KR20080027259A - 생리 활성 물질 ｎｋ13650ｐ3, 그 제조법 및 용도 - Google Patents

생리 활성 물질 ｎｋ13650ｐ3, 그 제조법 및 용도 Download PDF

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아리히로 도무라
쥰코 오다나카
마사카즈 니시모토
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니폰 가야꾸 가부시끼가이샤
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Abstract

하기의 이화학적 성질을 갖는 생리 활성 물질 NK13650P3, 또는 그 약리학적으로 허용되는 염.
1) 색상 및 외관: 담황색 분말
2) 분자식: C29H37N7O15
3) 분자량: 723
4) 수소 핵 자기 공명 스펙트럼: 중수(重水) 중에, 600 MHz에서 측정한 스펙트럼이 이하의 시그널을 포함한다.
화학적 이동치(chemical shift value) δppm: 7.05(1H, s), 7.00(1H, d), 6.96(1H, d), 6.83(1H, s) 등
5) 탄소 핵 자기 공명 스펙트럼: 중수 중에, 150 MHz에서 측정한 스펙트럼이 이하의 시그널을 포함한다.
화학적 이동치 δppm: 181.5(s), 181.4(s), 179.9(s), 179.2(s), 174.5(s), 174.3(s), 171.5(s), 165.4(s) 등
6) 자외선 스펙트럼: 수용액에서 측정한 스펙트럼이 이하의 UV 흡수 밴드를 포함한다.
λmax(MeOH): 196.5 nm, 224.5 nm, 322.5 nm
7) 용해성: 물에 쉽게 녹지만, 메탄올, 아세톤, 아세트산에틸, 클로로포 름 및 디메틸술폭시드에 불용.
8) 정색(呈色) 반응: 인몰리브덴산(phosphomolybdic acid)/황산 반응과 라이돈-스미스 반응에 양성(陽性).

Description

생리 활성 물질 ＮＫ13650Ｐ3, 그 제조법 및 용도{PHYSIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCE NK13650P3, METHOD OF PRODUCING THE SAME AND USE THEREOF}
본 발명은, 생리 활성 물질 NK13650P3, 그 제조법 및 그 용도에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은, 세포 증식을 억제하고, 악성 종양에 대한 치료약 등으로서 사용되는 항암 물질로서 기대된다.
비특허문헌 1에 의하면, 항암 항생 물질로서, 안트라사이클린(예로서, 독소루비신), 악티노마이신, 안트라마이신, 마이토마이신, 블레오마이신, 네오카르지노스타틴, 크로모마이신 항생 물질이 알려져 있다.
유방암이나 전립선암은 에스트로겐이나 안드로겐 등의 호르몬에 의해서, 세포 증식이 촉진되는 호르몬 의존성의 암이다. 따라서, 이러한 암에 대하여 항(抗) 호르몬 약이 사용되지만, 호르몬 의존성 암은 이러한 약에 대하여 호르몬 저항성을 갖게 된다(비특허문헌 2).
비특허문헌 1: 일본 임상종양연구회 편, 임상종양학(CLINLCAL ONCOLOGY), 제3판, Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy, 2003년 발행, 256페이지~260페이지
비특허문헌 2: 일본 임상종양연구회 편, 임상종양학(CLINICAL ONCOLOGY) Ⅰ. Principles of oncology, 제2판, Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy, 1999년 발행, 63페이지~72페이지
종래의 항암 항생 물질은 독성이 강하므로, 만족스러운 것은 아니다. 따라서, 저항성을 일으키지 않는 새로운 화합물의 발명이 기대되었다.
또한, 호르몬 의존성의 암에 대한 새로운 약제의 발명이 요망되고 있다.
본 발명자들은, 여러 가지의 미생물의 대사(代謝) 산물에 대하여 조사한 결과, 불완전 균류(菌類)에 속하는 하나의 균주(菌株)가, 포유 동물의 암 세포에 대한 세포 증식 억제 작용을 갖는 생리 활성 물질 NK13650P3을 생산하고, 또한 NK13650P3 및 그 약리학적으로 허용되는 염이 암 세포에 대한 세포 증식 억제 작용을 갖는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 이러한 발견을 기초로 하여 집중 연구한 결과, 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본 발명은,
(1) 하기의 이화학적 성질을 갖는 생리 활성 물질 NK13650P3, 또는 그 약리학적으로 허용되는 염,
1) 색상 및 외관: 담황색 분말
2) 분자식: C29H37N7O15
3) 분자량: 723
4) 수소 핵 자기(磁氣) 공명 스펙트럼: 중수(重水) 중에, 600 MHz에서 측정한 스펙트럼이 이하와 같다.
화학적 이동치(chemical shift value) δppm: 7.05(1H, s), 7.00(1H, d), 6.96(1H, d), 6.83(1H, s), 4.43-4.48(2H, m), 4.28(1H, m), 4.15(2H, m), 3.21(2H, m), 2.58-2.78(6H, m), 2.34(1H, m), 2.18(1H, m), 1.99(1H, m), 1.88(1H, m), 1.71(1H, m), 1.63(1H, m)
5) 탄소 핵 자기 공명 스펙트럼: 중수 중에, 150 MHz에서 측정한 스펙트럼이 이하와 같다.
화학적 이동치 δppm: 181.5(s), 181.4(s), 179.9(s), 179.2(s), 174.5(s), 174.3(s), 171.5(s), 165.4(s), 159.7(s), 149.5(s), 149.2(s), 127.8(s), 126.2(d), 126.1(s), 122.0(d), 119.0(d), 117.1(d), 77.7(s), 68.8(t), 57.8(d), 55.1(d), 54.2(d), 47.4(t), 47.0(t), 43.4(t), 40.7(t), 34.2(t), 33.9(t), 25.9(t)
6) 자외선 스펙트럼: 수용액에서 측정한 스펙트럼이 이하의 UV 흡수 밴드를 포함한다.
λmax(MeOH): 196.5 nm, 224.5 nm, 322.5 nm
7) 용해성: 물에 쉽게 녹고, 메탄올, 아세톤, 아세트산에틸, 클로로포름, 디메틸술폭시드에 불용.
8) 정색(呈色) 반응: 인몰리브덴산(phosphomolybdic acid)-황산, 라이돈-스미스 시약에 양성(陽性).
(2) 청구항 1에 의한 생리 활성 물질 NK13650P3, 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 함유하는 의약,
(3) 청구항 1에 의한 생리 활성 물질 NK13650P3, 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 함유하는 항종양제,
(4) 청구항 1에 의한 생리 활성 물질 NK13650P3, 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 함유하는 호르몬 의존성 암 치료제,
(5) 페니실륨속(屬)에 속하고, 청구항 1에 의한 생리 활성 물질 NK13650P3을 생산하는 능력을 갖는 미생물을, 영양 배지(培地)에서 배양하는 단계와, 이 미생물이 배양물 중에 생리 활성 물질 NK13650P3을 생성하여 축적하게 하는 단계와, 이 생리 활성 물질 NK13650P3을 채취하는 단계를 포함하는, 생리 활성 물질 NK13650P3의 제조법,
(6) 청구항 1에 의한 생리 활성 물질 NK13650P3을 생산하는 능력을 갖는 페니실륨속의 불완전 균류,
(7) 페니실륨 sp.(Penicillium sp.) NF 13650(수탁 번호: FERM BP-10600) 또는 그 변이주(變異株)에 관한 것이다.
본 발명은 세포 증식 억제 작용을 나타내는 생리 활성 물질 NK13650P3, 또는 그 약리적으로 허용되는 염을 제공한다. 종래의 항암 항생 물질은 독성이 강하고, 만족스러운 것이 아니다. 그러나, 미생물의 대사 산물로부터 취득한 본 발명의 새로운 화합물은 악성 종양에 대한 만족할만한 치료약으로서 이용할 수 있다. 본 발명의 새로운 화합물은 특히 호르몬 의존성의 암에 대한 항종양 효과를 가지므로, 호르몬 의존성 암에 대한 새로운 치료제로서 이용할 수 있다.
도 1은 NK13650P3의 중수 중에서 측정한 600 MHz 수소 핵 자기 공명 스펙트럼.
도 2는 NK13650P3의 중수 중에서 측정한 150 MHz 탄소 핵 자기 공명 스펙트럼.
도 3은 NK13650P3의 수용액 중에서 측정한 자외선 스펙트럼.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 생리 활성 물질 NK13650P3은, 페니실륨속에 속하는 생산 균주를 배양하고, 이 균주가 그 화합물을 생성하게 하여, 이 배양물로부터 화합물을 채취함으로써 취득된다.
NK13650P3의 생산 균주의 대표적인 것으로서, 예로서, 토양으로부터 분리한 페니실륨 sp.(Penicillium sp.) NF 13650(수탁 번호: FERM BP-10600)을 들 수 있다. 이하에, 이 균주의 균학적(菌學的) 특성을 나타낸다.
1. 형태적 특징
25℃에서 계대(繼代) 배양 후 1주일 후에 관찰한 결과, 한천(寒天) 표면상 또는 한천 내에 균사(菌絲)가 형성되었다. 무색의, 격벽을 가진 균사의 형성이 관찰되었다. 분생자병(分生子柄; conidiophore)은 분기되어 있지 않거나, 또는 드물게 규칙적으로 분기되어 있었다. 분생자병의 선단부에는 원통형의 메틀레(metulae) 가 형성되었다. 이 메틀레의 선단에는 침상(針狀)의 피알라이드(phialide), 즉, 분생자 형성 세포가 형성되었다. 분생자병, 메틀레 및 피알라이드는 이륜생(二輪生)의 페니실루스(penicillus)를 형성한다. 분생자는 피알로형(phialo) 분생자로서, 피알라이드로부터 쇄상(鎖狀)으로 형성되고, 각각 표면이 평활하거나 돌기가 있는 난형(卵形) 또는 타원형의 단일 세포로 구성되었다. 장기 배양 검체로부터는 텔레오모르프(teleomorph)의 형성은 확인할 수 없었다.
2. 각종 배지에 있어서의 생육
각종 배지 내에서, 25℃에서 계대 배양 후 1주일 후의 생육 상태를 하기의 표 1에 나타낸다.
배지(培地) 콜로니(colony)의 직경(mm) 색조(色調) 표면 형상 가용성 색소
포테이토 덱스트로오스 한천(寒天) 배지 18-20 겉:암녹색 속:오렌지색~백색 벨벳(velvet) 형상 없음
2% 몰트(malt) 한천 배지 16-18 겉:칙칙한 녹색~회녹색 속:올리브 황색~오렌지색 벨벳(velvet) 형상 없음
오트밀(oatmeal) 한천 배지 18-22 겉:암녹색 속:올리브 황색~오렌지색 벨벳(velvet) 형상 없음
미우라 배지 (LCA) 16-18 칙칙한 녹색 벨벳(velvet) 형상 없음
이 균주에 대하여 관찰된 형태적 특징을 근거로 하여, Arx(1981), Barron(1968), Domsch et al.(1993a, b), 및 Kiffer and Morelet(2000)에 기재되어 있는 균주의 검색표를 이용하여, 이 균주가 속하는 속명(屬名)까지의 분류군을 추정하였다. 그 결과, 이 균주는 격벽을 가진 균사를 형성하고, 유성생식기관의 형성이 인지되지 않으므로 불완전 균류의 일종인 것으로 판단된다. 또한, 이 균주는 녹색의 콜로니(colony)를 형성하고, 빗자루 형상의 페니실루스를 형성하고, 또한 무색의 단세포성의 피알로형 분생자를 형성하는 등의 형태적 특징으로부터, 불완전 균류 중의 페니실륨속에 속하는 것이 판명되었다. 따라서, 이 균주를 페니실륨 sp.(Penicillium sp.) NF 13650이라고 명명하였다.
이 균주는, 국제 기탁 당국인 독립 행정법인 산업기술종합연구소 특허 생물 기탁 센터(Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Ibaraki, Japan(zip code; 305-8566))에, 2005년 4월 14일에 수탁 번호: FERM P-20505로서 국내 기탁되었고, 2006년 4월 27일에 수탁 번호: FERM BP-10600으로서 부다페스트 조약에 근거하여 국제 기탁되었다.
본 발명에 이용하는 페니실륨속에 속하는 균주는 다른 페니실륨속의 균주와 같이 그 특성이 변화하기 쉽다. 예로서, 자외선, 엑스선 및 시약 등을 이용하는 인공적인 변이(變異) 수단으로써 용이하게 변이시킬 수 있다. 이와 같이 취득된 어떠한 변이주라도 본 발명이 대상으로 하는 생리 활성 물질 NK13650P3의 생산 능력을 갖는 한, 모두 본 발명에 사용할 수 있다.
본 발명의 제조법에 의해서 생리 활성 물질 NK13650P3을 제조하기 위해서는, 우선 상기 균주를 불완전 균류가 이용할 수 있는 영양물을 함유하는 배지(培地)에서 호기적(好氣的)으로 배양한다. 영양원(營養源)으로서는, 종래부터 불완전 균류의 배양에 이용되고 있는 공지된 것을 본 발명에 사용할 수 있다. 예로서, 탄소원(炭素源)으로서는, 글루코오스, 글리세린, 갈락토오스, 물엿, 덱스트린, 수크로오스, 전분, 당밀 및 동·식물유를 사용할 수 있다. 또한, 질소원(窒素源)으로서는, 대두분(大豆粉), 소맥, 소맥 배아, 옥수수 침지액(浸漬液), 육류 추출물, 펩톤, 효모 추출물, 황산암모늄, 질산나트륨 및 요소를 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 필요에 따라서, 나트륨, 코발트, 염소, 황산, 인산, 및 기타 이온을 형성할 수 있는 무기염을 첨가하는 것도 효과적이다. 또한, 균주의 생육에 도움이 되고, 생리 활성 물질 NK13650P3의 생산을 촉진하는 유기물 및 무기물을 적당히 첨가할 수 있다.
적합한 배양법에는 액체 배양법, 특히, 심부(深部) 교반(攪拌) 배양법이 있다. 적절한 배양 온도는 15~37℃이다. 많은 경우, 25~30℃ 부근에서 배양을 실행한다. 생리 활성 물질 NK13650P3의 축적은, 사용하는 배지 및 배양 조건에 따라서 상이하지만, 진탕(shake) 배양, 탱크(tank) 배양 모두에서 통상 1~10일 후에 최고에 달한다. 배양물 중의 생리 활성 물질 NK13650P3의 양이 최고에 달했을 때에, 배양을 정지하고, 배양액으로부터 목적 물질을 단리(單離)한다.
생리 활성 물질 NK13650P3은, 그 특성 및 통상의 분리 수단을 적절하게 이용하여 배양액으로부터 추출하여 정제할 수 있다. 상세하게는, 배양액을 원심분리 또는 여과하여, 여과액을 미생물 세포로부터 분리한다. 여과액을 양 이온 교환 수지 DOWEX 50W×4(상품명: DOW 케미컬사 제조) 등에 흡착시키고, 암모니아수 등을 사용하여 색층 분석법으로써 분리함으로써 생리 활성 물질 NK13650P3의 획분(劃分; fraction)을 취득할 수 있다.
상기 방법 이외에, 기타의 통상적인 정제 방법, 예로서, 흡착 크로마토그래피, 겔(gel) 여과 크로마토그래피, 박층(薄層) 크로마토그래피로부터의 스크레이핑(scraping) 및 고속 액체 크로마토그래피를 적절하게 조합하거나, 또는 반복적으로 실행함으로써 생리 활성 물질 NK13650P3을 정제할 수 있다.
이와 같이 취득한 생리 활성 물질 NK13650P3의 이화학적 성질을 하기에 나타낸다.
1) 색상 및 외관: 담황색 분말
2) 분자식: C29H37N7O15
3) 분자량: 723(ESI법으로써 측정한 [M+H]+=724.24207)
4) 수소 핵 자기 공명 스펙트럼: 중수 중에, 600 MHz에서 측정한 스펙트럼을 도 1에 나타낸다. 특징적인 시그널로서 이하의 시그널이 관측된다.
화학적 이동치(chemical shift value) δppm: 7.05(1H, s), 7.00(1H, d), 6.96(1H, d), 6.83(1H, s), 4.43-4.48(2H, m), 4.28(1H, m), 4.15(2H, m), 3.21(2H, m), 2.58-2.78(6H, m), 2.34(1H, m), 2.18(1H, m), 1.99(1H, m), 1.88(1H, m), 1.71(1H, m), 1.63(1H, m)
5) 탄소 핵 자기 공명 스펙트럼: 중수 중에, 150 MHz에서 측정한 스펙트럼을 도 2에 나타낸다. 특징적인 시그널로서 이하의 시그널이 관측된다.
화학적 이동치 δppm: 181.5(s), 181.4(s), 179.9(s), 179.2(s), 174.5(s), 174.3(s), 171.5(s), 165.4(s), 159.7(s), 149.5(s), 149.2(s), 127.8(s), 126.2(d), 126.1(s), 122.0(d), 119.0(d), 117.1(d), 77.7(s), 68.8(t), 57.8(d), 55.1(d), 54.2(d), 47.4(t), 47.0(t), 43.4(t), 40.7(t), 34.2(t), 33.9(t), 25.9(t)
6) 자외선 스펙트럼: 수용액에서 측정한 스펙트럼을 도 3에 나타낸다. 특징적인 UV 흡수 밴드로서 이하의 밴드가 관측된다.
λmax(MeOH): 196.5 nm, 224.5 nm, 322.5 nm
7) 용해성: 물에 쉽게 녹고, 메탄올, 아세톤, 아세트산에틸, 클로로포름, 디메틸술폭시드에 불용.
8) 정색(呈色) 반응: 인몰리브덴산-황산, 라이돈-스미스 시약에 양성(陽性).
본 발명에 있어서, 약리학적으로 허용되는 염은, 통상 약리학적으로 섭취할 수 있는 염이면 어느 것이라도 좋고, 알칼리와의 염, 즉, 나트륨염, 칼륨염 등이 바람직하다.
의약품으로서 사용되는 생리 활성 물질 NK13650P3 또는 그것의 약리학적으로 허용되는 염의 제제 형태 및 투여 방법에 종래의 공지된 여러 가지 방법을 적용할 수 있다. 투여 방법은, 예로서, 주사, 경구(經口) 또는 직장 투여 등이 가능하다. 제제 형태는, 예로서, 주사제, 분말제, 과립제, 정제, 좌제(坐劑) 또는 캡슐제의 어느 형태라도 좋다.
제제화(製劑化)에 있어서, 생리 활성 물질 NK13650P3 또는 그 약리학적으로 허용되는 염에 악영향을 미치지 않는 한, 의약용에 사용되는 여러 가지 의약용 첨가제, 즉, 담체(擔體)나 그 밖의 조제(助劑), 예로서, 안정제, 방부제, 진통제, 유화제(乳化劑)를 필요에 따라서 사용할 수 있다. 제제(製劑)에서, 생리 활성 물질 NK13650P3 또는 그 약리학적으로 허용되는 염의 함량은 제제 형태 등에 따라서 광범위하게 변경할 수도 있다. 함량은, 일반적으로 0.01~100 중량％, 바람직하게는 0.1~70 중량％이다. 나머지 부분은, 필요에 따라서, 의약에 통상적으로 사용되는 첨가제이다.
생리 활성 물질 NK13650P3 또는 그 약리학적으로 허용되는 염의 투여량은 증상, 투여 방법 등에 따라서 상이하다. 성인의 경우 1일당 투여량은 대략 0.01~800 mg이다.
(실시예)
이하, 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
실시예 1
생리 활성 물질 NK13650P3의 발효법에 의한 생산에 대하여 설명한다.
(1) 발효
종균 배양용의 배지로서, 가용성 전분 3.0％, 글루코오스 2.0％, 글루텐 밀(gluten meal) 1.0％, 효모 추출물(Difco사제) 0.2％, 대두분(Sun Rich, 쇼오와산교사제) 1.0％, 인산2수소칼륨 0.05％, 황산마그네슘 0.05％, 염화칼륨 0.1％, 황산철 0.00011％, 황산구리 0.00064％, 염화망간 0.00015％, 황산아연 0.00079％, 염화코발트 0.0001％, 및 PRONAL 0.01％로 구성되는 배지를 사용하였다. 또한, 멸균(滅菌) 전의 배지는 pH 6.7로 조정하여 사용하였다.
500 mL 삼각 플라스크에 상기 배지 100 mL를 주입하고, 120℃에서 20분간 멸균하였다. 이 배지에 페니실륨 sp. NF13650의 동결 균주 1mL를 접종하고, 200 rpm의 회전식 진탕기(shaker)에서 30℃로 2일간 배양하였다. 이 취득한 균주를 종균으로 사용하였다.
생산 배양의 배지로서, 수크로오스 8.0％, 대두분(Sun Rich, 쇼오와산교사제) 0.5％, 글루텐 밀 1.5％, 효모 추출물(Difco사제) 0.2％, 황산마그네슘 0.05％, 염화칼륨 0.1％, 황산철 0.00011％, 황산구리 0.00064％, 염화망간 0.00015％, 황산아연 0.00079％, 염화코발트 0.0001％, 및 PRONAL 0.01％로 구성되는 배지를 사용하였다. 또한, 멸균 전의 배지는 pH 6.7로 조정하여 사용하였다. 상기 배지의 멸균 후, 별도로 멸균한 아르기닌과 아스파라긴을 각각 최종 농도 5 mg/mL가 되도록 첨가하였다.
상기 배지 50 mL를 각각 포함하는 400개의 500 mL 삼각 플라스크의 각각에, 상기 종균을 접종량이 1％가 되도록 접종하고, 7일간 배양하였다. 배양 종료 후, 배양액에 6N의 수산화나트륨을 첨가하여 pH 6.8로 조정하였다. 이어서, 배양액을 원심 분리하고, 또한 여과하여 생리 활성 물질 NK13650P3을 함유하는 21 L의 여과액을 취득하였다.
(2) 정제(精製)
이 여과액을 양 이온 교환 수지 DOWEX 50W×4(Dow Chemical사제: 수소 이온형)에 흡착시키고, 전개 용매(developing solvent)로서 2.8％의 암모니아수를 사용하여 분리(chromatograph)하였다. 취득한 획분을 농축 및 동결-건조하여, 생리 활성 물질 NK13650P3을 함유하는 암갈색의 분말 89.5 g을 취득하였다.
생리 활성 물질 NK13650P3을 함유하는 암갈색의 분말 44 g을 물에 용해하였다. 이어서, 이 용액을, 미리 물로 충전한 G-10 칼럼(column; 관)(Merck사제, 1300 mL, φ4.0×100 cm)에 채워넣은 후, 전개 용매로서 물 2.0 L를 사용하여 분리하였다. 취득한 획분 중에서, 생리 활성 물질 NK13650P3을 많이 함유하는 획분을 농축 및 동결-건조하여 38.7 g의 획분을 얻었다. 나머지 45.5 g의 동결 건조품도 물에 용해하였다. 이어서, 이 용액을, 미리 물로 충전한 G-10 칼럼(column; 관)(Merck사제, 1300 mL, φ4.0×100 cm)에 채워넣은 후, 전개 용매로서 물 2.0 L를 사용하여 분리하였다. 취득한 획분 중에서, 생리 활성 물질 NK13650P3을 많이 함유하는 획분을 농축 및 동결-건조하여 39.3 g의 암갈색 분말을 얻었다.
첫 번째 및 두 번째의 G-10 칼럼 크로마토그래피(chromatography; 색층 분석법)에서 취득한 생리 활성 물질 NK13650P3을 함유하는 동결 건조품(38.7 g 및 39.3 g)을 각각 별도로 물에 용해하였다. 이어서, 미리 건식법으로 실리카 겔(silica gel)을 충전하고, 에탄올로써 탈기(脫氣)하고, 또한 물로 세정한 600 mL 중압(中壓) 실리카 겔 칼럼(실리카 겔 60, Merck사제, φ5.0×30 cm)에 이 각각의 용액을 채워넣었다. 이것에 물 900 mL와 50％ 에탄올 수용액 900 mL를 가한 후, 전개 용매로서, 에탄올:28％ 암모니아수:물=7:1:2의 혼합 용매 3 L를 사용하여 암갈색 분말을 분리하였다. 생리 활성 물질 NK13650P3을 많이 함유하는 첫 번째 및 두 번째의 획분을 함께 농축 및 동결-건조하여 29.7 g의 암갈색 분말을 얻었다.
이어서, 생리 활성 물질 NK13650P3을 많이 함유하는 이 29.7g의 암갈색 분말을 3회로 나누어, 동일한 조건하에서 중압 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 상세하게는, 첫 번째의 정제에서는, 10.1 g의 15 mL 수용액을 역상(逆相) 칼럼(센슈과학사제, PEGASIL PREP ODS-5015-12A, φ5.0×35 cm)에 채워넣었다. 이 칼럼을 물 800 mL로 세정한 후, 이것에 4.5％ 메탄올/10 mM 아세트산암모늄 수용액 800 mL를 가하였다. 또한, 전개 용매로서, 10％ 메탄올/10 mM 아세트산암모늄 수용액 4.0 L를 사용하여 생리 활성 물질 NK13650P3을 분리하였다. 동일한 방법으로 두 번째의 정제(9.5 g/15 mL)와 세 번째의 정제(10.1 g/15 mL)를 실시하였다. 이 3회의 정제에서 용출(溶出)한 획분 중에서, 생리 활성 물질 NK13650P3을 많이 함유하는 획분을 농축함으로써 염을 함유하는 12 g의 황색 분말을 얻었다.
염을 함유하는 이 12 g의 황색 분말을 5 mL의 물에 용해하였다. 이 용액을, 미리 물을 충전한 G-10 칼럼(1300 mL, φ4.0×100 cm)에 채워넣었다. 이 칼럼을 전개한 후, 탈염(脫鹽) 처리하였다. 이 탈염된, 생리 활성 물질 NK13650P3을 많이 함유하는 획분을 농축 및 동결-건조하여 1.3 g의 황색 분말을 얻었다.
이 1.3 g의 황색 분말을 중압 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 상세하게는, 5 mL의 수용액을 역상(逆相) 칼럼(센슈과학사제, PEGASIL PREP ODS-5015-12A, φ3.5×35 cm)에 채워넣었다. 이 황색 분말을, 4.5％ 메탄올/10 mM 아세트산암모늄 수용액 1000 mL와, 10％ 메탄올/10 mM 아세트산암모늄 수용액 1000 mL의 직선 구배(linear gradient)로써 분리(chromatograph)하였다. 용출한 획분 중에서, 생리 활성 물질 NK13650P3을 많이 함유하는 획분을 농축함으로써 염을 함유하는 490 mg의 담황색 분말을 얻었다.
이 490 mg의 담황색 분말을 10 mM 아세트산암모늄 수용액에 용해하였다. 생리 활성 물질 NK13650P3을 많이 함유하는 획분을 역상 고속 액체 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 상세하게는, 역상 칼럼(센슈과학사제, PEGASIL ODS, φ30×250 mm)을 사용하고, 4.5％ 메탄올/10 mM 아세트산암모늄 수용액을 사용하여 유속 20 mL/분으로, 80분 동안 상기 분말을 분리하였다. 생리 활성 물질 NK13650P3은, 40분 내지 50분의 유지 시간에 용출되었다. 메탄올을 증류하여 제거한 후에 생리 활성 물질 NK13650P3의 획분을 농축하였다.
농축물에 물을 첨가하여 2 mL로 하였다. G -10 크로마토그래피 칼럼(630 mL, φ3×90 cm)을 사용하여 물로 전개하였다. 취득한 NK13650P3의 획분을 동결-건조하여 12 mg(담황색 분말)의 생리 활성 물질 NK13650P3을 얻었다.
생리 활성 물질 NK13650P3의 정색 반응은, 인몰리브덴산-황산과 라이돈-스미스 시약에 양성이고, 닌히드린(ninhydrin), 사카구치 반응, p-아니스알데히드, 및 염화제2철에 음성이었다.
실시예 2
생리 활성 물질 NK13650P3의 포유 동물의 암 세포에 대한 세포 증식 억제 작용의 시험에 대하여 설명한다.
* 시험예 1
세포 증식 억제 작용
호르몬 의존성 인간 전립선암 세포 LNCaP를, 25％ GIT 배지(Wako Pure Chemical Industries, Ltd제)를 첨가한 Daigo의 T 배지(Wako Pure Chemical Industries, Ltd제)에 5％ CO2하에서 37℃로 유지하였다. 또한, 호르몬 비의존성 인간 전립선암 세포 PC-3을, D-MEM 배지(Nikken Chemical Co., Ltd제)에, 5％ CO2하에서 37℃로 유지하였다. 이들 세포를, 96 웰의 플레이트에 1 웰(well)당 2000개의 농도로 파종하고, 1일간 배양한 후, 이 웰에 생리 활성 물질 NK13650P3을 첨가하였다. LNCaP 세포의 경우에는, 생리 활성 물질 NK13650P3과 동시에 최종 농도 0.1 nM의 디히드로테스토스테론을 첨가하고, 이 세포들을 6일간 처리하였다. 세포의 수는, 메틸렌 블루법(methylene blue method)으로써 평가하였다. 상기 물질 NK13650P3은 31.6 ㎍/mL 농도로써 LNCaP 세포의 47％의 증식을 억제하였다. 한편, 상기 물질 NK13650P3은 31.6 ㎍/mL 농도로써 PC3 세포의 증식을 억제하지 않았다.
* 시험예 2
세포 증식 억제 작용
인간 유방암 세포 T-47D를, 10％ GF21(Wako Pure Chemical Industries, Ltd제)을 첨가한 Daigo의 T 배지를 사용하여, 5％ CO2하에서 37℃로 유지하였다. 이들 세포를, 96 웰의 플레이트에 1 웰(well)당 2000개의 농도로 파종하고, 1일간 배양한 후, 이 웰에 생리 활성 물질 NK13650P3을 첨가하였다. 생리 활성 물질 NK13650P3과 동시에 최종 농도 0.1 nM의 β-에스트라디올을 첨가하고, 이 세포들을 6일간 처리하였다. 세포의 수는, 메틸렌 블루법으로써 평가하였다. 상기 물질 NK13650P3은 20 ㎍/mL 농도로써 T-47D 세포의 30％의 증식을 억제하였다.
이러한 시험예로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 생리 활성 물질 NK13650P3은, 포유 동물의 암 세포의 증식을 억제한다. 본 발명의 생리 활성 물질 NK13650P3은, 특히, 호르몬 의존성의 전립선암 및 유방암 세포의 증식을 억제한다.
미생물의 대사 산물로부터 취득한 본 발명의 새로운 화합물은 악성 종양에 대한 치료약으로서 이용할 수 있다. 본 발명의 새로운 화합물은 특히 호르몬 의존성의 암에 대한 항종양 효과를 가지므로, 호르몬 의존성 암에 대한 새로운 치료제로서 이용할 수 있다.

Claims (7)

  1. 하기의 이화학적 성질을 갖는 생리 활성 물질 NK13650P3, 또는 그 약리학적으로 허용되는 염.
    1) 색상 및 외관: 담황색 분말
    2) 분자식: C29H37N7O15
    3) 분자량: 723
    4) 수소 핵 자기(磁氣) 공명 스펙트럼: 중수(重水) 중에, 600 MHz에서 측정한 스펙트럼이 이하와 같다.
    화학적 이동치(chemical shift value) δppm: 7.05(1H, s), 7.00(1H, d), 6.96(1H, d), 6.83(1H, s), 4.43-4.48(2H, m), 4.28(1H, m), 4.15(2H, m), 3.21(2H, m), 2.58-2.78(6H, m), 2.34(1H, m), 2.18(1H, m), 1.99(1H, m), 1.88(1H, m), 1.71(1H, m), 1.63(1H, m)
    5) 탄소 핵 자기 공명 스펙트럼: 중수 중에, 150 MHz에서 측정한 스펙트럼이 이하와 같다.
    화학적 이동치 δppm: 181.5(s), 181.4(s), 179.9(s), 179.2(s), 174.5(s), 174.3(s), 171.5(s), 165.4(s), 159.7(s), 149.5(s), 149.2(s), 127.8(s), 126.2(d), 126.1(s), 122.0(d), 119.0(d), 117.1(d), 77.7(s), 68.8(t), 57.8(d), 55.1(d), 54.2(d), 47.4(t), 47.0(t), 43.4(t), 40.7(t), 34.2(t), 33.9(t), 25.9(t)
    6) 자외선 스펙트럼: 수용액에서 측정한 스펙트럼이 이하의 UV 흡수 밴드를 포함한다.
    λmax(MeOH): 196.5 nm, 224.5 nm, 322.5 nm
    7) 용해성: 물에 쉽게 녹고, 메탄올, 아세톤, 아세트산에틸, 클로로포름, 디메틸술폭시드에 불용.
    8) 정색(呈色) 반응: 인몰리브덴산(phosphomolybdic acid)-황산, 라이돈-스미스 시약에 양성(陽性).
  2. 제1항에 의한 생리 활성 물질 NK13650P3, 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 함유하는 의약.
  3. 제1항에 의한 생리 활성 물질 NK13650P3, 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 함유하는 항종양제.
  4. 제1항에 의한 생리 활성 물질 NK13650P3, 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 함유하는 호르몬 의존성 암 치료제.
  5. 페니실륨속(屬)에 속하고, 제1항에 의한 생리 활성 물질 NK13650P3을 생산하 는 능력을 갖는 미생물을, 영양 배지(培地)에서 배양하는 단계와, 이 미생물이 배양물 중에 생리 활성 물질 NK13650P3을 생성하여 축적하게 하는 단계와, 이 생리 활성 물질 NK13650P3을 채취하는 단계를 포함하는, 생리 활성 물질 NK13650P3의 제조법.
  6. 제1항에 의한 생리 활성 물질 NK13650P3을 생산하는 능력을 갖는 페니실륨속의 불완전 균류.
  7. 페니실륨 sp.(Penicillium sp.) NF 13650(수탁 번호: FERM BP-10600) 또는 그 변이주(變異株).
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