Typensubstitutionen. Informationen bezüglich der Frage, welche Aminosäureänderungen wahrscheinlich phänotypisch unauffällig bzw. still sind, finden sich in Bowie, J. U. et al., Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions, Science 247, 1306–1310 (1990). Zusammensetzungen innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung können gemäß dem hierin beschriebenen Antiproliferationstest untersucht werden. Aminosäuren, die für die Cytokin-Aktivität entscheidend sind, können auch durch Strukturanalyse wie z. B. Kristallisation, kernmagnetische Resonanz oder Photoaffinitätsmarkierung bestimmt werden (Smith et al., J. Mol. Biol. 224, 899–904 (1992) und de Vos et al., Science 255, 306–312 (1992)).
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Varianten des für Cytokin kodierenden Polynucleotids, die für Abschnitte, Analoge oder Derivate des Cytokins kodieren. Varianten können natürlich vorkommen, z. B. eine natürliche allelische Variante. Unter „allelische Variante" sind hierin verschiedene alternative Formen eines Gens zu verstehen, die einen bestimmten Locus auf einem Chromosom eines Organismus einnehmen. Siehe Genes II, Lewin, B., Hg., John Wiley & Sons, New York (1985). Nicht natürlich vorkommende Varianten können unter Anwendung von auf dem Gebiet bekannten Mutagenese-Techniken produziert werden.
Änderungen der Kodierregionen können konservative oder nichtkonservative Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen und -Additionen bewirken. Insbesondere vorzuziehen sind davon stille Substitutionen, Additionen und Deletionen, die die Eigenschaften und Aktivitäten des Cytokins oder von Abschnitten davon nicht verändern. Besonders vorzuziehen in dieser Hinsicht sind außerdem konservative Substitutionen. Aromatische Aminosäuren, die konservativ füreinander substituiert werden können, sind z. B. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin. Hydrophobe Aminosäuren, die konservativ füreinander substituiert werden können, sind z. B. Leucin, Isoleucin und Valin. Polare Aminosäuren, die konservativ füreinander substituiert werden können, sind z. B. Glutamin und Asparagin. Basische Aminosäuren, die konservativ füreinan der substituiert werden können, sind z. B. Arginin, Lysin und Histidin. Saure Aminosäuren, die konservativ füreinander substituiert werden können, sind Asparaginsäure und Glutaminsäure. Kleine Aminosäuren, die konservativ füreinander substituiert werden können, sind z. B. Alanin, Serin, Threonin, Methionin und Glycin.
Substitutionen, Deletionen oder Insertionen können außerhalb der Region erfolgen, die für das kürzeste aktive Fragment des Cytokins kodiert, ohne die Aktivität des Cytokins zu beeinflussen. Außerdem behalten mutierte Protein (oder Muteine) oft biologische Aktivität bei, die jener des natürlich vorkommenden Proteins ähnelt. Beispielsweise führten Gayle et al. (J. Biol. Chem. 268, 22105-11222 (1993)) eine umfangreiche Mutationsanalyse des Humancytokin-IL-1α durch. Sie verwendeten Zufallsmutagenese, um mehr als 3.500 einzelne IL-1α-Mutanten mit durchschnittlich 2,5 Aminosäureänderungen pro Mutein über die gesamte Moleküllänge zu erzeugen. Multiple Mutationen wurden in jeder möglichen Aminosäure untersucht, und durchschnittlich war die Aminosäuresequenz jedes Muteins zu 98,4% identisch mit jener von natürlich vorkommendem IL-1α. Die Forscher beobachteten, dass ein Großteil des Moleküls ohne große Auswirkung auf die Bindung oder biologische Aktivität mutiert werden konnte und dass 75% des Moleküls möglicherweise nur geringfügig zur biologischen Aktivität des Moleküls beitragen.
Gronenborn et al., FEBS Letters 231, 135–138 (1988), analysierten die Rezeptor-Bindungsaktivität von sechs IL-1α-Polyeptidmutanten. Jede Mutante enthielt eine einzelne Aminosäureänderung gegenüber dem natürlich vorkommenden IL-1α-Polypeptid und wurde unter vier unterschiedlichen Versuchsbedingungen analysiert. In dieser Studie stellten die Forscher wenige Unterschiede zwischen der Rezeptor-Bindungsaktivität der Mutanten und von natürlich vorkommendem IL-1α fest.
Außerdem untersuchten Zurawski et al., EMBO J. 12, 5113–5119 (1993), die Reste 41–142 von mIL-2, indem sie 1.090 Muteine erzeugten. Das Ausmaß der Mutagenese war solcherart, dass durchschnittlich elf verschiedene Aminosäure-Substitutionen pro natürlich vorkommendem Aminosäurerest auftraten – mit Ausnahme der extremen N- und C-Termini und der Reste 310. Die mIL-2-Muteine wurden auf spezifische Aktivität untersucht und mit jener von natürlich vorkommendem mIL-2 verglichen. Das Ausmaß, in dem die spezifische Aktivität durch eine zuvor charakterisierte mIL-2-Mutante antagonisiert wurde, wurde ebenfalls bewertet. Die Forscher beobachteten, dass im aus 149 Resten bestehenden mIL-2-Protein nur 23 Reste für die Wechselwirkung mit IL-2R wichtig sind; man nimmt an, dass 18 Reste Teil des strukturellen Kerns sind und dass drei weitere Reste für die Struktur bedeutsam sind. 98 mIL-2-Reste (bzw. 65% des Proteins) wurden als relativ unbedeutende Reste eingestuft.
D für ein IFNω kodierenden Polynucleotid- und Aminosäuresequenzen enthalten die Sequenzen für das vollständige IFNω und das reife IFNω; siehe US-Patent 4.917.887; EP-A 0 170 204 B1; sowie Capon, D. J. et al., Molec. Cell. Biol. 5, 768– 779 (1985); Hauptmann, R. und Swetly, P., Nucl. Acids. Res. 13, 4739749 (1985); Adolf, G. R. et al., Biochim, Biophys. Acta 1089, 167–174 (1991); Mege, D. et al., J. Interf. Res. 11, 341–350 (1991); Charlier, M. et al., J. Interf. Res. 13, 313–322 (1993); Hughes, A. L., J. Mol. Evol. 41, 539–548 (1995); und Roberts, R. M. et al., Prog. Nucl. Acid Res. Molec. Biol. 56, 287–325, W. E. Cohn, Hg., Academic Press (1997).
Die für IFNα kodierenden Polynucleotid- und Aminosäuresequenzen enthalten die Sequenzen für das vollständige IFNα und das reife IFNα; siehe US-Patente 4.530.901, 4.695.543, 4.695.623, 4.748.233, 4.892.743, 4.897.471, 4.973.479, 4.975.276 und 5.098.703; sowie Pestka, S., Methods Enzymol. 119, 3–14 (1986); Hughes, A. L., J. Mol. Evol. 41, 539–548 (1995); und Roberts, R. M. et al., Prog. Nucl. Acid Res. Molec. Biol. 56, 287–325, W. E. Cohn, Hg., Academic Press (1997).
Die für ein IL-2 kodierenden Polynucleotid- und Aminosäuresequenzen enthalten die Sequenzen für as vollständige Human-IL-2 und reifes IL-2; siehe Lupker, J. et al., EP 0.307.285 A3 (1989); US-Patent 5.641.665; Maeda et al., Biochem. Biophys. Res.
Commun. 115, 1040–1047 (1983); Mita et al., Biochem. Biophys. Res. Commun 117, 114–121 (1983); Taniguchi et al., Nature 302, 305–310 (1983); Devos et al., Nucleic Acid Res. 11, 4307–4323 (1983), Fujita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 74347– 7441 (1983); Clark et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 2543–2547 (1984); und Cullen, DNA 7, 645–650 (1988).
Die für ein IFNω, ein IFNα und ein IL-2 kodierenden Polynucleotidsequenzen enthalten auch Sequenzen, die für das vollständige Polypeptid, für das die Nucleotidsequenzert in SEQ.-ID Nr. 7, 9 bzw. 13 kodieren, und die reifen Polypeptide kodieren, für die die Nucleotidsequenzen der SEQ.-ID Nr. 7. 9 bzw. 13 kodieren. Die für IL-2 kodierenden Polynucleotidsequenzen enthalten ferner die Sequenz, die für das vollständige IL-2-Polynucleotid kodiert, für das die Nucleotidsequenz in SEQ.-ID Nr. 25 kodiert (als SEQ.-ID Nr. 26 dargestellt).
Somit kann eine für ein Polypeptid kodierende Polynucleotidsequenz der Erfindung für ein Polypeptid kodieren, das gegenüber dem IFNα, IFNω oder IL-2 in reifer Form oder voller Länge 1–20 Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen oder -Insertionen besitzt (entweder aufgrund natürlicher Mutationen oder Human-Manipulation). Vorzugsweise liegen gegenüber dem IFNα, IFNω oder IL-2 in reifer Form oder voller Länge (ausschließlich der Signalsequenz) nicht mehr als 1–15 Substitutionen, Deletionen oder Insertionen vor. Noch bevorzugter liegen nicht mehr als 1–10 Substitutionen, Deletionen oder Insertionen vor. Noch bevorzugter liegen nicht mehr als 1–5 Substitutionen, Deletionen oder Insertionen vor.
Die Bestimmung einer wirksamen Menge der zuzuführenden Substanz kann von einigen Faktoren abhängen, z. B. von der chemischen Struktur und biologischen Aktivität der Substanz, dem Alter und Gewicht des Säugetiers, dem Behandlung bedürfenden jeweiligen Krankheitszustand und seinem Schwergrad und von der Verabreichungsweise. Die genaue Menge, die Anzahl der Dosierungen und deren Zeitpunkte werden vom behandelten Arzt oder Tierarzt festgelegt.
Wenn das Polynucleotidkonstrukt der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments verwendet wird, kann dieses in Einklang mit bekannten Verfahren zur Herstellung von Medikamenten formuliert werden, wobei die zuzuführende Substanz mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägervehikel kombiniert wird. Geeignete Vehikel und ihre Erzeugung werden z. B. in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Ausgabe, A. Osol, Hg., Mack Publishing Co., Easton, PA, USA (1980) und in Remington's Pharmaceutical Sciences, 19. Ausgabe, A. R. Gennaro, Hg., Mack Publishing Co., Easton, PA, USA (1995) erläutert.
Das Medikament kann in Form einer Emulsion, eines Gels, einer Lösung, einer Suspension oder in einer anderen auf dem Gebiet bekannten Form vorliegen. Gegebenenfalls kann es eine oder mehrere Lipide (s. o.) enthalten. Außerdem kann das Medikament auch pharmazeutisch annehmbare Additive enthalten, z. B. Verdünnen, Bindemittel, Stabilisatoren und Konservierungsstoffe. Die Verabreichung pharmazeutisch annehmbarer Salze der hierin beschriebenen Polynucleotide ist vorzuziehen. Solche Salze können aus pharmazeutisch annehmbaren nichttoxischen Basen gebildet sein, z. B. organischen und anorganischen Basen. Salze von anorganischen Basen sind z. B. Natrium, Kalium, Lithium, Ammonium, Calcium, Magnesium u. dgl. Salze von pharmazeutisch annehmbaren organischen und nichttoxischen Basen sind z. B. Salze primärer, sekundärer und tertiärer Amine, basischer Aminosäuren u. dgl.
Für in vivo verwendete wässrige Medikamente ist steriles Pyrogen-freies Wasser vorzuziehen. Solche Formulierungen enthalten eine wirksame Menge der Substanz sowie eine angemessene Menge an Vehikel, um pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzungen herzustellen, die sich zur Verabreichung an einen Menschen oder ein Tier eignen.
Ein Medikament kann in Lösungsform oder – alternativ dazu – in lyophilisierter Form vorliegen, um die Rekonstitution mit einem geeigneten Vehikel wie z. B. sterilem Py rogen-freien Wasser zu ermöglichen. Sowohl flüssige als auch lyophilisierte Formen umfassen ein oder mehrere Mittel, vorzugsweise Puffer, in Mengen, die zur entsprechenden Einstellung des pH-Werts der injizierten Lösung notwendig sind.
Der Behälter, in dem die pharmazeutische Formulierung vor der Verwendung verpackt ist, kann ein hermetisch abgeschlossener Behälter sein, der eine Menge der lyophilisierten Formulierung oder einer die Formulierung enthaltenden Lösung (für eine pharmazeutisch wirksame Dosis davon oder das Mehrfache einer wirksamen Dosis davon geeignet). Die pharmazeutische Formulierung ist in einem sterilen Behälter verpackt, und der hermetisch abgeschlossene Behälter ist ausgebildet, die Sterilität der pharmazeutischen Formulierung bis zu Verwendung aufrechtzuerhalten. Gegebenenfalls kann der Behälter mit einem Verabreichungsmittel oder Bedienungsanleitungen versehen sein.
Nach dieser allgemeinen Beschreibung der Erfindung wird diese nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erläutert, die nur zur Veranschaulichung dienen und den Schutzumfang – sofern nicht anders angegeben – keinesfalls einschränken.
Es wird Folgendes beschrieben: (1) die In-vivo-Charakterisierung biologischer Aktivitäten von durch Plasmid-DNA bereitgestellten IFN (antiproliferative und antivirale Aktivität in vitro); (2) die In-vivo-Expression von Cytokinen nach der In-vivo-Verabreichung von Cytokin exprimierender pDNA; und (3) die In-vivo-Charakterisierung von Anti-Tumor-Aktivität von Cytokinen in Mäusemodellen fester und metastatischer Turnoren nach intratumoraler, intramuskulärer oder intrakavitärer Verabreichung von für Cytokin kodierender pDNA.
Die für Cytokin kodierenden Polynucleotidkonstrukte besitzen in vitro starke antiproliferative Aktivität. Außerdem werden hierin die In-vivo-Anti-Tumor-Aktivitäten von IFNω, IFNα, IL-2 und IL-12 in mehreren Mäusetumormodellen erläutert, z. B. in unbehaarten Mäusen mit subkutanen Humantumoren oder in immunkompetenten Mäu sen mit festen und metastatischen Tumoren. Die intratumorale, intramuskuläre oder intraperitoneale Injektion der für Cytokin kodierenden Plasmide führt – wie dies hierin aufgezeigt wird – zu einer statistisch signifikanten Verlangsamung des Tumorwachstums und/oder einer statistisch signifikanten Zunahme der Überlebensrate. Zusätzlich zu den starken Anti-Tumor-Effekten der über intratumorale oder intramuskuläre Injektion zugeführten Cytokinplasmide handelt es sich hier um die erste In-vivo-Demonstration von Anti-Tumor-Aktivität für Human- IFNω. Außerdem wird die In-vivo-Anti-Tumor-Aktivität von IL-2 bei der Behandlung von peritoneal disseminierten Karzinomen, z. B. beim metastasierenden Eierstockmelanom, veranschaulicht.
Beispiel 1
Konstruktion von Expressionsvektoren
Drei basische eukaryotische Expressionsplasmidvektoren, die als VR1012, VR1055 und VR1033 bezeichnet werden, werden zur Konstruktion aller in den folgenden Beispielen eingesetzter Plasmide verwendet. Die Leerplasmide VR1012 und VR1055 unterscheiden sich nur hinsichtlich der Transkriptionsterminationssequenzen. Das Rückgrat beider Plasmide stammt aus pUC19, wobei das β-Lactamase- (Ampicillin-Resistenz) Gen durch das Aminoglykosid-Acetyltransferase- (Kanamycin-Resistenz) Gen aus pET9a (Novagen, Madison, WI, USA) ersetzt ist. Beide Plasmide lenken die eukaryotische Gen-Expression aus einer Kassette, umfassend den unmittelbar frühen Human-Zytomegalievirus-1- (CMV IE) Gen-Promotor/Enhancer, CMV IE 5'-UT-Sequenz und Intron A. Diesen regulatorischen Elementen folgt ein Klonierungspolylinker zur Insertion von Polypeptid kodierenden Sequenzen. Dem Polylinker in VR-1012 folgt die 3'-UT-Sequenz aus dem Kinderwachstumshormon-Gen für Polyadenylierung und transkriptionale Termination. In VR1055 enthält die Transkriptionalsterminatorregion ein Polyadenylierungs- und Terminationssignal aus dem Kaninchen-β-Globin-Gen. VR1033 ist identisch mit VR1012, außer dass es einen cap-unabhängigen Translations-Enhancer aus dem Enzephalomyokarditis-Virus innerhalb der Klo nierungspolylinker-Sequenz enthält. Diese Sequenz ermöglicht die Produktion zweier unterschiedlicher Polypeptide aus einer einzigen exprimierten mRNA.
Plasmid VR4101 (Mäuse-Interferon-α oder mIFNα) wurde durch Klonieren der mIFNα-cDNA in den Vektor VR1012 konstruiert. Die cDNA wurde durch Amplifizieren der Kodierungssequenz aus dem Plasmid RSV-''1 erhalten (Kelly, K. A. und Pitha, P. M., Nucl. Acids Res. 13, 805–823 (1985); Kelly, K. A. und Pitha, P. M., Nucl Acids. Res. 13, 825–839 (1985)), das von Dr. Paula Pitha-Rowe von der John Hopkins University bereitgestellt wurde. Plasmid VR4111 wurde durch Transferieren der Kodierungssequenz aus VR4101 in den VR1055-Klonierungsvektor konstruiert. Die Oligonucleotidprimer für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) waren 5'-AACTGC-AGATGGCTAGGCTCTGTGCT-3' (SEQ.-ID Nr. 15) und 5'-GAAG-ATCTTCATTTCT-CTTCTC-TCAG-3' (SEQ.-ID Nr. 16). Die Reaktionsbeindungen waren 30 Zyklen 1 Minute lang bei 94°C (Denaturieren), 2 Minuten lang bei 58°C (Annelieren) und 1 Minute lang bei 72°C (Verlängern).
Plasmid VR4102 (Human-Interferon-α oder hIFNα) wurde durch Klonieren der nIFNα-DNA in den VR1012-Vektor konstruiert. Die cDNA wurde erhalten, indem die Kodierungssequenz aus der genomischen Human-DNA (gebildet aus einer frischen Blutprobe) amplifiziert wurde. Plasmid VR4112 wurde durch Transferieren der Kodierungssequenzen aus VR4102 in den VR1055-Klonierungsvektor konstruiert. Genomische DNA wurde unter Anwendung des QIAamp Blood Kit (Quiagen, Inc.) isoliert. Die für PCR verwendeten Oligonucleotidprimer waren 5'-AACTGCAGATGGCCTC-GCCCTTTGCT-3' (SEQ.-ID Nr. 17) und 5'-CGGGATCCTTATTCCTTC-CTCCTT-AATC-3' (SEQ.-ID Nr. 18). Die Reaktionsbedingungen waren 30 Zyklen 1 Minute lang bei 94°C (Denaturieren), 2 Minuten lang bei 58°C (Annelieren) und 1 Minute lang bei 72°C (Verlängern).
Plasmid VR4150 (Human-Interferon-ω oder hIFNω) wurde durch Klonieren der Human-IFNω-cDNA in den VR1012-Klonierungsvektor konstruiert. Die cDNA wurde durch Amplifizieren der Kodierungssequenz aus genomischer Human-DNA (gebildet aus einer frischen Blutprobe) erhalten. Plasmid VR4151 (SEQ.-ID Nr. 1) wurde durch Transferieren der Kodierungssequenzen aus VR4150 in den VR1055-Klonierungsvektor konstruiert. Die für PCR verwendeten Oligonucleotidprimer waren 5'-GCT-CTAGATGGCCCTCCTGTTCCCT-3' (SEQ.-ID Nr. 19) und 5'-GCGG-ATCCTCAAG-ATGAGCCCAGGTC-3' (SEQ.-ID Nr. 20). Die Reaktionsbedingungen waren 30 Zyklen 1 Minute lang bei 94°C (Denaturieren), 2 Minuten lang bei 58°C (Annelieren) und 1 Minute lang bei 72°C (Verlängern).
Plasmid VR1110 (Mäuse-Interleukin-2 oder mIL-2) wurde durch Klonieren von modifizierter Mäuse-IL-2-cDNA in den VR1012-Vektor konstruiert. Die 5'-UT-Sequenz und die zwei Aminosäuren des Leaderpeptids wurden mit dem Ratten-Insulin-II-Gen-5'-UT-Sequenz und der Kodierungsregion der ersten sechs Aminosäuren des Ratten-Präproinsulin-Leaderpeptids ersetzt. Die IL-2-cDNA wurde dann in die BamHI-Stelle von VR1012 kloniert.
Plasmid VR1103 (Human-Interleukin-2 oder hIL-2) ist identisch mit VR1110 – mit der Ausnahme, dass die Mäuse-IL-2-cDNA mit der cDNA für Human-IL-2 ersetzt war (Parker et al., 1996).
Plasmid VR4001 (Mäuse-Interleukin-12 oder mIL-12) wurde durch Klonieren der für die zwei Mäuse-Untereinheiten p35 und p40 kodierenden cDNA in den VR1033-Vektor konstruiert. Beide cDNA wurden durch Amplifizieren der Kodierungssequenzen aus Plasmiden erhalten, die von Dr. Thomas Gajewski von der University of Chicago stammten (J. Immun. 154, 5637; J. Immun. 156, 1095). Die für PCR von p35 verwendeten Oligonucleotide waren 5'-CAT GCC ATG GGT CAA TCA CGC TAC CTC CTC TTT TTG G-3' (SEQ.-ID Nr. 23) und 5'-GCG GAT CCT CAG GCG GAG CTC AGA TAG CCC-3' (SEQ.-ID Nr. 24). Die für die PCR von p40 verwendeten Oligonucleotide waren 5'-ACG CGT CGA CAT GTG TCC TCA GAA GCT AAC CAT CTC-3' (SEQ.-ID Nr. 21) und 5'-GCG GAT CCC TAG GAT CGG ACC CTG CAG GGA ACA C-3' (SEQ.-ID Nr. 22). Die Reaktionsbedingungen waren 30 Zyklen 1 Minute lang bei 94°C (Denaturieren), 2 Minuten lang bei 58°C (Annelieren) und 1 Minute lang bei 72°C (Verlängern).
Plasmide VR1223 (Luciferase) wurde durch Klonieren von zytoplasmatischem Luciferase-Gen in den VR1012-Vektor (Hartikka et al., Hum. Gene Ther. 7, 1205–1217 (1996)) konstruiert. Die Quelle des zytoplasmatischen Luciferase-Gens in VR1223 war das Plasmid pSP-Iuc⁺, das von Promega stammte. Ein für die Luciferase-cDNA kodierendes Avr 11-Xba 1-Restriktionsfragment wurde von pSP-Iuc⁺ in VR1012 transferiert, um VR1223 zu ergeben.
Plasmid VR1412 (β-Galactosidase) wurde durch Klonieren des zytoplasmatischen β-gal-Gens in den vR1012-Vektor konstruiert (Doh et al., Gene Ther. 4, 648–663).
Plasmid VR1332 wurde durch Insertieren eines Sall-BamHl-Fragments (kodiert für Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)) aus pBS-CAT (Promega) in SaII/BamHIgeschnittenen VR1012-Vektor konstruiert (Hartikka et al., Hum. Gene Ther. 7, 1205– 1217 (1996)).
Beispiel 2
Reinigung von pDNA
pDNA wurde in Escherichia coli-DH10B-kompetente Zellen transformiert und in Terrific Broth (Sambrook J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, S. A.2 (1989)), ergänzt mit 50 μg/ml Kanamycin, in einem 1 l-Schüttelgefäß gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren am Ende der exponentiellen Wachstumsphase (etwa 16 h) geerntet, was typischerweise 10 g Biomasse Nettogewicht/l ergab. Kovalent ringgeschlossene pDNA wurde durch ein modifiziertes Lyseverfahren (Horn, N. A. et al., Human Gene Therapy 6, 565–573 (1995)) isoliert, gefolgt von standardmäßiger Doppel-CsCl-Ethidiumbromid-Gradient-Ultrazentrifugation mit einer mittlerer Ausbeute von etwa 5 mg/ l. Die Plasmide wurden mit Ethanol gefällt, in Salzlösung bei 4°C resolubilisiert und gegen Salzlösung dialysiert. Der Endotoxin-Gehalt wurde durch den Limulus Amebocyte Lysate Assay bestimmt (Associates of Cape Cod, Inc., Falmouth, MA, USA). Alle Plasmidpräparate waren frei von detektierbarer RNA. Die Endotoxinwerte betrugen weniger als 0,6 Endotoxineinheiten/ug Plasmid-DNA. Die spektralphotometrischen A260/A280-Verhältnisse lagen zwischen 1,75 und 2,0.
Beispiel 3
In vitro-Bewertung der biologischen Aktivität von IFNω und IFNα
Um sicherzustellen, dass die in den folgenden Beispielen verwendete IFN-Plasmid-DNA für biologisch aktives IFN kodiert, wurden Zellproliferations- und antivitalen Tests durchgeführt. Das gesamte in diesem und in den folgenden Beispielen verwendete Kulturmedium stammte von Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA), und das gesamte Serum stammte von HyClone (Logan, UT, USA).
UM449-Zellen (ATCC, Rockville, MD, USA) wurden mit einer Konzentration von 2 × 10⁵ Zellen/Napf in eine 6-Napf-Platte ausplattiert und 24 h lang inkubiert. Plasmid-DNA und das Lipid DMRIE/DOPE (1 : 1) wurden jeweils bis zu einer Konzentration von 1 mg in 0,5 Optimem-Medium (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) verdünnt. Das Lipid DMRIE/DOPE besteht aus dem kationischen Lipid (±)-N-(2-Hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis/tetradecyloxy)-1-propanaminiumbromid (DMRIE) und dem neutralen Lipid Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) in einem 1 : 1-Molverhältnis (Felgner et al., J. Biol. Chem 269, 2550–2561 (1994)). Es wurde aufgezeigt, dass DMRIE/DOPE sowohl in In-vitro- (Felgner et al., J. Biol. Chem. 269, 2550–2561 (1994)) als auch in In-vivo-Transfektion (Stopeck et al., J. Clin. Oncol. 15, 341–349 (1997) und Rubin et al. Gene Ther. 4, 419–425 (1997)) wirksam ist. Das Lipidge misch und das DNA-Gemisch wurden vorsichtig miteinander vermischt. Medium wurde aus den Zellen, die vorsichtig mit PBS gespült wurden, entfernt, gefolgt von der Zugabe des DNA : Lipid-Gemisches (1 ml/Napf). Nach dem Inkubieren der Zellen über den Zeitraum von 4–5 h bei 37°C wurde 1 ml Optimem mit 30% Kalbsfötenserum (FCS) jedem Napf zugesetzt. Nach der Inkubation über Nacht bei 37°C wurde 1 ml Optimem mit 10% FCS jedem Napf zugesetzt. Gewebekulturüberstände wurden 48 h nach dem Beginn der In-vitro-Transfektion gesammelt.
a. Antiproliferative Aktivität
Um die antiproliferative und somit auch die Anti-Tumor-Aktivität von IFNω und IFNα zu beurteilen, wurden Überstände aus den oben angeführten UM449-Zellen (transfiziert mit der IFN- oder Vergleichsplasmid-DNA) in einem Zellproliferationstest von Mäuse- oder Human-Tumorzelllinien (ATCC, Rockville, MD, USA) unter Verwendung des Cell Proliferation Kit II (XTT) von Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN, USA) untersucht. Mäuse- oder Human-Tumorzellen wurden in der erwünschten Konzentration in 96-Napf-Platten ausplattiert (die Zellkonzentration variierte je nach evaluierter Zelllinie, sie betrug z. B. 5 × 10³ Zellen/ml für B16F10-Zellen und 5 × 10⁴ Zellen/ml für die Cloudman S91- und Gliom 261-Zellen). Die Platten wurden 24 h lang bei 37°C inkubiert, gefolgt von der Zugabe von Gewebekulturüberständen aus UM449-Zellen (entweder mit IFN-Plasmid-DNA oder mit Vergleichsplasmid-DNA in vitro transfiziert). Als positiver Vergleich für mIFNα-Plasmid-DNA wurde mIFNα-Protein (ICN Pharmaceuticals Inc., Costa Mesa, CA, USA) reihenverdünnt und den Näpfen zugesetzt. Für die hIFN-Plasmid-DNA wurde ein IFN-Referenzstandard (Humanleukozyten-IFN, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) in jedem Test verwendet. Nach 24–74 h dauernder Inkubation bei 37°C wurden 50 μl XTT/ECR-Substrat jedem Napf zugesetzt. Die Platten wurden bei 37°C 6–24 h lang inkubiert und die optische Dichte (OD) bei 490 nm bestimmt. Steigende Mengen an IFN führen zur Hemmung der Zellproliferation und einer Reduktion der OD₄₉₀. Die prozentuelle Reduktion der Zellproli feration infolge der Zugabe der Überstände wurde durch die folgende Formel bestimmt:
Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, zeigen beide Human-IFN charakteristische starke antiproliferative Aktivität gegen eine Vielzahl an Human-Tumorzelllinien, wobei die sensitivste Linie die NIH-OVCAR3-Eierstocklinie und die am wenigsten sensitive Linie die SK-OV-3-Eierstocklinie ist. Die Überstände aus den mit mIFNα-pDNA (VR4111) transfizierten UM449-Zellen hemmten die Proliferation von Mäuse-B16F10M-Melanom (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Suzuki von der University of Texas, Galveston, TX, USA), Mäuse-Cloudman-Melanom S91 (ATCC, Rockville, MD, USA) und Mäuse-Gliom-261-Zelllinien (Division of Cancer Treatment Tumor Repository, National Cancer Institute, Frederick Cancer Research and Development Center, Frederick, MD, USA) um 40, 42 bzw. 17%.
Tabelle 1. Biologischer In-vitro-Test mit IFNω (VR4150) und IFNα (VR4102): Antiproliferationsaktivität gegen Humantumor-Zelllinien
b. Antivirale Aktivität
Es erfolgte ein antiviraler Test, um die Fähigkeit der Überstände aus den mit IFN-Plasmid-DNA transfizierten Zellen zu bewerten, Mäuse-L929-Zellen oder Human-A549-Zellen vor der Ijektion durch Mäuse-Enzephalomyokarditis- (EMC-) Virus zu bewerten (der Test wurde im IIT Institute in Chicago, IL, USA durchgeführt). In-vitro-Transfektionen erfolgten wie oben, und Überstände wurden aus Zellen gesammelt, die mit VR4151 (IFNω), VR4112 (hIFNα), VR4111 (mIFNα) oder VR1055 (Vergleich) transfiziert waren. Die antivirale Aktivität der Überstände wurde am IIT Research Institute in Chicago, IL, USA untersucht. Der antivirale Test bewertete das Ausmaß des Schutzes von Human-A549- oder Mäuse-L929-Zellen vor Infektion mit dem EMC-Virus. 2,5 × 10⁴ L929-Zellen wurden in 96-Napf-Platten ausplattiert und 24 h lang inkubiert. Gewebekulturüberstände wurden reihenverdünnt und den L929-Zellen zugesetzt, die weitere 24 h lang inkubiert wurden. Die Überstände wurden dann aus den Näpfen entfernt, die Zellen wurden gewaschen, und Mäuse-EMC-Virus wurde jedem Napf in einer Infektionsmultiplizität von 0,04 zugesetzt. Die Assayplatten wurden weitere 24 h lang inkubiert, gefolgt von der Entfernung von Überständen, dem Waschen von Näpfen, dem Fixieren mit 5% Formalin und dem Färben mit 1% Kristallviolett. Proben mit IFN-Aktivität schützten die Zellen vor Virusinfektion, was stark gefärbte Zellmonoschichten ergab.
Die Überstände aus mit VR4151, VR4112 oder VR4111 transfizierten UM449-Zellen besaßen antivirale Aktivität von 30.000, 3.000 bzw. 30 Einheiten/ml auf Human-A549-Zellen. Bei der Bewertung der antivitalen Aktivität auf der Mäuse-L929-Zelllinie besaßen die Überstände aus mit VR4151, VR4112 oder VR4111 transfizierten UM449-Zellen antivirale Aktivität von 300, 1.000 bzw. 30.000 Einheiten/ml (Tabelle 2); es zeigt sich somit Speziesspezifität der hIFN für Humanzellen und mIFN für Mäusezellen.
Tabelle 2. Antivirale Aktivität von IFN-Plasmid-DNA
Beispiel 4
Systemische IFN-Therapie; intramuskuläre Verabreichung von Cytokin exprimierenden Plasmiden
Zelllinien und Tumormodelle
Mäuse-B16F10-Zellen wurden in RPMI-1640 (GibcoBRL) und 5% Rinderfötenserum (FBS) gezüchtet. Mäuse-Cloudman-S91-Zellen wurden in Ham's F-10-Medium mit 25 mM Hepes, 0,1 mM nichtessentiellen Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat, 0,05 mM β-Mercaptoethanol, 2,5% FBS und 12,5% Pferdeserum gezüchtet. Human-Melanom-UM449-Zellen wurden in RPMI 1640 mit 10% FBS gezüchtet.
Mäusegliom-261-Tumorfragmente und M5076-Retikulumzellen-Sarkomzellen stammten vom Division of Cancer Treatment Tumor Repository (National Cancer Institute, Frederick Cancer Research and Development Center, Frederick, MD, USA). Die Gliom-261-Tumorfragmente (2 mm³) wurden unter Verwendung eines 13 g schweren Trokars (Popper Sons, Inc., New Hyde Park, NY, USA) in die Leistengegend von C57BL/-Mäusen implantiert. Die in den Mäusen wachsenden Tumoren wurden dazu verwendet, eine tumorigene Zelllinie zu schaffen. Zerkleinerte Tumorfragmente wurden in Iscove's Gewebekulturmedium mit 10% FBS eingebracht. Gliom-261-Tumorzellen begannen nach mehreren Tagen, sich an die Kolben anzuheften; die Zellen wurden unter Heranziehung herkömmlicher Gewebekulturtechniken vermehrt. Die M5076-Zellen wurden als Aszites in C57BL/6-Mäusen gezüchtet und in flüssigem Stickstoff gefroren. Human-A431-Zellen stammten von der ATCC und wurden in DMEM und 10% FBS gezüchtet.
C57BL/6-, DBA/2-, unbehaarte (nu/nu) und beige unbehaarte (bg/nu/xid) weibliche Mäuse im Alter von 6–8 Wochen stammten von Harlan Sprague Dawley (San Diego, CA, USA). Alle Tierversuche in diesem und den folgenden Beispielen erfolgten gemäß den Richtlinien des Vical's Institutional Animal Care and Use Committee sowie den Standards des National Research Council betreffend die Tierbetreuung und -verwendung in Experimenten.
Um subkutane B16F10-Melanomtumoren zu bilden, wurden C57BL/6-, unbehaarte oder beige unbehaarte Mäuse subkutan in der Flanke mit 10⁴ B16F10-Zellen injiziert. Das Cloudman-Melanom-Modell wurde durch subkutane Injektion von 10⁵ Cloudman-S91-Zellen in die Flanke von DBA/2-Mäusen und das Gliom-261-Modell durch subkutane Injektion von 5 × 10⁴ Gliom-261-Zellen in die Flanke von C57BL/6-Mäusen realisiert. Um Human-Plattenepithelkarzinome zu schaffen, wurden unbehaarte Mäuse subkutan in die Flanke mit 5 × 10³ A431-Zellen injiziert.
Um intradermale M5076-Tumoren und deren Lebermetastasen zu bilden, wurden C57BL76-Mäuse intradermal mit 10⁵ M5076-Reikulumzellen-Sarkomzellen injiziert. In diesem Modell metastasieren primäre intradermal Tumoren spontan in die Leber. Am Tag 29 nach der Tumorzelleninjektion wurden die Mäuse getötet, die Lungen entfernt und in 10% gepuffertem Formalin fixiert und die Lungenknötchen gezählt.
Um das primäre Tumorwachstum zu überwachen, wurden Tumorgrößen zwei- bis dreimal wöchentlich durch Messen mit Tastern (1 × w × h) bestimmt; Tumorvolumina wurden unter Heranziehung der Formel Tumorvolumen (mm³) = 0,52 (1 × w × h) bestimmt.
Das Tumorvolumen wurde mittels des nichtparametrischen statistischen Mann-Whitney-U-Tests analysiert, um Gruppen mit signifikant unterschiedlichen mittleren Gewichten zu identifizieren. Das Überleben der Mäuse wurde mittels eines Kaplan-Meier-Überlebensgraphen und anschließend einen Logrank-Test (Mantel-Cox) analysiert, um signifikante Differenzen hinsichtlich der Überlebensarten zwischen den Gruppen zu ermitteln. Die Differenzen gelten als statistisch signifikant, wenn der p-Wert = 0,05 betrug.
Intramuskuläre Injektionen
50–100 μg Plasmid-DNA in 50 μl Salzlösung wurden in den Rectus femoris jedes Hinterbeins injiziert; die gesamte DNA-Doss betrug 100–200 μg. Die Muskelinjektionen erfolgten mittels einer sterilen 300 μl-Tuberculinspritze, die mit einer 28G ½-Nadel (Becton Dickenson) und einer Kunststoffmanschette (ausgeschnitten aus einer 200 μl-Mikropipettenspitze) ausgestattet war. Die Manschettenlänge war eingestellt, um die Nadel daran zu hindern, weiter als 2 mm in den Rectus femoris einzudringen.
IFN-Serumwerte nach intramuskulärer Injektion von IFN-Plasmid-DNA
Serumproben aus C57BL/6-Mäusen, die intramuskulär mit VR4111 (mIFNα-Plasmid) oder VR1055 (Vergleichsplasmid-DNA) injiziert worden waren, wurden in einem mIFNα-ELISA analysiert (n = 10). Für den ELISA wurden 96-Napf-Platten (Immulon 4NBX-Patten hoher Bindung von Dynex Technologies, Chantilly, VA, USA) mit monoklonalem Ratten-Anti-Mäuse-IFNα-Antikörper (mAb) von Caltag Laboratories (Burlingame, CA, USA) mit einer Konzentration von 5 μg/ml in 100 mM Natriumcarbonatpufter, pH 9,5, (50 μl/Napf) bestrichen. Die Platten wurden mit dem Überzugs-mAb 16 h lang bei 4°C inkubiert. Die Platten wurden dann dreimal mit einem Waschpuffer (PBS), pH 7,2 und 0,05% Tween-20 (Sigma, St. Louis, MO, USA) gewaschen. Die Platten wurden in PBS blockiert, die 3% Rinderserumalbumin (BSA, Sigma) und 0,05% Tween-20 (400 μl/Napf) enthielt, 24 h lang bei 4EC inkubiert und anschließend dreimal mit Waschpuffer gewaschen.
Serumproben (10 μl) aus intramuskulär mit VR4111 (mIFNα) injizierten Mäusen wurden mit 40 μl Testpuffer (PBS, 1% BSA, 0,05% Tween-20) vermischt und das Gemisch jedem Testnapf zugesetzt. Der positive Vergleich war mIFNα (Biosource International, Camarillo, CA, USA), das in Testpuffer reihenverdünnt wurde; 50 μl wurden den positiven Vergleichsnäpfen zugesetzt. Der negative Vergleich war Serum aus intramuskulär mit VR1055 injizierten Mäusen. Nach dem Zugeben der Testproben und Vergleiche wurden die Platten 16 h lang bei 4°C inkubiert. Die Platten wurden dann sechsmal mit Waschpuffer gewaschen, gefolgt von der Zugabe von polyklonalem Schafs-Anti-Mäuse-IFNα-Antikörper (pAb; Biosource International, Camarillo, CA, USA). Der pAb wurde in einer Verdünnung von 1 : 500 in Testpuffer (50 μl/Napf) zugesetzt, und die Platten wurden 5 h lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach der Inkubation mit dem pAb wurden die Platten sechsmal mit Waschpuffer gewaschen, gefolgt von der Zugabe von Anti-Schafs-IgG (konjugiert mit Peroxidase von Sigma) in einer 1 : 5.000-Verdünnung in Testpuffer (50 μl/Napf), und 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden sechsmal mit Waschuffer gewaschen und 200 μl flüssiges 3,3'-5,5'-Tetramethylbenzidinsubstrat (TMB; Sigma Chemical Co.) pro Napf zugesetzt. Die Platten wurden bei Raumtemperatur 30 min lang inkubiert, gefolgt von der Bestimmung der OD der Näpfe bei 650 nm. Eine Standardkurve wurde durch Auftragen des ng/ml-Werts von mIFNα-Polypeptid über der OD bei 650 nm erstellt. Die Konzentration von mIFNα in den Testserumproben wurde anhand des linearen Abschnitts der mIFNα-Standardkurve ermittelt. Die Sensitivität des mIFNα-ELISA betrug 50 ng/ml.
Intramuskulär mit VR4111 injizierte C67BL/6-Mäuse besaßen detektierbare Serumwerte von mIFNα nach fünf intramuskulären Injektionen von 100 μg VR4111 (zweimal wöchentlich zwei Wochen lang, gefolgt von einer Injektion der darauf folgenden Woche). Der mittlere Serumwert von mIFNα nach fünf intramuskulären Injektionen von VR4111 betrug 1465 ng/ml (Mittel von 16 Mäusen). Bis zur Durchführung dieser Studie war kein kommerzielles mIFNα-ELISA-Set entwickelt worden. Da die Sensitivität des firmeninternen mIFNα-ELISA 50 ng/ml beträgt, könnten zu früheren Zeitpunkten niedrigere Serumwerte an mIFNα in den Mäusen bestehen, doch die Anmelder konnten dies in ihrem ELISA nicht detektieren.
Um die Serumwerte von hIFNω zu bestimmen, erhielten C57BL/6-Mäuse oder unbehaarte Mäuse eine einzige intramuskuläre Injektion von 100 μg VR4151 (hIFNω-Plasmid-DNA) oder VR1055 (Vergleichs-Plasmid-DNA; 50 μg beidseitig pro Bein) in den Rectus femoris. Serumproben wurden täglich zwei Wochen lang gesammelt und im hIFNω-ELISA-Set (Alexis, San Diego, CA, USA), das gegenüber 2 pg/ml sensitiv war, analysiert. Serumproben wurden aus vier bis fünf Mäusen pro Tag gezogen. In den C57BL/6-Mäusen wurden messbare Serumwerte von hIFNω bereits einen Tag nach der Injektion detektiert (69 pg/ml; 2A). In diesen Mäusen stellte man die Spitzenserumwerte sechs Tage nach der Injektion (254 pg/ml) fest, und die Expression setzte sich bis zu Tag 14, den Endpunkt der Studie, fort (50 pg/ml).
In unbehaarten Mäusen stellte man die Serumwerte von IFNω bereits einen Tag nach der Injektion fest (133 pg/ml). Die Spitzenserumwerte zeigten sich am Tag 7 (648 pg/ml), und die Expression setzte sich bis zum Tag 14, den Endpunkt der Studie, fort (134 pg/ml; 2B). IFN konnte somit im Serum nach einer einzigen intramuskulären Injektion einer für IFN kodierenden Plasmid-DNA detektiert werden.
Systemische IFN-Behandlung hemmt primäres Tumorwachstum
Wie aus 3–5 und 7A ersichtlich, konnten Mäuse mit unterschiedlichen Tumoren signifikant von der intramuskulären Injektion verschiedener Cytokine profitieren. Um die Wirksamkeit von IFNα-Plasmid zu testen, wurden C57BL/6-Mäuse mit subkutanem B16F10-Melanom, subkutanem Glio0m 261 oder intradermalen M5076-Tu moren oder DBA/2-Mäuse mit subkutanem Cloudman-Melanom mit 100 μg VR4111 (mIFNα) oder VR1055 (Vergleich) zweimal wöchentlich drei Wochen lang, beginnend am Tag 4 nach der Tumorzelleninjektion, injiziert (n = 8–10 Mäuse/Gruppe). In allen subkutanen Tumormodellen wiesen die intramuskulär mit VR4111 behandelten Mäuse eine beträchtliche Reduktion des Tumorvolumens (p < 0,05; 3A, 3C und 3E) sowie eine signifikante Steigerung der Überlebensrate (p < 0,02) gegenüber jenen Mäusen auf, die das Vergleichsplasmid erhielten (3B, 3D und 3F). Im intradermalen Tumormodell zeigten mit intramuskulärem VR4111 behandelte Mäuse eine signifikante Reduktion des primären Tumorvolumens (p < 0,001) gegenüber jenen Mäusen, die das Vergleichsplasmid erhielten (7).
Um die Wirksamkeit von IL-2-, IL-12- und IFNα-Plasmiden zu vergleichen, wurden C57BL/6-Mäuse mit subkutanem B16F10-Melanom mit 100 μg VR4111 (mIFNα), VR4001 (mIL-12), VR1110 (mIL-2) oder VR1012 (Vergleich) zweimal wöchentlich drei Wochen lang injiziert (n = 15–16 Mäuse/Gruppe). Mäuse, die intramuskuläre Injektionen von VR4111 erhielten, wiesen bis zum Tag 17 eine signifikante Reduktion des Tumorwachstums (p < 0,0002); 4A) sowie eine beträchtliche Zunahme der Überlebensrate (p = 00001; 4B) auf. Am Tag 28 der Studie waren 100% der mit VR4111 behandelten Mäuse noch am Leben – im Vergleich zu nur 20% im Fall der mit VR1012 behandelten Mäuse. Mit VR1110 behandelte Mäuse wiesen bis zum Tag 17 eine geringfügige Reduktion des Tumorwachstums (p < 0,02; 4A) auf, zeigten aber keine Zunahme der Überlebensrate im Vergleich zu den mit VR1012 behandelten Mäusen (4B). Mit VR4001 behandelte Mäuse wiesen auch bis zum Tag 17 eine geringfügige Reduktion des Tumorwachstums (p < 0,03; 4A) sowie eine signifikante Zunahme der Überlebensrate (p = 0,02; 4B) auf. Bis zum Tag 28 waren 55% der mit VR4001 behandelten Mäuse noch am Leben – im VergIeich zu 20% der mit VR1012 behandelten Mäuse.
Um die Wirksamkeit von IFNω zu untersuchen, wurden Mäuse mit Human-A431-Tumoren zwischen 30 und 80 mm³ mit 200 μg VR4151 (hIFNω) der VR1055 (Vergleich) zweimal pro Woche drei Wochen lang intramuskulär injiziert (n = 15). Mäuse mit subkutanen A431-Tumoren, die intramuskulär mit VR4151 injiziert wurden, wiesen gegenüber jenen Mäusen, die das Vergleichsplasmid erhielten (5B), eine signifikante Reduktion des Tumorvolumens (p < 0,05; 5A) und eine signifikante Zunahme der Überlebensrate (p < 0,05) auf.
Systemische mIFNα-Plasmid-DNA-Behandlung hemmt das Wachstum von Tumormetastasen
Wie aus 6 und 7 ersichtlich, stellte man fest, dass Mäuse, die unterschiedliche Tumormetastasen trugen, deutlich von der intramuskulären Injektion von IFNα profitierten. C57BL/6-Mäuse mit Lungenmetastasen von B16F10-Melanom wurden mit 100 μg VR4111 (mIFNα) oder VR1055 (Vergleich) zweimal wöchentlich drei Wochen lang intramuskulär injiziert (beginnend am Tag 4 nach der Tumorzelleninjektion; n = 10). Am Tag 25 nach der Tumorzelleninjektion wurden die Mäuse getötet, die Lungen entfernt und in 10% gepuffertem Formalin (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) fixiert und danach die Lungenknötchen gezählt.
Während 70% der mit Vergleichsplasmid behandelten Mäuse Lungenknötchen aufwiesen, die für eine Zählung zu viele waren, besaßen 80% der mit mIFNα-Plasmid-DNA behandelten Mäuse zehn oder weniger Knötchen (6). TNTC bedeutet Lungen mit Knötchen, die für eine Zählung zu viele waren.
Im Lebermetastasen-Modell wurden C57BL/6-Mäuse mit intradermalem M5076-Mäuse-Retikulumsarkom mit 100 μg VR4111 oder VR1055 zweimal wöchentlich drei Wochen lang, beginnend mit Tag 4 nach der Tumorzelleninjektion, intramuskulär injiziert (n = 10–13 Mäuse/Gruppe). Am Tag 29 nach der Tumorzelleninjektion wurden die Mäuse getötet, die Leber entfernt und in 10% gepuffertem Formalin (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) fixiert und anschließend die Leberknötchen gezählt.
Während die mit Vergleichsplasmid behandelten Mäuse durchschnittlich 190 Lungentumorknötchen oder Knötchen besaßen, die für eine Zählung zu viele waren, wiesen mit mIFNα-Plasmid-DNA behandelte Mäuse durchschnittlich 35 Lungentumorknötchen auf (7B).
Diese Ergebnisse zeigen auf, dass die intramuskuläre Injektion von mIFNα-Plasmid-DNA das Wachstum primärer und metastasierender Läsionen wirkungsvoll hemmen kann. Somit wäre für Patienten mit metastatischer Krankheit die intramuskuläre Verabreichung therapeutischer Plasmid-DNA für die Behandlung undiagnostizierter oder unzugänglicher metastasierender Läsionen von Vorteil.
Optimierung des Behandlungsregimes der mIFNα-Therapie im B16F10-Melanom-Modell
Eine Studie zur Optimierung des Behandlungsregimes wurde durchgeführt, um die Anti-Tumor-Wirksamkeit einer geringeren Anzahl an Injektionen und/oder einer niedrigeren Dosis von VR4111 (mIFNα) im subkutanen B16F10-Melanom-Modell zu bewerten. C57BL/6-Mäuse wurden mit 100 oder 50 μg VR4111 oder VR1055 sechs Wochen lang injiziert (n = 10). Die Mäuse erhielten entweder zweimal wöchentlich, einmal wöchentlich oder jede zweite Woche intramuskuläre Injektionen. Alle intramuskulären Injektionen begannen vier Tage nach der ersten subkutanen B16F10-Tumorzelleninjektion. Mäuse, die intramuskuläre Injektionen von 100 μg VR4111 in jeder beliebigen der oben angeführten Häufigkeiten erhielten, wiesen eine signifikante Reduktion des Tumorvolumens (= 0,005) und eine signifikante Steigerung der Überlebensrate (p = 0,007) auf (8A und 8B). Jene Mäuse, die die 100 μg-Dosis VR4111 jede zweite Woche sechs Wochen lang erhielten, bekamen insgesamt nur drei intramuskuläre Injektionen mit signifikanter Anti-Tumor-Wirksamkeit verabreicht. Im Gegensatz dazu zeigten Mäuse, die die 50 μg-Dosis VR4111 erhielten, eine von der Häufigkeit der Injektionen abhängige Dosisreaktion. Während Mäuse, die einmal oder zweimal wöchentlich mit 50 μg VR4111 injiziert wurden, eine signifikante Re duktion des Tumorvolumens (p = 0,03) und eine signifikante Zunahme der Überlebensrate (p = 0,002) aufwiesen, zeigten Mäuse, die nur jede zweite Woche injiziert wurden, keine signifikante Anti-Tumor-Response betreffend Tumorwachstum oder Überleben (8C und 8D).
Mechanismus der mIFNα-Anti-Tumor-Wirkung
Um die Rolle von NK- und T-Zellen bei Mediieren der Anti-Tumor-Wirkung von systemisch zugeführtem mIFNα zu untersuchen, wurde VR4111 oder VR1055 unbehaarten Mäusen (die T-Zellen-defizient sind) und beigen unbehaarten Mäusen (die NK- und T-Zellen-defizient sind) mit subkutanen B16F10-Melanomtumoren intramuskulär verabreicht. Beginnend am Tag 4 nach der Injektion von 10⁴ B16F10-Zellen wurden 50 μg Plasmid-DNA in 50 μg Salzlösung in den Rectus femoris jedes Hinterbeins für eine gesamte DNA-Dosis von 100 μg zweimal wöchentlich drei Wochen lang injiziert (n = 15 Mäuse/Gruppe).
Es erfolgte weder eine signifikante Reduktion des Tumorvolumens noch eine Steigerung der Überlebensrate in den unbehaarten Mäusen (9A und 9B) oder den beigen unbehaarten Mäusen (9C und 9D). Diese Ergebnisse legen nahe, dass T-Zellen möglicherweise für die mIFNα-Anti-Tumor-Response verantwortlich sind. NK-Zellen sind offenbar für die Anti-Tumor-Wirkung nicht erforderlich, da unbehaarte Mäuse (NK^–) keine stärkere Anti-Tumor-Response aufwiesen als die beigen unbehaarten Mäuse (NK^–).
Um die Rolle von T-Zellen in der Anti-Tumor-Wirkung der mIFNα-DNA-Therapie näher zu beleuchten, wurden C57BL/6-Mäuse mit subkutanen B16F10-Tumoren mit erschöpfenden Dosen monoklonaler Antikörper (mAb), die für CD4⁺- oder CD8⁺-T-Zellen spezifisch sind, injiziert. Für die Reduktion von T-Zellen-Untergruppen wurden Anti-CD4- (Klon GK1.5, Ratten-IgG) und Anti-CD8- (Klon 2.43, Ratten-IgG) Hybridome (ATCC, Rockville, MD, USA) dazu verwendet, den entsprechenden mAb zu pro duzieren. Das Anti-CD8-Hybridom wurde als Aszites in unbehaarten Mäusen gezüchtet und die mAb aus Aszites mittels Ionenaustausch-Chromatographie (Harlan Bioproducts for Science, San Diego, CA, USA) gereinigt. Das Anti-CD4-Hybridiom wurde in vitro mit Dulbecco's Modified Eagle Medium, 10% Rinderfötensrum und wenig IgG gezüchtet. Der Anti-CD4-mAb wurde aus Gewebekulturüberstand durch Ammoniumsulfat-Fällung auf 30% gereinigt. Das Proteinpellet wurde resolubilisiert und ausgiebig in Dulbecco's Ca²⁺/Mg²⁺-freier PBS (Zymed Laboratories, Inc., San Francisco, CA, USA) dialysiert.
Beginnend mit Tag 4 nach der subkutanen Injektion mit 10⁴ B16F10-Zellen wurden die Mäuse subkutan mit 100 μg VR4111 oder VR1055 zweimal pro Woche drei Wochen lang intramuskulär injiziert. Für die Reduktion von CD4^– und CD8⁺-T-Zellen wurden die Mäuse mit 500 μg Anti-CD4-mAb (Klon GK 1.5, Ratten-IgG) oder Anti-CD8-mAb (Klon 2.43, Ratten-IgG) einen Tag vor jeder intramuskulären DNA-Injektion intraperitoneal injiziert (n = 10 Mäuse/Gruppe). Die Tumor tragenden Vergleichsmäuse wurden mit 500 μg normalem Ratten-IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) intraperitoneal injiziert (n = 10). Um vollständige Reduktion zu gewährleisten, wurden Sentinel-Mäuse gemäß dem gleichen Regime injiziert und einmal wöchentlich ihre Milzen gesammelt, dissoziiert und auf die Gegenwart von CD4^–- und CD8⁺-Zellen untersucht. Die Milzzellen wurden mit FITC-konjugierten Anti-CD4- und PE-konjugierten Anti-CD8-mAb gefärbt (Pharmingen, San Diego, CA, USA) und durch Durchflusszytometrie (Cytometry Research Services, San Diego, CA, USA) analysiert. Die Erschöpfung an CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen war konsequent höher als 98% (bestimmt durch Zytometrie).
Die mIFNα-DNA-Therapie konnte gegenüber von Musen, die mit Vergleichsplasmid und mit normalem IgG behandelt wurden, das Tumorwachstum (p = 0,002) signifikant reduzieren und die Überlebensrate (p = 0,008) sowohl normaler Mäuse als auch CD4⁺-erschöpfter Mäuse erhöhen (10A und 10B). Diese Ergebnisse legen nahe, dass CD4⁺-T-Zellen für die mIFNα-Anti-Tumor-Wirkung nicht erforderlich sind. Im Gegensatz dazu zeigten CD8⁺-T-Zellen-erschöpfte Mäuse, denen mIFNα-DNA injiziert wurde, Tumorvolumina und Überlebensprofile, die sich nicht signifikant von jenen Mäusen unterschieden, die mit dem Vergleichsplasmid behandelt wurden ( 10A und 10B). Dieses Ergebnis legt nahe, dass CD8⁺-Zellen an der mIFNα-Anti-Tumor-Response beteiligt sind.
Beispiel 5
Lokale IFN-Therapie: Intratumorale Verabreichung von IFN-Plasmiden
Die Anti-Tumor-Aktivität von IFNω und IFNα wurde in vivo in unbehaarten Mäusen mit subkutanem Human-Eierstock- (NIH-OVCAR3) oder Human-Melanom (A375) (unbehaartes/Human-/Xenotransplantat-Modell) oder in C57BL/6-Mäusen mit Mäuse-Melanom- (B16F10) Tumoren nach intratumoraler Verabreichung von mit einem kationischen Lipid komkplexierter DNA untersucht.
Zelllinien und Tumormodelle
Athymische unbehaarte (nu/nu) und C57BL/6-Mäuse im Alter von zwischen sechs und zehn Wochen stammten von Harlan Sprague Dawley (San Diego, CA, USA).
Human-A375-Melanomzellen sowie Human-NIH-OVCAR3-Eierstockkarzinomzellen stammten von der ATCC (Rockville, MD, USA) und wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA), ergänzt mit 10% FBS, gezüchtet. B16F10-Zellen wurden freundlicherweise von Dr. Suzuki von der University of Texas (Galveston, TX, USA) zur Verfügung gestellt. Die Zellen wurden in RPMI-1640 (GibcoBRL) und 5% FBS gezüchtet.
Um subkutane A375-Melanomtumoren und subkutane NIH-OVCAR3-Eierstocktumoren zu bilden, wurden athymische unbehaarte/unbehaarte Mäuse (10 Mäuse/Grup pe) subkutan mit 5 × 10⁶ A375-Zellen bzw. 5 × 10⁷ NIH-OVCAR3-Zellen injiziert. Um subkutane Mäuse-B16F10-Melanomtumor zu bilden, wurden C57BL/6-Mäuse subkutan mit 10⁴ B16F10-Zellen injiziert.
Die Mäuse wurden auf Tumorwachstum und Überlebensprofil kontrolliert. Die Tumorgrößen wurden dreimal wöchentlich durch Messen der Taster (1 × w × h) bestimmt und die Tumorvolumina mittels der Formel Tumorvolumen (mm³) = 0,52 (1 × w × h) ermittelt. Die statistische Analyse erfolgte wie in Beispiel 4.
Lokale IFN-Plasmid-DNA hemmt Tumorwachstum
Gebildete subkutane A375-Human-Melanom- und NIH-OVCAR3-Human-Eierstockkarzinom-Tumoren in unbehaarten Mäusen wurden in vivo durch intratumorale Verabreichung von pDNA/DMRIE/DOPE- (DNA : Lipid-) Komplexen transfiziert (n = 10). Als man die Tumoren fühlen konnte (80–300 mm³, Tag 27 nach der Tumorzellenimplantation bezüglicher der A375-Zellen und am Tag 41 nach der Tumorzellenimplantation bezüglich der NIH-OVCAR3-Zellen), wurden die Mäuse mit 100 μg VR-4112 (hIFNα), VR4151 (hIFNω), VR1055 (Vergleich) oder VR1012 (Vergleich, komplexiert mit DMRIE/DOPE (1 : 1 DNA : DMRIE Masseverhältnis), intratumoral injiziert. Tumor tragende Tiere wurden intratumoral mit DNA : Lipid sechs aufeinander folgende Tage lang behandelt daran schlossen sich fünf Behandlungen jeden zweiten Tag (insgesamt elf Behandlungen) für das A375-Melanom-Modell oder jeden zweiten Tag (insgesamt elf Behandlungen) für das NIH-OVCAR3-Eierstockkarzinom-Modell).
Wie aus 11A ersichtlich führt im A375-Melanom-Modell die direkte intratumorale Injektion von VR4151 : Lipid-Komplex über sechs Tage hintereinander, gefolgt von fünf zusätzlichen Injektionen an jedem zweiten Tag (100 μg Plasmid-DNA/Injektion, insgesamt elf Injektionen), zu einer statistisch signifikanten Verlangsamung des Tumorwachstums gegenüber dem Vergleich (p < 0,03, Tage 40–44).
Wie aus 2B ersichtlich, bewirkte im NIH-OVCAR3-Eierstockkarzinom-Modell die direkte intratumorale Injektion des VR4151 : Lipid-Komplexes an jedem zweiten Tag über insgesamt elf Injektionen (100 g Plasmid-DNA/Injektion) eine lange andauernde und statistisch signifikante Reduktion des Tumorwachstums gegenüber dem Vergleichsplasmid (p < 0,001–0,05, Tage 45–65). Ein ähnliches Behandlungsregime mit VR4112 : Lipid wirkt sich, wie man feststellte, moderat auf das Tumorwachstum aus; nur an zwei Zeitpunkten während der Studie wurde statistische Signifikanz gegenüber dem Vergleichsplasmid erreicht (p < 0,05, Tage 53 und 57).
Wie aus 12A ersichtlich, rief im B16F10-Melanom-Modell die direkte intratumorale Injekion von mIFNα eine Verringerung des Tumorvolumens hervor. Sobald fühlbare Tumoren (80–300 mm³) am Tag 12 nach der Tumorzelleninjektion in C57BL/6-Mäusen mit subkutanen B16F10-Melanomtumoren gebildet waren, erhielten die Mäuse intratumorale Injektionen von 100 μg VR4101 (mIFNα) oder VR1012 (Vergleich), komplexiert mit dem kationischen Lipid DMRIE/DOPE in einem DNA/DMRIE-Masseverhältnis von 1 : 1 in einem Volumen von 100 μl. Die Mäuse erhielten sechs aufeinander folgende intratumorale Injektionen von VR4101 oder VR1012 (n = 10 Mäuse/Gruppe). Wie man in 12A erkennt, führte die intratumorale Injektion – obwohl sie statistisch nicht signifikant ist – am Tag 19 der Studie zu einer 54%igen Reduktion des Tumorvolumens. Wie in 12B zu sehen, wurde eine signifikante Zunahme der Überlebensrate (p = 0,02) bei den mit VR4101 behandelten Mäusen im Vergleich zu den Mäusen, die VR1012 erhielten, festgestellt.
Beispiel 6
Lokale Cytokintherapie: Intraperitoneale Verabreichung von Cytokin exprimierenden Plasmiden
sDieses Beispiel zeigt ein wirksames Verfahren zur Behandlung maligner Mäuse-Eierstockkarzinomtumoren mittels i. p. Injektion von Cytokin exprimierender Plasmid- DNA. Da Eierstockkarzinom im Spätstadium üblicherweise auf die Bauchfellhöhe beschränkt ist, ging man davon aus, dass kontinuierliche Sekretion eines Cytokins in diesen Hohlraum günstige Anti-Tumor-Immunreaktionen hervorrufen könnte. Insbesondere zeigt das vorliegende Beispiel klar auf, dass die Eierstockkarzinom-Therapie durch i. p. Injektion eines Komplexes aus Cytokin exprimierender Plasmid-DNA und Lipid (1) lange andauernde Mengen des Cytokins in Aszites hervorruft, sodass häufige Injektionen des Proteins überflüssig sind (im Gegensatz zur intraperitonealen Injektion von rekombinantem Cytokin, wo der Cytokinwert kurz nach der Injektion abnimmt), (2) auf Tumoraszites und nicht auf Peritonealgewebe abzielt (dies legt nahe, dass systemische Cytokin-Nebenwirkungen unter Anwendung dieses Verfahrens gemildert werden könnten), (3) Tumorwachstum hemmt und das Überlebensprofil verbessert und (4) mit Debulking von Tumoraszites kombiniert werden kann, um die Anti-Tumor-Wirkung zu steigern.
Zelllinien und Tumormodelle
Als Modell für Human-Eierstockkarzinom wurde das Mäuse-Eierstockteratokarzinom(MOT-) Modell in C3H/HeN-Mäusen verwendet. MOT weist zahlreiche der Charakteristika von Human-Eierstockkarzinom im Spätstadium auf, z. B. peritoneale Ausbreitung, Produktion von Tumoraszites und Tumorzellblockade von Lympgefäßen (Ozols et al., 1979, und Fekete et al., 1952).
MOT-Zellen stammten von Dr. Robert Knapp und Dr. Robert C. Bast am Dana-Farber Cancer Center (Boston, MA, USA). Die MOT-Zellen (10⁵) wurden durch i. p. Reihentransplantation in C3H/HeN-Mäusen gezüchtet und eine Masse an Zellen in flüssigem Stickstoff gefroren.
CTLL-2-Zellen stammten von der ATCC, Rockville, MD, USA und wurden in RPMI-1640 mit Glutamin, 1% Natriumpyruvat, 1% Penicillin-Streptomycin (Life Technolo gies, Gaithersburg, MD, USA), 10% Rinderfötenserum (HyGlone, Logan, UT, USA) und 10 U/ml Mäuse-IL-2 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA} gezüchtet.
C3H/HeN- und unbehaarte (nu/nu) weibliche Mäuse im Alter von zwischen sechs und zehn Wochen stammten von Harlan Sprague Dawley, San Diego, CA, USA. Alle Tierversuche erfolgten im Einklang mit den Kriterien des Vical's Institutional Animal Care and Use Committee sowie den vom National Research Council festgelegten Normen betreffend die Tierbetreuung und -verwendung in Experimenten.
Um i. p MOT-Tumoren zu bilden, erhielten die C43/HeN-Mäuse i. p. Injektionen mit 10⁵ MOT-Zellen in 100 μl Medium. Im MOT-Tumormodell wird das Tumorwachstum typischerweise durch Wägen der Mäuse kontrolliert, da es ein Maß für die Volumenszunahme von Tumoraszites ist (Berek et al., Cancer Res. 44, 1871–1875 (1984)). Die Studie mit unbehaarten Mäusen erfolgte in gleicher Weise wie die Studien in C3H/ HeN-Mäusen mit i. p. Injektionen von 10⁵ MOT-Zellen und Überwachen des Gewichts der Mäuse. Die statistische Analyse des Mäusegewichts und deren Überlebensprofils erfolgte wie in Beispiel 4.
Herstellung von Plasmid-DNA : Lipid-Komplexen und intraperitoneale Injektion
Um ein pDNA : DMRIE-Masseverhältnis von 1 : 1 zu liefern, wurden 100 μg VR1110 (mIL-2) in 500 μl 0,9% Salzlösung verdünnt (Radix Labs, Eau Claire, WI, USA). DMRIE/DOPE-Lipid (100 μg DMRIE) wurde in 500 μl 0,9% Salzlösung in einem getrennten Fläschchen verdünnt, und die pDNA und das kationische Lipid wurden kombiniert und fünf Sekunden fang gewirbelt. Um ein pDNA : DMRIE-Masseverhältnis von 5 : 1 zu ergeben, wurden 500 μg mIL-2-pDNA in 500 μl 0,9% Salzlösung verdünnt (Radix Labs, Eau Claire, WI, USA). DMRIE/DOPE-Lipid (100 μg DMRIE) wurde in 500 μl 0,9% Salzlösung in einem getrennten Fläschchen verdünnt, und die pDNA und das kationische Lipid wurden kombiniert und fünf Sekunden lang gewirbelt.
Der 1 ml-pDNA : DMRIE/DOPE- (DNA : Lipid-) Komplex wurde Mäusen mit i. p. MOT-Tumoren an verschiedenen Tagen nach der Tumorzellenimplantation i. p. injiziert. Vergleichs-MOT-Tumor tragende Mäuse erhielten i. p. Injektionen von VR1012 (Vergleich) : Lipid im gleichen Verhältnis (1 : 1 pDNA : DMRIE, 100 μg pDNA) und wurden an den gleichen Tagen wie die Cytokin exprimierende oder Reporter-Gen-Behandlungsgruppe i. p. injiziert.
Intraperitoneale Injektion von Plasmid-DNA: Lipid führt zu zielgerichteter Expression in Tumoraszites
Die pDNA : Lipid-Therapie wurde auf die Fähigkeit untersucht, auf maligne Zellen innerhalb des Hohlraums abzuzielen. C3H/HeN-Mäuse erhielten i. p. Injektionen mit 10⁵ Mot-Zellen, gefolgt von i. p. Injektion von 100 μg VR1223 (Luciferase) : Lipid (1 : 1 pDNA : DMRIE Masseverhältnis) an den Tagen 5 und 6 nach der Tumorzellenimplantation. MOT-Tumor tragende Vergleichsmäuse wurden mit 100 μg VR1012 : Lipid oder VR1223 ohne Lipid an den Tagen 5 und 6 nach der MOT-Tumorzelleninjektion i. p. injiziert. Eine zusätzliche Gruppe an Vergleichsmäusen erhielt keine MOT-Tumorzellen und wurde an den gleichen Tagen wie die anderen Behandlungsgruppen i. p. mit VR1223 injiziert (n = 3). Drei Tage später wurden die Mäuse getötet und Tumoraszites und Gewebe (Leber, Niere, Milz, Zwerchfell, Darm und Eierstöcke) gesammelt. Luciferase wurde aus den Geweben und Ausfrieren und Mahlen der Proben in Zelllyse-Reagens extrahiert Promega, Madison, WI, USA), wie dies bereits beschrieben wurde (Hartikka et al., Hum. Gene Ther. 7, 1205–1217 (1966)). Die Tumoraszites wurden 1 : 5 in Zelllyse-Reagens verdünnt, gefolgt von drei Ausfrierzyklen und Sammeln des Überstands aus dem Zelllysat. Die Proben wurden in einem Mikroplatten-Luminometer (Dynatech, Chantilly, VA, USA) abgelesen und danach Luciferase-Substrat zugesetzt (Promega, Madison, WI, USA). Die relativen Lichteinheiten (RLU) der Proben wurden anhand einer Standardkurve unter Verwendung gereinigter Glühwürmchen-Luciferase (Analytical Luminescence Laboratory, Sparks, MD, USA) bestimmt. Die Proteinkonzentration jeder Probewurde mittels des BCA Protein Assay Kit (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, USA) ermittelt. Luciferase-Mengen wurden als RLU/mg Protein exprimiert. Es kann eine Abnahme der IL-2-pDNA-Expression von Tag 1 bis Tag 3 nach der DNA-Injektion stattfinden.
Am Tag 3 wiesen Tumoraszites 900.000 RLU Luciferase/mg auf, während Zwerchfeli- und Eierstockgewebe nur 327 bzw. 16 RLU/mg aufwiesen (13). Nieren-, Leber-, Milz- und Darmgewebe besaß keine detektierbare Luciferase-Aktivität. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die i. p. Injektion von pDNA : Lipid-Komplexen offenbar auf Tumoraszites in der Bauchfellhöhle mit beschränkter oder vernachlässigbar geringer Transfektion der umgebenden Gewebe abzielt. Im Zwerchfell- und Eierstockgewebe detektierte Luciferase wurde nur in MOT-Tumor tragenden Mäusen festgestellt, die mit dem VR1223 : Lipid injiziert wurden. Wenn naive, keinen Tumor tragende Mäuse mit dem glichen DNA : Lipid-Komplex injiziert wurden wurde in keinem Gewebe irgendeine Luciferase-Aktivität beobachtet (Daten nicht dargestellt). Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die geringen Mengen an Luciferase im Zwerchfell und in den Eierstöcken von Mäusen mit MOT-Tumor auf Metastasen von Tumorzellen in diesen Geweben hindeuten könnte. Tumor tragende Mäuse mit injizierter Luciferase-pDNA ohne kationisches Lipid besaßen keine Luciferase-Aktivität – weder in Tumoraszites noch in umgebenden Geweben; dies ist ein Indikator dafür, dass Lipid für die optimale In-vivo-Transfektion von Eierstocktumor-Aszites erforderlich ist. Mit VR1012 : Lipid injizierte Mäuse wiesen weder in Tumoraszites noch in Geweben detektierbare Luciferase-Aktivität auf.
Eine Nachfolgestudie untersuchte den spezifischen Zelltyp in Eierstocktumor-Aszites, der nach i. p. Injektion eines Reporter-Gen-pDNA : DMRIE/DOPE-Komplexes transfiziert wurde. An den Tagen 5 und 6 nach der Tumorzellenimplantation (10⁵ Zellen) wurden C3H/HeN-Mäuse mit 100 μg VR1412 (β-Galactosidase (β-gal) : Lipid, VR-1012 : Lipid (1 : 1 DNA : DMRIE-Masseverhältnis) oder mit VR1412 ohne kationisches Lipid i. p. injiziert (n = 3 Mäuse/Gruppe). Einen tag später wurden die Mäuse getötet und die Tumoraszites gesammelt. Die Aszites wurden 2 Minuten lang bei 2.500 U/ min zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren, und der Überstand entfernt. Die Tumorzellen wurden in 10% gepuffertem Formalin (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) fixiert, in eine Kryoform mit OCT-Einbettungsmittel (VWR, S. Plainfield, NJ, USA) eingebracht, in Isopentan gefroren und dann bei –70°C gelagert. Die eingebetteten und gefrorenen Proben wurden dann cryostatgeschnitten (5 μm), fixiert (0,5% Glutaraldehyd in PBS), gewaschen (PBS), mit X-gal-Reagens (1 mg/ml X-gal, verdünnt in PBS mit 5 mM Kaliumferricyanid, 5 mM Kaliumferrocyanid und 1 mM Magnesiumchlorid) gefärbt, erneut gewaschen (PBS) und mit Hematoxylin und Eosin gegengefärbt, (Die Proben wurden durch Pathology Associates (Frederick, MS, USA) cryostatgeschnitten und gefärbt).
Aszites aus Mäusen, die entweder mit VR1012 oder VR1412 ohne Lipid behandelt wurden, besaßen in den Proben keine β-gal-Aktivität. Im Gegensatz dazu wiesen die Tumoraszites aus mit VR1412 : Lipid injizierten Mäusen β-gal-Färbung vor allem in den Tumorzellen auf (Daten nicht dargestellt). Auf einigen wenigen Objektträgern waren auch mehrere Makrophagen und Lymphozyten β-gal-positiv, während Neutrophile β-gal-negativ waren.
Intraperitoneale Injektion von IL-2-pDNA : Lipid führt zu lange andauernder Expression von IL-2 in Tumoraszites
Es erfolgte eine Zeitverlaufsstudie, um die Zeitdauer festzustellen, in der IL-2 nach mehreren i. p. Injektionen von IL-2-pDNA : Lipid oder einer einzelnen i. p. Injektion von IL-2-Pootein oder IL-2-pDNA : Lipid in Mäusen mit i. p. Eierstocktumor-Aszites detektierbar ist. Beginnend mit Tag 5 nach der Tumorzelleninjektion wurden Mäuse mehrere Male mit VR1110 (mIL-2) : Lipid oder einmal mit VR1110 : Lipid oder IL-2-Protein injiziert. Die Mäuse wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten getötet und Aszites und Serum auf IL-2-Werte analysiert. Aszites wurden aus den getöteten Mäusen entnommen, die Proben wurden 2 Minuten lang bei 14.000 U/min zentrifugiert, und der Überstand wurde geerntet. Blut wurde den Mäusen am gleichen Tag wie die Aszites entnommen und das Serum von den Blutzellen getrennt, indem man das Blut in Serumtrennröhrchen gerinnen ließ (Microtainer, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA), gefolgt von 10-minütigem Zentrifugieren bei 14.000 U/min und dem Sammeln des Serumüberstands. Die IL-2-Konzentration (pg/ml) in den Aszites- und Serumproben wurde unter Anwendung eines Mäuse-IL-2-ELISA (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA) bestimmt. Da das Volumen von Tumoraszites im Lauf der Zeit zunimmt, wurde das Aszitesvolumen auch für jede Maus bestimmt. Die Gesamtkonzentration von IL-2 in Aszites wurde unter Heranziehung der Formel IL-2 pg/ml × ml Aszites = pg IL-2/Gesamt-Aszites ermittelt. Die Serum-IL-2-Konzentrationen wurden als pg/ml angeführt.
IL-2 in Serum und Aszites nach mehreren Injektionen von IL-2-pDNA : Lipid
Beginnend mit Tag 5 nach der Tumorzelleninjektion wurden die Mäuse mit VR1110: Lipid zwei, vier oder sechs Tage hintereinander oder mit Vergleichs-VR1012 : Lipid sechs Tage hintereinander (100 μl Plasmid-DNA, komplexiert mit 100 μl DMRIE/DO-PE in einem Masseverhältnis von 1 : 1 und einem Gesamtvolume von 1 ml) injiziert. Eine zusätzliche Gruppe von Mäusen erhielt VR1110, das nicht mit DMRIE/DOPE komplexiert war. An jedem zweiten Tag bis zu 17 Tage nach den DNA : Lipid-Injektionen wurden drei bis vier Mäuse pro Behandlungsgruppe getötet, Aszites und Serum gesammelt und mittels des mIL-2-ELISA (s. o.) analysiert.
Zwei Injektionen von VR1110 : Lipid (100 μl DNA pro Tag, 1 : 1-Masseverhältnis von DNA : kationisches Lipid) in Mäuse mit i. p. MOT-Eierstocktumoren ergaben hohe Werte an IL-2-Protein in den Tumoraszites. Einen Tag nach der i. p. Injektion von VR-1110 : Lipid wurden 28.000 pg/ml IL-2 im Tumoraszites gemessen (Tabelle 3). Die IL-2-Expression im Aszites setzte sich mehr als zwei Wochen lang nach DNA : Lipid-Injektion fort, wobei 750 pg/ml 17 Tage nach der letzten pDNA : Lipid-Injektion nachgewiesen wurden. Die mit entweder vier oder sechs aufeinander folgenden Injektionen von VR1110 : Lipid injizierten Mäuse besaßen auch hohe Werte an IL-2 in den Tumor aszites; infolge der sehr hohen Expressionsmengen nach häufigeren VR1110 : Lipid-Injektionen stellte man jedoch durch IL-2 mediierte Nebenwirkungen in jenen Mäusen fest, die nicht über Tag 9 oder 13 nach der DNA-Injektion hinaus überlebten. Im Gegensatz dazu bewirkten zwei hintereinander erfolgende Injektionen von VR1110 plus DMRIE/DOPE keine beobachtbaren IL-2-Nebenwirkungen; die IL-2-Expressionsmengen blieben allerdings über mehr als zwei Wochen lang hoch. Das nach der i. p. DNA : Lipid-Injektion MOT-tragender Mäuse exprimierte IL-2 schien in der Bauchfellhöhle lokalisiert zu bleiben, da die IL-2-Serumwerte nach i. p. VR1110 : Lipid-Injektion immer unter 10% der Werte in den Tumoraszites ausmachten. Die Injektion von VR1110 ohne Lipid lieferte sehr geringe Mengen an IL-2 in Aszites und Serum (0–32 pg/ml). Die Injektion des Vergleichsvektors, VR1012, führte nur zu Hintergrundmengen von IL-2.
Tabelle 3 mIL-2-Konzentration in Aszites (pg/ml)
mIL-2-Konzentration in Serum (pg/ml)
IL-2 in Serum und Aszites nach einzelner Injektion von pDNA : Lipid-Injektion im Vergleich zu Proteininjektion
Fünf Tage nach der i. p. Injektion von 10⁵ MOT-Tumorzellen wurden C3H/HeN-Mäuse mit 100 μg VR1110 : Lipid oder VR1012 : Lipid (Masseverhältnis zwischen DNA: DMRIE von 1 : 1) oder mit 100 μg VR1110 ohne Lipid injiziert. Für die mit IL-2-Protein behandelte Gruppe wurden die Mäuse mit 1 μg rekombinantem Mäuse-IL-2-Protein (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA) injiziert. pDNA : Lipid, pDNA alleine oder rekombinantes Protein wurde i. p. in einem Gesamtvolumen von 1 ml Salzlösung/Maus injiziert. Fünf Mäuse aus jeder Gruppe wurden nach vier Stunden und an den Tagen 1, 2, 3, 6 und 10 nach DNA- oder Proteininjektion getötet. Aszites und Serum wurden entnommen und mittels mIL-2-ELISA (s. o.) analysiert.
Mit IL-2-Protein i. p. injizierte Mäuse wiesen vier Stunden nach der Injektion von IL-2 Spitzenwerte von IL-2 in Aszites (10 ng) und einen Tag später eine 1000fache Reduktion in IL-2 auf (0,009 ng; 14A). Im Gegensatz dazu wiesen mit IL-2-pDNA : Lipid injizierte Mäuse zwei Tage nach der Injektion Spitzenwerte von IL-2 in Aszites (64 ng) und zehn Tage nach der Injektion nur eine 2,6fache Reduktion von IL-2 auf (25 ng; 14A). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass IL-2-pDNA : Lipid erhaltende Mäuse länger andauernde Mengen an IL-2 in Aszites besitzen als IL-2-Protein erhaltende Mäuse. Tumor tragende Mäuse, die entweder VR1012 : Lipid oder VR1110 ohne kationisches Lipid i. p. injiziert bekamen, besaßen in den Tumoraszites kein IL-2. In einer verwandten Studie wiesen MOT-Tumor tragende Mäuse, in die i. p. 10fach weniger VR1110 : Lipid (10 μg DNA) injiziert wurde, elf Tage nach der VR1110 : Lipid-Injektion immer noch detektierbares IL-2 im Tumoraszites (Daten nicht dargestellt).
Die Serumwerte von IL-2 nach i. p. Protein- oder DNA-Injektion spiegelten ein ähnliches Muster wie in den Tumoraszites wider; die Serum IL-2-Werte waren jedoch im Vergleich zu den Aszites-IL-2-Werten deutlich geringer. Vier Stunden nach der Proteininjektion betrug II-2 im Serum 2,4 ng/ml und war ein Tag nach der Proteininjektion vernachlässigbar gering. Die Serumwerte von IL-2 betrugen einen Tag nach VR1110 : Lipid-Injektion 1 ng/ml und waren sechs Tage nach der Injektion undetektierbar (14B). Diese Daten legen nahe, dass der Großteil des IL-2 nach IL-2-Protein- oder pDNA : Lipid-Zufuhr in der Bauchfellhöhle verbleibt.
Intraperitoneale Injektion von IL-2-Plasmid-DNA : Lipid hemmt das Tumorwachstum und verbessert das Überlebensprofil
Sechs Behandlungen an aufeinander folgenden Tagen. Die Plasmid-DNA : Lipid-Therapie wurde auf die Fähigkeit untersucht, Tumorwachstum zu reduzieren und die Überlebensrate der Mäuse mit MOT-Tumoren zu erhöhen. Am Tag 5 nach der MOT-Tumorzelleninjektion wurden die Mäuse mit 100 μg VR1110 oder VR1012, bei de mit DMRIE/DOPE komplexiert, i. p. injiziert. Die Plasmid-DNA wurde entweder in einem 5 : 1- oder einem 1 : 1-Masseverhältnis zwischen DNA und DMRIE komplexiert. Eine zusätzliche Behandlungsgruppe erhielt VR1110, das nicht mit Lipid komplexiert war. Ein Gesamtvolumen von 1 ml DNA : Lipid oder DNA alleine in physiologischer Salzlösung wurde i. p. injiziert. Die DNA-Behandlungen erfolgten an sechs Tagen hintereinander, beginnend mit Tag 5 (Tage 5–10). MOT-Tumorwachstum wurde durch Wägen der Mäuse gemessen. Alle Behandlungsgruppen bestanden aus zehn Mäusen pro Gruppe.
Das hohe Ausmaß an IL-2-Expression in Aszites ging Hand in Hand mit signifikanten Anti-Tumor-Effekten. Mit VR1110-Lipid an Tagen 5–10 nach der Tumorzelleninjektion behandelte Mäuse zeigten eine signifikante Reduktion des MOT-Tumonnrachstums im Vergleich zu den mit VR1012 : Lipid behandelten Mäusen (p = 0,01; 15A). Eine signifikante Verbesserung des Überlebensprofils wurde für die mit VR1110 : Lipid i. p. injizierten Mäuse festgestellt (p = 0,05; 15B).
Das Komplexieren der pDNA mit einem kationischen Lipid schien für die Anti-Tumor-Wirkung notwendig, da die Behandlung von Tumor tragenden Mäusen mit VR1110 ohne Lipid nicht wirkungsvoll war (15E und 15F). Außerdem stellte sich ein Masseverhältnis zwischen DNA und kationischem Lipid von 1 : 1 als wirkungsvoller heraus, die Tumorbelastung zu mindern und die Überlebensrate zu erhöhen, als ein Masseverhältnis zwischen DNA und kationischem Lipid von 5 : 1 (15C und 15D).
Drei Behandlungen an jedem zweiten Tag. C3H/HeN-Mäuse mit i. p. MOT-Tumoraszites wurden mit VR1110 : Lipid oder mit VR1012 : Lipid (100 μg DNA) an Tagen 5, 8 und 11 nach der Tumorzellenimplantation i. p. injiziert. Am Tag 14 nach der Tumorzelleninjektion zeigten die mit VR1110 : Lipid behandelten Mäuse eine signifikante Reduktion des mittleren Gewichts (p = 0,001) gegenüber den mit Vergleichs-pDNA: Lipid behandelten Mäusen (16A). Außerdem stellte man im Vergleich zu den mit VR1012 : Lipid behandelten Mäusen eine signifikante Zunahme der Überlebensrate (p = 0,008) bei den mit VR1110 : Lipid behandelten Mäusen fest (16B). Am Tag 26 nach der Tumorzelleninjektion war keine der mit VR1012 behandelten Mäuse noch am Leben, während 50% der mit VR1110 : Lipid behandelten Mäuse noch lebten. Am Tag 55 nach der Tumorzelleninjektion schienen 20% der mit VR1110 : Lipid behandelten Mäuse tumorfrei zu sein.
Die Frage, ob die IL-2-pDNA : Lipid-Anti-Tumor-Wirkung T-Zellen erfordert, wurde geklärt, indem unbehaarte Mäuse mit i. p. MOT-Tumoren implantiert wurden; daran schloss sich das gleiche VR1110 : Lipid-Regime wie in den C3H/HeN-Mäusen mit Tumoren (DNA-Behandlung an Tagen 5, 8 und 11 nach Tumorzellenimplantation). Man beobachtete keine signifikante Anti-Tumor-Wirkung bei den mit VR1110 : Lipid behandelten unbehaarten Mäusen – ein Indiz dafür, dass T-Zellen möglicherweise für die Anti-Tumor-Wirkung erforderlich sind (Daten nicht dargestellt).
Durch Debulking von Tumoraszites verstärkte IL-2-Plasmid-DNA : Lipid-Anti-Tumor-Wirkung
Das Debulking von Tumoraszites erfolgt üblicherweise in menschlichen Eierstockkarzinom-Patienten. Eine ähnliche Vorgangsweise wurde in jenen Mäusen gewählt, die MOT-Tumoren aufwiesen und mit VR1110 : Lipid behandelt wurden. Mäuse mit MOT-Tumoren und i. p. injizierten 100 μl DNA : Lipid (die Injektionen erfolgten wie oben an Tagen 5–10 in einem DNA : Lipid-Masseverhältnis von 1 : 1) wurden am Tag 14 nach der Tumorzelleninjektion (vier Tage nach der letzten DNA : Lipid-Injektion) von Tumoraszites befreit. Die Mäuse wurden durch Einführen einer 22 G-Nadel (befestigt an einer 5 ml-Spritze) und Entnahme von 5 ml Flüssigkeit von 5 ml Tumoraszites befreit. Die Mäuse wurden mit Methoxyfluran während des Debulking-Verfahrens anästhesiert. Alle Behandlungsgruppen bestanden in diesem Experiment aus acht bis zehn Mäusen pro Gruppe.
Das Debulking von Eierstocktumor-Aszites in zuvor mit IL-2-Plasmid-DNA : Lipid behandelten Mäusen steigerte den Wirkungsgrad der Behandlung noch weiter, was zu einer deutlichen Reduktion des Tumorwachstums (p = 0,01) und einer Erhöhung der Überlebensrate führt. 44% der mit IL-2-Plasmid-DNA : Lipid behandelten und Debulking unterzogenen Mäuse waren am Tag 57 noch am Leben – im Vergleich zu nur 17% der mit Plasmidvergleich behandelten und Debulking unterzogenen Mäuse (17). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Plasmid-medüerte Gentherapie in Kombination mit herkömmlichen Verfahren wie z. B. Debulking von Tumoraszites für die zukünftige Behandlung von Eierstockkarzinom beim Menschen ein hohes Potenzial bietet.
Dosis-Responses von IL-2-pDNA : Lipid
Eine Dosis-Response-Studie wurde unternommen, um die Mindestdosis von VR-1110 : Lipid zu bestimmen, die noch zu einer signifikanten Anti-Tumor-Wirkung führen kann. V3H/HeN-Mäuse wurden mit 25, 50 oder 100 μg IL-2-pDNA : Lipid an Tagen 5, 8 und 11 nach der MOT-Tumorzelleninjektion injiziert. Eine Vergleichsgruppe von MOT-Tumor aufweisenden Mäusen wurde mit 100 μg VR1012 (komplexiert mit Lipid) injiziert. Am Tag 15 nach der Tumorzelleninjektion wiesen die mit 50 oder 100 μg mit Lipid komplexiertem VR1110 behandelten Mäuse eine signifikante Inhibition des Tumorwachstums (p = 0,002) im Vergleich zu jenen Mäusen auf, die mit VR1012 : Lipid behandelt wurden (18A). Eine signifikante Verbesserung des Überlebensprofils (p = 0,01) wurde ebenfalls für die mit 50 oder 100 μg VR1110 : Lipid behandelten Mäuse festgestellt (18B). Am Tag 25 lebte keine der mit VR1012 : Lipid behandelte Maus mehr, während die mit 50 oder 100 μg VR1110 : Lipid injizierten Mäuse eine Überlebensrate von 27 bzw. 33% besaßen. Am Tag 37 besaßen die mit 50 oder 100 μg VR1110 : Lipid behandelten Mäuse eine Überlebensrate von 20 bzw. 27%. Tumor tragende Mäuse, die mit 25 μg mit Lipid komplexiertem VR1110 behandelt wurden, unterschieden sich weder in Bezug auf Tumorvolumen noch in Bezug auf das Überlebensprofil signifikant von den Vergleichsmäusen.
Cytokinprofil von Eierstocktumor-Aszites
Da die i. p. Injektion von II-2-pDNA : Lipid in Mäuse mit i. p. MOT-Tumoren zu hohen Werten an IL-2-Expression in Aszites führt, war die Frage von Interesse, ob die IL-2-Therapie eine Cytokin-Kaskade im Tumoraszites initiiert. C3H/HeN-Mäuse wurden i. p. mit 10⁵ MOT-Zellen injiziert. An den Tagen 5, 8 und 11 nach der Tumorzellenimplantation wurden die Mäuse mit VR1110 : Lipid oder VR1012 : Lipid (1 : 1 pDNA: DMRIE Masseverhältnis) i. p. injiziert oder erhielten keine Behandlung nach der MOT-Tumorzelleninjektion. Zwei Tage nach jeder Injektion von pDNA : Lipid (Tage 7, 10 und 13 nach der Tumorzellenimplantation) wurden fünf Mäuse pro Gruppe getötet und die Tumoraszites entnommen. Es wurde das Gesamtvolumen der Aszites bestimmt. Die Aszitesproben wurden 2 Minuten lang bei 14.000 U/min zentrifugiert und anschließend die Überstände entnommen. Die Aszitesüberstände wurden auf die Konzentration der Cytokine untersucht: IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, GM-CSF, IFNγ und TNFα unter Verwendung von ELISA (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA). Die Konzentration des TGFβ im Aszites wurde mittels des TGFβ₂ Emax Immunoassay System (Promega, Madison, WI, USA) untersucht. Die Menge an Cytokin in den Tumoraszites wurde unter Heranziehung der Formel Cytokin-Konzentration in pg/ml × ml Gesamt-Aszites = pg Cytokin/Gesamt-Aszytes bestimmt.
Wie erwartet, besaßen Tumor tragende Mäuse mit i. p. injiziertem VR1110 : Lipid eine deutliche Zunahme an IL-2-Werten, und vernachlässigbare Werten wurden in unbehandelten Tumor tragenden Mäusen oder in mit VR1012 : Lipid injizierten Mäusen festgestellt (19A). Die Werte von IFNγ und GM-CSF waren in den mit VR-1110 : Lipid behandelten Mäusen deutlich erhöht (19B und 19C). Die IFNγ- und GM-CSF-Werte in diesen Mäusen nahmen an den Tagen 10 und 13 nach der Tumorzelleninjektion deutlich zu, aber nicht am Tag 7; dies könnte auf die IL-2-Sekretion zurückzuführen sein. Eine gewisse nichtspezifische Zunahme von IFNγ fand auch in den Aszites von Tumor tragenden Mäusen nach der Injektion von VR1012 statt; am Tag 13 jedoch waren die Werte von IFNγ in den mit VR1110 : Lipid behan delten Mäusen mit Tumoren 6fach höher als in den mit VR1012 behandelten Mäusen, was den Schluss zulässt, dass die Expression von IL-2 die IFNγ-Produktion hochreguliert.
Die Werte von IL-6, TNFα und IL-10 waren sowohl in der IL-2-pDNA : Lipid-Gruppe als auch in der pDNA : Lipid-Kontrollgruppe erhöht – ein Indiz dafür, dass pDNA : Lipid-Komplexe möglicherweise die Produktion dieser Cytokine in den Tumoraszites nichtspezifisch stimulieren (19D, 19E und 19F). Man stellte hinsichtlich IL-4, IL-12 oder TGFβ.keinerlei Differenz im Aszites aus irgendeiner Gruppe fest, und die Werte dieser Cytokine waren niedrig (0–300 pg/ml für IL-4 und IL12 sowie 0–2.000 pg/ml für TGFβ; Daten nicht dargestellt). Für alle bewerteten Cytokine besaßen die mit Vergleichs-pDNA ohne Lipid, IL-2-pDNA ohne Lipid oder nur mit Lipid behandelten Mäuse ähnliche Cytokinwerte wie die unbehandelten Mäuse.
Intraperitoneale Injektion von IFNα-pDNA: Lipid erhöht die Überlebensrate
C3H/HeN-Mäuse wurden i. p. mit 10⁵ MOT-Zellen injiziert, um i. p. Eierstocktumoren zu bilden. Die Mäuse erhielten dann i. p. Injektionen von 100 μg VR4111 (mFINα) oder VR1012 (Vergleich), komplexiert mit DMRIE : DOPE kationischem Lipid in einem DNA : DMRIE-Masseverhältnis von 1 : 1 in einem Gesamtvolumen von 1 ml Salzlösung. Die Mäuse erhielten die i. p. Injektionen von pDNA : Lipid an Tagen 5, 8 und 11 nach der Tumorzelleninjektion. Die Mäuse wurden drei- bis sechsmal pro Woche gewogen. 15 Mäuse waren in jeder Behandlungsgruppe enthalten.
Mäuse mit i. p. MOT-Tumoren, die mit i. p. VR4111 : Lipid behandelt waren, wiesen eine signifikante Zunahme der Überlebensrate (p < 0,006) gegenüber jenen Mäusen auf, die das Vergleichsplasmid erhielten (20B). Keine signifikante Reduktion des Tumorvolumens wurde für die mit VR4111 : Lipid behandelten Mäuse festgestellt ( 20A).
Beispiel 7
Selektive Transfektion maligner Zellen in intraperitoealem Mäusemelanom-Tumormodell
Die Anti-Tumor-Wirkung von DNA-Formulierungen mit oder ohne Lipide im i. p. Mäusemelanom-Modell wurde im vorliegenden Beispiel beurteilt.
Zelllinie und Tumormodell
B16G10-Mäuse-Melanomzellen wurden in vitro in DMEM und 10% FCS gezüchtet. 200.000 B16F10-Mäuse-Melanomzellen wurden i. p. in C57BL/6-Mäuse in 1–3 ml Salzlösung unter Verwendung einer 28 G ½-Nadel und ohne Punktieren der inneren Organe implantiert.
Herstellung von Plasmid-DNA : Lipid-Komplexen
Die aus Plasmid-DNA und kationischem Lipid bestehenden Formulierungen wurden knapp vor der Verwendung hergestellt. Es wurden gleiche Volumina von DNA und DMRIE : DOPE (1 : 1) durch Wirbeln miteinander vermischt, um eine Zielkonzentration von 0,5 mg DNA/ml, 100 μg DMRIE/ml und 0,12 mg DOPE/ml zu erzielen; siehe Parker et al., 1996; Saffran et aI, 1998. Die anderen kationischen Lipide wurden ähnlich miteinander vermischt, sodass das Masseverhältnis zwischen DNA und kationischem Lipid 5 : 1 und das Molverhältnis zwischen kationischem Lipid und DOPE 1 : 1 betrug. Das formulierte Material wurde dann mit hoher Geschwindigkeit 30 Sekunden lang gewirbelt und bei Raumtemperatur gehalten, bis die Verabreichung der Dosis erfolgte.
CAT-Assay
Tumor- oder andere Gewebe wurden entnommen, unmittelbar danach in flüssigem Stickstoff gefroren und mittels eines umkehrbaren Bohrers zu einem Pulver vermahlen; siehe Manthorpe, M., Hartikka, J., Vahlsing, H. L. und Sawdey, M., Quantification of plasmid DNA transfection in vivo, in: Gene Quantification, F. Ferre, Hg., Birkhauser, Boston, MA, USA, Drucklegung 1998. Das trockene gefrorene Pulver wurde aufgetaut und in Lysepufter extrahiert; Hochgeschwindigkeits-Überstände wurden mittels eines Zweiphasen-Trennungstests auf CAT-Aktivität untersucht, wie dies von Sankaran, L., Analytical Biochemistry 200, 180–186 (1992) beschrieben ist.
Kationische Lipide verstärken die Tumortransfektion
C57BL/6-Mäuse wurden i. p. mit 200.000 B16F10-Mäuse-Melanomzellen injiziert und sieben Tage später i. p. mit CAT-pDNA (VR1332) : DMRIE/DOPE injiziert. Zwei Tage später wurden Tumorgewebe gesammelt, extrahiert und auf CAT-Aktivität untersucht.
Wie aus Tabelle 4 ersichtlich, transfizierte DNA alleine Tumor, doch DMRIE : DOPE erhöhte die Transfektion um das 78fache (von 2.326 auf 182.052).
Tabelle 4 pg CAT/g an entnommenem Tumorgewebe (n = 4–6 Mäuse, wie angegeben); Salzlösungswerte subtrahiert
Selektive Transfektion von Tumorzellen
Normales Tier. Normale BALB/c-Mäuse ohne Tumor wurden mit 1 mg/2 ml VR1332 mit oder ohne kationisches Lipid sowie mit oder ohne das neutrale Lipid DOPE i. p. injiziert. Zwei Tage später wurden ausgewählte i. p. Gewebe (Leber, Lunge, Niere, Milz, Mesenterium) gesammelt, extrahiert und auf CAT-Aktivität untersucht.
Wie aus Tabelle 5 ersichtlich, waren normale i. p. Organe überhaupt nicht transfiziert oder transfizierten mit einer Vielzahl an kationischen Lipiden nur sehr geringfügig. Es fand geringe Transfektion von Mesenterium-Geweben und eine moderate Transfektion von einer bis fünf Milzen statt (die einzige transfizierte Milz wurde möglicherweise durch die Injektionsnadel punktiert).
Tabelle 5 Durchschnittliche pg CAT-Werte/g Tumorgewebe (Mittelwert, n = 5 Mäuse) Salzlösungs-Hintergrundwerte subtrahiert
Tumor tragendes Tier im Vergleich zu normalem Tier. C57BL/6-Mäuse wurden mit 200.000 B16F10-Mäuse-Melanomzellen i. p. injiziert und sieben Tage später mit VR-1332 mit oder ohne kationisches Lipid/DOPE ebenfalls i. p. injiziert. Zwei Tage später wurden ausgewählte i. p. Gewebe (Leber, Lunge, Niere, Milz, Mesenterium) gesammelt, extrahiert und auf CAT-Aktivität untersucht.
Wie aus Tabelle 6 ersichtlich, wurden Tumorgewebe mit pDNA (komplexiert mit kationischem LipidIDOPE) stark transfiziert. Normale i. p. Organe wurden im Vergleich zu i. p. Tumorgeweben nicht ausreichend transfiziert.
Tabelle 6 Durchschnittliche pg CAT-Werte/g Tumorgewebe (n = 5 Mäuse); Salzlösungswerte subtrahiert
Dosisreaktion
C57BL/-Mäuse wurden mit 200.000 B16F10-Mäuse-Melanomzellen i. p. injiziert und sieben Tage später mit 0,15 oder 1,5 mg VR1332 mit oder ohne kationisches Lipid/ DOPE in 3 ml Salzlösung ebenfalls i. p. injiziert. Zwei Tage später wurden Tumorgewebe gesammelt, extrahiert und auf CAT-Aktivität getestet.
Wie aus Tabelle 7 ersichtlich, transfizierte eine höhere DNA-Dosis Tumorgewebe besser als eine niedrige Dosis. DMRIE transfizierte besser als die zwei anderen untersuchten kationischen Lipide.
Tabelle 7 Durchschnittliche pg CAT-Werte/g Tumorgewebe (n = 5 Mäuse); Salzlösungswerte subtrahiert
Testen einer Vielzahl kationischer Lipide
C57BL/6-Mäuse wurden mit 200.000 B16F10-Mäuse-Melanomzellen i. p. injiziert und sieben Tage später mit 1 mg VR1332 mit oder ohne kationisches Lipid/DOPE in 3 ml Salzlösung ebenfalls i. p. injiziert. Zwei Tage später wurden Tumorgewebe gesammelt, extrahiert und auf CAT-Aktivität getestet.
Wie aus Tabelle 8 ersichtlich, erhöhten alle untersuchten kationischen Lipide das Transfektionsniveau, und DMRIE war eines der drei bevorzugten kationischen Lipide.
Tabelle 8 Durchschnittliche pg CAT-Werte/g Tumorgewebe (n = 5 Mäuse); Salzlösungswerte subtrahiert
Zusammenfassend gesagt wird der Erfolg der hierin dargestellten Ausführungsform der intrakavitären Zufuhr im Mäusemelanom-Tumormodell veranschaulicht. Nach i. p. Injektion einer Polynucleotids tritt Transfektion vor allem in Tumorgeweben auf. Normale i. p. Organe, z. B. Leber, Lunge und Niere, werden jedoch – wenn überhaupt – mit der Polynucleotid-Formulierung nur mangelhaft transfiziert.
Es ist offenkundig, dass die vorliegende Erfindung anders durchgeführt werden kann, als dies in der obigen Beschreibung und in den Beispielen dargelegt ist.
Es sind im Lichte der obigen Lehren zahlreiche Modifikationen und Variationen der Erfindung möglich, ohne vom erfindungsgemäßen Schutzumfang abzuweichen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines Polynucleotidkonstrukts, das ein für ein Cytokin oder ein aktives Fragment davon kodierendes Polynucleotid umfasst, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs oder Metastasen davon bei einem Säugetier, das diese Behandlung benötigt, worin das Polynucleotidkonstrukt in ein Nicht-Tumorgewebe des Säugetiers zu verabreichen ist und das Cytokin in vivo so exprimiert, dass das Cytokin im Blutstrom des Säugetiers in einer Menge vorhanden ist, die für die Behandlung des Krebses oder der Metastasen davon wirksam ist; worin das Polynucleotidkonstrukt nicht infektiös und nicht integrativ ist und aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (a) DNA, die mit einem Promotor operabel verbunden ist; und (b) Messenger-RNA; und worin das Polynucleotidkonstrukt frei von Ex-vivo-Zellen zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Säugetier ein Mensch ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Cytokin aus der aus IFNω, IFNa, IFNτ, IFNγ, IFNβ, IL-1, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, GM-CSF und beliebigen Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin das aktive Fragment des Cytokins aus der aus einem aktiven Fragment von IFNω, einem aktiven Fragment von IFNα, einem aktiven Fragment von IFNτ, einem aktiven Fragment von IFNγ, einem aktiven Fragment von IFNβ, einem aktiven Fragment von IL-1, einem aktiven Fragment von IL-2, einem aktiven Fragment von IL-4, einem aktiven Fragment von IL-7, einem aktiven Fragment von IL-12, einem aktiven Fragment von IL-15, einem aktiven Fragment von IL-18, einem aktiven Fragment von GM-CSF und beliebigen Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 3, worin das Cytokin aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (a) einem Interferon-ω, das die Aminosäuren 1 bis 172 von Seq.-ID Nr. 8 umfasst; (b) einem Interferon-ω, das die Aminosäuren -23 bis 172 von Seq.-ID Nr. 8 umfasst; (c) einem Interferon-α, das die Aminosäuren 1 bis 166 von Seq.-ID Nr. 10 umfasst; (d) einem Interferon-α, das die Aminosäuren -23 bis 166 von Seq.-ID Nr. 10 umfasst; (e) einem Interleukin-2, das die Aminosäuren 58 bis 105 von Seq.-ID Nr. 14 umfasst; und (f) einem Interleukin-2, das die Aminosäuren 20 bis 126 von Seq.-ID Nr. 14 umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 5, worin die DNA aus der aus VR4151 (Seq.-ID Nr. 4), VR4112 (Seq.-ID Nr. 2) und VR1103 (Seq.-ID Nr. 25) bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Polynucleotidkonstrukt operabel für ein oder mehrere weitere Proteine kodiert.
Verwendung nach Anspruch 7, worin das eine oder die mehreren weitere(n) Proteine) (ein) Cytokin(e) ist bzw. sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Polynucleotidkonstrukt eine Region umfasst, die Genexpression reguliert.
Verwendung nach Anspruch 9, worin die Genexpression regulierende Region zellspezifisch ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das Polynucleotidkonstrukt frei von Assoziation mit jeglichem Abgabevehikel zu verabreichen ist, das bewirken kann, dass das Eindringen in Zellen erleichtert wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das Polynucleotidkonstrukt als Komplex der DNA und einer oder mehrerer kationischen Verbindungen zu verabreichen ist, die aus der aus kationischen Lipiden, kationischen Peptiden, kationischen Proteinen, anderen kationischen Polymeren als Lipiden oder Peptiden und Gemischen davon bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Verwendung nach Anspruch 12, worin die eine oder die mehreren kationische(n) Verbindungen) ein oder mehrere kationische Lipide sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 12 oder 13, worin der Komplex weiters ein oder mehrere neutrale Lipide umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, worin das Massenverhältnis zwischen dem Polynucleotidkonstrukt und Lipid etwa 5 : 1 bis etwa 1 : 1 beträgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, worin das Polynucleotidkonstrukt in ein Gewebe zu verabreichen ist, das aus der aus Muskel, Haut, Gehirn, Lunge, Leber, Milz, Knochenmark, Thymusdrüse, Herz, Lymphknoten, Blut, Knochen, Knorpel, Bauchspeicheldrüse, Niere, Gallenblase, Magen, Darm, Hoden, Eierstock, Gebärmutter, Rectum, Nervensystem, Auge, Drüse und Bindegewebe bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 16, worin das Gewebe Muskel ist.
Verwendung nach Anspruch 17, worin das Muskelgewebe aus der aus Skelettmuskel, Glattmuskel oder Herzmuskel bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, worin der Krebs aus der aus Nierenzellenkarzinom, Colorektalkarzinom, Lymphom, Kaposi-Sarkom, Melanom, Prostatakrebs, Eierstockkrebs, Lungenkrebs, Leberkrebs, Kopf- und Halskrebs, Blasenkrebs, Leukämie, Brustkrebs, Nicht-Melanom-Hautkrebs, Gliom, festen kutanen Tumoren, Metastasen jeglicher davon und beliebigen Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 19, worin die Metastasen aus der aus Lungenmetastasen und Lebermetastasen bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 20 in Kombination mit einer oder mehreren zusätzlichen Krebsbehandlungen, die aus der aus chirurgischem Eingriff, Strahlentherapie, Chemotherapie, Immuntherapie und Gentherapie bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Verwendung nach Anspruch 21, worin das Polynucleotid zu einem Zeitpunkt zu verabreichen ist, der aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (a) vor dem Beginn der einen oder mehreren zusätzlichen Krebsbehandlung(en); (b) während der Durchführung der einen oder mehreren zusätzlichen Krebsbehandlung(en); (c) nach dem Ende der einen oder mehreren zusätzlichen Krebsbehandlung(en).