WO2012172271A1 - Chélatants bifonctionnels phosphonates - Google Patents

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WO2012172271A1
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integer
independently
antibody
hydrogen atom
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PCT/FR2012/051360
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Inventor
Loïc CHARBONNIERE
Câline CHRISTINE
Alexandre LECOINTRE
Katia NCHIMI NONO
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique
Universite De Strasbourg
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6558—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system
    • C07F9/65583—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system each of the hetero rings containing nitrogen as ring hetero atom
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    • A61K49/0002—General or multifunctional contrast agents, e.g. chelated agents
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    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/553—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07F9/576—Six-membered rings
    • C07F9/58—Pyridine rings

Definitions

  • the present invention relates to bifunctional compounds, complexes formed from said compounds and therapeutic or diagnostic use of said complexes.
  • metallopharmaceutical diagnostic and therapeutic agents contain a radioisotope or paramagnetic or luminescent metal, which, when introduced into a subject, is localized on a previously chosen target: organ, tissue or part of the skeleton.
  • images representing the in vivo distribution of the radioisotope, paramagnetic metal or radiopaque or luminescent can be made by various means, including single photon emission, magnetic resonance and ray emission. X, depending on the metal chosen and the substitution pattern on the metal complex.
  • the distribution and corresponding relative intensity of the radioisotopes or paramagnetic or radiopaque or luminescent metal detected not only indicate the space occupied by the targeted tissue, but may also indicate the presence of receptors, antigens, aberrations , pathological conditions, etc.
  • the agent usually contains a radioisotope and delivers a dose of radiation locally to the chosen site.
  • a range of metallopharmaceutical agents may be used.
  • these complexes are in the form of a conjugate comprising a radioactive or paramagnetic or luminescent metal, a carrier for targeting conjugated to a specific organ or site of the tissue, and a link for chemically binding the metal to the carrier.
  • Positron Emission Tomography is a non-invasive medical imaging technique used for the diagnosis of certain cancers, the monitoring of tumor progression and the efficacy of treatments.
  • the images are obtained by injection into the body of a radiotracer (radioactive molecule) emitting positrons.
  • Copper 64 Cu has a growing interest in the field of medical imaging. Indeed, the life of this positron emitting radioelement is considerably greater than that of fluorine 18 F, radio isotope most commonly used. Copper 67 Cu, due to its gamma emitting property, is of interest in therapeutic nuclear medicine by internal radiotherapy (local irradiation of the tumor in a restricted area). 64 Cu and 67 Cu for use must be incorporated into a bifunctional chelator (CBF). This dual functionality makes it possible, on the one hand, to fix the metal and, on the other hand, to create a covalent bond with a logically active macromolecule or a bio vector, capable, for example, of targeting overexpressed receptors in certain diseases, in particular cancers. .
  • CBF bifunctional chelator
  • the most developed complexing agents are acyclic chelating agents of the polyaminocarboxylate or macrocyclic type of tetraaza-, polyaminocarboxylate and polyaminophosphonate type.
  • these copper chelants have modest in vivo stability, low stability to an acid medium and undergo a reduction phenomenon which leads to the loss of the metal.
  • radiopharmaceutical agents comprising a cyclic bicarf functional cyclic chelating sarcophagine-based copper carrying carboxylic acid functions.
  • HYNIC Tc-99m chelator hydrazinonicotinamide
  • EP 0298939 discloses bifunctional ligands derived from pyridines which would be more stable than conventionally used ligands, but the chelating functions of these new ligands are still carboxylate groups.
  • the object of the present invention is therefore to provide bifunctional complexes which have improved properties compared to bifunctional complexes of the prior art, in particular a better stability.
  • the invention relates to novel compounds, their use for the preparation of complexes with metal ions, the preparation of conjugates with biological macromolecules or supports and the use of the complexes and conjugates obtained as markers, as NMR relaxation agents, for MRI imaging, for PET and SPOT, for luminescence microscopy, for as drugs.
  • A represents
  • ring comprising from 3 to 6 carbon atoms, or an aromatic ring comprising from 5 to 10 ring members, said ring and said ring optionally comprising one or more heteroatoms chosen from N, O and S, W represents
  • E chosen from the group comprising the oxygen atom, a -C ⁇ C- group, a (CH 2 ) m group , m being an integer between 0 and 5, and a -CONH- group,
  • r, s and t being each independently an integer of 0 to 5, and R 2 and R 3 each independently of one another being a hydrogen atom, a group of C4) alkyl or a hydrolyzable group,
  • Q is either a hydrogen atom or an amine protecting group or a functional group capable of forming a covalent bond with primary and secondary amines, alcohols and thiols and
  • R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom, a group (C1-C4) alkyl or a hydrolyzable group selected from the group consisting of esters and amides and J is either -CH 2 or is a ring aromatic compound comprising 5 to 10 members and optionally one or more heteroatoms selected from N, O and S,
  • R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom, a (C 1 -C 4) alkyl group or a hydrolyzable group,
  • These compounds of formula (I) are bifunctional ligands comprising both phosphonated chelating functions and a grafting function.
  • the compound terms of formula (I) and bifunctional ligands are used interchangeably.
  • ring comprising from 3 to 6 carbon atoms means any saturated carbon ring comprising a skeleton of 3, or 4 or 5, or 6 carbon atoms.
  • one or more carbon atoms may be substituted with other carbon atoms selected from nitrogen, oxygen or sulfur.
  • aromatic ring any unsaturated carbon ring comprising a skeleton of 5, or 6, or 7 or 8 or 9 or 10 carbon atoms.
  • one or more carbon atoms may be substituted with other carbon atoms selected from nitrogen, oxygen or sulfur.
  • (C 1 -C 4) alkyl group is meant a linear or branched group comprising from 1 to 4 carbon atoms selected from the group consisting of methyl, propyl, n-butyl, iso-butyl or tert-butyl.
  • hydrolyzable group means a group capable of being hydrolysed in situ to give a free OH function; by way of example, mention may be made of: (a) the ester groups -COOR in which R represents either a (C 1 -C 4) alkyl group as defined above, or an aryl group, in particular a phenyl or benzyl group, ( b) the amide groups -CONRR 'wherein R and R' each independently represent a hydrogen atom, a (C 1 -C 4) alkyl group as defined above, or a aryl group, especially a phenyl or benzyl group, (c) the ether -ROR 'groups in which R and R' each represent independently of each other, ie a (C 1 -C 4) alkyl group as defined above. above, an aryl group, especially a phenyl or benzyl group.
  • amine protecting group is used to mean the groups conventionally used, in particular the Boc, Fmoc, acyl, trifluoroacetamide, benzyl, tosyl and phthalimide groups.
  • the functional group capable of forming a covalent bond with the primary and secondary amines, the alcohols and the thiols of a bio-logically active molecule or a support will be chosen according to these different groups and this choice is within the range of skilled person.
  • this functional group and the group with which it is to react are both electrophilic groups or both nucleophilic groups, then oxidative coupling can be carried out to form the linkage (eg -SH + HS-> -SS -) or chemically convert one of the two groups into a group of the opposite type by activating for example the bifunctional coupling reagents.
  • this functional group is a nucleophilic group and the group with which it must react an electrophilic group or vice versa, these two groups can generally be reacted with each other without any prior activation.
  • this functional group may carry an activated acid function capable of forming an amide function with this amine; if the active molecule is a protein having free thiol groups, then this functional group may carry an activated acid function capable of forming a thioester function with this thiol.
  • This functional group capable of forming a covalent bond with the primary and secondary amines, alcohols and thiols can therefore be chosen from the group comprising isothiocyanato, bromoacetamido, iodoacetamido, succinimido, pyridylthio, mercapto, maleimido, carboxyl and the derived esters (such as N-hydroxy-succinimido, hydroxybenzotriazole and pentafluorophenyl), hydroxyl, aldehyde, amino, diazonium, tosyl, mesytylyl, trexyl , phosphodiester, phosphotriester.
  • isothiocyanato bromoacetamido, iodoacetamido, succinimido, pyridylthio, mercapto, maleimido, carboxyl and the derived esters (such as N-hydroxy-succinimido,
  • bio-logically active molecule is understood to mean any molecule capable of participating in a specific affinity reaction, in particular antigens, antibodies and their fragments, nucleic acids, peptides, polypeptides, hormones, lymphokines and growth factors. , albumin, cytokines, enzymes, immunogenic modulators, receptors.
  • antibodies or antibody fragments capable of reacting with the antigens associated with various pathologies, in particular those associated with diseases such as cancers (lymphomas, carcinomas, sarcomas, leukemias, myelomas or tumors of the nervous system). central), inflammatory diseases, cardiovascular diseases (thrombus, embolus, infarction, atherosclerotic plaque ...), and infectious diseases.
  • the carrier carrier of a group selected from primary and secondary amines, alcohols and thiols may be in any form known to those skilled in the art and may be administered to humans, especially in the form of polymer beads or nanoparticles of metal or semiconductor. All these supports are known to those skilled in the art and well described in the literature.
  • salts are understood to mean any salts known to those skilled in the art, in particular the pharmaceutically or biologically acceptable salts, for example salts with organic or inorganic bases, for example alkali metal salts, alkaline earth salts and ammonium salts, soluble in water or insoluble in water.
  • pharmaceutically or biologically acceptable salts for example salts with organic or inorganic bases, for example alkali metal salts, alkaline earth salts and ammonium salts, soluble in water or insoluble in water.
  • organic or inorganic bases for example alkali metal salts, alkaline earth salts and ammonium salts, soluble in water or insoluble in water.
  • alkali metal salts for example alkali metal salts, alkaline earth salts and ammonium salts
  • soluble in water or insoluble in water for example, mention may be made of sodium, calcium and ammonium salts.
  • the subject of the present invention is compounds of the following formula (I):
  • A represents
  • a ring comprising from 3 to 6 carbon atoms, or an aromatic ring comprising from 5 to 10 ring members, said ring and said ring possibly comprising one or more heteroatoms chosen from N, O and S,
  • E chosen from the group comprising the oxygen atom, a -C ⁇ C- group, a (CH 2 ) m group , m being an integer between 0 and 5, and a -CONH- group,
  • r, s and t being each independently of one another an integer of 0 to 5, and R 2 and R 3 each representing independently of one another a hydrogen atom, a (C 1 -C 4) alkyl group or a hydrolyzable group,
  • Q is either a hydrogen atom or an amine protecting group or a functional group capable of forming a covalent bond with primary and secondary amines, alcohols and thiols and
  • R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom, a group (C1-C4) alkyl or a hydrolyzable group selected from the group consisting of esters and amides and J is either -CH 2 or is an aromatic ring having 5 to 10 members and optionally one or more heteroatoms selected from N, O and S,
  • r 1, Si and t 1 are each independently an integer of 1 to 2
  • R 2 and R 3 are each independently of one another a hydrogen atom, a group (Ci -C4) alkyl or a hydrolyzable group
  • R is H or Et
  • the subject of the present invention is compounds of the following formula (I):
  • - W is as defined above with the exception of E which is selected from the group consisting of the oxygen atom, -C ⁇ C- group, and -CONH- group,
  • A represents an aromatic ring comprising from 5 to 10 ring members and optionally one or more heteroatoms chosen from N, O and S, in particular A represents a pyridine, more preferably a pyridine substituted in position. 2 (ortho position of the nitrogen) by a group X, in position 4 (in position para of the nitrogen) by a group W and in position 6 (position ortho of the nitrogen) by a group, X, Y and W being as defined in formula (I).
  • the compounds of formula (I) in which A represents a pyridine substituted in position 2 (ortho position of nitrogen) by a group X, in position 4 (in the para position of nitrogen) by a group W and at position 6 (ortho position of nitrogen) with a group Y are of formula (Ia) below:
  • E chosen from the group comprising the oxygen atom, a -C ⁇ C- group, a (CH 2 ) m group , m being an integer between 0 and 5, and a -CONH- group,
  • r, s and t being each independently of one another an integer of 0 to 5, and R 2 and R 3 each representing independently of one another a hydrogen atom, a (C 1 -C 4 ) alkyl group or a hydrolyzable group,
  • Q is either a hydrogen atom or an amine protecting group or a functional group capable of forming a covalent bond with primary and secondary amines, alcohols and thiols;
  • R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom, a group (Ci-C 4) alkyl group or a hydrolyzable group selected from the group consisting of esters and amides and J is -CH 2 or is an aromatic ring comprising from 5 to 10 ring members and optionally one or more heteroatoms selected from N, O and S,
  • r 1, Si and t 1 are each independently an integer of 1 to 2
  • R 2 and R 3 are each independently of one another a hydrogen atom, a group (Ci -C4) alkyl or a hydrolyzable group
  • the compounds of formula (I) in which A represents a pyridine substituted in position 2 (ortho position of nitrogen) by a group X, in position 4 (in the para position of nitrogen) by a group W and at position 6 (ortho position of nitrogen) with a group Y are of formula (Ia) below:
  • E selected from the group consisting of oxygen atom, -C ⁇ C- group, and -CONH- group,
  • r, s and t being each independently an integer of 0 to 5, and R 2 and R 3 each independently of one another being a hydrogen atom, a group of C4) alkyl or a hydrolyzable group,
  • Q is either a hydrogen atom or an amine protecting group or a functional group capable of forming a covalent bond with primary and secondary amines, alcohols and thiols, and
  • R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom, a group (C1-C4) alkyl or a hydrolyzable group selected from the group consisting of esters and amides and J is either -CH 2 or is an aromatic ring having 5 to 10 members and optionally one or more heteroatoms selected from N, O and S,
  • r 1, Si and t 1 are each independently an integer of 1 to 2
  • R 2 and R 3 are each independently of one another a hydrogen atom, a group (Ci -C4) alkyl or a hydrolyzable group
  • A represents an aromatic ring comprising from 5 to 10 ring members and optionally one or more heteroatoms chosen from N, O and S, in particular A represents a pyridine, more preferably a pyridine substituted in position 2 (ortho position of nitrogen) by a group X, in position 4 (in the para position of nitrogen) by a group Y and in position 6 (position ortho of nitrogen) by a group W, the groups W, X and Y being as defined in said formula (I).
  • the compounds of formula (I) in which A represents a pyridine substituted in position 2 (ortho position of nitrogen) by a group X, in position 4 (in the para position of nitrogen) by a group Y and in position 6 (ortho position of nitrogen) with a group W are of formula (Ib) below:
  • W, X and Y are as defined in formula (I) excluding compounds in which W and X are H.
  • the compounds of formula (I) in which A represents a pyridine substituted in position 2 (ortho position of nitrogen) by a group X, in position 4 (in the para position of nitrogen) by a group Y and in position 6 (ortho position of the nitrogen) by a group W are of formula (Ic) following:
  • W represents an E-G-Q group with
  • r, s and t being each independently an integer of 0 to 5, and R 2 and R 3 each independently of one another being a hydrogen atom, a group (C 1 -C 4) ) alkyl or a hydrolyzable group,
  • X is as defined in formula (I) excluding H and
  • W represents a group E-G-Q as defined in formula (I-c),
  • X represents:
  • the compounds of formula (I) are those for which W is chosen from the group comprising:
  • the compounds of formula (I) are those for which X and Y each represent, independently of one another, a group
  • the compounds of formula (I) are those in which J represents a pyrazol-1-yl group or a pyridin-2-yl group .
  • the compounds are those for which:
  • X represents a group
  • Y represents a group where J, R 2 , R 3 , u, v, w t 1 , r 1 and Si are as previously defined.
  • the compounds according to the invention can be synthesized by standard methods known to those skilled in the art from compounds available commercially or whose synthesis is described in the literature.
  • the key step in the synthesis of the compounds according to the invention is the step of selective deprotection of the phosphonic esters in the presence of an activated function. This step is carried out in the presence of trimethylsilyl bromide in a solvent such as dichloromethane or chloroform, in the presence of lutidine, followed by deprotection of the silylated esters with an alcohol, in particular methanol.
  • the subject of the invention is also a process for the preparation of compounds of formula (I) comprising a step of selective deprotection of the phosphonic esters in the presence of an activated function.
  • This step comprises contacting a compound of formula (I) bearing an activated function and at least one phosphonic ester function with trimethylsilyl bromide in a solvent such as dichloromethane or chloroform, in the presence of lutidine, followed by deprotection of the silylated esters with an alcohol, in particular methanol.
  • the compounds according to the invention have, as their central unit, a polysubstituted aromatic nucleus, in particular a polysubstituted pyridine nucleus, with polyaminophosphonate termini and a side chain containing an activated chemical function. Because of this innovative structure, these molecules are capable of selectively and strongly chelating certain metals, in particular through their phosphonate units. Compared with carboxylate groups, phosphonate groups confer a much higher stability for complexes formed with metals. This is particularly important if the intended application requires very small amounts of cations as is the case in imaging methods involving radioactive elements (PET, SPECT) or if the bifunctional chelants are to be used over long periods of time. (several days).
  • PET radioactive elements
  • SPECT radioactive elements
  • difunctional chelants commonly used do not provide sufficient stability in vivo and radioelements are released into the body (Boswell A. et al J. Med Chem 2004, 47, 1465).
  • the present invention therefore also relates to complexes comprising at least one metal ion coordinated with at least one compound of formula (I).
  • Non-radioactive metals can also be used for their paramagnetic, fluorescence, or phosphorescence properties.
  • lanthanides include lanthanides (europium, terbium, samarium, dysprosium, erbium, ytterbium, praseodymium and neodymium), iron, cobalt, nickel, copper ( 64 Cu, 67 Cu), zinc, arsenic, selenium and molybdenum.
  • the metal of the complex formed with the ligand of formula (I) is terbium.
  • the compounds according to the invention can also be grafted covalently on a biological target (proteins, antibodies, peptides) via said side chain containing the activated function.
  • the subject of the present invention is therefore ligands comprising at least one complex formed with a compound of formula (I) for which
  • W represents:
  • E chosen from the group comprising the oxygen atom, a -C ⁇ C- group, a (CH 2 ) m group , m being an integer between 0 and 5 and a -CONH- group,
  • R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom, a group (C 1 -C 4) ) alkyl or a hydrolyzable group,
  • Q is either a hydrogen atom or an amine protecting group or a functional group capable of forming a bond covalent with primary and secondary amines, alcohols and thiols,
  • a target structure selected from the group consisting of logically active organic compounds or a carrier to form a conjugate system.
  • the conjugate system consists of:
  • the ligand L1 to which an antibody is attached in particular the antibody B28.13 directed against tenascine, or
  • an antibody is bound, in particular the dreg55 antibody having a very strong affinity for L-selectin or the antibody dreg 200 mouse antibody directed against L-selectin, or the antibody PSS233, antibody anti "prostate-specifying antigen” (PSA), or antibody PSR222, anti-"prostate-specifying antigen” (PSA), or antibody EgB4, an antibody fragment consisting of a single variable domain and directed against the epidermal growth, or EgAl antibody, an antibody fragment consisting of a single variable domain and directed against epidermal growth factor, or
  • a protein is fixed, in particular L-selectin.
  • the antibody B28.13 can be obtained according to S. Wagner et al. (Early osteoarthritic changes of human femoral head cartilage subsequent to femoro-acetabular impingement "Osteoarthritis and cartilage, 2003, 11, 508).
  • the dreg55 and dreg200 antibodies can be obtained according to Man Sung Co et al. (Properties and pharmacokinetics of human-specified antibodies for L-selectin, Immunotechnology 4 (1999) 253-266).
  • the antibodies PSS233, PSR222 and the fragments EgB4 or EggAl can be obtained from THERMO FISHER SCIENTIFIC CD NIMES CEZANNE, 280 Graham Bell alley, Georges Besse Science Park, 30035 Nîmes Cedex 1 France).
  • the conjugate system consists of:
  • the ligand L1 to which an antibody is attached in particular the antibody B28.13 directed against tenascine, or
  • an antibody is fixed, in particular the fixed antibody is the dreg55 antibody having a very strong affinity for L-selectin or the antibody dreg 200 mouse antibody directed against L-selectin are fixed, or
  • a protein is fixed, in particular L-selectin.
  • the subject of the present invention is also ligands comprising at least one complex formed with a compound of formula (I) for which
  • W represents:
  • E chosen from the group comprising the oxygen atom, a -C ⁇ C- group, a (CH 2 ) m group , m being an integer between 0 and 5 and a -CONH- group,
  • R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom, a group (C 1 -C 4) ) alkyl or a hydrolyzable group,
  • Q is either a hydrogen atom or an amine protecting group or a functional group capable of forming a covalent bond with primary and secondary amines, alcohols and thiols;
  • complexes can be prepared by any technique known to those skilled in the art, in particular by an equimolar mixture of the compound of formula (I) and a water-soluble metal salt in an aqueous medium followed by isolation of the complex by precipitation or dry evaporation or chromatography.
  • the subject of the present invention is also a conjugated system comprising a bifunctional agent of formula (I) in which
  • W represents:
  • E chosen from the group comprising the oxygen atom, a -C ⁇ C- group, a (CH 2 ) m group , m being an integer between 0 and 5 and a -CONH- group,
  • R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom, a group (C 1 -C 4) ) alkyl or a hydrolyzable group,
  • Q is either a hydrogen atom or an amine protecting group or a functional group capable of forming a covalent bond with the primary and secondary amines, alcohols and thiols of a biologically logically active molecule or a carrier, and a logically active organic compound or a carrier.
  • conjugated systems may be prepared by any technique known to those skilled in the art, in particular by a coupling reaction of the bifunctional agent of formula (I) with the bio-logically active compound or the support, in a buffered aqueous medium, with a temperature between 4 and 40 ° C, followed by purification by chromatography.
  • the complex according to the invention or the conjugate system according to the invention are formed with a bifunctional ligand chosen from the group comprising L1, L2, L3 and L4 as defined above. .
  • the complexed conjugated system consists of the conjugated systems defined above complexed to a metal, in particular terbium.
  • the present invention also relates to a diagnostic agent comprising at least one compound of formula (I) according to the invention or a complex according to the invention.
  • This agent can be used in any imaging technique known to those skilled in the art, in particular in nuclear magnetic resonance (NMR), magnetic resonance imaging (MRI), X-ray radiography, and positron emission tomography ( PET or PET), in single photon emission computed tomography (SPECT or TEMP), in radiology, in luminescence spectroscopy.
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • MRI magnetic resonance imaging
  • X-ray radiography positron emission tomography
  • PET or PET positron emission tomography
  • SPECT or TEMP single photon emission computed tomography
  • radiology in luminescence spectroscopy.
  • the diagnostic agent can be used as a nuclear magnetic resonance imaging agent with the following metal ions: Eu, Yb, Gd, Dy, Tb, Ho, Er or Fe, as imaging agent X-rays with the following metal ions: Bi, Pb or Os, as imaging agent in radiology with the following metal ions: Co, Cu, Ga, Ge, Sr, Y, Te, In, Sm, Gd, Tb, Yb, Re, Zr or Ir or by luminescence spectroscopy with the following metal ions: Eu, Tb, Dy, Sm, Yb
  • the diagnostic agent may be in any pharmaceutically acceptable form prepared by any technique known to those skilled in the art, in particular by mixing an amount of complex with any known pharmaceutically acceptable additive of the skilled person.
  • the metal dose is generally from 0.0001 to 10 mmol / kg, preferably from 0.005 to 0.5 mmol / kg.
  • the dose of metal ion is generally from 0.01 to 20 mmol / kg, preferably from 0.1 to 10 mmol / kg.
  • the dose of radioactivity is 370-18500 MBq.
  • the imaging agent is generally administered parenterally, especially intravenously, but in some cases it can be administered either orally or intra- arterially.
  • the compounds of formula (I) and the complexes as defined above can be used for the detection of diseases such as lymphomas, carcinomas, sarcomas, leukemias, myelomas or tumors of the central nervous system, inflammatory diseases, cardiovascular diseases (thrombus, embolus, infarction, atherosclerotic plaque %), and infectious diseases.
  • diseases such as lymphomas, carcinomas, sarcomas, leukemias, myelomas or tumors of the central nervous system, inflammatory diseases, cardiovascular diseases (thrombus, embolus, infarction, atherosclerotic plaque ...), and infectious diseases.
  • the present invention therefore relates to a diagnostic agent as defined above for its use in the detection of diseases mentioned above.
  • the present invention also relates to a method of detecting a disease that produces or is associated with a marker or receptor, said method comprising administering to a human subject afflicted with said disease a detectable amount of a complex such as as defined above and comprising a biologically logically active molecule specific for said marker or said receptor.
  • the compounds of formula (I) and the complexes as defined above can also be used for the treatment of diseases such as lymphomas, carcinomas, sarcomas, leukemias, myelomas or tumors central nervous system, inflammatory diseases, cardiovascular diseases (thrombus, embolus, infarction, atherosclerotic plaque ...), infectious diseases.
  • the present invention therefore relates to a complex as defined above for its use in the treatment of the diseases mentioned above.
  • it may be presented in any pharmaceutical form known to those skilled in the art in association with any pharmaceutically acceptable excipient.
  • it is in the form of an injectable solution prepared by dissolving the complex in a physiologically acceptable aqueous solvent.
  • the present invention also provides a method of treating a disease that produces or is associated with a marker or receptor, said method comprising administering to a human subject afflicted with said disease a detectable amount of a complex such as as defined above and comprising a biologically logically active molecule specific for said marker or said receptor.
  • a complex such as as defined above and comprising a biologically logically active molecule specific for said marker or said receptor.
  • the present invention also relates to a kit comprising:
  • the present invention also relates to a kit comprising:
  • the present invention also relates to a kit for preparing a diagnostic agent comprising:
  • the present invention also relates to a kit comprising:
  • E chosen from the group comprising the oxygen atom, a -C ⁇ C- group, a (CH 2 ) m group , m being an integer between 0 and 5 and a -CONH- group,
  • R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom, a group of C4) alkyl or a hydrolyzable group
  • Q is either a hydrogen atom or an amine protecting group
  • R 2 and R 3 each independently represent a (C 1 -C 4) alkyl group and J is either -CH 2 or is an aromatic ring comprising from 5 to 10 members and optionally one or more heteroatoms selected from N, O and S, - or a group
  • r 1, Si and t 1 are each independently an integer of 1 to 2, and R 2 and R 3 each independently represent a (C 1 -C 4) alkyl group or a hydrolyzable group,
  • E chosen from the group comprising the oxygen atom, a -C ⁇ C- group, a (CH 2 ) m group , m being an integer between 0 and 5 and a -CONH- group,
  • R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom, a group of C4) alkyl or a hydrolyzable group
  • Q represents either a hydrogen atom or a functional group capable of forming a covalent bond with primary and secondary amines, alcohols and thiols
  • R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom and J is either -CH 2 or is an aromatic ring comprising 5 to 10 members and optionally one or more heteroatoms selected from N, O and S, - or a group
  • ri, Si and ti are each independently an integer of 1 to 2, and R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom, provided that X, W and Y are not simultaneously H.
  • FIG. 1 represents the mass spectrum of the reference Streptavidin in the mQ water obtained by MALDI-MS mass spectrometry according to Example 5.
  • Figure 2 shows the mass spectrum of ligand labeled streptavidin
  • Figure 3 shows the chromatogram obtained in HPLC showing the injection of
  • Figure 4 shows the MALDI-TOF spectrum of antibody B28.13.
  • Figure 5 shows the MALDI-TOF spectrum of labeled B28.13 antibody.
  • Figure 6 shows the fluorescence microscopy image showing the recognition of extracellular tenascin that develops around colonic tumors by the labeled B28.13 antibody.
  • Figure 7 shows the chromatogram showing the injection of 2 ⁇ g of dreg55
  • Figure 8 shows the MALDI-TOF spectrum of the dreg55 antibody.
  • Figure 9 shows the MALDI-TOF spectrum of the labeled dreg55 antibody.
  • Figure 10 shows the fluorescence assay of the labeled dreg55 antibody.
  • Figure 12 shows the excitation spectrum of the labeled dreg55 antibody.
  • Figure 13 shows the decay of the luminescence of the terbium complex.
  • Figure 14 shows the MALDI-TOF spectrum of the dreg200 antibody.
  • Figure 15 shows the MALDI-TOF spectrum of the labeled dreg200 antibody.
  • Figure 16 shows the fluorescence assay of the labeled dreg200 antibody.
  • Figure 17 shows the chromatogram showing the injection of 0.75 ⁇ g of L-selectin (injection of 20 ⁇ , a solution of L-selectin at 0.037 mg / ml).
  • Figure 18 shows the MALDI-TOF spectrum of L-selectin.
  • Figure 19 shows the overlap of the MALDI-TOF spectra of L-selectin (light gray) and labeled L-selectin (black).
  • Figure 20 shows the MALDI-TOF spectrum of antibody PSS233.
  • Figure 21 shows the MALDI-TOF spectrum of the labeled PSS233 antibody.
  • Figure 23 shows the excitation spectrum of the labeled PSS233 antibody.
  • Figure 24 shows the decay of the luminescence of the terbium complex.
  • Figure 25 shows the MALDI-TOF spectrum of the PSR222 antibody.
  • Figure 26 shows the MALDI-TOF spectrum of the labeled PSR222 antibody.
  • Figure 28 shows the excitation spectrum of the labeled PSR222 antibody.
  • Figure 29 shows the decay of the luminescence of the terbium complex.
  • Figure 30 shows the MALDI-TOF spectrum of the EgB4 antibody fragment.
  • Figure 31 shows the tricine SDS PAGE gel of the EgB4 antibody fragment and the labeled EgB4 antibody fragment.
  • Figure 32 shows the MALDI-TOF spectrum of the EgAl antibody fragment.
  • Figure 33 shows the tricine SDS-PAGE gel of the EgAl antibody fragment and the labeled EgAl antibody fragment.
  • Figure 34 shows the SDS-PAGE glycine gel of the EgAl antibody fragment and the labeled EgAl antibody fragment.
  • Li ligand was obtained by following the synthetic scheme below:
  • Diester 1 and aminoalcohol 2 were prepared, respectively, according to the methods described by Célia S. Bonnet et al., In Chem. Common. 2010, 46, 124 and by S. Machida et al. in Chem. Eur. J. 2008, 74, 1392.
  • diester 1 (3.27 g, 13.70 mmol) in 325 ml of THF are added, under argon, triphenylphosphine (7.20 g, 27.46 mmol) and aminoalcohol 2 (4.80 g). 27.52 mmol) solubilized in a little THF. DIAD (5.43 mL, 27.4 mmol) is then added dropwise by drop. The mixture is stirred at 70 ° C overnight.
  • IR cm 1 , ATR: ⁇ 3411, 3250, 2980, 1703, 1508, 1238, 1252, 1107, 1029, 784.
  • Amine 6 was prepared according to a procedure described by S. Aime et al. In Chem. Eur. J, 2000, 14, 6.
  • IR cm 1 , ATR: v 3303, 2980, 1708, 1597, 1230, 1019, 959.
  • IR cm 1 , ATR: ⁇ 2989, 1774, 1634, 1202, 1160, 1023, 975.
  • R 7 0.6; Si0 2 ; CH 2 Cl 2 / MeOH (88/12)
  • the ligand L 2 was obtained according to the following synthetic scheme:
  • the eluent used is a mixture of dichloromethane and methanol: CH 2 Cl 2 / MeOH (100/0 to 95/5). 1.2 g of compound 11 (1.26 mmol) are obtained, ie a yield of 62%.
  • the characteristics of compound 11 are as follows:
  • R 7 0.13; Si0 2 ; CH 2 Cl 2 / MeOH (95/5).
  • R 7 0.27; Si0 2 ; CH 2 Cl 2 / MeOH (90/10).
  • IR cm 1 , ATR: ⁇ 2233, 1720, 1211, 1019, 987, 795.
  • the ligand L 3 was obtained by following the synthetic scheme below:
  • IR cm 1 , ATR: ⁇ 2239, 1812, 1781, 1736, 1611, 1204, 1060, 794.
  • 2,6-3zs (bromomethyl) pyridine 18 was prepared according to a procedure described by T. Vermoden et al. In Tetrahedron, 2003, 59, 5039.
  • R 7 0.6; Si0 2 ; CH 2 Cl 2 / MeOH (90/10)
  • ester 24 400 mg, 0.527 mmol
  • dichloromethane 0.78 mL (10.54 mmol) of trifluoroacetic acid are added under argon at 0 ° C.
  • the medium then changes at room temperature overnight.
  • the solvent is evaporated, the crude product is purified on a silica column (CH 2 Cl 2 / MeOH gradient from 100/0 to 95/5).
  • the acid mass obtained is 254 mg (69%).
  • the characteristics of compound 25 are as follows:
  • the centrifugate was analyzed by MALDI-MS mass spectrometry.
  • Matrix ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid.
  • Method of deposit Dried drop.
  • the B28.13 antibody is an antibody to tenascin, an extracellular glycoprotein that develops around tumors (such as colon cancer).
  • a method for analyzing the antibody by HPLC has been developed.
  • the analyzes were carried out on an Alliance 2695 HPLC chain (Waters) equipped with a Waters 2996 UV diode array detector.
  • the separations were carried out on a Poros RI 1x150 mm (10 ⁇ ) column (Applied Biosystems).
  • the flux was set at 0.4 mL / min, the temperature of the column was maintained at 50 ° C and the gradient used was: solvent A: acidified water (0.1% TFA), solvent B: acidified acetonitrile (0, 1% TFA).
  • the gradient starts at 5% solvent B, is held for 5 minutes and then increased linearly to 85% in 25 minutes, then again increased to 95% again in one minute and maintained at 95% for 3 minutes.
  • a step of equilibration of the column in 5% of solvent B follows the elution. Elution is monitored at 210 nm ( Figure 3).
  • MALDI-TOF analyzes were performed on the antibody.
  • the antibody solution is desalted on ZipTip Cl 8 (Millipore).
  • An amount of 70 pmol of antibody is loaded and then eluted in 5 ⁇ l, H 2 O / acetonitrile / HCOOH 20/75/5 (v / v / v).
  • 0.6 ⁇ l of the sample (approximately 8 pmol) are deposited in triplicate on a MALDI MTP 348 plate (Brucker Daltonics) with 0.6 ⁇ l of sinapinic acid (at 2 mg / ml in 50% d acetonitrile).
  • Analyzes were performed in positive mode and the mass spectrometer (Autoflex, Brucker Daltonics) was calibrated on a m / z range of 20000 to 190000 with BSA. The result is shown in Figure 4.
  • the labeling experiment was carried out on 230 ⁇ g (ie 1.5 ⁇ 10 -9 mol) of the B28.13 antibody to which 0.86 mg of the solid Li ligand (30% purity) is 3.5 ⁇ 10 -7 mol. added. That means 230 equivalents of Li ligand for each antibody.
  • the pH was adjusted to 7 with PBS buffer and the reaction medium was stirred for one hour at room temperature.
  • reaction medium was then purified in order to remove the excess Li ligand by ultrafiltration on vivaspin500 modules (Sartorius) with a 30 kDa cut-off and washed several times (20 cycles) with 0.01 M Tris-HCl buffer. at pH 7.
  • the mass spectrum shows a small displacement of the [M + H] + peak to the right due to the Li ligand mass which is added to that of the antibody. At the level of the maximum, the difference is 800 Da, which corresponds to 1 Li ligand per antibody.
  • the dreg55 antibody is a monoclonal antibody with a very high affinity for L-selectin.
  • a method for analyzing the antibody by HPLC has been developed.
  • the analyzes were carried out on an Alliance 2695 HPLC chain (Waters) equipped with a Waters 2996 UV diode array detector.
  • the separations were carried out on a Poros RI 1x150 mm (10 ⁇ ) column (Applied Biosystems).
  • the flux was set at 0.4 mL / min, the temperature of the column was maintained at 50 ° C and the gradient used was as follows: solvent A: acidified water (0.1% TFA), solvent B: acidified acetonitrile ( 0.1% TFA).
  • the gradient starts at 5% of solvent B, is maintained for 5 minutes then linearly increased to 85% in 25 minutes and then increased again to 95% in one minute and maintained at 95% for 3 minutes.
  • a step of equilibration of the column in 5% of solvent B follows the elution. Elution is monitored at 210 nm ( Figure 7).
  • MALDI-TOF analyzes were performed on the antibody.
  • the antibody solution is desalted on ZipTip C18 (Millipore).
  • An amount of 70 pmol of antibody is loaded and then eluted in 5 H 2 0 / acetonitrile / HCOOH 20/75/5 (v / v / v).
  • 0.6 of the sample (approximately 8 pmol) are deposited in triplicate on a MALDI MTP 348 plate (Brucker Daltonics) with 0.6 of sinapinic acid (at 2 mg / ml in 50% of acetonitrile).
  • the analyzes were performed in positive mode ( Figure 8) and the mass spectrometer (Autoflex, Brucker
  • Daltonics was calibrated on a m / z range of 20000 to 190000 with BSA.
  • the labeling experiment was performed on 400 ⁇ g (100 ⁇ l of a 4 mg / ml solution, ie 2.7 ⁇ 10 -9 mol) of the dreg55 antibody to which 0.65 mg of solid L 2 ligand (3, 4xl0 ⁇ 8 mol of ligand L 2 containing 17% of lutidinium salt) was added, which means that 230 equivalents of ligand L 2 for each antibody.
  • the pH was adjusted to 7.3 with PBS buffer and the reaction medium was stirred for one hour at room temperature.
  • reaction medium was then purified to remove the excess L 2 ligand by ultrafiltration on vivaspin500 (Sartorius) modules with a 30 kDa cut-off and washed several times (20 cycles) with a 0.01 Tris-HCl buffer. M at pH 7.4.
  • reaction medium (11 pmol) was then deposited after desalting on ZipTip C18 on a MALDI plate as described previously (FIG. 9).
  • the mass spectrum shows a shift of the [M + H] + peak to the right due to the mass of L 2 ligand added to that of the antibody. At the maximum level, the difference is 7000 Da, which corresponds to approximately 9 L 2 ligands per antibody.
  • the measurements were performed on a Horiba Jobin Yvon spectrofluorometer using a 390 nm filter and an excitation wavelength.
  • the labeled antibody was then complexed with Tb 3+ by adding 3 equivalents of a solution of TbCl 3 at 5.35x10 -4 M in a solution of 0.01 M Tris-HCl pH 7.
  • the reaction medium was purified. again by ultrafiltration (vivaspin500, 30 kDa cut-off) and washed several times (20 cycles) with 0.01M Tris-HCl buffer pH 7 to remove excess Tb 3+ .
  • the excitation wavelength used to measure the emission spectrum was 328 nm.
  • the acquisition was made from 400 to 750 nm, the maximum emission was measured at 544 nm ( Figure 11).
  • the excitation spectrum was measured against an emission at 544 nm and acquired between 250 and 450 nm ( Figure 12).
  • the excitation spectrum shows a maximum at 328 nm.
  • the lifetime of the complex was measured using the excitation and emission wavelengths previously established ( Figure 13).
  • the curve shows a monoexponential decay of luminescence which indicates the presence of a single species that emits in solution.
  • the measured life time is 1.6 ms.
  • the dreg200 antibody is a mouse antibody directed against L-selectin. 8.1 MALDI - TOF MS Analyzes
  • the MALDI mass spectrum shows that the dreg200 antibody has a molar mass of about 150000 Da.
  • the labeling experiment was carried out on 200 ug (25 of a solution containing 8 mg / mL or l, 32xl0 "9 mol) of dreg200 antibody to which 0.27 mg of ligand L 2 solid ( ⁇ 2,58xl0 7 mol of L 2 ligand containing 17% of lutidinium salts) was added, which means 200 equivalents of L 2 ligand for each antibody
  • the pH was adjusted to 7.3 with PBS buffer and the reaction medium was maintained with stirring for one hour at room temperature.
  • the reaction medium was then purified in order to remove the excess of L 2 ligand by ultrafiltration on vivaspin500 modules with a 30 kDa cut-off and washed several times (20 cycles) with a 0.01 M Tris-HCl pH buffer. 7.
  • the MALDI spectrum shows a shift of the [M + H] + peak to the right by 8000 Da. This difference in mass corresponds to approximately 10 L 2 ligands / antibodies.
  • the labeled antibody was then complexed with the Tb 3+ by adding 2 equivalents of a solution of 3 to TBCL 7,4xl0 -5 M in Tris-HCl 0.01 M pH 7.
  • the reaction mixture was again purified by ultrafiltration (vivaspin500, 30 kDa cut-off) and washed several times (20 cycles) with 0.01M Tris-HCl buffer pH 7 to remove excess Tb 3+ .
  • a method for analyzing L-selectin by HPLC was carried out on an Alliance 2695 HPLC (Waters) equipped with a Waters 2996 diode array UV detector. The separations were performed on a Symmetry Cl 8 3.5 ⁇ column, 4.6 x 75 mm (Waters). The flux was set at 0.5 mL / min, the temperature of the column was maintained at 40 ° C and the gradient used was as follows: solvent A: acidified water (0.1% TFA), solvent B: acidified acetonitrile ( 0.1% TFA). The gradient begins at 5% solvent B, is maintained for 5 minutes then linearly increased to 85% in 25 minutes and then increased again to 95% in one minute and maintained at 95% for 3 minutes. A step of equilibration of the column in 5% of solvent B follows the elution. Elution is monitored at 210 nm ( Figure 17).
  • L-selectin to which was added a solution of L 2 ligand at 1.02 mg / mL (containing 17%) of lutidinium salts) prepared in 0.005%) HCl (pH ⁇ 3), which means L 2 ligand equivalents for each L-selectin equivalent.
  • the pH was adjusted to 7.3 with buffer PBS and the reaction medium was stirred for one hour at room temperature.
  • reaction medium was then purified to remove excess L 2 ligand on Zeba (Thermo Scientif) columns, 7 kDa cut-off (one pass).
  • Zeba Thermo Scientif
  • the columns were conditioned with 0.01M Tris-HCl buffer pH 7.
  • reaction medium was then deposited after desalting with ZipTip Cl 8 on a MALDI target as previously described (FIG. 19).
  • the MALDI spectrum shows a shift of the peak [M + H] + to the right by 2000 Da.
  • This difference in mass corresponds to approximately 3 ligands L 2 / L-selectin.
  • the labeled L-selectin sample was then complexed with Tb 3+ by adding 5 equivalents of a 10 -3 M TbCl 3 solution in 0.01 M Tris-HCl pH 7.
  • reaction medium was purified again on a Zeba column (one pass) conditioned with a 0.01 M Tris-HCl buffer at pH 7 to remove excess Tb 3+ .
  • the antibody PSS233 is an anti-PSA antibody (Prostate Specifies Antigen).
  • MALDI-TOF analysis was performed on the antibody before labeling to determine its molar mass.
  • the antibody was desalted on ZipTip C18 and then plated on a MALDI target as previously described using sinapinic acid as template ( Figure 20).
  • MALDI-MS analysis shows that the antibody PSS233 has a molar mass of 150000 Da.
  • the labeling experiment was carried out on 108 ⁇ g (7.2 ⁇ 10 -10 mol) of PSS 233 to which 0.8 mg of solid L 2 ligand (7.7 ⁇ 10 -7 mol of L 2 ligand containing 17% of lutidinium salts). was added, which means 1065 equivalents of L 2 ligand for each antibody.
  • the pH was adjusted to 7.1 with PBS buffer and the reaction medium was stirred for one hour at room temperature.
  • the reaction medium was then purified in order to remove the excess of L 2 ligand by ultrafiltration on vivaspin500 modules with a 30 kDa cut-off and washed several times (20 cycles) with a 0.01 M Tris-HCl pH buffer. 7.
  • the reaction medium was then deposited after desalting with ZipTip Cl 8 on a MALDI plate as previously described (FIG. 21).
  • the MALDI spectrum shows a shift of the peak [M + H] of 5500 Da to the right. This difference in mass corresponds to approximately 7 L 2 ligands / antibodies.
  • the labeled antibody was then complexed with Tb 3+ by adding 2.2 ⁇ 10 -8 mol of a solution of TbCl 3 in a solution of 0.01 M Tris-HCl pH 7.
  • the reaction medium was further purified. by ultrafiltration (vivaspin500, cut-off 30 kDa) and washed several times (20 cycles) with 0.01 Tris-HCl buffer pH 7 to remove excess Tb 3+ .
  • the excitation wavelength used to measure the emission spectrum was 328 nm.
  • the acquisition was from 400 to 750 nm, the maximum emission was measured at 544 nm ( Figure 22).
  • the excitation spectrum was measured against an emission at 544 nm and acquired between 250 and 450 nm (FIG. 23).
  • the excitation spectrum shows a maximum at 329 nm.
  • the curve shows a monoexponential decay of luminescence which indicates the presence of a single species that emits in solution.
  • the measured life time is 1.94 ms.
  • the PSR222 antibody is an anti-PSA antibody (Prostate Specifies Antigen). 11.1 MALDI-TOF MS analysis
  • MALDI-TOF analysis was performed on the antibody before labeling to determine its molar mass.
  • the antibody was desalted on ZipTip C18 and then plated on a MALDI target as previously described using sinapinic acid as template ( Figure 25).
  • the MALDI-MS analysis shows that the PSR222 antibody has a molar mass of 147500 Da.
  • ligand L 2 solid (l, 25xl0 ⁇ 7 mol of ligand L 2 containing 17% of lutidinium salt) was added, which means that 250 equivalents of Ligand L 2 for each antibody.
  • the pH was adjusted to 7.1 with PBS buffer and the reaction medium was stirred for one hour at room temperature.
  • the reaction medium was then purified in order to remove the excess of L 2 ligand by ultrafiltration on vivaspin500 modules with a 30 kDa cut-off and washed several times (20 cycles) with a 0.01 M Tris-HCl pH buffer. 7.
  • reaction medium was then deposited after desalting on ZipTip Cl 8 on a MALDI plate as previously described (FIG. 26).
  • the MALDI spectrum shows a shift of the [M + H] + peak of 2500 Da to the right.
  • This difference in mass corresponds to approximately 3 L 2 ligands / antibodies.
  • the labeled antibody was then complexed with Tb 3+ by adding 5.25 x 10 -9 mol of a solution of TbCl 3 in a solution of 0.01 M Tris-HCl at pH 7.
  • the reaction medium was purified from again by ultrafiltration (vivaspin500, 30 kDa cut-off) and washed several times (20 cycles) with 0.01M Tris-HCl buffer pH 7 to remove excess Tb 3+ .
  • the excitation wavelength used to measure the emission spectrum was 328 nm.
  • the acquisition was from 400 to 750 nm, the maximum emission was measured at 544 nm. ( Figure 27). 11.4.2 Excitement
  • the excitation spectrum was measured against an emission at 544 nm and acquired between 250 and 450 nm ( Figure 28).
  • the curve shows a monoexponential decay of luminescence which indicates the presence of a single species that emits in solution.
  • the measured life time is 2.17 ms.
  • EgB4 is an antibody fragment (consisting of a single variable monomeric domain of an antibody) directed against epidermal growth factor (EGF).
  • EGF epidermal growth factor
  • MALDI-TOF analysis was performed on the antibody fragment.
  • the antibody fragment solution was desalted on ZipTip Cl 8 and then 15 pmol of the sample was applied to a MALDI target using sinapinic acid as template.
  • the acquisition was performed in a positive mode over the m / z range of 4000 to 40000.
  • the mass spectrometer was calibrated using myoglobin (Figure 30).
  • MALDI analysis shows that the EgB4 antibody fragment has a molar mass of 17,200 Da.
  • the labeling was carried out on 270 ⁇ g (1.75 ⁇ 10 -8 mol) of the EgB4 antibody fragment to which 1.58 mg of solid L 2 ligand (1.33 ⁇ 10 -6 mol of L 2 ligand containing 27% of lutidinium salts ) were added, which means 85 equivalents of L 2 ligand for each antibody fragment.
  • the pH was adjusted to 7 with PBS buffer and the reaction medium was stirred for one hour at room temperature.
  • reaction medium was then purified in order to remove the excess of L 2 ligand by ultrafiltration on vivaspin500 modules with a 10 kDa cut-off and washed several times (20 cycles) with 0.01 M Tris-HCl pH buffer. 7.
  • the labeled antibody fragment was deposited on a SDS polyacrylamide tricine gel.
  • the gels were prepared according to a procedure described by H. Schagger and G. Von Jagow (Analytical Biochemistry, 1987, 166, 368). The replacement of glycine in conventional gels with tricine allows better separation of low molecular weight proteins.
  • the spacer gel described by H. Schagger and G. Von Jagow was omitted and the acrylamide concentration used for the gels was 16.5% T.
  • the sample Prior to gel deposition, the sample is diluted (with a ratio of at least 1: 4) in Laemmli buffer, the preparation of which is described by U. K. Laemmli (Nature, 1970, 277, 680).
  • the gel shows that the antibody fragment has been fully labeled and that the labeled product has a mass distribution between 19 and 25 kDa, which would correspond to a labeling level of between 2 and 10 L 2 ligands / antibody fragment.
  • the labeled antibody fragment solution was then complexed with the Tb 3+ by adding 2,35xl0 "7 mol of a solution of TBCL 3 in 0.01 M Tris-HCl pH 7, 15 equivalent of Tb 3+
  • the reaction medium was further purified by ultrafiltration (vivaspin500, 10 kDa cut-off) and washed several times (20 cycles) with 0.01M Tris-HCl pH 7 to remove excess Tb 3+ .
  • the precipitate formed after the addition of the Tb 3+ solution.
  • EgAl is an antibody fragment directed against epidermal growth factor
  • reaction medium was then purified to remove the excess L 2 ligand by ultrafiltration on vivaspin500 modules with a 10 kDa cut-off and washed several times (20 cycles) with 0.01 M Tris-HCl pH buffer. 7.
  • reaction medium was then deposited after desalting on ZipTip C18 on a MALDI target as described previously but no signal could be obtained.
  • the labeled antibody fragment was deposited on a SDS polyacrylamide tricine gel.
  • the gels were prepared as previously described and the acrylamide concentration used for the gels was 16.5% T.
  • the sample Prior to gel deposition, the sample is diluted (with a ratio of at least 1: 4) in Laemmli buffer.
  • the gel does not show a change in mass at the labeled antibody fragment. A fraction of the antibody fragment appears to have a lower mass than the unlabeled antibody fragment. No conclusions could be drawn from this gel.
  • An SDS-PAGE glycine gel was also prepared for this sample with a concentration of 15% acrylamide. Before deposition on gel, the sample is diluted (with a ratio of at least 1: 4) in a Laemmli buffer.
  • the gel shows that the antibody fragment has been completely labeled and that the labeled product has a mass distribution between 18 and 24 kDa, which corresponds to a labeling level of between 1 and 10 L 2 ligands / fragment. antibody.
  • the labeled antibody fragment solution was then complexed with Tb 3+ by adding 1 ⁇ 10 -7 mol of a solution of TbCl 3 in a solution of 0.01 M Tris-HCl pH 7, 15 equivalents of Tb. 3+
  • the reaction medium was purified again by ultrafiltration (vivaspin500, 10 kDa cut-off) and washed several times (20 cycles) with 0.01 Tris-HCl buffer at pH 7 to remove excess Tb 3+ . A precipitate formed following the addition of the Tb 3+ solution.

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Abstract

Composés de formule (I) suivante: dans laquelle A représente soit un atome d'azote, soit un cycle comprenant de 3 à 6 atomes de carbone, soit un noyau aromatique comprenant de 5 à 10 chaînons, ledit cycle et le dit noyau comprenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S, W représente une fonction de greffage et X et Y représente des fonctions chélatantes.

Description

CHELATANTS BIFONCTIO NELS PHOSPHONATES
La présente invention concerne des composés bifonctionnels, les complexes formés à partir desdits composés et l'utilisation thérapeutique ou diagnostique desdits complexes.
L'application d'agents diagnostiques et thérapeutiques métallopharmaceutiques est de plus en plus importante en recherche biologique et médicale, ainsi que dans les procédures diagnostiques et thérapeutiques. En général, ces agents contiennent un métal radio-isotope ou paramagnétique ou luminescent, qui, lors de l'introduction dans un sujet, se localise sur une cible préalablement choisie : organe, tissu ou partie du squelette. Dans le cas d'une méthode de diagnostic, des images représentant la distribution in vivo du radio-isotope, métal paramagnétique ou radio-opaques ou luminescent peuvent être faites par divers moyens, y compris les émissions de photons uniques, résonance magnétique et de rayons X, en fonction du métal choisi et le modèle de substitution sur le complexe métallique. La distribution et l'intensité relative correspondante des radio-isotopes ou du métal paramagnétique ou radio- opaque ou luminescent détecté indiquent non seulement l'espace occupé par le tissu ciblé, mais peut également indiquer la présence de récepteurs, d'antigènes, des aberrations, des conditions pathologiques, etc. Dans le cadre d'une méthode thérapeutique, l'agent contient généralement un radio-isotope et délivre une dose de rayonnement localement au site choisi. Selon l'organe ou le tissu cible d'intérêt et selon qu'on est dans le cadre d'un diagnostic ou d'un traitement thérapeutique, une gamme d'agents métallopharmaceutiques peuvent être utilisés. En général ces complexes se présentent sous la forme d'un conjugué comprenant un métal radioactif ou paramagnétique ou luminescent, un agent de support pour le ciblage conjugué à un organe ou un site spécifique du tissu, et un lien pour lier chimiquement le métal au transporteur.
La tomographie par émission de positon (TEP) est une technique d'imagerie médicale non invasive utilisée pour le diagnostic de certains cancers, le suivi de l'évolution des tumeurs et l'efficacité des traitements. Les images sont obtenues par injection dans l'organisme d'un radiotraceur (molécule radioactive) émetteurs de positons.
Le cuivre 64Cu présente un intérêt croissant dans le domaine de l'imagerie médicale. En effet, la durée de vie de ce radioélément émetteur de positons est considérablement supérieure à celle du fluor 18F, radio isotope le plus couramment utilisé. Le cuivre 67Cu, du fait de sa propriété émettrice gamma, présente un intérêt en médecine nucléaire thérapeutique par radiothérapie interne (irradiation locale de la tumeur dans un périmètre restreint). Le 64Cu et le 67Cu pour être utilisés doivent être incorporés dans un chélatant bifonctionnel (CBF). Cette double fonctionnalité permet d'une part de fixer le métal, et d'autre part, de créer une liaison covalente avec une macromolécule ou un vecteur bio logiquement actifs, capable par exemple de cibler les récepteurs surexprimés dans certaines maladies, en particulier les cancers.
Les complexants les plus développés sont des chélatants acycliques de type polyaminocarboxylate ou macrocycliques de type tétraaza-, polyaminocarboxylate et polyaminophosphonate. Cependant, ces chélatants du cuivre présentent une modeste stabilité in vivo, une faible stabilité vis-à-vis d'un milieu acide et subissent un phénomène de réduction qui conduit à la perte du métal.
Ainsi Smith et al. {Journal oflnorganic Biochemistry, (2004), 98, 1874-1901) font une revue de CBF et de leur utilisation pour le radiomarquage avec 64Cu et le 67Cu. Les CBF cités sont soit des macrocycles polyaminocarboxyliques ou polyaminophosphonates, soit des polyaminocarboxylates ouverts. La stabilité thermodynamique de ces derniers est nettement moins bonne que celles des macrocycles.
Récemment il a été décrit dans la demande de brevet US 2010019627 des agents radiopharmaceutiques comprenant un agent bifonctionnels macro cyclique chélatants du cuivre à base de sarcophagine porteuse de fonctions acides carboxyliques.
Mezzaros et al. (Inorganica Chimica Acta, (2010), 363, 1059-1069) décrivent des CBF à base d'hydrazinonicotinamide (HYNIC) chelateur de Tc-99m. HYNIC, utilisé sous forme d'un ester activé, notamment sous forme d'un dérivé N-hydrosuccinimide, se fixe sur les bio molécules par une liaison amide formée entre la fonction ester activé et les fonctions aminés de ladite biomolécule. Toutefois pour la coordination avec le métal il est nécessaire d'utiliser un co-ligand additionnel qui rend incertaine la structure finale du complexe, donc son utilisation.
Aussi existe-il un besoin de disposer de ligands bifonctionnels qui permettent d'obtenir des complexes stables et évitent le relargage des métaux dans l'organisme.
La demande EP 0298939 décrit des ligands bifonctionnels dérivés de pyridines qui seraient plus stables que les ligands classiquement utilisés, mais les fonctions chélatantes de ces nouveaux ligands sont toujours des groupes carboxylates.
Or les inventeurs ont montré que des ligands mono fonctionnels basés soit sur un motif 2,6- bis[(N,N-bis(methylene phosphonic acid)aminomethyl]pyridine, soit sur un motif bispyrazolylpyridyl forment des complexes très stables avec les cations métalliques et notamment beaucoup plus stables que leurs homologues carboxylés (Abada S. et al, Dalton Trans (2010), 39, 9055-9062 et Nchnimi Nono et al. Inorganic Chemistry, 2011, 50, n°5, 1689-1697).
Le but de la présente invention est donc de proposer des complexes bifonctionnels qui présentent des propriétés améliorées par rapport aux complexes bifonctionnels de l'art antérieur, notamment une meilleure stabilité. C'est pourquoi l'invention a pour objet de nouveaux composés, leur utilisation pour la préparation de complexes avec des ions métalliques, la préparation de conjugués avec des macro molécules biologiques ou des supports ainsi que l'utilisation des complexes et des conjugués obtenus comme marqueurs, comme agents de relaxation pour la RMN, pour l'imagerie IRM, pour la tomographie par émission de positrons (PET) et la tomographie à émission monophotonique (TEMP), pour la microscopie de luminescence, pour les analyses fluoro-immunolgiques ainsi que comme médicaments.
La présente invention a donc pour objet des composés de formule (I) suivante :
Figure imgf000004_0001
dans laquelle
A représente
- soit un atome d'azote,
- soit un cycle comprenant de 3 à 6 atomes de carbone, soit un noyau aromatique comprenant de 5 à 10 chaînons, ledit cycle et le dit noyau comprenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S, W représente
- soit un atome de brome, soit un atome d'iode,
- soit un groupe E-G-Q avec
* E choisi dans le groupe comprenant l'atome d'oxygène, un groupe -C≡C-, un groupe (CH2)m, m étant un nombre entier compris entre 0 et 5, et un groupe -CONH-,
* G est choisi dans le groupe comprenant
i) -(CH2)0, o étant un nombre entier compris entre 0 et 5, ii) -(CH2)n-NH-, n étant un nombre entier compris entre 0 et 5, iii) -(CH2)p-CO-NH-(CH2)q-NH-, p et q étant des nombres entiers compris entre 0 et 5, et
iv)
Figure imgf000005_0002
r, s et t étant chacun indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 0 et 5, et R2 et R3 représentant chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe (Ci-C4)alkyle ou un groupe hydrolysable,
* Q représente soit un atome d'hydrogène, soit un groupe protecteur d' aminé, soit un groupe fonctionnel capable de former une liaison covalente avec les aminés primaires et secondaires, les alcools et les thiols et
X et Y représentent indépendamment l'un de l'autre,
- soit un atome d'hydrogène,
- soit un groupe
Figure imgf000005_0001
où u est un entier égal à 0 ou 1 , v et w, identiques ou différents sont des entiers égaux à 1 ou 2, R2 et R3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe (Ci-C4)alkyle ou un groupe hydrolysable choisi dans le groupe comprenant les esters et les amides et J est soit -CH2, soit est un noyau aromatique comprenant de 5 à 10 chaînons et éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S,
- soit un groupe
Figure imgf000006_0001
où ri, Si et ti sont chacun indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 1 et
2, et R2 et R3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe (Ci-C4)alkyle ou un groupe hydrolysable,
à condition que X, W et Y ne soient pas simultanément H,
et leur sels.
Ces composés de formule (I) sont des ligands bifonctionnels comprenant à la fois des fonctions chélatante phosphonatées et une fonction de greffage. Les termes composés de formule (I) et ligands bifonctionnels sont employés indifféremment.
Au sens de la présente invention, on entend par cycle comprenant de 3 à 6 atomes de carbone, tout cycle carboné saturé comprenant un squelette de 3, ou 4 ou 5, ou 6 atomes de carbones. Dans ledit cycle, un ou plusieurs atomes de carbones peuvent être substitués par d'autres atomes différents du carbone, choisis parmi les atomes d'azote, d'oxygène ou de soufre. A titre d'exemple on peut citer les groupes cyclopropyle, cyclobutyle, cyclopentyle, cyclohexyle, oxirane, aziridine, tétrahydrothiophène, tétrahydrofurane, pipéridine, dioxane, pyrrolidine, morpholine et oxathiolane.
On entend par noyau aromatique tout cycle carboné insaturé comprenant un squelette de 5, ou 6, ou 7 ou 8 ou 9 ou 10 atomes de carbones. Dans ledit cycle, un ou plusieurs atomes de carbones peuvent être substitués par d'autres atomes différents du carbone, choisis parmi les atomes d'azote, d'oxygène ou de soufre. A titre d'exemple on peut citer, le phényle, le benzyle, le naphtyle, le pyrane, le pyrole, le thiophène, le furane, la pyridine, la pyrimidine, la pyrazine, la triazine, Pimidazole, le thiazole, l'oxazole, la purine, le pyrazole, le triazole, le tétrazole, le thiadiazole, et le benzothiazole. On entend par groupe (Ci-C4)alkyle un groupe linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 4 atomes de carbone choisi dans le groupe comprenant les groupes méthyle, propyle, n-butyle, iso-butyle ou tert-butyle.
On entend par groupe hydrolysable, un groupe susceptible d'être hydrolysé in situ pour donner une fonction OH libre ; on peut citer à titre d'exemple : (a) les groupes ester -COOR dans lequel R représente soit un groupe (Ci-C4)alkyle tel que défini ci- dessus, soit un groupe aryle, notamment un groupe phényle ou benzyle, (b) les groupes amides -CONRR' dans lequel R et R' représentent chacun indépendamment l'un de l'autre, soit un atome d'hydrogène, soit un groupe (Ci-C4)alkyle tel que défini ci-dessus, soit un groupe aryle, notamment un groupe phényle ou benzyle, (c) les groupes éther -R-O-R' dans lequel R et R' représentent chacun indépendamment l'un de l'autre, soit un groupe (Ci-C4)alkyle tel que défini ci-dessus, soit un groupe aryle, notamment un groupe phényle ou benzyle.
On entend par groupe protecteur d'amine, les groupes classiquement utilisés notamment les groupes Boc, Fmoc, acyle, trifluoroacétamide, benzyle, tosyle et phthalimide.
Le groupe fonctionnel capable de former une liaison covalente avec les aminés primaires et secondaires, les alcools et les thiols d'une molécule bio logiquement active ou d'un support sera choisi en fonction de ces différents groupes et ce choix est à la portée de l'homme du métier. Ainsi si ce groupe fonctionnel et le groupe avec lequel il doit réagir sont tous les deux des groupes électrophiles ou tous les deux des groupes nucléophiles, alors on peut réaliser un couplage oxydant pour former la liaison (par exemple-SH + HS— >-SS-) ou convertir chimiquement un des deux groupes en un groupe de type opposé en activant par exemple les réactifs de couplage bifonctionnels. Si ce groupe fonctionnel est un groupe nucléophile et le groupe avec lequel il doit réagir un groupe électrophile ou vice versa, ces deux groupes peuvent généralement être mis à réagir l'un avec l'autre sans aucune activation préalable. Ainsi si la molécule active est une protéine présentant des groupes aminés libres, alors ce groupe fonctionnel pourra porter une fonction acide activée apte à former une fonction amide avec cette aminé ; si la molécule active est une protéine présentant des groupes thiol libres, alors ce groupe fonctionnel pourra porter une fonction acide activée apte à former une fonction thioester avec ce thiol. Ce groupe fonctionnel capable de former une liaison covalente avec les aminés primaires et secondaires, les alcools et les thiols peut donc être choisi dans le groupe comprenant les groupes isothiocyanato, bromoacetamido, iodoacetamido, succinimido, pyridylthio, mercapto, maléimido, carboxyle et les esters dérivés (comme les groupes N-hydroxy-succinimido, hydroxybenzotriazole et pentafluorophényle), hydroxyle, aldéhyde, amino, diazonium, tosyle, mésytylyle, trexyle, phosphodiester, phosphotriester.
On entend par molécule bio logiquement active toute molécule capable de participer à une réaction d'affinité spécifique, notamment les antigènes, les anticorps et leurs fragments, les acides nucléiques, les peptides, les polypeptides, les hormones, les lymphokines, les facteurs de croissance, l'albumine, les cytokines, les enzymes, les modulateurs immunogènes, les récepteurs. A titre d'exemple on peut citer les anticorps ou fragments d'anticorps susceptibles de réagir avec les antigènes associés à différentes pathologies, en particulier ceux associés aux maladies comme les cancers (lymphomes, carcinomes, sarcomes, leucémies, myélomes ou tumeurs du système nerveux central), les maladies inflammatoires, les maladies cardiovasculaires (thrombus, embolus, infarctus, plaque athéroscléreuse...), et les maladies infectieuses.
Conformément à l'invention, le support porteur d'un groupe choisi parmi les aminés primaires et secondaires, les alcools et les thiols peut se présenter sous toute forme connue de l'homme du métier et susceptible d'être administrée à l'homme, notamment sous forme de billes de polymères ou de nanoparticules de métal ou de semiconducteur. Tous ces supports sont connus de l'homme du métier et bien décrit dans la littérature.
Conformément à l'invention, on entend par sels, tous sels connus de l'homme du métier, notamment les sels pharmaceutiquement ou bio logiquement acceptables comme par exemple les sels avec des bases organiques ou inorganiques comme par exemple les sels de métaux alcalins, les sels alcalino terreux et les sels d'ammonium, solubles dans l'eau ou insolubles dans l'eau. On peut citer à titre d'exemple les sels de sodium, de calcium et d'ammonium.
Dans un mode de réalisation avantageux, la présente invention a pour objet des composés de formule (I) suivante :
Figure imgf000009_0002
dans laquelle
A représente
- soit un atome d'azote,
- soit un cycle comprenant de 3 à 6 atomes de carbone, soit un noyau aromatique comprenant de 5 à 10 chaînons, ledit cycle et le dit noyau comprenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S,
W représente
- soit un atome de brome, soit un atome d'iode,
- soit un groupe E-G-Q avec
* E choisi dans le groupe comprenant l'atome d'oxygène, un groupe -C≡C-, un groupe (CH2)m, m étant un nombre entier compris entre 0 et 5, et un groupe -CONH-,
* G est choisi dans le groupe comprenant
i) -(CH2)0, o étant un nombre entier compris entre 0 et 5, ii) -(CH2)n-NH-, n étant un nombre entier compris entre 0 et 5, iii) -(CH2)p-CO-NH-(CH2)q-NH-, p et q étant des nombres entiers compris entre 0 et 5, et
iv)
Figure imgf000009_0001
r, s et t étant chacun indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 0 et 5, et R2 et R3 représentant chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe (Ci-C4)alkyle ou un groupe hydrolysable,
* Q représente soit un atome d'hydrogène, soit un groupe protecteur d' aminé, soit un groupe fonctionnel capable de former une liaison covalente avec les aminés primaires et secondaires, les alcools et les thiols et
X et Y représentent indépendamment l'un de l'autre,
- soit un atome d'hydrogène,
- soit un groupe
Figure imgf000010_0001
où u est un entier égal à 0 ou 1 , v et w, identiques ou différents sont des entiers égaux à 1 ou 2, R2 et R3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe (Ci-C4)alkyle ou un groupe hydrolysable choisi dans le groupe comprenant les esters et les amides et J est soit -CH2, soit est un noyau aromatique comprenant de 5 à 10 chaînons et éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S,
- soit un groupe
Figure imgf000010_0002
où ri, Si et ti sont chacun indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 1 et 2, et R2 et R3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe (Ci-C4)alkyle ou un groupe hydrolysable,
à condition que :
- X et Y, ou - X, W et Y,
ne soient pas simultanément H,
et à l'exclusion des composés de formule suivante:
Figure imgf000011_0001
dans laquelle R représente H ou Et,
et leurs sels.
Dans un mode de réalisation avantageux, la présente invention a pour objet des composés de formule (I) suivante :
Figure imgf000011_0002
dans laquelle
- A est tel que défini ci-dessus,
- W est tel que défini ci-dessus à l'exception de E qui est choisi dans le groupe comprenant l'atome d'oxygène, un groupe -C≡C-, et un groupe -CONH-,
- X et Y sont tels que définis ci-dessus, à l'exception qu'ils ne peuvent représenter
H simultanément
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, A représente un noyau aromatique comprenant de 5 à 10 chaînons et éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S, en particulier A représente une pyridine, plus avantageusement une pyridine substituée en position 2 (position ortho de l'azote) par un groupe X, en position 4 (en position para de l'azote) par un groupe W et en position 6 (position ortho de l'azote) par un groupe , X, Y et W étant tels que définis dans la formule (I). Dans un mode de réalisation avantageux, les composés de formule (I) dans lesquels A représente une pyridine substituée en position 2 (position ortho de l'azote) par un groupe X, en position 4 (en position para de l'azote) par un groupe W et en position 6 (position ortho de l'azote) par un groupe Y sont de formule (I-a) suivante :
Figure imgf000012_0001
dans laquelle :
W représente
- soit un atome de brome, soit un atome d'iode,
- soit un groupe E-G-Q avec
* E choisi dans le groupe comprenant l'atome d'oxygène, un groupe -C≡C-, un groupe (CH2)m, m étant un nombre entier compris entre 0 et 5, et un groupe -CONH-,
* G est choisi dans le groupe comprenant
i) -(CH2)0, o étant un nombre entier compris entre 0 et 5, ii) -(CH2)n-NH-, n étant un nombre entier compris entre 0 et 5, iii) -(CH2)p-CO-NH-(CH2)q-NH-, p et q étant des nombres entiers compris entre 0 et 5, et
iv)
Figure imgf000012_0002
r, s et t étant chacun indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 0 et 5, et R2 et R3 représentant chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe (Ci-C4)alkyle ou un groupe hydrolysable,
* Q représente soit un atome d'hydrogène, soit un groupe protecteur d' aminé, soit un groupe fonctionnel capable de former une liaison covalente avec les aminés primaires et secondaires, les alcools et les thiols,
à l'exclusion des composés dans lesquels W représente H, et
X et Y représentent indépendamment l'un de l'autre,
- soit un atome d'hydrogène,
- soit un groupe
Figure imgf000013_0001
où u est un entier égal à 0 ou 1 , v et w, identiques ou différents sont des entiers égaux à 1 ou 2, R2 et R3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe (Ci-C4)alkyle ou un groupe hydrolysable choisi dans le groupe comprenant les esters et les amides et J est soit -CH2, soit est un noyau aromatique comprenant de 5 à 10 chaînons et éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S,
- soit un groupe
Figure imgf000013_0002
où ri, Si et ti sont chacun indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 1 et 2, et R2 et R3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe (Ci-C4)alkyle ou un groupe hydrolysable,
à condition que X et Y ne soient pas simultanément H,
Dans un mode de réalisation avantageux, les composés de formule (I) dans lesquels A représente une pyridine substituée en position 2 (position ortho de l'azote) par un groupe X, en position 4 (en position para de l'azote) par un groupe W et en position 6 (position ortho de l'azote) par un groupe Y sont de formule (I-a) suivante :
Figure imgf000014_0001
dans laquelle :
W représente
- soit un atome de brome, soit un atome d'iode,
- soit un groupe E-G-Q avec
* E choisi dans le groupe comprenant l'atome d'oxygène, un groupe -C≡C-, et un groupe -CONH-,
* G est choisi dans le groupe comprenant
i) -(CH2)0, o étant un nombre entier compris entre 0 et 5, ii) -(CH2)n-NH-, n étant un nombre entier compris entre 0 et 5, iii) -(CH2)p-CO-NH-(CH2)q-NH-, p et q étant des nombres entiers compris entre 0 et 5, et
iv)
Figure imgf000014_0002
r, s et t étant chacun indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 0 et 5, et R2 et R3 représentant chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe (Ci-C4)alkyle ou un groupe hydrolysable,
* Q représente soit un atome d'hydrogène, soit un groupe protecteur d' aminé, soit un groupe fonctionnel capable de former une liaison covalente avec les aminés primaires et secondaires, les alcools et les thiols, et
X et Y représentent indépendamment l'un de l'autre,
- soit un atome d'hydrogène,
- soit un groupe
Figure imgf000015_0001
où u est un entier égal à 0 ou 1 , v et w, identiques ou différents sont des entiers égaux à 1 ou 2, R2 et R3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe (Ci-C4)alkyle ou un groupe hydrolysable choisi dans le groupe comprenant les esters et les amides et J est soit -CH2, soit est un noyau aromatique comprenant de 5 à 10 chaînons et éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S,
- soit un groupe
Figure imgf000015_0002
où ri, Si et ti sont chacun indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 1 et 2, et R2 et R3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe (Ci-C4)alkyle ou un groupe hydrolysable,
à condition que X et Y ne soient pas simultanément H,
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, dans la formule (I), A représente un noyau aromatique comprenant de 5 à 10 chaînons et éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S, en particulier A représente une pyridine, plus avantageusement une pyridine substituée en position 2 (position ortho de l'azote) par un groupe X, en position 4 (en position para de l'azote) par un groupe Y et en position 6 (position ortho de l'azote) par un groupe W, les groupes W, X et Y étant tels que définis dans ladite formule (I).
Dans un mode de réalisation avantageux, les composés de formule (I) dans lesquels A représente une pyridine substituée en position 2 (position ortho de l'azote) par un groupe X, en position 4 (en position para de l'azote) par un groupe Y et en position 6 (position ortho de l'azote) par un groupe W sont de formule (I-b) suivante :
Figure imgf000016_0001
dans laquelle :
W, X et Y sont tels que définis dans la formule (I) à l'exclusion des composés dans lesquels W et X représentent H.
Dans un mode de réalisation avantageux, les composés de formule (I) dans lesquels A représente une pyridine substituée en position 2 (position ortho de l'azote) par un groupe X, en position 4 (en position para de l'azote) par un groupe Y et en position 6 (position ortho de l'azote) par un groupe W sont de formule (I-c) suivante :
Figure imgf000016_0002
dans laquelle :
W représente un groupe E-G-Q avec
* E représentant un groupe (CH2)m, m étant un nombre entier compris entre 0 et 5
* G représentant dans le groupe comprenant
i)
Figure imgf000017_0002
r, s et t étant chacun indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 0 et 5, et R2 et R3 représentant chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe (Ci-C4)alkyle ou un groupe hydrolysable,
* Q représentant soit un atome d'hydrogène, soit un groupe protecteur d' aminé, soit un groupe fonctionnel capable de former une liaison covalente avec les aminés primaires et secondaires, les alcools et les thiols,
à l'exclusion des composés dans lesquels W représente H, et
X est tel que défini dans la formule (I) à l'exclusion de H et
Y représente H,
Dans un mode de réalisation avantageux, dans les composés de formule (I-c), W représente un groupe E-G-Q tel que défini dans la formule (I-c),
X représente :
Figure imgf000017_0001
et Y représente H. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les composés de formule (I) sont ceux pour lesquels W est choisi dans le groupe comprenant :
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000019_0001
Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, les composés de formule (I) sont ceux pour lesquels X et Y représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un groupe
Figure imgf000019_0002
où J, R2, R3, u, v et w sont tels que définis précédemment.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, les composés de formule (I) sont ceux dans lesquels J représente un groupe pyrazol-1- yle ou un groupe pyridin-2-yle'
Dans un mode de réalisation encore plus avantageux de l'invention, les composés sont ceux pour lesquels :
X représente un groupe
Figure imgf000019_0003
et Y représente un groupe
Figure imgf000020_0001
où J, R2, R3, u, v, w ti, ri et Si sont tels que définis précédemment.
Des exemples de composés conformes à l'invention répondent aux formules suivantes :
Figure imgf000020_0002
Ll
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
Composé 17
Les composés selon l'invention peuvent être synthétisés par des méthodes classiques connues de l'homme du métier à partir de composés disponibles commercialement ou dont la synthèse est décrite dans la littérature.
L'étape-clé de la synthèse des composés selon l'invention est l'étape de déprotection sélective des esters phosphoniques en présence d'une fonction activée. Cette étape est réalisée en présence de bromure de triméthylsilyle dans un solvant tel que le dichlorométhane ou le chloroforme, en présence de lutidine, suivie d'une déprotection des esters silylés par un alcool, en particulier du méthanol.
Ainsi l'invention a-t-elle également pour objet un procédé de préparation des composés de formule (I) comprenant une étape de déprotection sélective des esters phosphoniques en présence d'une fonction activée. Cette étape comprend la mise en contact d'un composé de formule (I) portant une fonction activée et au moins une fonction ester phosphonique avec du bromure de triméthylsilyle dans un solvant tel que le dichlorométhane ou le chloroforme, en présence de lutidine, suivie d'une déprotection des esters silylés par un alcool, en particulier du méthanol. Les composés selon l'invention possèdent comme motif central un noyau aromatique polysubstitué, notamment un noyau pyridine polysubstitué, avec des terminaisons polyaminophosphonates et une chaîne latérale contenant une fonction chimique activée. De part cette structure innovante, ces molécules sont susceptibles de chélater sélectivement et fortement certains métaux par le biais notamment de leurs unités phosphonates. Comparativement à des groupes carboxylates, les groupes phosphonates confèrent une stabilité très supérieure pour les complexes formés avec des métaux. Ce point est particulièrement important si l'application visée nécessite de très faibles quantités de cations comme c'est le cas dans les méthodes d'imagerie impliquant des éléments radioactifs (PET, SPECT) ou si les chélatants bifonctionnels doivent être utilisés sur de longues périodes (plusieurs jours). Dans ce cas, les chélatants bifonctionnels couramment utilisés (acide 1, 4,7,10-tétraazacyc lododécane- 1,4,7,10-tétraacétique (DOTA) fonctionnalisé par exemple) n'apportent pas une stabilité suffisante in vivo et les radioéléments sont relargués dans l'organisme (Boswell A. et al. J. Med. Chem. 2004, 47, 1465).
La présente invention a donc également pour objet des complexes comprenant au moins un ion métallique coordonné avec au moins un composé de formule (I).
A titre d'exemple, on peut citer comme ions métalliques les radiométaux émettant des rayons gamma, les radiométaux émettant des positrons, les radiométaux émettant des rayons alpha, les radiométaux émettant des rayons beta ou les radiométaux émettant des électrons Auger. On peut également utiliser des métaux non radioactifs pour leurs propriétés paramagnétiques, de fluorescence, ou de phosphorescence. On peut citer à titre d'exemple les lanthanides (europium, terbium, samarium, dysprosium, erbium, ytterbium, praseodyme et neodyme), fer, cobalt, nickel, cuivre (64Cu, 67Cu), zinc, arsenic, sélénium, molybdène, technétium, ruthénium, palladium, argent, cadmium, indium, antimoine, rhénium, osmium, iridium, platine, or, mercure, thallium, plomb, bismuth, polonium, gallium, zirconium, yttrium, scandium et asiate. Tous ces métaux peuvent être utilisés tels quels ou sous forme de sels bien connus de l'homme du métier.
Ils peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par mélange équimolaire d'un composé de formule (I) ou un de ses sels avec un sel métallique, chauffage et refroidissement du mélange puis neutralisation à un pH compris entre 6 et 8 et finalement récupération du complexe à la température ambiante. Dans un mode de réalisation avantageux, le métal du complexe formé avec le ligand de formule (I) est le terbium.
De par la présence d'une chaîne latérale contenant une fonction chimique activée les composés selon l'invention peuvent également se greffer de façon covalente sur une cible biologique (protéines, anticorps, peptides) par l'intermédiaire de ladite chaîne latérale contenant la fonction activée.
Aussi la présente invention a-t-elle pour objet des ligands comprenant au moins un complexe formé avec un composé de formule (I) pour lequel
W représente :
- un groupe E-G-Q avec
* E choisi dans le groupe comprenant l'atome d'oxygène, un groupe -C≡C-, un groupe (CH2)m, m étant un nombre entier compris entre 0 et 5 et un groupe -CONH-,
* G est choisi dans le groupe comprenant
i) -(CH2)0, o étant un nombre entier compris entre 0 et 5, ii) -(CH2)n-NH-, n étant un nombre entier compris entre 0 et 5, iii) -(CH2)p-CO-NH-(CH2)q-NH-, p et q étant des nombres entiers compris entre 0 et 5, et
iv)
Figure imgf000027_0001
r, s et t étant chacun indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 0 et 5, et R2 et R3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe (Ci-C4)alkyle ou un groupe hydrolysable,
* Q représente soit un atome d'hydrogène, soit un groupe protecteur d' aminé, soit un groupe fonctionnel capable de former une liaison covalente avec les aminés primaires et secondaires, les alcools et les thiols,
une structure cible choisie dans le groupe comprenant des composés bio logiquement actifs ou un support pour former un système conjugué.
Dans un mode de réalisation avantageux, le système conjugué est constitué :
- du ligand Ll sur lequel un anticorps est fixé, en particulier l'anticorps B28.13 dirigé contre la ténascine, ou
- du ligand L2 sur lequel :
* un anticorps est fixé, en particulier l'anticorps dreg55 possédant une affinité très forte vis-à-vis de la L-sélectine ou l'anticorps dreg 200 anticorps de souris dirigé contre la L-sélectine, ou l'anticorps PSS233, anticorps anti « prostate spécifie antigen » (PSA), ou l'anticorps PSR222, anticorps anti « prostate spécifie antigen » (PSA), ou l'anticorps EgB4, fragment d'anticorps constitué d'un seul domaine variable et dirigé contre le facteur de croissance épidermique, ou l'anticorps EgAl, fragment d'anticorps constitué d'un seul domaine variable et dirigé contre le facteur de croissance épidermique, ou
* une protéine est fixée, en particulier la L-sélectine.
L'anticorps B28.13 peut être obtenu selon S. Wagner et al. (Early osteoarthritic changes of human fémoral head cartilage subséquent to femoro-acetabular impingement" Osteoarthritis and cartilage, 2003, 11, 508).
Les anticorps dreg55 et dreg200 peuvent être obtenus selon Man Sung Co et al. (Properties and pharmacokinetics of two humanized antibodies spécifie for L- selectin, Immunotechnology 4 (1999) 253-266).
Les anticorps PSS233, PSR222 et les fragments EgB4 ou EggAl peuvent être obtenus chez THERMO FISHER SCIENTIFIC CD NIMES CEZANNE, 280 allée Graham Bell, Parc Scientifique Georges Besse, 30035 Nîmes Cedex 1 France).
Dans un mode de réalisation avantageux, le système conjugué est constitué :
- du ligand Ll sur lequel un anticorps est fixé, en particulier l'anticorps B28.13 dirigé contre la ténascine, ou
- du ligand L2 sur lequel :
*un anticorps est fixé, en particulier l'anticorps fixé est l'anticorps dreg55 possédant une affinité très forte vis-à-vis de la L-sélectine ou l'anticorps dreg 200 anticorps de souris dirigé contre la L-sélectine sont fixés, ou
*une protéine est fixée, en particulier la L-sélectine. La présente invention a également pour objet des ligands comprenant au moins un complexe formé avec un composé de formule (I) pour lequel
W représente :
- un groupe E-G-Q avec
* E choisi dans le groupe comprenant l'atome d'oxygène, un groupe -C≡C-, un groupe (CH2)m, m étant un nombre entier compris entre 0 et 5 et un groupe -CONH-,
* G est choisi dans le groupe comprenant
i) -(CH2)0, o étant un nombre entier compris entre 0 et 5, ii) -(CH2)n-NH-, n étant un nombre entier compris entre 0 et 5, iii) -(CH2)p-CO-NH-(CH2)q-NH-, p et q étant des nombres entiers compris entre 0 et 5, et
iv)
Figure imgf000029_0001
r, s et t étant chacun indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 0 et 5, et R2 et R3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe (Ci-C4)alkyle ou un groupe hydrolysable,
* Q représente soit un atome d'hydrogène, soit un groupe protecteur d' aminé, soit un groupe fonctionnel capable de former une liaison covalente avec les aminés primaires et secondaires, les alcools et les thiols,
un métal coordonné audit composé de formule (I) et une structure cible choisie dans le groupe comprenant des composés bio logiquement actifs ou un support pour former un système conjugué complexé.
Ces complexes peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par un mélange équimolaire du composé de formule (I) et d'un sel de métal hydrosoluble en milieu aqueux suivi de l'isolation du complexe par précipitation ou évaporation à sec ou chromatographie.
La présente invention a également pour objet un système conjugué comprenant un agent bifonctionnel de formule (I) dans laquelle
W représente :
- un groupe E-G-Q avec
* E choisi dans le groupe comprenant l'atome d'oxygène, un groupe -C≡C-, un groupe (CH2)m, m étant un nombre entier compris entre 0 et 5 et un groupe -CONH-,
* G est choisi dans le groupe comprenant
i) -(CH2)0, o étant un nombre entier compris entre 0 et 5, ii) -(CH2)n-NH-, n étant un nombre entier compris entre 0 et 5, iii) -(CH2)p-CO-NH-(CH2)q-NH-, p et q étant des nombres entiers compris entre 0 et 5, et iv)
Figure imgf000030_0001
r, s et t étant chacun indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 0 et 5, et R2 et R3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe (Ci-C4)alkyle ou un groupe hydrolysable,
* Q représente soit un atome d'hydrogène, soit un groupe protecteur d' aminé, soit un groupe fonctionnel capable de former une liaison covalente avec les aminés primaires et secondaires, les alcools et les thiols d'une molécule bio logiquement active ou d'un support, et un composé bio logiquement actif ou un support. Ces systèmes conjugués peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par une réaction de couplage de l'agent bifonctionnel de formule (I) avec le composé bio logiquement actif ou le support, en milieu aqueux tamponné, à une température comprise entre 4 à 40°C, suivi d'une purification par chromatographie.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, le complexe selon l'invention ou le système conjugué selon l'invention sont formés avec un ligand bifonctionnel choisi dans le groupe comprenant Ll, L2, L3 et L4 tels que définis ci-dessus.
Si des complexes possédant des fonctions phosphonatées ont largement été décrits dans la littérature, c'est la première fois que l'introduction d'une fonction d'activation pour fixer de manière covalente de telles structures à des composés biologiques est décrite. Les molécules décrites jusqu'à ce jour comme possédant une fonction de greffage sont des dérivés dont les fonctions complexantes sont généralement des carboxylates, pour lesquelles la complexation des cations est beaucoup plus faible, en particulier lorsque le pH diminue.
Dans un mode de réalisation avantageux, le système conjugué complexé est constitué des systèmes conjugués ci-dessus définis complexés à un métal, en particulier le terbium.
La présente invention a également pour objet un agent de diagnostic comprenant au moins un composé de formule (I) selon l'invention ou un complexe selon l'invention. Cet agent peut être utilisé dans toute technique d'imagerie connue de l'homme du métier, notamment en résonance magnétique nucléaire (RMN), en imagerie par résonance magnétique (IRM), en radiographie à rayons X, en tomographie par émission de positons (TEP ou PET), en tomographie d'émission monophotonique, (TEMP ou SPECT), en radiologie, en spectroscopie de luminescence.
Conformément à l'invention, l'agent de diagnostic peut être utilisé comme agent d'imagerie en résonnance magnétique nucléaire avec les ions métalliques suivants : Eu, Yb, Gd, Dy, Tb, Ho, Er ou Fe, comme agent d'imagerie en rayons X avec les ions métalliques suivants : Bi, Pb ou Os, comme agent d'imagerie en radiologie avec les ions métalliques suivants : Co, Cu, Ga, Ge, Sr, Y, Te, In, Sm, Gd, Tb, Yb, Re, Zr ou Ir ou par spectroscopie de luminescence avec les ions métalliques suivants : Eu, Tb, Dy, Sm, Yb Conformément à la présente invention, l'agent de diagnostic peut se présenter sous toute forme pharmaceutiquement acceptable préparée par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par mélange d'une quantité de complexe avec n'importe quel additif pharmaceutiquement acceptable et connu de l'homme du métier. Avantageusement il se présente sous forme d'une solution injectable préparée par dissolution du complexe dans un solvant aqueux physio logiquement acceptable. Les doses utilisées seront adaptées en fonction du type d'imagerie utilisée et cette adaptation est à la portée de l'homme du métier. Pour le diagnostic par RMN, la dose de métal est généralement de 0,0001 à 10 mmol/kg, avantageusement de 0,005 à 0,5 mmol/kg. Pour le diagnostic aux rayons X, la dose d'ion métallique est généralement de 0,01 à 20 mmol/kg, avantageusement de 0,1 à 10 mmol/kg. Par ailleurs en radiologie, la dose de radioactivité est de 370-18500 MBq. L'agent d'imagerie est généralement administré par voie parentérale, notamment par voie intraveineuse mais dans certains cas il peut l'être soit oralement, soit par voie intra- artérielle.
Conformément à l'invention, les composés de formule (I) et les complexes tels que définis ci-dessus peuvent être utilisés pour la détection de maladies telles que les lymphomes, les carcinomes, les sarcomes, les leucémies, les myélomes ou les tumeurs du système nerveux central, les maladies inflammatoires, les maladies cardiovasculaires (thrombus, embolus, infarctus, plaque athéroscléreuse...), et les maladies infectieuses.
La présente invention a donc pour objet un agent de diagnostic tel que défini ci- dessus pour son utilisation dans la détection de maladies mentionnées précédemment. La présente invention a également pour objet une méthode de détection d'une maladie qui produit ou est associée à un marqueur ou à un récepteur, ladite méthode comprenant l'administration à un sujet humain atteint de ladite maladie une quantité détectable d'un complexe tel que défini précédemment et comprenant une molécule bio logiquement active spécifique dudit marqueur ou dudit récepteur. Conformément à l'invention, les composés de formule (I) et les complexes tels que définis ci-dessus peuvent également être utilisés pour le traitement de maladies telles que les lymphomes, les carcinomes, les sarcomes, les leucémies, les myélomes ou les tumeurs du système nerveux central, les maladies inflammatoires, les maladies cardiovasculaires (thrombus, embolus, infarctus, plaque athéroscléreuse...), les maladies infectieuses. La présente invention a donc pour objet un complexe tel que défini ci-dessus pour son utilisation dans le traitement des maladies mentionnées précédemment. Dans ce cadre il peut être présenté sous toute forme pharmaceutique connue de l'homme du métier en association avec tout excipient pharmaceutiquement acceptable. Avantageusement il se présente sous forme d'une solution injectable préparée par dissolution du complexe dans un solvant aqueux physio logiquement acceptable. La présente invention a également pour objet une méthode de traitement d'une maladie qui produit ou est associée à un marqueur ou à un récepteur, ladite méthode comprenant l'administration à un sujet humain atteint de ladite maladie une quantité détectable d'un complexe tel que défini précédemment et comprenant une molécule bio logiquement active spécifique dudit marqueur ou dudit récepteur. Les complexes selon l'invention sont préparés selon des techniques connues de l'homme du métier.
La présente invention a également pour objet une trousse comprenant :
(1) un ligand bifonctionnel tel que défini précédemment.
Dans un mode de réalisation avantageux, la présente invention a également pour objet une trousse comprenant :
(1) un ligand bifonctionnel tel que défini précédemment,
(2) une solution d'un sel ou d'un chélate d'un radionucléide métallique et
(3) si nécessaire, des instructions d'utilisation pour la réaction avec une prescription pour faire réagir (1) et (2).
La présente invention a également pour objet une trousse pour préparer un agent de diagnostic comprenant :
(1) un ligand bifonctionnel tel que défini précédemment et
(2) si nécessaire, des instructions d'utilisation pour la réaction avec une prescription pour son utilisation
La présente invention a également pour objet, une trousse comprenant :
(1) un ligand bifonctionnel tel que défini précédemment,
(2) une solution d'un sel ou d'un chélate d'un radionucléide métallique et
(3) des instructions d'utilisation, avec une prescription pour faire réagir (1) et (2) avec un composé bio logiquement actif ou un support inerte.
Les composés de formule (I) dans lesquels
W représente
- soit un atome de brome, soit un atome d'iode, - soit un groupe E-G-Q avec
* E choisi dans le groupe comprenant l'atome d'oxygène, un groupe -C≡C-, un groupe (CH2)m, m étant un nombre entier compris entre 0 et 5 et un groupe -CONH-,
* G est choisi dans le groupe comprenant
i) -(CH2)0, o étant un nombre entier compris entre 0 et 5, ii) -(CH2)n-NH-, n étant un nombre entier compris entre 0 et 5, iii) -(CH2)p-CO-NH-(CH2)q-NH-, p et q étant des nombres entiers compris entre 0 et 5, et
iv)
Figure imgf000034_0001
r, s et t étant chacun indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 0 et 5, et R2 et R3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe (Ci-C4)alkyle ou un groupe hydrolysable,
* Q représente soit un atome d'hydrogène, soit un groupe protecteur d' aminé,
X et Y représentent indépendamment l'un de l'autre,
- soit un atome d'hydrogène,
- soit un groupe
Figure imgf000034_0002
où u est un entier égal à 0 ou 1 , v et w, identiques ou différents sont des entiers égaux à 1 ou 2, R2 et R3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un groupe (Ci-C4)alkyle et J est soit -CH2, soit est un noyau aromatique comprenant de 5 à 10 chaînons et éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S, - soit un groupe
Figure imgf000035_0001
où ri, Si et ti sont chacun indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 1 et 2, et R2 et R3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un groupe (Ci- C4)alkyle ou un groupe hydrolysable,
à condition que X, W et Y ne soient pas simultanément H,
comme intermédiaires dans la synthèse des composés de formule (I) dans laquelle W représente
- un groupe E-G-Q avec
* E choisi dans le groupe comprenant l'atome d'oxygène, un groupe -C≡C-, un groupe (CH2)m, m étant un nombre entier compris entre 0 et 5 et un groupe -CONH-,
* G est choisi dans le groupe comprenant
i) -(CH2)0, o étant un nombre entier compris entre 0 et 5, ii) -(CH2)n-NH-, n étant un nombre entier compris entre 0 et 5, iii) -(CH2)p-CO-NH-(CH2)q-NH-, p et q étant des nombres entiers compris entre 0 et 5, et iv)
Figure imgf000035_0002
r, s et t étant chacun indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 0 et 5, et R2 et R3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe (Ci-C4)alkyle ou un groupe hydrolysable,
* Q représente soit un atome d'hydrogène, soit un groupe fonctionnel capable de former une liaison covalente avec les aminés primaires et secondaires, les alcools et les thiols
X et Y représentent indépendamment l'un de l'autre,
- soit un atome d'hydrogène,
- soit un groupe
Figure imgf000036_0001
où u est un entier égal à 0 ou 1 , v et w, identiques ou différents sont des entiers égaux à 1 ou 2, R2 et R3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène et J est soit -CH2, soit est un noyau aromatique comprenant de 5 à 10 chaînons et éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S, - soit un groupe
Figure imgf000036_0002
où ri, Si et ti sont chacun indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 1 et 2, et R2 et R3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, à condition que X, W et Y ne soient pas simultanément H.
Dans un mode de réalisation avantageux, dans les composés définis ci-dessus:
- X et Y, ou
- X, W et Y,
ne sont pas simultanément H,
et les composés de formule suivante:
Figure imgf000037_0001
dans laquelle R représente H ou Et sont exclus,
Les figures 1 et 2 et les exemples qui suivent illustrent l'invention.
La Figure 1 représente le spectre de masse de la Streptavidine de référence dans l'eau mQ obtenu par spectrométrie de masse MALDI- MS selon l'exemple 5.
La Figure 2 représente le spectre de masse de la Streptavidine marquée par le ligand
L2 obtenu par spectrométrie de masse MALDI- MS selon l'exemple 5.
La Figure 3 représente le chromatogramme obtenu en HPLC montrant l'injection de
0,2 μg de l'anticorps B28.13.
La Figure 4 représente le spectre MALDI-TOF de l'anticorps B28.13.
La Figure 5 représente le spectre MALDI-TOF de l'anticorps B28.13 marqué.
La Figure 6 représente l'image par microscopie de fluorescence montrant la reconnaissance de la ténascine extracellulaire qui se développe autour des tumeurs du côlon par l'anticorps B28.13 marqué.
La Figure 7 représente le chromatogramme montrant l'injection de 2μg de dreg55
(injection de 20μΙ, d'une solution de dreg55 à 0,lmg/mL).
La Figure 8 représente le spectre MALDI-TOF de l'anticorps dreg55.
La Figure 9 représente le spectre MALDI-TOF de l'anticorps dreg55 marqué.
La Figure 10 représente le dosage par fluorescence de l'anticorps dreg55 marqué. La Figure 11 représente le spectre d'émission de l'anticorps dreg55 marqué ( exc. = 328 nm) par TbL2.
La Figure 12 représente le spectre d'excitation de l'anticorps dreg55 marqué.
La Figure 13 représente la décroissance de la luminescence du complexe de terbium. La Figure 14 représente le spectre MALDI-TOF de l'anticorps dreg200.
La Figure 15 représente le spectre MALDI-TOF de l'anticorps dreg200 marqué. La Figure 16 représente le dosage par fluorescence de l'anticorps dreg200 marqué. La Figure 17 représente le chromatogramme montrant l'injection de 0,75 μg de L- sélectine (injection de 20μΙ, d'une solution de L-sélectine à 0,037 mg/mL).
La Figure 18 représente le spectre MALDI-TOF de la L-sélectine.
La Figure 19 représente la superposition des spectres MALDI-TOF de la L-sélectine (gris clair) et de la L-sélectine marquée (noir).
La Figure 20 représente le spectre MALDI-TOF de l'anticorps PSS233.
La Figure 21 représente le spectre MALDI-TOF de l'anticorps PSS233 marqué. La Figure 22 représente le spectre d'émission de l'anticorps PSS233 marqué (ÀeXC. =
328 nm).
La Figure 23 représente le spectre d'excitation de l'anticorps PSS233 marqué.
La Figure 24 représente la décroissance de la luminescence du complexe de terbium. La Figure 25 représente le spectre MALDI-TOF de l'anticorps PSR222.
La Figure 26 représente le spectre MALDI-TOF de l'anticorps PSR222 marqué.
La Figure 27 représente le spectre d'émission de l'anticorps PSR222 marqué ( exc. = 328 nm).
La Figure 28 représente le spectre d'excitation de l'anticorps PSR222 marqué.
La Figure 29 représente la décroissance de la luminescence du complexe de terbium. La Figure 30 représente le spectre MALDI-TOF du fragment d'anticorps EgB4.
La Figure 31 représente le gel SDS PAGE tricine du fragment d'anticorps EgB4 et du fragment d'anticorps EgB4 marqué.
La Figure 32 représente le Spectre MALDI-TOF du fragment d'anticorps EgAl . La Figure 33 représente le gel SDS - PAGE tricine du fragment d'anticorps EgAl et du fragment d'anticorps EgAl marqué.
La Figure 34 représente le gel SDS - PAGE glycine du fragment d'anticorps EgAl et du fragment d'anticorps EgAl marqué.
Exemple 1 : Préparation du ligand Li
Figure imgf000039_0001
Le ligand Li a été obtenu en suivant le schéma synthétique ci-dessous :
Figure imgf000039_0002
Préparation du composé 3 :
Le diester 1 et l'aminoalcool 2 ont été préparés, respectivement, selon les procédés décrits par Célia S. Bonnet et al, dans Chem. Commun. 2010, 46, 124 et par S. Machida et al. dans Chem. Eur. J. 2008, 74, 1392.
A une solution de diester 1 (3,27 g ; 13,70 mmol) dans 325 mL de THF sont ajoutés, sous argon, la triphénylphosphine (7,20 g ; 27,46 mmol) et l'aminoalcool 2 (4,80 g ; 27,52 mmol) solubilisé dans un peu de THF. Le DIAD (5,43 mL ; 27,4 mmol) est ensuite additionné goutte à goutte. Le mélange est agité à 70°C pendant une nuit. Après évaporation du solvant, on obtient une huile qui est purifiée sur colonne de silice deux fois successivement avec d'abord éther de pétrole/acétate d'éthyle 7/3 puis ensuite avec CH2CI2 100% puis gradient avec du MeOH 0,5%, 1%) puis 1,5%. La masse du composé 3 obtenu est de 4,5 g et le rendement est de 83%). Les caractéristiques du composé 3 sont les suivantes :
R7= 0,63 ; Si02 ; CH2C12 / MeOH (96 / 4)
RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) : δ 1,44 (s, 9H) ; 1,45 (t, J = 7,1 Hz, 6H); 2,05 (qt, J = 6,3 Hz, 2H) ; 3,34 (m, 2H); 4,20 (t, J = 12,6 Hz, 2H); 4,47 (q, J = 7,1 Hz, 4H) ; 4,81 (s large, 1H); 7,74 (s, 2H).
RMN 13C (CDCI3, 75 MHz) : δ 14,2; 28,4; 29,4; 37,5; 62,4; 66,6; 79,4; 114,3; 150,2; 156,0; 164,7; 166,8.
IR (cm 1, ATR) : v 3411, 3250, 2980, 1703, 1508, 1238, 1252, 1107, 1029, 784.
ESI+/ MS : m/z 397,2 ([3 + H]+, 100%).
Préparation du composé 4
A une solution de diester 3 (4,48 g ; 11,29 mmol) dans 240 mL d'éthanol, sont ajoutés
1,01 g (26,67 mmol) de NaBH4 puis le mélange est chauffé à reflux. Le solvant est évaporé puis une solution aqueuse de NaHC03 saturée est ajoutée jusqu'à pH 9 et enfin de l'eau est rajoutée. La phase aqueuse est extraite avec du dichlorométhane. La phase organique est séchée sur Na2S04, filtrée et concentrée. Le produit 4 obtenu est un solide blanc (1,56 g ; 44%>) dont les caractéristiques sont les suivantes :
R7= 0,36 ; Si02 ; CH2C12 / MeOH (90 / 10)
RMN 1H (CDC13, 300 MHz) : δ 1,44 (s, 9H); 2,01 (qt, J= 6,3 Hz, 2H); 3,32 (m, 2H); 4,09 (t, J= 6 Hz, 2H); 4,71 (s, 4H); 6,71 (s, 2H).
RMN 13C (CDC13, 75 MHz) : δ 28,5; 29,4; 37,6; 64,4; 65,7; 79,4; 105,6; 156,3; 161,2; 166,5. IR (cm 1, ATR) : v 3371, 2974, 1685, 1602, 1572, 1520, 1272, 1146, 1048, 844.
ESI+/ MS : m/z 313,2 ([4 + H]+, 100%); 314,2 (31%); 355,2 (33%).
Préparation du composé 5
A 0°C, une solution de chlorure de tosyle (3,55 g ; 18,64 mmol) dans 67 mL de THF est ajoutée, goutte à goutte, à une solution du diol 4 (1,45 g ; 4,66 mmol) et de NaOH (1,12 g ; 27,96 mmol) en solution dans un mélange THF / H20 (34 mL / 34 mL). La réaction évolue ensuite à température ambiante. Après séparation des deux phases, la phase aqueuse est extraite par du dichlorométhane. Les phases organiques réunies sont lavées avec une solution aqueuse de NaHC03 5 %> puis avec une solution aqueuse saturée de NaCl. La phase organique est ensuite séchée sur Na2S04, filtrée et concentrée. Après purification par chromato graphie sur colonne de silice (CH2CI2 / MeOH : gradient 1% à 2%), le composé bis-tosylé (2,44 g) est obtenu avec un rendement de 85% (solide blanc). Les caractéristiques du composé 5 sont les suivantes :
R7= 0,28 ; Si02 ; CH2C12 / MeOH (98,5 / 1,5)
RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) : δ 1,46 (s, 9H); 1,92 (m, 2H); 2,44 (s, 6H); 3,31 (m, 2H); 4,04 (t, J = 6,1 Hz, 2H); 4,70 (s large, 1H); 4,98 (s, 4H); 6,81 (s, 2H); 7,34 (d, J = 8,1 Hz, 4H); 7,81 (d, J= 8,3 Hz, 4H).
RMN 13C (CDC13,75 MHz) : δ 21,8; 28,5; 29,4; 37,6; 66,1; 71,3; 79,6; 107,7; 128,2; 130,1; 132,8; 145,3; 155,3; 156,1; 166,7.
IR (cm 1, ATR) v : 3356, 2926, 1677, 1366, 1171, 1033, 840, 809, 669.
ESI+/ MS : m/z 607,7 (54%); 643,2 ([5 +Na]+, 100%); 702,3 (34%).
Préparation du composé 7
L'amine 6 a été préparée selon un mode opératoire décrit par S. Aime et al, dans Chem. Eur. J, 2000, 14, 6.
A une solution de l'amine 6 (2,73 g ; 8,60 mmol) dans 200 mL d'acétonitrile, sous azote, est ajouté du K2C03 préalablement flambé (3,14 g ; 22,72 mmol). Après 20 min d'agitation le dérivé ôz's-tosylé 5 (2,35 g ; 3,78 mmol) dissout dans de l'acétonitrile et de l'iodure de potassium (1,29 g ; 7,75 mmol) sont additionnés et le mélange est chauffé à 70°C. Après une nuit à 70°C, la réaction n'est pas terminée. 0,92 g (2,89 mmol) d'amine 6, 1 ,02 g (7,42 mmol) de K2C03 et 0,41 g (2,47 mmol) d'iodure de potassium sont de nouveau ajoutés et le milieu est agité à 70°C pendant 22h. Après filtration, le solvant est évaporé ; on obtient une huile qui est purifiée sur colonne de silice (gradient CH2C12 / MeOH : gradient 2%> à 6%>). La masse du produit 7 obtenu est de 1,75 g (50%>, huile jaune clair). Les caractéristiques du composé 7 sont les suivantes :
R7= 0,33 ; Si02 ; CH2C12 / MeOH (92 / 8)
RMN 1H (CDC13, 300 MHz) : δ 1,24 (t, J= 7 Hz, 24H); 1,36 (s, 9H); 1,91 (m, 2H); 3,18 (m, 10H); 4,04 (m, 22H); 5,09 (s large, 1H); 6,99 (s, 2H).
RMN 13C (CDC13, 75 MHz ) : δ 16,4 (d, J = 5,5 Hz); 28,4; 29,2 ; 37,5; 50,3 (dd , J = 157,7 Hz, J = 8,3 Hz); 61,9; 62,0 (d, J = 6,2 Hz); 62,4 (t, J = 8,4 Hz) ; 65,5; 79,0; 108,2; 156,0; 159,4; 166,3.
RMN 31P (CDC13, 161,9 MHz) : δ 24,60.
IR (cm 1, ATR) : v 3303, 2980, 1708, 1597, 1230, 1019, 959.
ESI+/ MS : m/z 908,1 (27%): 933,4 ([7 +Na]+, 100%).
Préparation du composé 8 A une solution d'amine 7 (1,21 g ; 1,33 mmol) dans 15 mL de dichlorométhane, est ajouté à 0°C, sous azote, 1,97 mL (26,6 mmol) d'acide trifluoroacétique. Le milieu évolue ensuite à température ambiante jusqu'à disparition du produit de départ. Le solvant est évaporé, puis le produit brut (sel de triflate) est séché sous vide (huile marron). Il est utilisé sans purification dans l'étape suivante. Les caractéristiques du composé 8 sont les suivantes : R7= 0,1 ; Si02 ; CH2C12 / MeOH (88 / 12)
RMN 1H (CDC13, 300 MHz) : δ 1,31 (t, J = 7 Hz, 24H); 2,29 (m, 2H); 3,30 (m, 10H); 4,18 (m, 16H); 4,32 (s large, 4H); 4,46 (m, 2H); 7,39 (s, 2H); 7,92 (s large, 2H).
RMN 13C (CDCI3, 100 MHz ) : δ 16,2; 26,1; 37,1; 50,4 (dd, J= 158,9 Hz, J= 6,1 Hz); 57,6 (t, J = 5,8 Hz); 63,5 (t, J = 3,4 Hz); 67,7; 110,7; 115,5 (q, J = 289,0 MHz); 155,7; 160,2 (q, J = 39,7 MHz); 171,8.
RMN 31P (CDCI3, 161,9 MHz) : δ 24,05.
IR (cm 1, ATR) : v 2989, 1774, 1634, 1202, 1160, 1023, 975.
ESI+ / MS : m/z 406,2 ([8 (aminé libre) + 2H]2+, 100%) ; 811,3 ([8 (aminé libre) + H]+, 32%).
Préparation du composé 9
A une solution de sel d'ammonium 8 (1,33 mmol) dans 30 mL d'acétonitrile, sous azote, est ajouté la triéthylamine (0,33 mL ; 2,39 mmol) puis le DSC (612,2mg ; 2,39 mmol) dissout dans de l'acétonitrile. La réaction est agitée à température ambiante jusqu'à disparition du produit de départ. Après évaporation du solvant, du dichlorométhane est ajouté. La phase organique est ensuite lavée plusieurs fois avec une solution aqueuse saturée de NH4CI jusqu'à ce que le contrôle par ccm indique la disparition du DSC résiduel. La phase organique est séchée sur Na2S04, filtrée et concentrée. Le produit 9 obtenu qui est une huile marron (821 mg; 65 %>) présente les caractéristiques suivantes :
R7= 0,6 ; Si02 ; CH2C12 / MeOH (88 / 12)
RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) : δ 1,30 (t, J = 7,1 Hz, 24H) ; 2,06 (m, 2H) ; 2,79 (s, 4H); 3,20 (d, J=10,0 Hz, 8H); 3,39 (m, 2H); 4,21 (m, 21H); 7,52 (s large, 2H).
RMN 13C (CDCI3, 75 MHz ) : δ 16,6 (t, J = 3 Hz); 25,6; 28,4; 38,6; 50,7 (dd, J = 160,2 Hz, J = 7,7 Hz); 62,3 (t, J= 3,7 Hz); 152,1; 169,9.
RMN 31P (CDCI3, 161,9 MHz) : δ 24,13.
ESI+/ MS : m/z 869,3 (77%); 952,3 ([9 +H]+, 100%).
Préparation du composé
A une solution de carbamate 9 (181,7 mg ; 0,19 mmol) dans 5 mL de dichlorométhane, sous azote, sont ajoutés 1 mL (7,64 mmol) de lutidine puis 0,88 mL (7,64 mmol) de TMSBr. L'agitation est maintenue environ 15 heures. Le solvant est ensuite évaporé. Le produit brut obtenu est repris avec du méthanol, qui est ensuite évaporé. Cette opération est effectuée de nouveau deux fois. Le solide obtenu est centrifugé en présence de dichlorométhane, puis lavé plusieurs fois avec du dichlorométhane et avec du méthanol. Le produit final Li est obtenu sous forme de sel de lutidinium (solide marron clair) et présente les caractéristiques suivantes :
RMN 1H (D20, 300 MHz) : δ 2,08 (m, 2H); 2,72 (s, 6H); 2,91 (s, 4H); 3,45 (m, 2H); 3,63 (d, J = 12,1 Hz, 8H); 4,27 (m, 2H); 4,91 (s, 4H); 7,13 (s, 2H); 7,63 (d, J = 8,1 Hz, 2H); 8,28 (t, J = 8 Hz, 8H).
ESI+/ MS (eau / acétonitrile / acide formique) : m/z 728,1 ([Li + H]+, 100%).
Exemple 2 : Préparation du ligand L2
Figure imgf000043_0001
Le ligand L2 a été obtenu selon le schéma synthétique suivant :
Figure imgf000044_0001
Préparation du composé 11 :
Dans un ballon bicol sous atmosphère d'azote, sont introduits 1,5 g (4,73 mmol) d'amine 6 et 1,14 g de K2CO3 (8,24 mmol) dans 200 mL d'acétonitrile séchée sur purificateur de solvant. Le mélange est porté à reflux pendant une demi-heure. 0,96 g (2,06 mmol) du composé 10 (préparé selon une méthode décrite par P. Kadjane et al, dans Inorg. Chem, 2009, 48, 4601) sont alors ajoutés. Le mélange réactionnel est porté à reflux pendant 36 heures, jusqu'à consommation complète des réactifs de départ. La solution est filtrée pour enlever le K2CO3 rémanent, puis évaporée à sec. Le résidu huileux a été purifié par colonne de chromatographie sur gel de silice. L'éluant utilisé est un mélange de dichlorométhane et de méthanol : CH2C12 / MeOH (100/0 à 95/5). On obtient 1 ,2 g du composé 11 (1,26 mmol), soit un rendement de 62 %. Les caractéristiques du composé 11 sont les suivantes :
R7 = 0,13 ; Si02 ; CH2C12 / MeOH (95 / 5).
RMN 1H (CDC13, 300 MHz) : δ 1,33 (t, J = 70 Hz, 24H) ; 3,22 (d, J = 10 Hz, 8H) ; 3,98 - 4,27 (m, 20H) ; 6,56 (d, J= 2,6 Hz, 2H) ; 7,95 (s, 2H) ; 8,44 (d, J= 2,6 Hz, 2H).
RMN 13C (CDCI3, 75 MHz) : δ 16,5 (d, J = 6,0 Hz) ; 49,0 (d, J = 8,0 Hz) ; 51,1 (dd, J = 158,0 Hz, J= 8,5 Hz) ; 54,0 ; 62,0 (d, J= 7,1 Hz) ; 109,1 ; 112,2 ; 128,0 ; 150,4 ; 153,2. RMN 31P (CDCI3, 161,9 MHz) : δ 23,98.
Analyses calculées pour C33H58BrN7Oi2P4.H20 : C 41,00, H 6,26, N 10,14. Trouvées : C 40,83, H 6,44, N 9,95.
IR (cm"1, ATR) : v 3486, 2982, 2928, 2907, 1679, 1589, 1463-1388, 1211, 1017.
EI+ / MS : m/z 949,3 ([11 + H]+, 100 %).
Préparation du composé 12 :
Dans un ballon bicol de 250 mL, sont introduits 1,12 g (1,20 mmol) du composé 11, 182 mg (1,44 mmol) d'acide 6-heptynoïque à 90% et 42 (0.06 mmol) mg de [Pd(PPh3)2Cl2], le tout en solution dans 80 mL de THF fraîchement distillé et 24 mL de triéthy lamine. La solution est dégazée par passage d'un flux continu d'azote pendant une demi- heure. 22,9 mg (0,1 mmol) de Cul est ajouté puis le mélange réactionnel est chauffé à 60°C pendant 15 heures. Le solvant est éliminé par évaporation et co-évaporations successives avec du dichlorométhane. Le résidu huileux est repris dans 250 mL d'un mélange CH2C12 /H20 (50/50), puis la phase aqueuse extraite. La phase organique est lavée avec une solution de NaCl saturée, puis séchée sur Na2S04. Le résidu est purifié par colonne de chromato graphie sur gel de silice. L'éluant utilisé est un mélange : CH2C12 / MeOH (100/0 à 93/7). On obtient 1,01 g (1,02 mmol) du composé 12 sous forme d'une huile brune, soit un rendement de 85%. Le composé 12 présente les caractéristiques suivantes :
R7= 0,27 ; Si02 ; CH2C12 / MeOH (90 / 10).
RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) : δ 1,33 (t, J = 7,0 Hz, 24H) ; 1,70 (m, 2H) ; 1,95 (m, 2H) ; 2,43 (m, 2H) ; 2,51 (m, 2H) ; 3,26 (d, J = 10 Hz, 8H) ; 4,05 - 4,35 (m, 20H) ; 6,50 (d, J = 2.6 Hz, 2H) ; 7,82 (s, 2H) ; 8,45 (d, J= 2,6 Hz, 2H).
RMN 13C (CDCI3, 75 MHz) : δ 16,5 (d, J = 6,1 Hz) ; 19,1 ; 19,4 ; 24,0 ; 27,2 ; 50,1 (dd, J = 159,9 Hz, J = 9,4 Hz) ; 58,3 ; 62,2 (d, J = 7,0 Hz) ; 96,6 ; 108,8 ; 111,4 ; 127,67 ; 137,4 ; 150,0 ; 152,1 ; 175,4 ; 206,9.
RMN 31P (CDCI3, 161,9 MHz) : δ 24,73. Analyses calculées pour C4oH67N7Oi4P4 : C 48,34, H 6,79, N 9,86. Trouvées : C 48,52, H 7,12, N 9,65.
IR (cm 1, ATR) : v 2233, 1720, 1211, 1019, 987, 795.
EI+ / MS : m/z 994,4 ([12 + H]+, 100 %).
Préparation du composé 13 :
Dans un ballon monocol de 100 mL, sont introduits 300 mg (0,30 mmol) du composé 12, 175 mg (0,68 mmol) de carbonate de N,N'-disuccinimidyle, 240 μΐ, de triéthylamine et 45 mL de CH2CI2. Le mélange réactionnel est agité sous atmosphère d'azote pendant 12 heures. Le mélange réactionnel est ensuite évaporé à sec, repris dans 100 mL de CH2CI2, et lavé successivement avec une solution aqueuse saturée de NH4C1 et avec de l'eau. La phase organique est séchée sur Na2S04, filtrée, puis évaporée à sec. On obtient 320 mg du composé 13 (0,29 mmol ; 97%) sous forme d'une huile jaune pâle dont les caractéristiques sont les suivantes :
RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) : δ 1,26 (t, J = 7,1 Hz, 24 H) ; 1,70 - 1 ,83 (m, 2H) ; 1,86 - 1 ,98 (m, 2H) ; 2,52 (t, J = 6.9 Hz, 2H) ; 2,68 (t, J = 7,2 Hz, 2H) ; 2,83 (s, 47H) ; 3,21 (d, J = 10,1 Hz, 8 H) ; 4,03 - 4,24 (m, 20 H) ; 6,52 (d, J= 2,7 Hz, 2H) ; 7,73 (s, 2H) ; 8,44 (d, J = 2,7 Hz, 2H).
RMN 13C (CDCI3, 75 MHz) : δ 16,6 (d, J= 6,1 Hz) ; 19,2 ; 23,9 ; 25,7 ; 27,4 ; 30,6 ; 50,1 (dd, J = 158,4 Hz, J = 9,7 Hz) ; 62,1 (d, J = 7,2 Hz) ; 79,0 ; 95,9 ; 108,8 ; 111,3 ; 127,9 ; 137,2 ; 150,2 ; 152,7 ; 168,4 ; 169,2.
RMN 31P (CDCI3, 161,9 MHz) : δ 24,49.
IR (cm"1, ATR) : v 2234, 1841, 1784, 1740, 1715, 1209, 962, 742.
Préparation du ligand L^:
Dans un ballon monocol de 50 mL contenant 57 mg du composé 13 (0,053 mmol) en solution dans 10 mL de dichlorométhane, 224 mg (2,09 mmol) de lutidine et 320 mg (2,09 mmol) de TMSBr sont introduits. Le mélange réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante pendant 12 heures, puis les substances volatiles sont évaporées à température ambiante sous pression réduite. On co-évapore le TMSBr avec du dichlorométhane (l'opération est répétée deux fois). On obtient alors un précipité blanc. On rajoute 10 mL de méthanol et on évapore aussitôt, toujours à température ambiante, sous pression réduite. L'opération est répétée deux fois. Le précipité blanchâtre obtenu est lavé avec du dichlorométhane, puis du méthanol pour donner le ligand L2, poudre brune, sous forme de monophosphonate de lutidinium et dont les caractéristiques sont les suivantes : RMN 1H (D20-NaOD, 200 MHz) : δ 1,28 (m, 4H); 1 ,83 (m, 2H); 2, 15 (m, 2H); 2,30 (d, J = 12,1 Hz, 8H); 2,91 (s, 6H); 3,66 (s, 4H); 6,37 (s, 2H); 6,70 (d, J= 7,6 Hz, 2H); 7,22 (m, 3H); 8,18 (s, 2H).
RMN 31P (CDC13, 161,9 MHz) : δ 16,89.
Analyses calculées pour C28H38N80i6P4'C7H9N'4H20 : C, 40,20 ; H, 5,30 ; N, 12,05. Trouvées : C, 40,26 ; H, 5,24 ; N, 12,07.
IR (cm 1, ATR) : v 2157, 1837, 1781, 1736, 1611, 1203, 987, 795.
ESI7 MS : m/z 865,15 ([L2-H]", 30%); 768,14 ([L2-NHS]~, 100%).
Exemple 3 : Préparation du ligand L3
Figure imgf000047_0001
Le ligand L3 a été obtenu en suivant le schéma synthétique ci-dessous :
Figure imgf000048_0001
Préparation du composé 15
Dans un ballon bicol de 250 mL, sont introduits 400 mg (0,42 mmol) du composé 10,
191 mg (0,67 mmol) du composé 14 et 15 mg (0,021 mmol) de [Pd(PPh3)2Cl2], le tout en solution dans 20 mL de THF fraîchement distillé et 8 mL de triéthy lamine. La solution est dégazée par passage d'un flux continu d'azote pendant une demi-heure. 8 mg (0,04 mmol) de
Cul sont ajoutés puis le mélange réactionnel est chauffé à 60°C pendant 15 heures. Les solvants sont éliminés par évaporation puis co-évaporations avec du dichlorométhane. Le résidu huileux obtenu est repris dans 60 mL d'un mélange CH2C12 / H20 (50/50), puis la phase aqueuse extraite. La phase organique est lavée avec une solution de NaCl saturée, puis séchée sur Na2S04. Le résidu est purifié par colonne de chromatographie sur gel de silice. L'éluant utilisé est CH2C12 / MeOH (100/0 à 93/7). On obtient 428 mg (0,37 mmol) du composé 15 sous forme d'une huile brune, soit un rendement de 88%. Le composé 15 présente les caractéristiques suivantes:
R/ = 0,17 ; Si02 ; CH2C12 / MeOH (90 / 10).
RMN 1H (CDC13, 300 MHz) : δ 1,31 (t, 24 H, J = 7,1 Hz); 1,41 (s, 9H); 1,54 - 1,74 (m, 4H); 1,75 - 1,92 (m, 2H); 2,25 (t, J = 7,2Hz, 2H); 2,47 (t, J = 6,8 Hz, 2H); 3,34 - 3,06 (m, 12H); 3,93 - 4,28 (m, 22 H); 6,52 (d, J= 2,6 Hz, 2H); 7,72 (s, 2H); 8,44 (d, 2H, J= 2,6 Hz).
RMN 13C (CDC13, 75 MHz) : δ 16,4 (d, J = 6,1 Hz); 19,3; 25,0; 27,9; 28,4; 30,2; 35,8; 36,1; 37,0; 49,9 (d, J = 159,4 Hz); 53,9; 62,0; 62,1; 78,6; 79,2; 96,6; 108,6; 111,2; 127,8; 137,3; 150,0; 152,5; 172,9.
RMN 31P (CDC13, 161,9 MHz) : δ 24.50.
Analyses calculées pour C48H83N9Oi5P4'2MeOH : C, 49.46; H, 7.55; N, 10.38. Trouvées: C,
49.31; H, 7.39; N, 10.01.
ESI+ / MS : m/z 1172.5 ([15+Na]+, 100%).
Préparation du composé 16:
Dans un ballon monocol de 100 mL, sont introduits 120 mg du composé 15 (0,10 mmol) en solution dans 10 mL de CH2C12. 78 μΐ^ (1 mmol) d'acide trifluoroacétique sont additionnés puis le mélange réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante pendant 15 heures. Les composés volatils sont éliminés par évaporation puis co-évaporations successives avec du dichlorométhane. On obtient 150 mg du composé 16 (triflate d'ammonium), sous forme d'une huile brune dont les caractéristiques sont les suivantes : RMN 1H (CD3OD, 300 MHz) : δ 1,20 - 1,26 (m, 24 H); 1 ,52 - 1,65 (m, 2H); 1,66 - 1,81 (m, 2H); 1,85 - 2,01 (m, 2H); 2,13 - 2,27 (m, 2H); 2,39 - 2,54 (m, 2H); 2,79 - 3,01 (m, 2H) 3,07 - 3,28 (m, 18H); 3,93 - 4,19 (m, 16H); 6,51 (m, 2H); 7,63 (s, 2H); 8,55 - 8,66 (m, 2H). RMN 31P (CDCI3, 161,9 MHz) : δ 24,83.
IR (cm 1, ATR) : v 2158, 1676, 1200, 1015, 797.
ESI+ / MS : m/z 1050,5 ([16+H]+, 100%).
Préparation du composé 17:
Dans un ballon monocol de 50 mL, sont introduit 57 mg (0,05 mmol) du composé 16,
27 mg (0,09 mmol) de carbonate de N,N'-disuccinimidyle, 50 de triéthylamine et 15 mL de CH2CI2. Le mélange réactionnel est agité sous atmosphère d'azote pendant 12 heures. Le mélange réactionnel est ensuite évaporé à sec, repris dans 20 mL de CH2CI2, et lavé successivement avec une solution aqueuse saturée de NH4C1 et avec de l'eau. La phase organique est séchée sur Na2S04, filtrée, puis évaporée à sec. On obtient 50 mg (0,04 mmol) du composé 17 sous forme d'une huile jaune pâle, dont les caractéristiques sont les suivantes : RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) : 1,08 - 1 ,48 (m, 26H); 1,71 (m, 2H); 1 ,83 (m, 2H); 2,28 (t, J = 7,3 Hz, 2H); 2,50 (t, J= 6,7 Hz, 2H); 2,79 (s, 4H); 3,10 - 3,44 (m, 12H); 4,03 - 4,26 (m, 20H); 6,52 (d, J= 2,5 Hz, 2H); 7,73 (s, 2H); 8,45 (d, J= 2,6 Hz, 2H).
RMN 13C (CDCI3, 75 MHz) : δ 16,7 (d, J = 6,2 Hz); 19,5; 25,3; 25,7; 28,1; 29,8; 36,3; 38, 9; 50,2 (dd, J= 159 Hz, J= 8,4 Hz); 53,9; 54,1; 62,3 (d, J= 6,9 Hz); 108,9; 111,4; 128,0; 150,0; 152,7; 170,0; 173,8; 180,2; 186,1; 195,1; 205,2.
RMN 31P (CDCI3, 161,9 MHz) : δ 24,54.
IR (cm 1, ATR) : v 2239, 1812, 1781, 1736, 1611, 1204, 1060, 794.
ESI+/ MS : m/z 1213,4 ([17+Na]+, 90%).
Préparation du ligand L3:
Dans un ballon monocol de 50 mL contenant 50 mg du composé 17 (42 μιηοΐ) en solution dans 10 mL de dichlorométhane, 204 mg (2,21 mmol) de lutidine et 232 mg (1,68 mmol) de TMSBr sont ajoutés. Le mélange réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante pendant 12 heures, puis les substances volatiles sont évaporées à température ambiante sous pression réduite. On co-évapore le TMSBr avec du dichlorométhane (opération faite deux fois). On obtient alors un précipité blanc. On rajoute 10 mL de méthanol et on évapore aussitôt, toujours à température ambiante, sous pression réduite. Le ligand L3 obtenu sous forme de monophosphonate de lutidinium présente les caractéristiques suivantes :
RMN 1H (D20-NaOD, 300 MHz) : δ 1,47 - 1,89 (m, 6H); 2,30 (m, 2H); 2,41 (m, 4H); 2,54 (m, 2H); 2,70 (d, J = 11,2 Hz, 8H); 3,01 (m, 2H); 3,20 (m, 2H); 4,08 (s, 4H); 6,78 (s, 2H); 7,07 (d, J= 7,8 Hz, 1H); 7,52 - 7,69 (m, 2,5H); 8,58 (s, 2H).
RMN 31P (CDCI3, 161,9 MHz) : δ 16,68.
ESI7 MS : m/z: 965,2 ([L3-H]", 30%). Exemple 4 : Préparation du ligand L4
Figure imgf000051_0001
Le ligand L4 a été obtenu en suivant le schéma synthétique ci-dessous
Figure imgf000051_0002
Préparation du composé 19
La 2,6-3zs(bromométhyl) pyridine 18 a été préparée selon un mode opératoire décrit par T. Vermoden et al, dans Tetrahedron, 2003, 59, 5039.
A une solution de K2CO3 préalablement flambé (391,13 mg ; 2,83 mmol) dans 20 mL d'acétonitrile, sous azote, l'aminé 6 (359,13 mg ; 1,13 mmol) est ajoutée, puis la 2,6- ôz's(bromométhyl) pyridine 18 (300 mg ; 1,13 mmol) est additionnée. Le mélange est porté à 65 °C pendant plus 6 h, puis évolue une nuit à température ambiante. Après fïltration, le solvant est évaporé; le produit brut est purifié sur colonne de silice (CH2CI2 / MeOH gradient de 100/0 à 94/6). La masse du produit 19 obtenu est de 253 mg (44%, huile). Les caractéristiques du composé 19 sont les suivantes :
R7= 0,6; Si02 ; CH2C12 / MeOH (90 / 10)
RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) : δ 1,29 (t, J = 7,3 Hz, 12H); 3,23 (d, J = 9,7 Hz, 4H); 4,11 (m, 10H); 4,51 (s, 2H); 7,31 (d, J= 7,6 Hz, 1H); 7,51 (d, J= 7,6 Hz, 1H); 7,68 (t, J= 7,8 Hz, 1H). RMN 13C (CDCI3, 75 MHz ) : δ 16,6 (t, J = 3,1 Hz); 34,0; 50,4 (dd, J = 159,8 Hz, J = 7,4 Hz); 62,2; 122,1; 123,1; 137,6; 156,0; 158,8.
RMN 31P (CDCI3, 161,9 MHz) : δ 24,4.
IR (cm 1, ATR) : v 3415, 962-1016, 1592-1675, 1392.
ESI+ / MS (CH2CI2): m/z 363,0 (22%); 417,9 (44%); 501,1 ([19+H]+, 54%); 503,1 ([19+H]+, 54%); 523,1 ([19+Na]+, 70%); 525,1 ([19+Na]+, 70%); 598,2 (17%); 737,0 (42%); 752,3 (100%); 759,3 (94%).
Préparation du composé 21
A une solution de K2CO3, préalablement flambé (1,98 g ; 14,31 mmol) dans 20 mL d'acétonitrile, sous azote, 1,20 g (4,77 mmol) de 6-bromohexanoate de tert-butyle 20 (préparé selon une procédure décrite par M. S. Shchepinov dans le brevet European Patent Application EP1506959A2, 2005) et 1,02 g de benzylamine (9,52 mmol) sont ajoutés, puis le mélange est porté à 65°C pendant 24 h. Après fïltration, de l'eau est ajoutée et puis la phase aqueuse extraite avec du dichlorométhane. La phase organique est séchée sur Na2S04, filtrée et concentrée. Le produit brut est purifié sur colonne de silice (CH2CI2 / MeOH gradient de 100/0 à 90/10). La masse du produit 21 obtenu est de 1,32 g (56%>, huile).
RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) : δ 1.44 (m, 15H); 2,16 (t, J = 7,3 Hz, 2H); 2,58 (t, J = 7,2 Hz, 2H); 3,73 (s, 2H); 7,19-7,27 (m, 5H).
RMN 13C (CDCI3, 75 MHz) : δ 25,1; 26,9; 28,2; 29,9; 35,6; 49,3 ; 54,1; 80,1; 127,0; 128,3; 128,5; 140,5; 173,3. Analyses calculées pour C17H27NO2: C, 73,61 ; H, 9,81; N, 5,05. Trouvées: C, 73,59; H, 9,90; N, 5,07.
IR (cm 1, ATR) : v 2931; 1604; 1727.
ESI+ / MS (CH2CI2): m/z 222,1 ([21-C4H9+H]+, 66%); 278,2 ([21+H]+, 100 %); 392,3 (16%); 432,2 (31%); 481,3 (31%); 709,5 (19%).
Préparation du composé 22
300 mg (1,08 mmol) du composé 21 et 223,21 mg de diéthylphosphite (1,62 mmol) sont mélangés puis du formaldéhyde (37%> dans l'eau) (174,63 mg ; 2,15 mmol) est ajouté goutte-à-goutte. Le milieu réactionnel est chauffé à 100°C pendant 3 h. Après évaporation à sec, le produit brut est purifié sur colonne de silice (CH2CI2 / MeOH gradient de 100/0 à 99/1). On obtient 290 mg de l'aminé 22 sous forme d'une huile, soit un rendement de 63%>. Le produit 22 présente les caractéristiques suivantes :
RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) : δ 1,21-1,57 (m, 21H); 2,17 (t, J= 7,5 Hz, 2H); 2,60 (t, J= 7,1 Hz, 2H); 2,86 (d, J= 10,3 Hz, 2H); 3,74 (s, 2H); 4,09 (qt, J= 9,6 Hz, 4H); 7,17-7,33 (m, 5H). RMN 13C (CDCI3, 75 MHz ) : δ 16,6 (d, J = 5,8 Hz); 25,1; 26,7; 28,2; 32,8; 35,7; 49,2 (d, J =
156.2 Hz); 54,9 (d, J = 8,3 Hz); 59,7 (d, J = 8,3 Hz); 61,8 (d, J = 6,8 Hz); 80,0; 127,1; 128,3; 129,1; 139,1; 173,2.
RMN 31P (CDCI3, 161,9 MHz) : δ 25,8.
IR (cm"1, ATR) : v 2932; 1727; 1679; 1052.
Préparation du composé 23
A une solution contenant 250 mg (0,584 mmol) de l'aminé 22, 150 mg de palladium sur charbon dans 20 mL d'éthanol, de l'hydrogène est mis à barboter à l'aide d'un générateur d'hydrogène (0,1 bar). Le mélange est chauffé à reflux pendant 3h30. Après fïltration sur célite, et évaporation du solvant, on obtient 160 mg du composé 23 sous forme d'une huile (soit un rendement de 81 >). Le produit 23 présente les caractéristiques suivantes :
RMN 1H (CDCI3, 300 MHz) 1,31 (m, 8H); 1,41-1,61 (m, 13H) ; 2,18 (t, J= 7,5 Hz, 2H); 2,65
(t, J= 7,1 Hz, 2H); 2,95 (d, J= 12,5 Hz, 2H); 4,13 (m, 4H).
RMN 13C (CDCI3, 75 MHz ) : δ 16,6 (d, J= 5,4 Hz); 25,0; 26,7; 28,2; 29,5 ; 35,6; 45,3 (d, J =
154.3 Hz); 51,3 (d, J= 15,3 Hz); 62,1 (d, J= 6,7 Hz); 80,1; 173,2.
RMN 31P (CDC13, 161,9 MHz) : 0 26,4.
ESI+ / MS (CH2CI2): m/z 338,2 ([23+H]+, 100 %); 369,0 (45%); 373,6 (56%); 675,5 (21%);
780.4 (96%).
Préparation du composé 24 A une solution de K2C03, préalablement flambé, (2,17 g; 15,70 mmol) dans 8 mL d'acétonitrile, sous azote, le composé 23 (125 mg ; 0,37 mmol) et le produit de monosubstitution 19 (250 mg ; 0,498 mmol) sont ajoutés, puis le mélange est chauffé à 70°C pendant une nuit. Après fïltration, le solvant est évaporé; le produit brut est purifié sur colonne de silice (CH2C12 / MeOH gradient de 100/0 à 95/5). La masse du produit 24 obtenu est de 259 mg (92%).
RMN 1H (CDC13, 200 MHz) 1,26-1,59 (m, 37H) ; 2,18 (m, 2H); 2,63 (m, 2H); 2,94 (d, J = 10,4 Hz, 2H); 3,21 (d, J = 9,9 Hz, 2H); 3,88 (s déformé, 2H); 4,11 (m, 16H); 7,44 (m, 2H); 7,64 (m, 1H, H4).
RMN 31P (CDC13, 161,9 MHz) : δ 26,1.
IR (cm"1, ATR) : v 3476-2933, 1727, 1020.
ESI+/ MS (CH2C12): m/z 780,4 ([24+Na]+, 100 %).
Préparation du composé 25
A une solution d'ester 24 (400 mg ; 0,527 mmol) dans le dichlorométhane, sont ajoutés à 0°C, sous argon, 0,78 mL (10,54 mmol) d'acide trif uoroacétique. Le milieu évolue ensuite à température ambiante pendant une nuit. Le solvant est évaporé, le produit brut est purifié sur colonne de silice (CH2CI2 / MeOH gradient de 100/0 à 95/5). La masse d'acide 25 obtenu est de 254 mg (69%>). Les caractéristiques du composé 25 sont les suivantes :
RMN 1H (Acétone-d6, 300 MHz) : δ 1,26-1,33 (m, 20H); 1,49-1,66 (m, 4H); 2,05 (m, 2H); 2,24 (t, J= 7,2 Hz, 2H); 2,80 (m, 2H); 3,31 (m, 4H); 4,08-4,27 (m, 16H); 7,56 (m, 2H); 7,93 (t, J= 7,8 Hz, 1H).
RMN 31P (CDC13, 161,9 MHz) : δ 23,7-26,0 (m large).
IR (cm"1, ATR) : v 3477-2934, 1727, 1020.
ESI+ / MS (CH2CI2): m/z 430,2 (6%); 552,3 (8%); 594,6 (8%); 702,3 ([25+H]+, 100 %); 757,2 (27%); 774,4 (14%); 934,15 (10%).
Préparation du composé 26
A 190 mg (0,270 mmol) de l'acide 25 dans 10 mL de CH2C12, 152,42 mg (0,595 mmol) de carbonate de N,N'-disuccinimidyle, 0,19 mL (1,35 mmol) de triéthylamine sont ajoutés. A la fin de la réaction, le mélange réactionnel est évaporé à sec, repris dans du CH2CI2, puis lavé plusieurs fois avec une solution aqueuse saturée de NH4C1 jusqu'à disparition de la DSC (contrôle CCM). La phase organique est séchée sur Na2S04, filtrée, puis évaporée à sec. On obtient 133,5 mg de l'ester de N-hydroxysuccinimide 26 brut (62%>) dont les caractéristiques sont les suivantes : RMN 1H (CDCI3, 200 MHz) : δ 1,26-1,75 (m, 23H) ; 2,59 (m, 4H); 2,83 (s déformé, 5H); 2,94 (d, J = 10,6 Hz, 2H); 3,21 (d, J = 10,2 Hz, 2H); 3,88 (s déformé, 2H); 4,11 (m, 16H); 7,43 (m, 2H); 7,65 (m, 1H).
RMN 31P (CDCI3, 161,9 MHz) : δ 24,5.
ESI+ / MS (CH2CI2): m/z 799,3 ([26+H]+, 100 %); 822,0 (20%).
Préparation du composé L4
A une solution d'ester 26 (30 mg ; 0.0375 mmol) dans le dichlorométhane, sous argon, sont ajoutés 0,16 mL (1,40 mmol) de lutidine puis 0,15 mL (1,12 mmol) de TMSBr. L'agitation est maintenue environ 22 heures. Le solvant est ensuite évaporé. Le produit brut obtenu est repris avec du méthanol, qui est ensuite évaporé. Cette opération est effectuée de nouveau deux fois. Le solide obtenu est lavé plusieurs fois avec du dichlorométhane et avec du méthanol. Le produit final L4 est obtenu sous forme de sel de lutidinium (solide marron). Les caractéristiques du composé L4 brut sont les suivantes :
RMN 1H (D20, 300 MHz) : δ 1,38 (m, 3H); 1,62 (m, 3H); 1,84 (m, 3H); 2,39 (m, 2H); 2,70 (s, 3H); 2,77 (s, 4H) ; 3,28-3,75 (m, 13H); 4,92 (m, 3H); 7,45-7,64 (m, 4H); 7,99 (t, J = 7,8 Hz, 1H); 8,25 (m, 0,4H).
Exemple 5 : Marquage de la Streptavidine par le ligand L2
5.1. Mode opératoire
Dans un ballon de 1 mL contenant le ligand L2 (0,13 mg ; 13,2.10"9 mol) dans 200 μΐ^ d'une solution aqueuse de tampon bicarbonate d'ammonium (pH=8,05 ; C=200.10"3 mol.L"1), on ajoute la streptavidine (0,2 mg ; 3,3 nmol) en solution dans 20 d'eau. La solution obtenue est maintenue sous agitation à température ambiante pendant 15 h. Le mélange réactionnel est concentré et l'excès de ligand est éliminé par ultracentrifugation (VIVASPIN 500 Sartorius Stedim, cut-off 5000MWCO PES, vitesse de rotation : 1500 tr/min). La solution est soumise à 5 cycles de centrifugation de deux minutes chacun, avec ajout de 100 du tampon. Au terme de ces opérations, on recueille 100 de centrifugat. Ce dernier est analysé selon deux méthodes : la spectroscopie d'absorption UV- Visible et la spectrométrie de masse.
5.2. Analyse par spectroscopie de masse :
Le centrifugat a été analysé par spectrométrie de masse MALDI- MS.
Matrice : acide a-cyano-4-hydroxycinnamic.
Méthode de dépôt : Goutte séchée.
Le spectre de masse de la streptavidine non marquée (Figure 1), montre un pic majoritaire à 13038 unité de m/z. L'analyse du spectre de masse de la streptavidine marquée (Figure 2) montrent 3 pics majoritaires à 13049, 13860 et 14549, correspondants respectivement à un monomère de streptavidine non marquée (Strep), un monomère marqué par un ligand L2 (Strep-(L2)) et un monomère deux fois marqué (Strep(L2)2).
5.3. Spectroscopie UV- Visible :
On réalise un titrage de 25 μΐ, du centrifugat, soit 0,83 nmol de StrepL2 par une solution de TbCl3.6H20 (C=5,36.10~5 mol.L 1).
La complexation du métal par les groupements phosphonates des ligands liés à la Streptavidine déplace le maximum d'absorption de l'échantillon de 320 nm à 329 nm. Cette longueur d'onde est atteinte pour 210 de Tb ajoutés, soit 11 ,3 nmol de Strep TbL2 pour la formation de complexes 1 : 1. On en déduit un taux de marquage moyen de 13 ligands L2 par streptavidine.
Exemple 6 : Marquage de l'anticorps B28.13 par le ligand Li
L'anticorps de B28.13 est un anticorps dirigé contre la ténascine, une glycoprotéine extracellulaire qui se développe autour des tumeurs (tel que le cancer du côlon).
6.1 Analyse HPLC
Une méthode a été développée pour analyser l'anticorps par HPLC. Les analyses ont été effectuées sur une chaîne HPLC Alliance 2695 (Waters) équipée d'un détecteur UV à barrette de diodes Waters 2996. Les séparations ont été réalisées sur une colonne Poros RI 1x150 mm (10 μιη) (Applied Biosystems). Le flux était fixé à 0,4 mL/min, la température de la colonne était maintenue à 50 °C et le gradient utilisé était : solvant A : eau acidifiée (0,1% TFA), solvant B : acétonitrile acidifié (0,1% TFA). Le gradient commence à 5% de solvant B, est maintenu pendant 5 minutes puis augmenté linéairement à 85% en 25 minutes, puis de nouveau augmenté de nouveau à 95% en une minute et maintenu à 95% pendant 3 minutes. Une étape d'équilibration de la colonne dans 5% de solvant B suit l'élution. L'élution est suivie à 210 nm (Figure 3).
6.2 Analyses MALDI-TOF MS
Des analyses MALDI-TOF ont été effectuées sur l'anticorps. La solution d'anticorps est dessalée sur des ZipTip Cl 8 (Millipore). Une quantité de 70 pmol d'anticorps est chargée puis éluée dans 5 μΐ, H20/acétonitrile/HCOOH 20/75/5 (v/v/v). 0,6 μΐ, de l'échantillon (à peu près 8 pmol) sont déposés en triplicat sur une plaque MALDI MTP 348 (Brucker Daltonics) avec 0,6 μΐ, d'acide sinapinique (à 2mg/mL dans 50%> d'acétonitrile). Les analyses ont été effectuées en mode positif et le spectromètre de masse (Autoflex, Brucker Daltonics) était calibré sur une gamme m/z de 20000 à 190000 avec de la BSA. Le résultat est montré dans la figure 4.
Ce résultat a permis d'estimer la masse de l'anticorps B28.13 autour de 148000 Da.
6.3 Marquage de l'anticorps
L'expérience de marquage a été effectuée sur 230 μg (soit l,55xl0~9 mol) de l'anticorps B28.13 auquel 0,86 mg du ligand Li solide (pureté 30%) soit 3,5xl0~7 mol a été ajouté. Ce qui signifie 230 équivalents de ligand Li pour chaque anticorps. Le pH a été ajusté à 7 avec du tampon PBS et le milieu réactionnel était maintenu sous agitation pendant une heure à température ambiante.
Le milieu réactionnel a été purifié ensuite pour éliminer l'excès de ligand Li par ultrafïltration sur des modules vivaspin500 (Sartorius) avec un cut-off de 30 kDa et lavé plusieurs fois (20 cycles) avec un tampon Tris-HCl 0,01 M à pH 7.
Le milieu réactionnel a été ensuite déposé après dessalage sur ZipTip C18 sur une plaque MALDI comme décrit précédemment. Le résultat est présenté dans la figure 5.
Le spectre de masse montre un faible déplacement du pic [M+H]+ vers la droite dû à la masse du ligand Li qui s'ajoute à celle de l'anticorps. Au niveau du maximum, la différence est de 800 Da ce qui correspondrait à 1 ligand Li par anticorps.
6.4 Activité de l'anticorps après le marquage
L'activité de l'anticorps B28.13 marqué a été testée suite au marquage sur une coupe de cancer de côlon humain, puis révélée par un anticorps secondaire contenant un colorant. Ce test a révélé que l'anticorps était toujours affïn pour sa cible (Figure 6).
Exemple 7 : Marquage de l'anticorps dreg55 par le ligand L2
L'anticorps dreg55 est un anticorps monoclonal possédant une très forte affinité vis-à- vis de la L-sélectine.
7.1 Analyse HPLC
Une méthode a été développée pour analyser l'anticorps par HPLC. Les analyses ont été effectuées sur une chaîne HPLC Alliance 2695 (Waters) équipée d'un détecteur UV à barrette de diodes Waters 2996. Les séparations ont été réalisées sur une colonne Poros RI 1x150 mm (10 μιη) (Applied Biosystems). Le flux était fixé à 0,4 mL/min, la température de la colonne était maintenue à 50 °C et le gradient utilisé était le suivant : solvant A : eau acidifiée (0,1% TFA), solvant B : acétonitrile acidifié (0,1% TFA). Le gradient commence à 5% de solvant B, est maintenu pendant 5 minutes puis augmenté linéairement à 85% en 25 minutes puis augmenté de nouveau à 95% en une minute et maintenu à 95% pendant 3 minutes. Une étape d'équilibration de la colonne dans 5% de solvant B suit l'élution. L'élution est suivie à 210 nm (Figure 7).
7.2 Analyses MALDI-TOF MS
Des analyses MALDI-TOF ont été effectuées sur l'anticorps. La solution d'anticorps est dessalée sur des ZipTip C18 (Millipore). Une quantité de 70 pmol d'anticorps est chargée puis éluée dans 5 H20/acétonitrile/HCOOH 20/75/5 (v/v/v). 0,6 de l'échantillon (à peu près 8 pmol) sont déposés en triplicat sur une plaque MALDI MTP 348 (Brucker Daltonics) avec 0,6 d'acide sinapinique (à 2mg/mL dans 50%> d'acétonitrile). Les analyses ont été effectuées en mode positif (Figure 8) et le spectromètre de masse (Autoflex, Brucker
Daltonics) était calibré sur une gamme m/z de 20000 à 190000 avec de la BSA.
Ce résultat a permis d'estimer la masse de l'anticorps dreg55 autour de 148000 Da.
7.3 Marquage de l'anticorps
L'expérience de marquage a été effectuée sur 400 μg (100 μΐ, d'une solution à 4 mg/mL soit 2,7xl0"9 mol) de l'anticorps dreg55 auquel 0,65 mg de ligand L2 solide (3,4xl0~8 mol de ligand L2 contenant 17% de sels de lutidinium) a été ajouté, ce qui signifie 230 équivalents de ligand L2 pour chaque anticorps. Le pH a été ajusté à 7,3 avec du tampon PBS et le milieu réactionnel était maintenu sous agitation pendant une heure à température ambiante.
Le milieu réactionnel a été purifié ensuite pour éliminer l'excès de ligand L2 par ultrafïltration sur des modules vivaspin500 (Sartorius) avec un cut-off de 30 kDa et lavé plusieurs fois (20 cycles) avec un tampon Tris-HCl 0,01 M à pH 7,4.
Le milieu réactionnel (11 pmol) a été ensuite déposé après dessalage sur ZipTip C18 sur une plaque MALDI comme décrit précédemment (Figure 9).
Le spectre de masse montre un déplacement du pic [M+H]+ vers la droite dû à la masse du ligand L2 qui s'ajoute à celle de l'anticorps. Au niveau du maximum, la différence est de 7000 Da ce qui correspondrait à approximativement 9 ligands L2 par anticorps.
7.4 Dosage par fluorescence
Une estimation du nombre de ligand L2 par anticorps a été établie également par un dosage par fluorescence. Le dosage a été effectué sur 6,7x l0~n mol de l'anticorps marqué par ajouts successifs d'une solution de TbCl3 à 5x 10"6 M préparée dans une solution de Tris-HCl 0,01 M pH 7 (20 μν νΛ).
Les mesures ont été effectuées sur un spectrofluoromètre Horiba Jobin Yvon en utilisant un filtre à 390 nm et une longueur d'onde d'excitation Le spectre
Figure imgf000059_0001
d'émission était acquis de 400 à 750 nm et la lecture se faisait au maximum d'émission du terbium à 544 nm.
On observe une augmentation linéaire de la fluorescence mesurée à 544 nm suivie d'un plateau qui commence autour de 2x 10~9 mol de TbCl3 (Figure 10). L'intersection des deux droites correspond au point d'équivalence du dosage. Le rapport de cette quantité sur la quantité d'anticorps présente en solution donne le nombre de ligand L2 par anticorps. Ce nombre est évalué à 30 ligands L2 /anticorps.
7.5 Complexation avec le terbium
L'anticorps marqué a été complexé ensuite avec Tb3+ en ajoutant 3 équivalents d'une solution de TbCl3 à 5,35xl0"4 M dans une solution de Tris-HCl 0,01 M pH 7. Le milieu réactionnel a été purifié de nouveau par ultrafîltration (vivaspin500, cut-off 30 kDa) et lavé plusieurs fois (20 cycles) avec un tampon Tris-HCl 0,01 M à pH 7 pour éliminer l'excès de Tb3+.
7.6 Caractérisation par fluorescence de l'anticorps dreg55 marqué
Les mesures ont été effectuées sur un spectrofluoromètre Fluoromax de Horiba Jobin
Yvon dans une solution de Tris-HCl 0,01 M à pH 7.
7.6.1 Emission
La longueur d'onde d'excitation utilisée pour mesurer le spectre d'émission était 328 nm. L'acquisition a été faite de 400 à 750 nm, le maximum d'émission était mesuré à 544 nm (Figure 11).
7.6.2 Excitation
Le spectre d'excitation a été mesuré par rapport à une émission à 544 nm et acquis entre 250 et 450 nm (Figure 12).
Le spectre d'excitation montre un maximum à 328 nm.
7.6.3 Temps de vie
Le temps de vie du complexe a été mesuré en utilisant les longueurs d'onde d'excitation et d'émission établies précédemment
Figure imgf000059_0002
(Figure 13). La courbe montre une décroissance monoexponentielle de la luminescence ce qui indique la présence d'une seule espèce qui émet en solution. Le temps de vie mesuré est de 1,6 ms.
Exemple 8 : Marquage de l'anticorps dreg200 par le ligand L2
L'anticorps dreg200 est un anticorps de souris dirigé contre la L-sélectine. 8.1 Analyses MALDI - TOF MS
Une analyse MALDI-TOF a été effectuée sur l'anticorps. La solution d'anticorps a été dessalée sur ZipTip Cl 8 puis déposée sur une cible MALDI comme décrit précédemment. Le résultat est indiqué sur la figure 14.
Le spectre de masse MALDI montre que l'anticorps dreg200 a une masse molaire d'environ 150000 Da.
8.2 Marquage de dreg200
L'expérience de marquage a été effectuée sur 200 μg (25 d'une solution à 8 mg/mL soit l,32xl0"9 mol) de l'anticorps dreg200 auquel 0,27 mg de ligand L2 solide (2,58xl0~7 mol de ligand L2 contenant 17% de sels de lutidinium) a été ajouté, ce qui signifie 200 équivalents de ligand L2 pour chaque anticorps. Le pH a été ajusté à 7,3 avec du tampon PBS et le milieu réactionnel était maintenu sous agitation pendant une heure à température ambiante.
Le milieu réactionnel a été purifié ensuite pour éliminer l'excès de ligand L2 par ultrafïltration sur des modules vivaspin500 avec un cut-off de 30 kDa et lavé plusieurs fois (20 cycles) avec un tampon Tris-HCl 0,01 M à pH 7.
Le milieu réactionnel (11 pmol) a été ensuite déposé après dessalage par ZipTip C18 sur une plaque MALDI comme décrit précédemment. Le résultat est présenté sur la figure 15.
Le spectre MALDI montre un déplacement du pic [M+H]+ vers la droite de 8000 Da. Cette différence de masse correspond à peu près à 10 ligands L2 /anticorps.
8.3 Dosage par fluorescence
Une estimation du nombre de ligand L2 par anticorps a été établie également par un dosage par fluorescence. Le dosage a été effectuée sur 3,8x l0~n mol de l'anticorps marqué par ajouts successifs d'une solution de TbCl3 à 10"6 M préparée dans une solution de Tris-HCl 0,01 M à pH 7 (20 uL/ajout).
On observe une augmentation linéaire de la fluorescence mesurée à 544 nm suivie d'un plateau qui commence autour de 8x 10"10 mol de TbCl3 (Figure 16). L'intersection des deux droites correspond au point d'équivalence du dosage. Le rapport de cette quantité sur la quantité d'anticorps présente en solution donne le nombre de ligand L2 par anticorps. Ce nombre est évalué à 21 ligands L2 /anticorps. 8.4 Complexation avec le terbium
L'anticorps marqué a été complexé ensuite avec le Tb3+ en ajoutant 2 équivalents d'une solution de TbCl3 à 7,4xl0~5 M dans une solution de Tris-HCl 0,01 M à pH 7. Le milieu réactionnel a été purifié de nouveau par ultrafîltration (vivaspin500, cut-off 30 kDa) et lavé plusieurs fois (20 cycles) avec du tampon Tris-HCl 0,01 M à pH 7 pour éliminer l'excès de Tb3+.
Exemple 9 : Marquage de la L-sélectine par le ligand L2
Les expériences ont été effectuées sur 50 μg de L-sélectine (protéine recombinante humaine).
9.1 Analyse HPLC
Une méthode a été développée pour analyser la L-sélectine par HPLC. Les analyses ont été effectuées sur une chaîne HPLC Alliance 2695 (Waters) équipée d'un détecteur UV à barrette de diodes Waters 2996. Les séparations ont été réalisées sur une colonne Symmetry Cl 8 3.5 μιη, 4.6 x 75 mm (Waters). Le flux était fixé à 0,5 mL/min, la température de la colonne était maintenue à 40°C et le gradient utilisé était le suivant : solvant A : eau acidifiée (0,1% TFA), solvant B : acétonitrile acidifié (0,1% TFA). Le gradient commence à 5% de solvant B, est maintenu pendant 5 minutes puis augmenté linéairement à 85% en 25 minutes puis augmenté de nouveau à 95% en une minute et maintenu à 95% pendant 3 minutes. Une étape d'équilibration de la colonne dans 5% de solvant B suit l'élution. L'élution est suivie à 210 nm (Figure 17).
9.2 MALDI - TOF MS
Une analyse MALDI-TOF a été effectuée sur l'échantillon. La solution d'anticorps a été dessalée sur ZipTip C 18 puis déposée sur une cible MALDI comme décrit précédemment. Le pic [M+H]+ obtenu est relativement large et montre une masse de 72 kDa pour la L-sélectine (Figure 18).
9.3 Marquage de la L-sélectine
L'expérience de marquage a été effectuée sur une quantité de 46 μg (6,4xl0~9 mol) de
L-sélectine à laquelle a été ajouté 10 d'une solution de ligand L2 à 1,02 mg/mL (contenant 17%) de sels de lutidinium) préparée dans 0,005%) HC1 (pH ~ 3), ce qui signifie 15 équivalents de ligand L2 pour chaque équivalent de L-sélectine. Le pH a été ajusté à 7,3 avec du tampon PBS et le milieu réactionnel était maintenu sous agitation pendant une heure à température ambiante.
Le milieu réactionnel a été purifié ensuite pour éliminer l'excès de ligand L2 sur des colonnes Zeba (Thermo Scientifïc), cut-off 7 kDa (un seul passage). Les colonnes étaient conditionnées avec un tampon Tris-HCl 0,01 M à pH 7.
Le milieu réactionnel a été ensuite déposé après dessalage par ZipTip Cl 8 sur une cible MALDI comme décrit précédemment (Figure 19).
Le spectre MALDI montre un déplacement du pic [M+H]+ vers la droite de 2000 Da.
Cette différence de masse correspond à peu près à 3 ligands L2 /L-sélectine.
9.4 Complexation avec le terbium
L'échantillon de L-sélectine marquée a été complexé ensuite avec le Tb3+ en ajoutant 5 équivalents d'une solution de TbCl3 à 10"3 M dans une solution de Tris-HCl 0,01 M à pH 7.
Le milieu réactionnel a été purifié de nouveau sur une colonne Zeba (un seul passage) conditionnée avec un tampon Tris-HCl 0,01 M à pH 7 pour éliminer l'excès de Tb3+.
Exemple 10 : Marquage de l'anticorps PSS233 par le ligand L2
L'anticorps PSS233 est un anticorps anti PSA (Prostate Spécifie Antigen).
10.1 Analyse MALDI-TOF MS
Une analyse MALDI-TOF a été réalisée sur l'anticorps avant le marquage pour déterminer sa masse molaire. L'anticorps a été dessalé sur ZipTip C18 et puis déposé sur une cible MALDI comme décrit précédemment en utilisant l'acide sinapinique comme matrice (Figure 20).
L'analyse MALDI-MS montre que l'anticorps PSS233 possède une masse molaire de 150000 Da.
10.2 Marquage de PSS233
L'expérience de marquage a été effectuée sur 108 μg (7,2xl0~10 mol) de PSS233 auquel 0,8 mg de ligand L2 solide (7,7xl0~7 mol de ligand L2 contenant 17% de sels de lutidinium) a été ajouté, ce qui signifie 1065 équivalents de ligand L2 pour chaque anticorps. Le pH a été ajusté à 7,1 avec du tampon PBS et le milieu réactionnel était maintenu sous agitation pendant une heure à température ambiante.
Le milieu réactionnel a été purifié ensuite pour éliminer l'excès de ligand L2 par ultrafïltration sur des modules vivaspin500 avec un cut-off de 30 kDa et lavé plusieurs fois (20 cycles) avec un tampon Tris-HCl 0,01 M à pH 7. Le milieu réactionnel a été ensuite déposé après dessalage par ZipTip Cl 8 sur une plaque MALDI comme décrit précédemment (Figure 21).
Le spectre MALDI montre un déplacement du pic [M+H] de 5500 Da vers la droite. Cette différence de masse correspond à peu près à 7 ligands L2 /anticorps.
10.3 Complexation avec le terbium
L'anticorps marqué a été complexé ensuite avec le Tb3+ en ajoutant 2,2xl0"8 mol d'une solution de TbCl3 dans une solution de Tris-HCl 0,01 M pH 7. Le milieu réactionnel a été purifié de nouveau par ultra fïltration (vivaspin500, cut-off 30 kDa) et lavé plusieurs fois (20 cycles) avec du tampon Tris-HCl 0,01 pH 7 pour éliminer l'excès de Tb3+.
10.4 Caractérisation par fluorescence de l'anticorps PSS233 marqué
Les mesures ont été effectuées sur un spectrofluoromètre Fluoromax de Horiba Jobin Yvon dans du tampon Tris-HCl 0,01 M à pH 7.
10.4.1 Emission
La longueur d'onde d'excitation utilisée pour mesurer le spectre d'émission était 328 nm. L'acquisition se faisait de 400 à 750 nm, le maximum d'émission était mesuré à 544 nm (Figure 22).
10.4.2 Excitation
Le spectre d'excitation a été mesuré par rapport à une émission à 544 nm et acquis entre 250 et 450 nm (Figure 23).
Le spectre d'excitation montre un maximum à 329 nm.
10.4.3 Temps de vie
Le temps de vie du complexe a été mesuré en utilisant les longueurs d'onde d'excitation et d'émission établies précédemment
Figure imgf000063_0001
(Figure 24).
La courbe montre une décroissance monoexponentielle de la luminescence ce qui indique la présence d'une seule espèce qui émet en solution. Le temps de vie mesuré est de 1,94 ms.
Exemple 11 : Marquage de l'anticorps PSR222 par le ligand L2
L'anticorps PSR222 est un anticorps anti PSA (Prostate Spécifie Antigen). 11.1 Analyse MALDI-TOF MS
Une analyse MALDI-TOF a été réalisée sur l'anticorps avant le marquage pour déterminer sa masse molaire. L'anticorps a été dessalé sur ZipTip C18 et puis déposé sur une cible MALDI comme décrit précédemment en utilisant l'acide sinapinique comme matrice (Figure 25).
L'analyse MALDI-MS montre que l'anticorps PSR222 possède une masse molaire de 147500 Da.
11.2 Marquage de PSR222
L'expérience de marquage a été effectuée sur 75 μg (5xl0~10 mol) de PSR222 auquel
0,13 mg de ligand L2 solide (l,25xl0~7 mol de ligand L2 contenant 17% de sels de lutidinium) a été ajouté, ce qui signifie 250 équivalents de ligand L2 pour chaque anticorps. Le pH a été ajusté à 7,1 avec du tampon PBS et le milieu réactionnel était maintenu sous agitation pendant une heure à température ambiante.
Le milieu réactionnel a été purifié ensuite pour éliminer l'excès de ligand L2 par ultrafïltration sur des modules vivaspin500 avec un cut-off de 30 kDa et lavé plusieurs fois (20 cycles) avec un tampon Tris-HCl 0,01 M à pH 7.
Le milieu réactionnel a été ensuite déposé après dessalage sur ZipTip Cl 8 sur une plaque MALDI comme décrit précédemment (Figure 26).
Le spectre MALDI montre un déplacement du pic [M+H]+ de 2500 Da vers la droite.
Cette différence de masse correspond à peu près à 3 ligands L2 /anticorps.
11.3 Complexation avec le terbium
L'anticorps marqué a été complexé ensuite avec le Tb3+ en ajoutant 5,25xl0"9 mol d'une solution de TbCl3 dans une solution de Tris-HCl 0,01 M à pH 7. Le milieu réactionnel a été purifié de nouveau par ultra fîltration (vivaspin500, cut-off 30 kDa) et lavé plusieurs fois (20 cycles) avec du tampon Tris-HCl 0,01 M à pH 7 pour éliminer l'excès de Tb3+.
11.4 Caractérisation par fluorescence de l'anticorps PSR222 marqué
Les mesures ont été effectuées sur un spectrofluoromètre Fluoromax de Horiba Jobin Yvon dans du tampon Tris-HCl 0,01 M à pH 7.
11.4.1 Emission
La longueur d'onde d'excitation utilisée pour mesurer le spectre d'émission était 328 nm. L'acquisition se faisait de 400 à 750 nm, le maximum d'émission était mesuré à 544 nm. (Figure 27). 11.4.2 Excitation
Le spectre d'excitation a été mesuré par rapport à une émission à 544 nm et acquis entre 250 et 450 nm (Figure 28).
Le spectre d'excitation montre un maximum à 329 nm. 11.4.3 Temps de vie
Le temps de vie du complexe a été mesuré en utilisant les longueurs d'onde d'excitation et d'émission établies précédemment (Figure 29).
Figure imgf000065_0001
La courbe montre une décroissance monoexponentielle de la luminescence ce qui indique la présence d'une seule espèce qui émet en solution. Le temps de vie mesuré est de 2,17 ms. Exemple 12 : Marquage du fragment d'anticorps EgB4 par le ligand L2
EgB4 est un fragment d'anticorps (constitué d'un seul domaine monomérique variable d'un anticorps) dirigé contre le facteur de croissance épidermique (EGF).
12.1 Analyse MALDI-TOF MS
Une analyse MALDI-TOF a été effectuée sur le fragment d'anticorps. La solution de fragment d'anticorps a été dessalée sur ZipTip Cl 8 puis une quantité de 15 pmol de l'échantillon a été déposée sur une cible MALDI en utilisant l'acide sinapinique comme matrice. L'acquisition a été effectuée en mode positif sur la gamme m/z de 4000 à 40000. Le spectromètre de masse a été calibré en utilisant la myoglobine (Figure 30).
L'analyse MALDI montre que le fragment d'anticorps EgB4 a une masse molaire de 17200 Da.
12.2 Marquage du fragment d'anticorps EgB4
Le marquage a été effectué sur 270 μg (l,57xl0~8 mol) du fragment d'anticorps EgB4 auquel 1,58 mg de ligand L2 solide (l,33xl0~6 mol de ligand L2 contenant 27% de sels de lutidinium) ont été ajouté, ce qui signifie 85 équivalents de ligand L2 pour chaque fragment d'anticorps. Le pH a été ajusté à 7 avec du tampon PBS et le milieu réactionnel était maintenu sous agitation pendant une heure à température ambiante.
Le milieu réactionnel a été purifié ensuite pour éliminer l'excès de ligand L2 par ultrafiltration sur des modules vivaspin500 avec un cut-off de 10 kDa et lavé plusieurs fois (20 cycles) avec un tampon Tris-HCl 0,01 M à pH 7.
Le milieu réactionnel a été ensuite déposé après dessalage par ZipTip Cl 8 sur une plaque MALDI comme décrit précédemment mais aucun signal n'a pu être obtenu. 12.3 Gel SDS - PAGE Tricine
Afin d'obtenir une idée du taux de marquage, le fragment d'anticorps marqué a été déposé sur un gel SDS polyacrylamide tricine. Les gels ont été préparés selon une procédure décrite par H. Schâgger et G. Von Jagow (Analytical Biochemistry, 1987, 166, 368). Le remplacement de la glycine dans les gels classiques par la tricine permet une meilleure séparation des protéines de faible poids moléculaire. Le gel espaceur décrit par H. Schâgger et G. Von Jagow a été omis et la concentration en acrylamide utilisée pour les gels était de 16,5% T.
Avant dépôt sur gel, l'échantillon est dilué (avec un ratio d'au moins 1 :4) dans un tampon Laemmli, dont la préparation est décrite par U. K. Laemmli (Nature, 1970, 277, 680).
Le gel montre que le fragment d'anticorps a été totalement marqué et que le produit marqué a une distribution de masse entre 19 et 25 kDa, ce qui correspondrait a un taux de marquage entre 2 et 10 ligands L2 /fragment d'anticorps.
12.4 Complexation avec le terbium
La solution de fragment d'anticorps marqué a été complexée ensuite avec le Tb3+ en ajoutant 2,35xl0"7 mol d'une solution de TbCl3 dans 0,01 M Tris-HCl pH 7, soit 15 équivalent de Tb3+. Le milieu réactionnel a été purifié de nouveau par ultrafïltration (vivaspin500, cut-off 10 kDa) et lavé plusieurs fois (20 cycles) avec Tris-HCl 0,01 M à pH 7 pour éliminer l'excès de Tb3+. Un précipité s'est formé suite à l'ajout de la solution de Tb3+.
Exemple 13 : Marquage du fragment d'anticorps EgAl par le ligand L2
EgAl est un fragment d'anticorps dirigé contre le facteur de croissance épidermique
(EGF). 13.1 Analyse MALDI-TOF MS
Une analyse MALDI-TOF a été effectuée sur le fragment d'anticorps. La solution de fragment d'anticorps a été dessalée sur ZipTip Cl 8 puis une quantité de 15 pmol de l'échantillon a été déposée sur une cible MALDI en utilisant l'acide sinapinique comme matrice (Figure 32).
L'analyse MALDI montre que le fragment d'anticorps EgAl a une masse molaire de
17100 Da.
13.2 Marquage du fragment d'anticorps EgAl Le marquage a été effectué sur 115 μg (6,7xl0~9 mol) du fragment d'anticorps EgAl auquel 1,38 mg de ligand L2 solide (1,1x10 e mol de ligand L2 contenant 27% de sels de lutidinium) ont été ajoutés, ce qui signifie 170 équivalents de ligand L2 pour chaque fragment d'anticorps. Le pH a été ajusté à 7 avec du tampon PBS et le milieu réactionnel était maintenu sous agitation pendant une heure à température ambiante.
Le milieu réactionnel a été purifié ensuite pour éliminer l'excès de ligand L2 par ultrafïltration sur des modules vivaspin500 avec un cut-off de 10 kDa et lavé plusieurs fois (20 cycles) avec un tampon Tris-HCl 0,01 M à pH 7.
Le milieu réactionnel a été ensuite déposé après dessalage sur ZipTip C18 sur une cible MALDI comme décrit précédemment mais aucun signal n'a pu être obtenu.
13.3 SDS - PAGE
13.3.1 Gel SDS - PAGE Tricine
Afin d'obtenir une idée sur le taux de marquage, le fragment d'anticorps marqué a été déposé sur un gel SDS polyacrylamide tricine. Les gels ont été préparés comme décrit précédemment et la concentration en acrylamide utilisée pour les gels était de 16,5% T.
Avant dépôt sur gel, l'échantillon est dilué (avec un ratio d'au moins 1 :4) dans un tampon Laemmli.
Comme le montre la figure 33, le gel ne présente pas de variation de masse au niveau du fragment d'anticorps marqué. Une fraction du fragment d'anticorps paraît avoir une masse plus faible que le fragment d'anticorps non marqué. Aucune conclusion n'a pu être tirée de ce gel.
13.3.2 Gel SDS - PAGE Glycine
Un gel SDS - PAGE glycine a aussi été préparé pour cet échantillon avec une concentration en acrylamide 15% T. Avant dépôt sur gel, l'échantillon est dilué (avec un ratio d'au moins 1 :4) dans un tampon Laemmli.
Le gel (Figure 34) montre que le fragment d'anticorps a été totalement marqué et que le produit marqué a une distribution de masse entre 18 et 24 kDa, ce qui correspondrait a un taux de marquage entre 1 et 10 ligands L2 /fragment d'anticorps.
13.4 Complexation avec le terbium
La solution de fragment d'anticorps marqué a été complexée ensuite avec le Tb3+ en ajoutant lxlO"7 mol d'une solution de TbCl3 dans une solution de Tris-HCl 0,01 M à pH 7, soit 15 équivalents de Tb3+. Le milieu réactionnel a été purifié de nouveau par ultrafïltration (vivaspin500, cut-off 10 kDa) et lavé plusieurs fois (20 cycles) avec du tampon Tris-HCl 0,01 à pH 7 pour éliminer l'excès de Tb3+. Un précipité s'est formé suite à l'ajout de la solution de Tb3+.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composés de formule (I) suivante
Figure imgf000069_0001
dans laquelle
A représente
- soit un atome d'azote,
- soit un cycle comprenant de 3 à 6 atomes de carbone, soit un noyau aromatique comprenant de 5 à 10 chaînons, ledit cycle et le dit noyau comprenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S,
W représente
- soit un atome de brome, soit un atome d'iode,
- soit un groupe E-G-Q avec
* E choisi dans le groupe comprenant l'atome d'oxygène, un groupe -C≡C-, un groupe (CH2)m, m étant un nombre entier compris entre 0 et 5, et un groupe -CONH-,
* G est choisi dans le groupe comprenant
i) -(CH2)0, o étant un nombre entier compris entre 0 et 5, ii) -(CH2)n-NH-, n étant un nombre entier compris entre 0 et 5, iii) -(CH2)p-CO-NH-(CH2)q-NH-, p et q étant des nombres entiers compris entre 0 et 5, et
iv)
Figure imgf000069_0002
r, s et t étant chacun indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 0 et 5, et R2 et R3 représentant chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe (Ci-C4)alkyle ou un groupe hydrolysable
* Q représente soit un atome d'hydrogène, soit un groupe protecteur d' aminé, soit un groupe fonctionnel capable de former une liaison covalente avec les aminés primaires et secondaires, les alcools et les thiols et
X et Y représentent indépendamment l'un de l'autre,
- soit un atome d'hydrogène,
- soit un groupe
Figure imgf000070_0001
où u est un entier égal à 0 ou 1 , v et w, identiques ou différents sont des entiers égaux à 1 ou 2, R2 et R3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe (Ci-C4)alkyle ou un groupe hydrolysable choisi dans le groupe comprenant les esters et les amides et J est soit -CH2, soit est un noyau aromatique comprenant de 5 à 10 chaînons et éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S,
- soit un groupe
Figure imgf000070_0002
où ri, Si et ti sont chacun indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 1 et 2, et R2 et R3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe (Ci-C4)alkyle ou un groupe hydrolysable choisi dans le groupe comprenant les esters et les amides,
à condition que X, W et Y ne soient pas simultanément H,
et leur sels.
2. Composé selon la revendication 1 , dans lesquels :
X et Y, ou
X, W et Y,
ne sont pas simultanément H,
et les composés de formule suivante:
Figure imgf000071_0001
dans laquelle R représente H ou Et, sont exclus.
3. Composés selon la revendication 2, dans lesquels A représente un noyau aromatique comprenant de 5 à 10 chaînons et éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S.
4. Composé selon la revendication 3, dans lesquels A représente une pyridine.
5. Composés selon la revendication 4 caractérisés en ce que X et Y sont en position ortho de l'azote de la pyridine et W en position para de l'azote de la pyridine.
6. Composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisés en ce que W est choisi dans le groupe comprenant :
* Br
* -0-(CH2)3NHBoc,
Figure imgf000072_0001
7. Composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisés en ce que X et Y représentent chacun un groupe
Figure imgf000072_0002
8. Composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 dans laquelle J représente un groupe pyrazol-l-yle ou un groupe pyridin-2-yle.
9. Composés selon la revendication 4 caractérisés en ce que X et W sont en position ortho de l'azote de la pyridine et Y en position para de l'azote de la pyridine.
10. Composés selon la revendication 9, dans lesquels W représente un groupe E-G-Q, dans lequel :
* E représentant un groupe (CH2)m, m étant un nombre entier compris entre 0 et 5
* G représentant dans le groupe comprenant
i)
Figure imgf000073_0002
r, s et t étant chacun indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 0 et 5, et R2 et R3 représentant chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe (Ci-C4)alkyle ou un groupe hydrolysable,
* Q représentant soit un atome d'hydrogène, soit un groupe protecteur d' aminé, soit un groupe fonctionnel capable de former une liaison covalente avec les aminés primaires et secondaires, les alcools et les thiols,
X représente :
Figure imgf000073_0001
et Y représente H.
11. Procédé de préparation d'un composé de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 caractérisé en ce qu'il comprend une étape de déprotection sélective des esters phosphoniques ladite étape comprenant la mise en contact d'un composé de formule (I) portant une fonction activée et au moins une fonction ester phosphonique avec du bromure de triméthylsilyle dans un solvant tel que le dichlorométhane ou le chloroforme en présence de lutidine suivie d'une déprotection des esters silylés par un alcool, en particulier du méthanol.
12. Complexe entre un ion métallique et un ligand bifonctionnel selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.
13. Complexe selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il est en outre conjugué avec une structure cible choisie dans le groupe comprenant des composés bio logiquement actifs ou un support et que la formule (I)
Figure imgf000074_0001
est celle dans laquelle
A représente
- soit un atome d'azote,
- soit un cycle comprenant de 3 à 6 atomes de carbone, soit un noyau aromatique comprenant de 5 à 10 chaînons, ledit cycle et le dit noyau comprenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S,
W représente
- un groupe E-G-Q avec
* E choisi dans le groupe comprenant l'atome d'oxygène, un groupe -C≡C-, un groupe (CH2)m, m étant un nombre entier compris entre 0 et 5 et un groupe -CONH-,
* G est choisi dans le groupe comprenant i) -(CH2)0, o étant un nombre entier compris entre 0 et 5, ii) -(CH2)n-NH-, n étant un nombre entier compris entre 0 et 5, iii) -(CH2)p-CO-NH-(CH2)q-NH-, p et q étant des nombres entiers compris entre 0 et 5,
iv) -(CH2)m-CO-NH-(CH2)p-NHZ et v)
Figure imgf000075_0002
r, s et t étant chacun indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 0 et 5, et R2 et R3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe (Ci-C4)alkyle ou un groupe hydrolysable
* Q un groupe fonctionnel capable de former une liaison covalente avec les aminés primaires et secondaires, les alcools et les thiols, et
X et Y représentent indépendamment l'un de l'autre,
- soit un atome d'hydrogène, soit un groupe
Figure imgf000075_0001
où u est un entier égal à 0 ou 1 , v et w, identiques ou différents sont des entiers égaux à 1 ou 2, R2 et R3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe (Ci-C4)alkyle ou un groupe hydrolysable choisi dans le groupe comprenant les esters et les amides et J est soit -CH2, soit est un noyau aromatique comprenant de 5 à 10 chaînons et éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S,
- soit un groupe
Figure imgf000076_0001
où ri, Si et ti sont chacun indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 1 et 2, et R2 et R3 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe (Ci-C4)alkyle ou un groupe hydrolysable choisi dans le groupe comprenant les esters et les amides
à condition que X, W et Y ne soient pas simultanément H,
et leur sels pharmaceutiquement acceptables, constituant ainsi un complexe conjugué.
14. Système conjugué comprenant un ligand bifonctionnel de formule (I) tel que défini dans la revendication 10 et un composé bio logiquement actif ou un support.
15. Complexe selon l'une quelconque des revendications 12 et 13 ou système selon la revendication 14 caractérisé en ce que le ligand bifonctionnel est choisi dans le groupe comprenant Ll,
Figure imgf000077_0001
Figure imgf000078_0001
et L4 :
Figure imgf000078_0002
16. Agent diagnostic comprenant au moins un complexe selon l'une des revendications 12 et 13 et 15 ou au moins un système selon la revendication 14 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
17. Complexe selon l'une des revendications 12 et 13 et 15 ou au moins un système selon la revendication 11 pour son utilisation comme médicament.
18. Trousse pour préparer un agent de diagnostic comprenant un ligand bifonctionnel tel que défini dans la revendication 10.
19. Trousse pour préparer un agent de diagnostic selon la revendication 18, comprenant :
(1) un ligand bifonctionnel tel que défini dans la revendication 10.
(2) une solution d'un sel ou d'un chélate d'un radionucléide métallique.
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