JP2014522808A - 二官能性ホスホネートキレート剤 - Google Patents

二官能性ホスホネートキレート剤 Download PDF

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Abstract

本発明は、次の式（Ｉ）の化合物に関する：

ここで、Ａは、窒素原子か、環および芳香環が所望により、Ｎ、Ｏ、Ｓから選択される1つ以上のヘテロ原子を含み、３から６の炭素原子を含む環、または、５から１０のメンバーを含む芳香環を表し、Ｗはグラフト官能基を表し、ＸおよびＹはキレート官能基を表す。
【選択図】なし

Description

本発明は、反応性の化合物、該化合物から形成された錯体、該錯体の診断的または治療的使用に関する。
金属性医薬用診断的および治療的な薬剤の応用は、診断及び治療方法と同様に、生物学的および生命医学的研究においてますます重要な課題となりつつある。一般に、これらの薬剤は、対象に導入される場合、器官、組織または骨格構造などの事前に選択された目標に局在化する放射性同位体または常磁性金属を含む。この手法の目的が診断用である場合、選択した金属および金属錯体上の置換モデルに応じて、単光子放出、磁気共鳴およびＸ線を含む様々な手段で、放射性同位体、常磁性金属または放射線不透過性金属または発光性金属のインビボでの分布を表す画像を作製できる。検出された放射性同位体、常磁性金属または放射線不透過性金属または発光性金属の分布および対応する相対強度は、標的組織が占める空間を示すだけでなく、受容体、抗原、染色体異常、病的状態などの存在も示すことができる。この手法の目的が治療用である場合、その薬剤は通常放射性同位体を含み、かつ、ある放射線照射量を局所部位に送達する。
対象の標的器官または組織に応じて、かつ、診断または治療手法の状況に応じて、ある範囲の金属性医薬品を用いることができる。一般的に、これらの錯体は、放射性または常磁性または発光性金属、器官または組織の特定の部位に結合した、標的化のための担体薬剤、および金属をトランスポータと化学的に結合する連結を含む共役の形態である。
ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）は、ある種の癌を診断、および腫瘍の発生ならびに治療の有効性のモニタリングに使用されている非侵襲性医用画像法である。画像は、ポジトロンを放出する放射性トレーサー（放射活性分子）を生命体に注入して得る。
銅（64Ｃｕ）は、医用画像法の分野で興味の対象になってきている。ポジトロンを放出する放射性元素の寿命は、最も多く使用される放射性同位元素のフッ素（18Ｆ）より有意に長い。ガンマを放出する性格から銅（64Ｃｕ）は、組織内照射法による治療核医学において、興味の対象である（腫瘍について、制限された周辺での局所照射）。
使用する場合、64Ｃｕおよび67Ｃｕは、二官能性キレート剤（ＢＣＡ）に組込まれていなければならない。この二官能性により、一方において、金属に結合し、また、他方において、ある種の疾患、特に癌で過剰発現している受容体を標的にすることができ、生物学的に活性の巨大分子またはベクターとの共有結合が可能となる。
最も進んでいる錯化剤は、ポリアミノカルボキシレート型の非環状のキレート剤、または、テトラアザ−、ポリアミノカルボキシレートおよびポリアミノホスホネート型の大環状のキレート剤である。しかしながら、これらの銅キレート剤はインビボで中程度の安定性が有るのみであり、酸環境に関しては安定性に乏しく、金属の損失になる還元現象を起す。
従って、Ｓｍｉｔｈらは、64Ｃｕおよび67Ｃｕの同位体標識に関して、ＢＣＡとその使用の検討を行った(Journal of Inorganic Biochemistry, (2004), 98, 1874-1901)。前述のＢＣＡは、ポリアミノカルボンあるいはポリアミノホスホネート大環状、またはオープンのポリアミノカルボキシレートである。後者は、大環状と比べて熱力学的安定性がはるかに低い。
最近、米国特許出願公開第2010019627号は、カルボン酸官能基を有するサルコファギンに基づいた銅キレート大環状の二官能性剤を含む放射性医薬品について述べている。
Mezzarosらは（Inorganica Chimica Acta, (2010), 363, 1059-1069）、Ｔｃ−９９ｍのキレート剤である、ヒドラジノニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）に基づくＢＣＡについて述べている。ＨＹＮＩＣは活性化されたエステルの形態、特に、N-ハイドロスクシンイミド誘導体の形態で使用され、活性化されたエステル官能基と生体分子のアミン官能基との間で形成したアミド結合で該生体分子に結合している。しかしながら、金属との配位については、錯体の最終構造とその使用を不確実にする、追加の共配位子を使用する必要がある。
従って、安定的な錯体を得て、かつ、有機体に金属の放出を回避することが可能な二官能性配位子が必要である。
出願 EP0298939号は、通常の配位子よりもより安定的と言われているピリジン由来の二官能性配位子を述べているが、これらの新規の配位子のキレート官能基は依然としてカルボキシレート基である。
それで、本発明者らは、２、６−ビス［（Ｎ、Ｎ−ビス（メチレンホスホン酸）アミノメチル］ビピリジン単位、または、ビスピラゾリルピリジル単位に基づく一官能性配位子が、非常に安定な、特に、カルボキシル化相同体よりも非常に安定な、金属カチオンを有する錯体を形成することを示した(Abada S. et al., Dalton Trans (2010), 39, 9055-9062 and Nchnimi Nono et al. Inorganic Chemistry, 2011, 50, No. 5, 1689-1697)。
従って、本発明の目的は、先行技術の二官能性錯体と比べて、特に、安定性に優れた、改良された特性を有する二官能性錯体を提案することである。
それゆえ、本発明の主題は、新規化合物であり、金属イオンを用いた錯体の製造、生体高分子または担体を用いた共役の製造をする該化合物の使用、ならびに、マーカーとして得た錯体および共役の使用、ＮＭＲ用、ＭＲＩ画像化用、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）用および単一光子放出トモグラフィー（ＳＰＥＴ）用、蛍光顕微鏡法用、フルオロ−免疫学的解析用の緩和剤として、さらに、薬剤としての使用である。
従って、本発明の主題は、以下の式（Ｉ）の化合物およびそれらの塩である：
（ここで、
Ａは、以下を表す
− 窒素原子か、
− 環および芳香環が所望により、Ｎ、Ｏ、Ｓから選択される1つ以上のヘテロ原子を含み、３から６の炭素原子を含む環、または５から１０のメンバーを含む芳香環かのいずれか、
Ｗは、以下を表す
− 臭素原子か、ヨウ素原子かのいずれか、
− または、Ｅ−Ｇ−Ｑ基、ここで
*Ｅは、酸素原子、
mが0から5までの整数である(CH2)m基、そして-CONH-基を含む群から選択され、
*Ｇは、以下を含む群から選択され
ｉ）ｏが0から5の間の整数である、-(CH2)o、
ｉｉ）ｎが0から5の間の整数である、-(CH2)n-NH-、
iii）ｐとｑが0から5の間の整数である、-(CH2)p-CO-NH-(CH2)q-NH-、
ｉｖ）
（ここで、ｒ、s、ｔは、各々独立し、0から5までの整数であり、かつ、Ｒ2およびＲ3は各々独立して、水素原子、(C1-C4)アルキル基、または加水分解性基を表す）、
*Ｑは、水素原子か、アミノ保護基か、一級および二級アミン、アルコール、チオールと共有結合の形成が可能な官能基のいずれかを表し、かつ
ＸとＹは、各々独立して、次のいずれかを表し、
− 水素原子か、
− または
基を表し、
ここで、ｕは０か１の整数であり、同一であっても異なっていてもよく、ｖとｗは、１か２の整数であり、Ｒ2およびＲ3が、各々独立して、水素原子、(C1-C4)アルキル基、または、エステルならびにアミドを含む群から選択される加水分解性基を表し、かつ、Ｊは-CH2であるか、または、５から１０メンバーおよび所望によりＮ、Ｏ、Ｓから選択される1つ以上のヘテロ原子を含む芳香環のいずれかである、
− または
基を表し、ここで、ｒ1、ｓ1、ｔ1は、各々独立して、１と２の間の整数であり、Ｒ2とＲ3は、各々独立して、水素原子、(C1-C4)アルキル基、または、加水分解性基を表し、
ただし、条件としては、Ｘ、Ｗ、Ｙが同時にＨではない）。
式（Ｉ）のこれらの化合物は、ホスホン化キレート官能基およびグラフト官能基の両方を含む二官能性配位子である。式（Ｉ）の化合物および二官能性配位子の用語は、無差別に用いられる。
本発明の意味において、３から６の炭素原子を含む環とは、３、４、５、または６炭素原子を骨格とする飽和炭素環を意味する。該環では、1つ以上の炭素原子が、窒素、酸素、または硫黄原子から選択される炭素原子以外の他の原子で置換され得る。例を挙げると、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、オキシラン、アジリジン、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロフラン、ピペリジン、ジオキサン、ピロリジン、モルホリン、オキサチオラン基などが言及できる。
芳香環とは、５、６、７、８、９、または１０の炭素原子の骨格を含む不飽和炭素原子である。該環では、1つ以上の炭素原子は、窒素、酸素、または硫黄原子から選択される炭素以外の原子で置換され得る。例を挙げると、フェニル、ベンジル、ナフチル、ピラン、ピロール、チオフェン、フラン、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン、イミダゾール、チアゾール、オキサゾール、プリン、ピラゾール、トリアゾール、テトラゾール、チアジアゾール、ベンゾチアゾールなどを言及できる。
(C1-C4)アルキル基とは、メチル、プロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、または、ｔｅｒｔ‐ブチル基を含む群から選択される１から４の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖の基を意味する。
加水分解性基とは、その場で加水分解して遊離ＯＨ官能基を得ることができる基を意味する：（ａ）Ｒが上記に定義した(C1-C4)アルキル基か、アリ−ル基、特にフェニル基またはベンジル基のいずれかを表す-COOR エステル基、（ｂ）RおよびR’が各々独立して、水素原子か、上記に定義した(C1-C4)アルキル基、またはアリール基、特にフェニル基またはベンジル基のいずれかを表す−CONRR’アミド基、（ｃ）RおよびR’が各々独立して、上記に定義した(C1-C4)アルキル基、またはアリール基、特にフェニル基またはベンジル基のいずれかを表す-R-O-R' エーテル基などが例として挙げられる。
アミノ保護基とは、従来から使用されている基、特に、Bｏｃ、Fｍｏｃ、アシル、トリフルオロアセトアミド、ベンジル、トシル、フタルイミド基を意味する。
生物学的に活性な分子または担体の一級および二級アミン、アルコール、チオールと共有結合の形成が可能な官能基は、これらの基の官能基として選択され、かつ、当該選択は当事者がなしうるものである。従って、この官能基および反応する基が、両方とも求電子基であるか、両方とも求核性基である場合、結合（例えば、-SH + HS-->-SS-）を形成するために酸化的カプリングが実施し得るか、二官能性カプリング剤を活性化することで、2基のうちの1つが、逆のタイプの基に化学的に変換され得る。この官能基が求核性基であり、かつ、反応する基が求電子基またはその逆である場合、一般的に、これらの2つの基は、事前の活性化することなしに互いに反応し得る。これにより、活性分子が遊離アミン基を有するタンパク質である場合、この官能基は、当該アミンを用いてアミド官能基の形成が可能な活性された酸官能基を有することができる；活性分子が遊離チオール基を有するタンパク質である場合、この官能基は、当該チオールを用いてチオエステル官能基の形成が可能な活性された酸官能基を有し得る。従って、一級および二級アミン、アルコール、チオールと共有結合の形成が可能なこの官能基は、イソチオシアナト、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、スクシンイミド、ピリジルチオ、メルカプト、マレイミド、カルボキシル基およびエステル誘導体（Ｎ-ヒドロキシ-スクシンイミド、ヒドロキシベンゾトリアゾール、ペンタフルオロフェニル基など）、ヒドロキシル、アルデヒド、アミノ、ジアゾニウム、トシル、メシチリル、トレキシル、ホスホジエステル、ホスホトリエステルを含む群から選択され得る。
生物学的活性分子とは、特異的な親和性に関与できる分子、特に、抗原、抗体、それらのフラグメント、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ホルモン、リンフォカイン、増殖因子、アルブミン、サイトカイン、酵素、免疫原性の調節因子、受容体という意味である。例を挙げると、特に、癌（リンパ腫、癌腫、肉腫、白血病、骨髄腫または中枢神経の腫瘍）、炎症性疾患、心血管疾患（血栓、塞栓、梗塞、アテローム性プラークなど）および感染症などの種々の病状の関連する抗原と反応することが可能な抗体または抗体フラグメントなどを言及できる。
本発明では、人に投与可能な、一級および二級アミン、アルコール、チオールから選択される群を有する担体は、特に、ポリマビーズ、あるいは、金属または半導体ナノ粒子の形態で、当事者に周知の任意の形態で提示し得る。これら担体に関しては当事者に知られており、かつ、文献に詳しく記載されている。
本発明では、塩とは、当事者に周知の何らかの塩、特に、医学的に、または、生物学的に許容可能な塩、例えば、有機あるいは無機塩、さらに例えを挙げれば、アルカリ金属の塩、アルカリ土類塩、水溶性あるいは水不溶性のアンモニウム塩を意味する。例を挙げると、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム塩などを言及できる。
有利な実施形態では、本発明の主題は、以下の式（Ｉ）の化合物およびそれらの塩である：
（ここで、
Ａは以下を表す
− 窒素原子か、
− 環および芳香環が所望により、Ｎ、Ｏ、Ｓから選択される1つ以上のヘテロ原子を含み、３から６の炭素原子を含む環、または５から１０のメンバーを含む芳香環かのいずれか、
Ｗは、以下を表す
− 臭素原子か、ヨウ素原子かのいずれか
− または、以下を有するＥ−Ｇ−Ｑ基、ここで
*Ｅは、酸素原子、
mが0から5までの整数である(CH2)m基、そして-CONH-基を含む群から選択される、
*Ｇは、以下を含む群から選択される
ｉ）ｏが0から5の間の整数である-(CH2)o、
ｉｉ）ｎが0から5の間の整数である-(CH2)n-NH-、
iii）ｐとｑが0から5の間の整数である-(CH2)p-CO-NH-(CH2)q-NH-、
ｉｖ）
（ここで、ｒ、s、ｔは、各々独立し、0から5までの整数であり、かつ、Ｒ2およびＲ3は、各々独立して、水素原子、(C1-C4)アルキル基、または加水分解性基を表す）、
*Ｑは、水素原子か、アミノ保護基か、一級および二級アミン、アルコール、チオールと共有結合の形成が可能な官能基のいずれかを表す、
ＸとＹは、各々独立して、次のいずれかを表し、
− 水素原子か、
− または
基を表し、ここで、ｕは０か１の整数であり、同一であっても異なっていてもよく、ｖとｗは、１か２の整数であり、Ｒ2およびＲ3が、各々独立して、水素原子、(C1-C4)アルキル基、または、エステルならびにアミドを含む群から選択される加水分解性基を表し、かつ、Ｊは-CH2であるか、または、５から１０メンバーおよびを所望によりＮ、Ｏ、Ｓから選択される1つ以上のヘテロ原子含む芳香環のいずれかであり、
− または
基を表し、ここで、ｒ1、ｓ1、ｔ1は、各々独立して、１と２の間の整数であり、Ｒ2とＲ3は、各々独立して、水素原子、(C1-C4)ルキル基、または、加水分解性基を表し、
ただし、条件としては、
-ＸおよびＹ、または
-Ｘ、ＷおよびＹ
が同時にＨではない）
かつ、以下の式の化合物：
（ここで、Ｒ' はＨまたはＥｔを表す）
を除く。
有利な実施形態では、本発明の主題は、以下の式（Ｉ）の化合物である：
（ここで、
− Ａは上記で定義した通りであり、
− Ｗは、酸素原子、
-CONH-基を含む群から選択されるＥを除き、上記で定義した通りであり、
− ＸとＹは、同時にＨを表せないことを除き、上記で定義した通りである）。
有利な実施形態では、Ａは、５から１０メンバーおよび所望によりＮ、Ｏ、Ｓから選択される1つ以上のヘテロ原子を含む芳香環を表し、特に、Ａはピリジン、より有利には、Ｘ基により２位（窒素のオルト位）に、Ｗ基により４位（窒素のパラ位）に、および、Ｙ基により６位（窒素のオルト位）に置換されるピリジンを表すが、Ｘ、Ｙ、Ｗは式（Ｉ）において上記に定義された通りである。
有利な実施形態では、ＡがＸ基により２位（窒素のオルト位）に、Ｗ基により４位（窒素のパラ位）に、および、Ｙ基により６位（窒素のオルト位）に置換されるピリジンを表す、式（Ｉ）の化合物は、以下の式（Ｉ-ａ）である：
（ここで：
Ｗは、以下を表す
− 臭素原子か、ヨウ素原子かのいずれか、
− または、以下を有するＥ−Ｇ−Ｑ基、ここで
*Ｅは、酸素原子、
mが0から5までの整数である(CH2)m基、そして-CONH-基を含む群から選択される、
*Ｇは、以下を含む群から選択される
ｉ）ｏが0から5の間の整数である、-(CH2)o、
ｉｉ）ｎが0から5の間の整数である、-(CH2)n-NH-、
iii）ｐとｑが0から5の間の整数である、-(CH2)p-CO-NH-(CH2)q-NH-、
ｉｖ）
（ここで、ｒ、s、ｔは、各々独立し、0から5までの整数である、かつ、Ｒ2およびＲ3は、各々独立して、水素原子、(C1-C4)アルキル基、または加水分解性基を表す）、
*Ｑは、水素原子か、アミノ保護基か、一級および二級アミン、アルコール、チオールと共有結合の形成が可能な官能基のいずれかを表し、
ＷがＨを表す化合物を除き、かつ、
ＸとＹは、各々独立して、次のいずれかを表し、
− 水素原子か、
− または
基を表し、ここで、ｕは０か１の整数であり、同一であっても異なっていてもよく、ｖとｗは、１か２の整数であり、Ｒ2およびＲ3が、各々独立して、水素原子、(C1-C4)アルキル基、または、エステルならびにアミドを含む群から選択される加水分解性基を表し、かつ、Ｊは-CH2であるか、または、５から１０メンバーおよび所望によりＮ、Ｏ、Ｓから選択される1つ以上のヘテロ原子を含む芳香環のいずれかであり、
− または
基を表し、ここで、ｒ1、ｓ1、ｔ1は、各々独立して、１と２の間の整数であり、Ｒ2とＲ3は、各々独立して、水素原子、(C1-C4)ルキル基、または、加水分解性基を表し、
ただし、条件としては、ＸとＹが同時にＨではない）。
有利な実施形態では、ＡがＸ基により２位（窒素のオルト位）に、Ｗ基により４位（窒素のパラ位）に、および、Ｙ基により６位（窒素のオルト位）に置換されるピリジンを表し、式（Ｉ）の化合物は、以下の式（Ｉ-ａ）である：
（ここで：
Ｗは、以下を表す
− 臭素原子か、ヨウ素原子かのいずれか、
− または、以下を有するＥ−Ｇ−Ｑ基、ここで
*Ｅは、酸素原子、
そして-CONH-基を含む群から選択される、
*Ｇは、以下を含む群から選択される
ｉ）ｏが0から5の間の整数である、-(CH2)o、
ｉｉ）ｎが0から5の間の整数である、-(CH2)n-NH-、
iii）ｐとｑが0から5の間の整数である、-(CH2)p-CO-NH-(CH2)q-NH-、
ｉｖ）
（ここで、ｒ、s、ｔは、各々独立し、0から5までの整数であり、かつ、Ｒ2およびＲ3は、各々独立して、水素原子、(C1-C4)アルキル基、または加水分解性基を表す）、
*Ｑは、水素原子か、アミノ保護基か、一級および二級アミン、アルコール、チオールと共有結合の形成が可能な官能基のいずれかを表し、
ＸとＹは、各々独立して、次のいずれかを表し、
− 水素原子か、
− または
基を表し、ここで、ｕは０か１の整数であり、同一であっても異なっていてもよく、ｖとｗは、１か２の整数であり、Ｒ2およびＲ3が、各々独立して、水素原子、(C1-C4)アルキル基、または、エステルならびにアミドを含む群から選択される加水分解性基を表し、かつ、Ｊは-CH2であるか、または、５から１０メンバーおよび所望によりＮ、Ｏ、Ｓから選択される1つ以上のヘテロ原子を含む芳香環のいずれか、
− または
基を表し、ここで、ｒ1、ｓ1、ｔ1は、各々独立して、１と２の間の整数であり、Ｒ2とＲ3は、各々独立して、水素原子、(C1-C4)アルキル基、または、加水分解性基を表し、
ただし、条件としては、ＸとＹが同時にＨではない）。
有利な実施形態では、式（Ｉ）において、Ａは、５から１０メンバーおよび所望によりＮ、Ｏ、Ｓから選択される1つ以上のヘテロ原子を含む芳香環を表し、特に、Ａはピリジン、より有利には、Ｘ基で２位（窒素のオルト位）に、Ｙ基で４位（窒素のパラ位）に、および、Ｗ基により６位（窒素のオルト位）に置換されるピリジンを表すが、Ｗ、Ｘ、Ｙは式（Ｉ）において上記に定義された通りである。
有利な実施形態では、ＡがＸ基により２位（窒素のオルト位）に、Ｙ基により４位（窒素のパラ位）に、および、Ｗ基により６位（窒素のオルト位）に置換されるピリジンを表し、式（Ｉ）の化合物は、以下の式（Ｉ-ｂ）である：
（ここで：
ＷおよびＸがＨを表す化合物を除き、Ｗ、Ｘ、Ｙは式（Ｉ）で定義された通りである）。
有利な実施形態では、ＡがＸ基で２位（窒素のオルト位）に、Ｙ基で４位（窒素のパラ位）に、および、Ｗ基で６位（窒素のオルト位）に置換されるピリジンを表し、式（Ｉ）の化合物は、以下の式（Ｉ-ｃ）である：
（ここで：
Ｗは、以下で表されるＥ−Ｇ−Ｑ基を表す
*Ｅは、mが0から5までの整数である(CH2)m基を表し
*Ｇは、以下を含む基を表し
ｉ）
（ここで、ｒ、s、ｔは、各々独立して、0から5までの整数であり、かつ、Ｒ2およびＲ3は、各々独立して、水素原子、(C1-C4)アルキル基、または加水分解性基を表す）、
*Ｑは、水素原子か、アミノ保護基か、一級および二級アミン、アルコール、チオールと共有結合の形成が可能な官能基のいずれかを表し、
ＷがＨを表す化合物を除き、
Ｘは、Ｈを除き式（Ｉ）で定義された通りであり、
ＹはＨを表す）。
有利な実施形態では、式（Ｉ-ｃ）において、Ｗは式（Ｉ-ｃ）で定義したＥ-Ｇ-Ｑ基を表し、
Ｘは以下を表し：
そして、ＹはＨを表す。
本発明の有利な実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、Ｗが以下を含む群から選択されるものであり：
*Br
*-O-(CH2)3NHBoc
本発明の有利な実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、各々独立して、ＸおよびＹは次の基を表す、
（ここで、J、R2、R3、u、v、wは上記で定義された通りである）。
本発明の特に有利な形態では、式（Ｉ）の化合物は、Ｊがピラゾール‐1‐イル基またはピリジン‐2‐イル基を表すものである。
本発明の更に有利な形態では、化合物は、以下となる：
Ｘは次の基を表し
そして、Ｙは次の基を表し
（ここで、J、R2、R3、u、v、w、t1、r1、s1は上記に定義された通りである）。
本発明の化合物の例は、以下の式に対応する。
本発明の化合物は、市販の、または、文献に記載された合成法による化合物から当事者に知られている標準的な方法で合成し得る。
本発明の化合物を合成する際の重要なステップは、活性化された官能基の存在下でのホスホン酸エステルを選択的脱保護するステップである。このステップは、ルチジンの存在下で、ジクロロメタンまたはクロロホルムなどの溶液中のトリメチルシリルブロミドの存在下で実施し、続いて、アルコール、特に、メタノールでシリル化エステルの脱保護をする。
また、本発明のさらなる目的は、活性化された官能基の存在下でのホスホン酸エステルの選択的脱保護のステップを含む式（Ｉ）の化合物の製造法である。このステップは、活性化された官能基を有する式（Ｉ）の化合物および少なくとも1つのホスホン酸エステル官能基を、ルチジンの存在下で、ジクロロメタンまたはクロロホルムなどの溶液中のトリメチルシリルブロミドとの接触を含み、続いて、アルコール、特に、メタノールで、シリル化エステルの脱保護をする。
本発明の化合物は、ポリアミノホスホネート末端基および活性化された化学的官能基を含む側鎖を有する、多置換芳香環、特に多置換ピリジン核を中央単位として有する。この革新的構造により、この分子は、特に、ホスホネート単位で、選択的に、かつ、強力に、特定の金属のキレートが可能である。カルボキシレート基と比較してみると、ホスホネート基は、金属と形成された錯体において、より優れた安定性を付与する。対象とする用途が、放射性元素を含んだ画像法（ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ）などの、非常に僅かな量のカチオンを必要とする場合、あるいは、二官能性キレート剤を長期間（数日間）使用しなければならない場合には、この点は大変重要である。この場合、二官能性キレート剤（例えば、官能化された1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸 （ＤＯＴＡ））は、インビボでの十分な安定性が無く、放射性元素は有機体に放出する（Boswell A. et al. J. Med. Chem. 2004, 47, 1465）。
従って、本発明の更なる主題は、式（Ｉ）の少なくとも1つの化合物に配位した、少なくとも1つの金属イオンを含む錯体である。
例を挙げると、金属イオンとしては、ガンマ線放出放射性金属、ポジトロン放出放射性金属、アルファ線放出放射性金属、ベータ線放出放射性金属、または、オージェ電子放出放射性金属などが言及できる。また、常磁性、蛍光、または、燐光の性質について、非放射性金属の使用も可能である。例を挙げると、ランタニド（ユーロピウム、テルビウム、サマリウム、ジスプロシウム、エルビウム、イッテルビウム、プラセオジム、ネオジム）、鉄、コバルト、ニッケル、銅（64Ｃｕおよび67Ｃｕ）、亜鉛、砒素、セレニウム、モリブデン、テクネチウム、ルテニウム、パラジウム、銀、カドミウム、インジウム、アンチモン、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金、金、水銀、タリウム、鉛、ビスマス、ポロニウム、ガリウム、ジルコニウム、イットリウム、スカンジウム、アスタチンなどが言及できる。これらすべての金属は、そのままでの使用、または、当事者に周知の塩の形態での使用が可能である。
これは当事者に周知の技術で製造でき、特に、式（Ｉ）の化合物またはその塩と金属塩とを等モル混合し、混合液を加熱冷却し、次にｐＨ６から８の間に中和した後、最後に、周囲温度で錯体を回収することによって製造できる。
本発明の有利な実施形態では、式（Ｉ）の配位子を用いて生成した錯体の金属は、テルビウムである。
また、活性化された化学的官能基を含む側鎖が存在するので、本発明の化合物は、活性化された官能基を含む該側鎖を経由して生物学的標的（タンパク質、抗体、ペプチド）上に共有結合でグラフトすることが可能である。
従って、本発明の主題は、式（Ｉ）の化合物、
（ここで
Ｗは以下を表す：
− Ｅ−Ｇ−Ｑ基、ここで
*Ｅは、酸素原子、
mが0から5までの整数である(CH2)m基、そして-CONH-基を含む群から選択される、
*Ｇは、以下を含む群から選択され
ｉ）ｏが0から5の間の整数である、-(CH2)o、
ｉｉ）ｎが0から5の間の整数である、-(CH2)n-NH-、
iii）ｐとｑが0から5の間の整数である、-(CH2)p-CO-NH-(CH2)q-NH-、
（ここで、ｒ、s、ｔは、各々独立し、0から5までの整数であり、かつ、Ｒ2およびＲ3は、各々独立して、水素原子、(C1-C4)アルキル基、または加水分解性基を表す）、
*Ｑは、水素原子か、アミノ保護基か、一級および二級アミン、アルコール、チオールと共有結合の形成が可能な官能基のいずれかを表す）
を用いて生成した少なくとも1つの錯体、共役系を生成する、生物学的に活性な化合物または担体を含む群から選択される標的構造を含む配位子である。
有利な実施形態では、共役系は、以下で構成される：
−抗体、特に、テナシンに対するＢ28.13抗体が結合した配位子Ｌ１、または
−以下が結合した配位子Ｌ２：
*抗体は、特に、L-セレクチンに対する強い親和性を有するdreg55抗体、または、L-セレクチンに対するマウス抗体のdreg200抗体、あるいは、「前立腺特異的抗原」（ＰＳＡ）抗体のＰＳＳ２３３抗体、あるいは、抗「前立腺特異的抗原」（ＰＳＡ）抗体のＰＳＲ２２２抗体、あるいは、EgB4抗体、１つの可変ドメインにより構成され、かつ、上皮成長因子に対する抗体フラグメント、または、EgA１抗体、１つの可変ドメインにより構成され、かつ、上皮成長因子に対する抗体フラグメントに、または、
*タンパク質は、特に、L-セレクチンに。
B28.13抗体は、S. Wagnerら（"Early osteoarthritic changes of human femoral head cartilage subsequent to femoro-acetabular impingement", Osteoarthritis and Cartilage, 2003, 11, 508）に従って得ることができる。
dreg55およびdreg20抗体は、Man Sung Coら（"Properties and pharmacokinetics of two humanized antibodies specific for L-selectin", Immunotechnology 4 (1999) 253-266）に従って得ることができる。
PSS２３３抗体、PSR222抗体およびEgB4またはEggA1フラグメントは、THERMO FISHER SCIENTIFIC CD NIMES CEZANNE, 280 allee Graham Bell, Parc Scientifique Georges Besse, 30035 Nimes Cedex 1 Franceから得ることができる。
有利な実施形態では、共役系は、以下で構成される：
−抗体、特に、テナシンに対するB28.13抗体が結合した配位子Ｌ１、または
−以下が結合した配位子Ｌ２：
*抗体は、特に、抗体結合がL-セレクチンに対する強い親和性を有するdreg55またはdreg200抗体、L-セレクチンに対するマウス抗体など、または
*タンパク質は、特に、L-セレクチンに。
本発明の更なる主題は、式（Ｉ）の化合物、
（ここで
Ｗは以下を表す：
− E-G-Q基、ここで
*Ｅは、酸素原子、
mが0から5までの整数である(CH2)m基、そして-CONH-基を含む群から選択される、
*Ｇは、以下を含む群から選択される
ｉ）ｏが0から5の間の整数である、-(CH2)o、
ｉｉ）ｎが0から5の間の整数である、-(CH2)n-NH-、
iii）ｐとｑが0から5の間の整数である、-(CH2)p-CO-NH-(CH2)q-NH-、
iｖ）
（ここで、ｒ、s、ｔは、各々独立し、0から5までの整数であり、かつ、Ｒ2およびＲ3は、各々独立して、水素原子、(C1-C4)アルキル基、または加水分解性基を表す）、
*Ｑは、水素原子か、アミノ保護基か、一級および二級アミン、アルコール、チオールと共有結合の形成が可能な官能基のいずれかを表す）
を用いて生成した少なくとも1つの錯体、式（Ｉ）の該化合物に配位する金属および共役系を生成する、生物学的に活性な化合物または担体を含む群から選択される標的構造を含む配位子である。
この錯体は当事者に周知の技術で製造でき、特に、式（Ｉ）の化合物と水性媒体中の水溶性金属塩との等モル混合、続けて、沈殿または蒸発乾固またはクロマトグラフィーでの錯体の単離によって製造することができる。
本発明の更なる主題は、式（Ｉ）の二官能性剤、（ここで、
Ｗは以下を表す：
− Ｅ−Ｇ−Ｑ基、ここで
*Ｅは、酸素原子、
mが0から5までの整数である(CH2)m基、そして-CONH-基を含む群から選択される、
*Ｇは、以下を含む群から選択される
ｉ）ｏが0から5の間の整数である、-(CH2)o、
ｉｉ）ｎが0から5の間の整数である、-(CH2)n-NH-、
iii）ｐとｑが0から5の間の整数である、-(CH2)p-CO-NH-(CH2)q-NH-、
iｖ）
（ここで、ｒ、s、ｔは、各々独立し、0から5までの整数であり、かつ、Ｒ2およびＲ3は、各々独立して、水素原子、(C1-C4)アルキル基、または加水分解性基を表す）、
*Ｑは、水素原子、アミノ保護基、または生物学的に活性な分子または担体の一級および二級アミン、アルコール、チオールと共有結合の形成が可能な官能基のいずれかを表す）
および生物学的に活性の化合物または担体を含む共役系である。
この共役系は当事者に周知の技術で製造でき、特に、緩衝水性媒体中で、式（Ｉ）の二官能性剤と生物学的に活性な化合物または担体とのカップリング反応で製造でき、温度は4℃から40℃の間で行い、次に、クロマトグラフィーによる精製と続ける。
本発明の特に有利な形態では、本発明の錯体または本発明の共役系は、上記に定義したＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４を含む群から選択される二官能性配位子を用いて生成する。
ホスホン官能基を有する錯体については、多くの文献に記載されているが、生物学的化合物にそのような構造を共有結合させるための活性化官能基の導入については初めてのことである。これまで報告されたグラフト官能基を有する分子は、その官能基が一般的にカルボキシレートである誘導体であり、そのためカチオンの錯体形成がかなり弱く、このことはｐＨが低下するときに顕著である。
有利な実施形態では、錯化共役系は、金属、特にテルビウムへ錯体化した、上記の共役系で構成される。
本発明の更なる主題は、本発明の式（Ｉ）の少なくとも1つの化合物または本発明の錯体を含む診断薬である。
この薬は、当事者に周知の画像技術に使用することができ、特に、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、Ｘ線による放射線撮影、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放出型断層撮影（ＳＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ）、放射線撮影、ルミネセンス分光法で使用できる。
本発明では、診断薬は、Ｅｕ、Ｙｂ、Ｇｄ、Ｄｙ、Ｔｂ、Ｈｏ、ＥｒまたはＦｅなどの金属イオンを用いて核磁気共鳴においてイメージング剤として、Ｂｉ、Ｐｂ、またはＯｓなどの金属イオンを用いてＸ線イメージング剤として、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｇａ、Ｇｅ、Ｓｒ、Ｙ、Ｔｃ、Ｉｎ、Ｓｍ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｒｅ、ＺｒまたはＩｒなどの金属イオンを用いて放射線撮影でのイメージング剤として、あるいは、Ｅｕ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｓｍ、Ｙｂなどの金属イオンを用いてルミネセンス分光法で使用できる。
本発明では、診断薬は、当事者に周知の技術で、特に、錯体の量を当事者に周知の医薬的に許容される添加剤と混合して調製された医薬的に許容される形で提示し得る。有利には、錯体を生理学的に許容される水性の溶媒中に溶解して調製した注射用液の形式で提示する。
用量は撮影のタイプにより適合させるが、この適合は当事者の権限の範囲内である。ＮＭＲでの診断については、一般に、金属の量は０．０００１から１０ｍｍｏｌ／ｋｇ、有利には、０．００５から０．５ｍｍｏｌ／ｋｇである。Ｘ線での診断については、一般に、金属イオンの量は０．０１から２０ｍｍｏｌ／ｋｇ、有利には、０．１から１０ｍｍｏｌ／ｋｇである。また、放射線撮影では、放射能は３７０−１８５００ＭＢｑの範囲である。一般に、イメージング剤は、非経口的経路で投与するが、特に、静脈内投与で、また、特定の場合には、経口投与か動脈内投与をする。
本発明では、式（Ｉ）の化合物および上記の錯体は、リンパ腫、癌腫、肉腫、白血病、骨髄腫または中枢神経の腫瘍、炎症性疾患、心血管疾患（血栓、塞栓、梗塞、アテローム性プラークなど）、感染症などの疾患の検出に使用できる。
従って、本発明の主題は、前記の疾患の検出に使用する上記の診断薬である。
本発明の更なる主題は、マーカーあるいは受容体を生成、または、関連する疾患の検出法であるが、該方法は疾患があるヒトに、上記の錯体の検出可能な量を投与することを含み、かつ、該マーカーあるいは該受容体に特異な生物学的に活性な分子を含むものである。また、本発明では、上記の式（Ｉ）の化合物および錯体は、リンパ腫、癌腫、肉腫、白血病、骨髄腫または中枢神経の腫瘍、炎症性疾患、心血管疾患（血栓、塞栓、梗塞、アテローム性プラークなど）および感染症などの疾患の治療用に使用できる。
従って、本発明の主題は、前記の疾患の治療に使用する上記の錯体である。ここでは、医薬的に許容できる賦形剤と組合せて当事者に周知の剤型で提示してもよい。有利には、生理学的に許容される水性の溶媒中で錯体を溶解して調製した注射用液の形式で提示する。
本発明の更なる主題は、マーカーあるいは受容体の生成、または、関連する疾患の治療法であるが、該方法は疾患があるヒトに、上記の錯体の検出可能な量を投与することを含み、かつ、該マーカーあるいは該受容体に特異な生物学的に活性な分子を含むものである。本発明の錯体は、当事者に周知の技術で製造される。
本発明の更なる主題は、以下を含むキットである：
（１）上記の二官能性配位子。
有利な実施形態では、本発明の更なる主題は、以下を含むキットである：
（１）上記の二官能性配位子、
（２）金属放射性核種の塩またはキレートの溶液、
（３）必要な場合、（１）および（２）の反応法を伴う反応の使用指示書。
本発明の更なる主題は、以下を含む診断薬の製造用キットである：
（１）上記の二官能性配位子、
（２）必要な場合、使用方を伴う反応の使用指示書。
本発明の更なる主題は、以下を含むキットである：
（１）上記の二官能性配位子、
（２）金属放射性核種の塩またはキレートの溶液、
（３）生物学的に活性な化合物または不活性担体と（１）と（２）との反応法を伴う使用指示書。
下記に示す式（Ｉ）の化合物の合成における中間体としての式（Ｉ）の化合物
（ここで
Ｗは、以下を表す
− 臭素原子か、ヨウ素原子かのいずれか、
− または、Ｅ−Ｇ−Ｑ基、ここで
*Ｅは、酸素原子、
mが0から5までの整数である(CH2)m基、そして-CONH-基を含む群から選択される、
*Ｇは、以下を含む群から選択される
ｉ）ｏが0から5の間の整数である、-(CH2)o、
ｉｉ）ｎが0から5の間の整数である、-(CH2)n-NH-、
iii）ｐとｑが0から5の間の整数である、-(CH2)p-CO-NH-(CH2)q-NH-、
ｉｖ）
（ここで、ｒ、s、ｔは、各々独立し、0から5までの整数である、かつ、Ｒ2およびＲ3は、各々独立して、水素原子、(C1-C4)アルキル基、または加水分解性基を表す）、
*Ｑは、水素原子、アミノ保護基、官能基のいずれかを表す、
ＸとＹは、各々独立して、いずれかを表し、
− 水素原子か、
− または

基を表し、ここで、ｕは０か１の整数であり、同一であっても異なっていてもよく、ｖとｗは、１か２の整数であり、Ｒ2およびＲ3が、各々独立して、 (C1-C4)アルキル基を表し、かつ、Ｊは-CH2であるか、または、５から１０メンバーおよび所望によりＮ、Ｏ、Ｓから選択される1つ以上のヘテロ原子を含む芳香環のいずれかである、
− または
基を表し、ここで、ｒ1、ｓ1、ｔ1は、各々独立して、１と２の間の整数であり、Ｒ2とＲ3は、各々独立して、(C1-C4)アルキル基、または、加水分解性基を表し、
しかし、条件としては、ＸとＹが同時にＨではない）、
ここで、上記化合物を中間体として、合成される式（Ｉ）の化合物は、Ｗが以下を表し、
− Ｅ−Ｇ−Ｑ基、ここで
*Ｅは、酸素原子、
mが0から5までの整数である(CH2)m基、そして-CONH-基を含む群から選択される、
*Ｇは、以下を含む群から選択される
ｉ）ｏが0から5の間の整数である、-(CH2)o、
ｉｉ）ｎが0から5の間の整数である、-(CH2)n-NH-、
iii）ｐとｑが0から5の間の整数である、-(CH2)p-CO-NH-(CH2)q-NH-、
iｖ）
（ここで、ｒ、s、ｔは、各々独立し、0から5までの整数であり、かつ、Ｒ2およびＲ3は、各々独立して、水素原子、(C1-C4)アルキル基、または加水分解性基を表す）、
*Ｑは、水素原子か、一級および二級アミン、アルコール、チオールと共有結合の形成が可能な官能基のいずれかを表す、
ＸとＹは、各々独立して、次のいずれかを表し、
− 水素原子か、
− または
基を表し、ここで、ｕは０か１の整数であり、同一であっても異なっていてもよく、ｖとｗは、１か２の整数であり、Ｒ2およびＲ3が、各々独立して、水素原子を表し、かつ、Ｊは-CH2であるか、または、５から１０メンバーおよび所望によりＮ、Ｏ、Ｓから選択される1つ以上のヘテロ原子を含む芳香環のいずれかである、
− または
基を表し、ここで、ｒ1、ｓ1、ｔ1は、各々独立して、１と２の間の整数であり、Ｒ2とＲ3は、各々独立して、水素原子を表し、
しかし、条件としては、Ｘ、ＷとＹが同時にＨではない）。
有利な実施形態では、上記の化合物では、
-ＸおよびＹ、または
-Ｘ、ＷおよびＹ
が同時にＨではなく、
および、以下の式の化合物：
（ここで、Ｒ' はＨまたはＥｔを表す）
は除かれる。
図１と２、さらに以下の実施例は、本発明を説明する。
図１は、実施例５のMALDI-MS質量分析で得たmQ 水中での標準ストレプトアビジンの質量スペクトルを示す。 図２は、実施例５のMALDI-MS質量分析で得た配位子Ｌ2で標識付けされたストレプトアビジンの質量スペクトルを示す。 図３は、Ｂ28.13抗体の0.2μg注入を表した、HPLC で得たクロマトグラムを示す。 図４は、Ｂ28.13抗体のMALDI-TOFスペクトルを示す。 図５は、標識Ｂ28.13抗体のMALDI-TOFスペクトルを示す。 図６は、標識Ｂ28.13抗体と併せて、結腸腫瘍の近傍で起こる細胞外テナシンの認識を示す蛍光顕微鏡画像を示す。 図７は、dreg55の2μg注入（0.1 mg/mLで、dreg55溶液の20μL注入）した場合のクロマトグラムを示す。 図８は、dreg55抗体のMALDI-TOFスペクトルを示す。 図９は、標識dreg55抗体のMALDI-TOFスペクトルを示す。 図１０は、標識dreg55抗体の蛍光アッセイを示す。 図１１は、TbL2-標識dreg55抗体（λexc. = 328 nm）の発光スペクトルを示す。 図１２は、標識dreg55抗体の励起スペクトルを示す。 図１３は、テルビウム錯体のルミネッセンスの低下を示す。 図１４は、dreg200抗体のMALDI-TOFスペクトルを示す。 図１５は、標識dreg200抗体のMALDI-TOFスペクトルを示す。 図１６は、標識dreg200抗体の蛍光アッセイを示す。 図１７は、L-セレクチンの0.75μg注入（0.037 mg/mLで、L-セレクチン溶液の20μL注入）した場合のクロマトグラムを示す。 図１８は、L-セレクチンのMALDI-TOFスペクトルを示す。 図１９は、L-セレクチン（薄灰色）および標識L-セレクチン（黒色）のMALDI-TOFスペクトルのスーパインポジションを示す。 図２０は、PSS233抗体のMALDI-TOFスペクトルを示す。 図２１は、標識PSS233抗体のMALDI-TOFスペクトルを示す。 図２２は、標識PSS233抗体（λexc. = 328 nm）の発光スペクトルを示す。 図２３は、標識PSS233抗体の励起スペクトルを示す。 図２４は、テルビウム錯体のルミネッセンスの低下を示す。 図２５は、PSR222抗体のMALDI-TOFスペクトルを示す。 図２６は、標識PSR222抗体のMALDI-TOFスペクトルを示す。 図２７は、標識PSR222抗体（λexc. = 328 nm）の発光スペクトルを示す。 図２８は、標識PSR222抗体の励起スペクトルを示す。 図２９は、テルビウム錯体のルミネッセンスの低下を示す。 図３０は、EgB4抗体フラグメントのMALDI-TOFスペクトルを示す。 図３１は、EgB4抗体フラグメントおよび標識EgB4抗体フラグメントのトリシンゲル SDS-PAGEを示す。 図３２は、EgA1抗体フラグメントのMALDI-TOFスペクトルを示す。 図３３は、EgA1抗体フラグメントおよび標識EgA1抗体フラグメントのSDS-PAGE トリシンゲルを示す。 図３４は、EgA1抗体フラグメントおよび標識EgA1抗体フラグメントのSDS-PAG グリシンゲルを示す。
実施例１：配位子Ｌ1の製造
配位子Ｌ1は、以下の合成図に従って得られた：
化合物３の製造：
ジエステル1およびアミノアルコール２は、ぞれぞれ、Chem. Commun. 2010, 46, 124に記載のCelia S. Bonneらの方法と、Chem. Eur. J. 2008, 14, 1392.に記載のS. Machidaらの方法で製造した。
トリフェニルホスフィン（7.20 g; 27.46 mmol）および僅かのＴＨＦに溶解したアミノアルコール２（4.80 g; 27.52 mmol）を、アルゴン雰囲気下で、325 mLのＴＨＦ中のジエステル1（3.27 g; 13.70 mmol）の溶液に添加する。次に、DIAD（5.43 mL; 27.4 mmol）を滴加する。混合液を70℃で一晩撹拌する。溶媒蒸発後、シリカカラムで連続して2回、初めに、石油エーテル／酢酸エチル７／３で、次にCH2Cl2 100%で、更に、MeOH 0.5%、1%そして1.5%を用いた勾配で精製し、オイルを得た。得られた化合物３の重量は4.5ｇで、収率は83％である。化合物３の特徴は、以下の通りである：
Rf = 0.63; SiO2; CH2Cl2 / MeOH (96 / 4)
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 1.44 (s, 9H); 1.45 (t, J = 7.1 Hz, 6H); 2.05 (qt, J = 6.3 Hz, 2H); 3.34 (m, 2H); 4.20 (t, J = 12.6 Hz, 2H); 4.47 (q, J = 7.1 Hz, 4H); 4.81 (ブロード s, 1H); 7.74 (s, 2H).
13C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 14.2; 28.4; 29.4; 37.5; 62.4; 66.6; 79.4; 114.3; 150.2; 156.0; 164.7; 166.8.
IR (cm-1, ATR): ν 3411, 3250, 2980, 1703, 1508, 1238, 1252, 1107, 1029, 784.
ESI+ / MS: m/z 397.2 ([3 + H]+, 100%).
化合物４の製造：
1.01 g (26.67 mmol)のNaBH4を、240 mLのエタノール中のジエステル３（4.48 g; 11.29 mmol）の溶液に添加し、次に、混合液を、還流下で、加熱する。溶媒を蒸発させて、NaHCO3の飽和水性溶液をｐＨ９に添加してから、最後に水を添加する。水相は、ジクロロメタンで抽出する。有機相は、Na2SO4 で乾燥させ、濾過し、濃縮する。得られた生成物４は、白色固体（1.56 g; 44%）で、その特徴は以下の通りである：
Rf = 0.36; SiO2; CH2Cl2 / MeOH (90 / 10)
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 1.44 (s, 9H); 2.01 (qt, J = 6.3 Hz, 2H); 3.32 (m, 2H); 4.09 (t, J = 6 Hz, 2H); 4.71 (s, 4H); 6.71 (s, 2H).
13C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 28.5; 29.4; 37.6; 64.4; 65.7; 79.4; 105.6; 156.3; 161.2; 166.5.
IR (cm-1, ATR): ν 3371, 2974, 1685, 1602, 1572, 1520, 1272, 1146, 1048, 844.
ESI+ / MS: m/z 313.2 ([4 + H]+, 100%); 314.2 (31%); 355.2 (33%).
化合物５の製造：
0℃で、６７ｍＬのＴＨＦ中のトシルクロリド（3.55 g; 18.64 mmol）溶液を、ＴＨＦ／Ｈ2Ｏ混合液（34 mL / 34 mL）中のジオール４（1.45 g; 4.66 mmol）およびＨａＯＨ（1.12 g; 27.96 mmol）の溶液に滴下する。これで、周囲温度で反応が起こる。2つの相を分離した後、水相は、ジクロロメタンで抽出する。混合した有機相は、まず、NaHCO3の５％水性溶液、次に、NaClの飽和水性溶液で洗浄する。次いで、有機相は、Na2SO4で乾燥し、濾過し、濃縮する。シリカカラムクロマトグラフ（CH2Cl2 / MeOH: 勾配は1%から2%まで）で精製した後、収率85％（白色固体）でビス-トシル化化合物（2.44 g）を得た。化合物５の特徴は、以下の通りである：
Rf = 0.28; SiO2; CH2Cl2 / MeOH (98.5 / 1.5)
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 1.46 (s, 9H); 1.92 (m, 2H); 2.44 (s, 6H); 3.31 (m, 2H); 4.04 (t, J = 6.1 Hz, 2H); 4.70 (ブロード s, 1H); 4.98 (s, 4H); 6.81 (s, 2H); 7.34 (d, J = 8.1 Hz, 4H); 7.81 (d, J = 8.3 Hz, 4H).
13C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 21.8; 28.5; 29.4; 37.6; 66.1; 71.3; 79.6; 107.7; 128.2; 130.1; 132.8; 145.3; 155.3; 156.1; 166.7.
IR (cm-1, ATR) ν: 3356, 2926, 1677, 1366, 1171, 1033, 840, 809, 669.
ESI+ / MS: m/z 607.7 (54%); 643.2 ([5 +Na]+, 100%); 702.3 (34%).
化合物７の製造：
アミン６を、Chem. Eur. J., 2000, 14, 6に記載のS. Aimeらによる手順で製造した。
炎処理した後のK2CO3（3.14 g; 22.72 mmol）を窒素下で200ｍＬの アセトニトリル中のアミン６（2.73 g; 8.60 mmol）溶液に添加する。20分間撹拌した後、アセトニトリルとヨードカリウム（1.29g; 7.75mmol）中に溶解したビス-トシル化誘導体５（2.35 g; 3.78 mmol）を添加し、混合液を70℃まで加熱する。一晩70℃の温度を維持した後でも反応は終了しない。0.92ｇ（2.89 mmol）のアミン６、1.02ｇ（7.42 mmol）のK2CO3、0.41ｇ（2.47 mmol）のヨードカリウムを、再度添加し、22時間70℃で撹拌する。濾過後、溶媒を蒸発させ、シリカカラム（CH2Cl2 / MeOH勾配: 勾配2%から6%まで）精製してオイルを得る。得られた生成物７の重量は、1.75ｇ（50％、薄黄色）である。化合物７の特徴は、以下の通りである：
Rf = 0.33; SiO2; CH2Cl2 / MeOH (92 / 8)
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 1.24 (t, J= 7 Hz, 24H); 1.36 (s, 9H); 1.91 (m, 2H); 3.18 (m, 10H); 4.04 (m, 22H); 5.09 (ブロード s, 1H); 6.99 (s, 2H).
13C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 16.4 (d, J = 5.5 Hz); 28.4; 29.2; 37.5; 50.3 (dd, J = 157.7 Hz, J = 8.3 Hz); 61.9; 62.0 (d, J = 6.2 Hz); 62.4 (t, J = 8.4 Hz); 65.5; 79.0; 108.2; 156.0; 159.4; 166.3.
31P NMR (CDCl3, 161.9 MHz): δ 24.60.
IR (cm-1, ATR): ν 3303, 2980, 1708, 1597, 1230, 1019, 959.
ESI+ / MS: m/z 908.1 (27%): 933.4 ([7 +Na]+, 100%).
化合物８の製造：
1.97ｍＬ（26.6 mmol）のトリフルオロ酢酸を、0℃の窒素下で、15ｍＬのジクロロメタン中のアミン7（1.21 g; 1.33 mmol）の溶液に添加する。次に、出発物質が消えるまで、周囲温度で、混合液を作る。溶媒を蒸発させ、次に、粗生成物（トリフラート塩）を真空で乾燥させる（褐色オイル）。精製せずに、次のステップで使用する。化合物８の特徴は、以下の通りである：
Rf = 0.1; SiO2; CH2Cl2 / MeOH (88 / 12)
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 1.31 (t, J = 7 Hz, 24H); 2.29 (m, 2H); 3.30 (m, 10H); 4.18 (m, 16H); 4.32 (ブロード s, 4H); 4.46 (m, 2H); 7.39 (s, 2H); 7.92 (ブロード s, 2H).
13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 16.2; 26.1; 37.1; 50.4 (dd, J = 158.9 Hz, J = 6.1 Hz); 57.6 (t, J = 5.8 Hz); 63.5 (t, J = 3.4 Hz); 67.7; 110.7; 115.5 (q, J = 289.0 MHz); 155.7; 160.2 (q, J = 39.7 MHz); 171.8.
31P NMR (CDCl3, 161.9 MHz): δ 24.05.
IR (cm-1, ATR): ν 2989, 1774, 1634, 1202, 1160, 1023, 975.
ESI+ / MS: m/z 406.2 ([8 (free amine) + 2H]2+, 100%); 811.3 ([8 (free amine) + H]+, 32%).
化合物９の製造：
トリエチルアミン（0.33 mL; 2.39 mmol）と、次に、アセトニトリルに溶解したＤＳＣ（612.2 mg; 2.39 mmol）を、窒素下で、30ｍＬのアセトニトリル中のアンモニウム塩８（1.33mmol）溶液に添加する。反応混合液を、開始物質が消えるまで、周囲温度で撹拌する。溶媒が蒸発した後、ジクロロメタンを添加する。有機相は、ＴＬＣの検査で残留ＤＳＣが消失していることを示すまで、NH4Clの飽和水性溶液で数回、洗浄する。有機相は、Na2SO4で乾燥し、濾過し、濃縮する。褐色オイル（821 mg; 65%）の得られた生成物９は、以下の特色を有する：
Rf = 0.6; SiO2; CH2Cl2 / MeOH (88 / 12)
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 1.30 (t, J = 7.1 Hz, 24H); 2.06 (m, 2H); 2.79 (s, 4H); 3.20 (d, J =10.0 Hz, 8H); 3.39 (m, 2H); 4.21 (m, 21H); 7.52 (ブロード s, 2H).
13C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 16.6 (t, J = 3 Hz); 25.6; 28.4; 38.6; 50.7 (dd, J = 160.2 Hz, J = 7.7 Hz); 62.3 (t, J = 3.7 Hz); 152.1; 169.9.
31P NMR (CDCl3, 161.9 MHz): δ 24.13.
ESI+ / MS: m/z 869.3 (77%); 952.3 ([9 +H]+, 100%).
化合物Ｌ1の製造
１mL（7.64 mmol）のルチジンおよび0.88ｍＬ（7.64 mmol）のＴＭＳＢｒを、５ｍＬのジクロロメタン中のカルバメート９（181.7mg; 0.19mmol）溶液に、窒素下で、添加する。これを約5時間撹拌する。次に、溶媒は蒸発する。得られた粗生成物を、メタノール中に採り、次に、蒸発する。これをその後2回実施する。得られた固体は、ジクロロメタン存在下で遠心分離し、次に、ジクロロメタンおよびメタノールで数回洗浄する。最終生成物Ｌ1を、ルチジニウム塩（薄茶色固体）として得て、以下の特徴がある。
1H NMR (D2O, 300 MHz): δ 2.08 (m, 2H); 2.72 (s, 6H); 2.91 (s, 4H); 3.45 (m, 2H); 3.63 (d, J = 12.1 Hz, 8H); 4.27 (m, 2H); 4.91 (s, 4H); 7.13 (s, 2H); 7.63 (d, J = 8.1 Hz, 2H); 8.28 (t, J = 8 Hz, 8H).
ESI+ / MS (水 / アセトニトリル / ギ酸): m/z 728.1 ([L1 + H]+, 100%).
実施例２：配位子Ｌ2の製造
配位子Ｌ2は、以下の合成図に従って得られた：
化合物１１の製造：
溶剤浄化装置で乾燥した、200ｍＬのアセトニトリル中の1.5ｇ（4.73 mmol）のアミン６および1.14ｇのＫ2ＣＯ3（8.24 mmol）を、窒素雰囲気下で、２つ口のフラスコに導入する。次に、混合液を30分間還流する。0.96ｇ（2.06 mmol）の化合物10（P. Kadjane et al., in Inorg. Chem, 2009, 48, 4601に記載された方法で製造）を添加する。出発試薬が完全に消費されるまで、反応混合液を36時間還流する。残留Ｋ2ＣＯ3を除去するために溶液を濾過して、次に、蒸発乾固する。油性残査は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製する。使用した溶離液は、ジクロロメタンおよびメタノールの混合液である：CH2Cl2 / MeOH（100/0から95/5まで）。1.2ｇの化合物11を得る（1.26 mmol）、つまり、62％の収率である。化合物１１の特徴は以下である：
Rf = 0.13; SiO2; CH2Cl2 / MeOH (95 / 5).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 1.33 (t, J = 70 Hz, 24H); 3.22 (d, J = 10 Hz, 8H); 3.98 - 4.27 (m, 20H); 6.56 (d, J = 2.6 Hz, 2H); 7.95 (s, 2H); 8.44 (d, J = 2.6 Hz, 2H).
13C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 16.5 (d, J = 6.0 Hz); 49.0 (d, J = 8.0 Hz); 51.1 (dd, J = 158.0 Hz, J = 8.5 Hz); 54.0; 62.0 (d, J = 7.1 Hz); 109.1; 112.2; 128.0; 150.4; 153.2.
31P NMR (CDCl3, 161.9 MHz): δ 23.98.
分析計算値C33H58BrN7O12P4.H2O: C 41.00, H 6.26, N 10.14 実測値：C 40.83, H 6.44, N 9.95
IR (cm-1, ATR): ν 3486, 2982, 2928, 2907, 1679, 1589, 1463-1388, 1211, 1017.
EI+ / MS: m/z 949.3 ([11 + H]+, 100%).
化合物１２の製造：
80 mLの新たに蒸留したＴＨＦおよび24ｍＬのトリエチルアミンの溶液中にある、1.12 g (1.20 mmol)の化合物11、182 mg (1.44 mmol)の90％の6-ヘプチン酸、42 (0.06 mmol) mg の[Pd(PPh3)2Cl2]を、250ｍＬの２つ口のフラスコに導入する。溶液を、30分間、窒素の連続流に通過させて脱気する。22.9ｍｇ（0.1mmol）のCuIを添加し、次に、反応混合液を60℃で15時間加熱する。溶媒を蒸発およびジクロロメタンによる一連の同時蒸発により除去する。油性残査は、250ｍLのCH2Cl2/H2O混合液（50／50）に採り、水相は抽出する。有機相は、飽和NaCl溶液で洗浄し、次に、Na2SO4で乾燥する。残査は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製する。使用した溶離液は、CH2Cl2 / MeOH混合液（100／0から93／７）である。1.01ｇ（1.02mmol）の化合物12は、褐色オイルの形態、つまり、85%の収率で得られる。化合物12は、以下の特徴を有する：
Rf = 0.27; SiO2; CH2Cl2 / MeOH (90 / 10).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 1.33 (t, J = 7.0 Hz, 24H); 1.70 (m, 2H); 1.95 (m, 2H); 2.43 (m, 2H); 2.51 (m, 2H); 3.26 (d, J = 10 Hz, 8H); 4.05 - 4.35 (m, 20H); 6.50 (d, J = 2.6 Hz, 2H); 7.82 (s, 2H); 8.45 (d, J = 2.6 Hz, 2H).
13C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 16.5 (d, J = 6.1 Hz); 19.1; 19.4; 24.0; 27.2; 50.1 (dd, J = 159.9 Hz, J = 9.4 Hz); 58.3; 62.2 (d, J = 7.0 Hz); 96.6; 108.8; 111.4; 127.67; 137.4; 150.0; 152.1; 175.4; 206.9.
31P NMR (CDCl3, 161.9 MHz): δ 24.73.
分析計算値C40H67N7O14P4: C 48.34, H 6.79, N 9.86 実測値：C 48.52, H 7.12, N 9.65
IR (cm-1, ATR): ν 2233, 1720, 1211, 1019, 987, 795.
EI+ / MS: m/z 994.4 ([12 + H]+, 100%).
化合物１３の製造：
300ｍｇ（0.30mmol）の化合物12、175ｍｇ（0.68mmol）のN,N'-炭酸ジスクシンイミジル、240 μL のトリエチルアミンおよび45ｍＬのCH2Cl2を100ｍＬの1つ口のフラスコに導入する。反応混合液を、窒素雰囲気下で12時間撹拌する。次に、反応混合液を蒸発乾固し、100ｍＬのCH2Cl2に採り、引き続いて、NH4Clの飽和水性溶液および水で洗浄する。有機相は、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、次に、蒸発乾固する。320ｍｇの化合物13は、淡黄色オイルの形態（0.29 mmol; 97%）で得られ、以下の特徴を有する。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 1.26 (t, J = 7.1 Hz, 24 H); 1.70 - 1.83 (m, 2H); 1.86 - 1.98 (m, 2H); 2.52 (t, J = 6.9 Hz, 2H); 2.68 (t, J = 7.2 Hz, 2H); 2.83 (s, 47H); 3.21 (d, J = 10.1 Hz, 8 H); 4.03 - 4.24 (m, 20 H); 6.52 (d, J = 2.7 Hz, 2H); 7.73 (s, 2H); 8.44 (d, J = 2.7 Hz, 2H).
13C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 16.6 (d, J = 6.1 Hz); 19.2; 23.9; 25.7; 27.4; 30.6; 50.1 (dd, J = 158.4 Hz, J = 9.7 Hz); 62.1 (d, J = 7.2 Hz); 79.0; 95.9; 108.8; 111.3; 127.9; 137.2; 150.2; 152.7; 168.4; 169.2.
31P NMR (CDCl3, 161.9 MHz): δ 24.49.
IR (cm-1, ATR): ν 2234, 1841, 1784, 1740, 1715, 1209, 962, 742.
配位子Ｌ2の製造：
224ｍｇ（2.09mmol）のルチジンおよび320ｍｇ（2.09mmol）のTMSBｒを、10ｍＬのジクロロメタン溶液中にある57ｍｇの化合物13（0.053mmol）が含まれた50ｍＬの1つ口のフラスコに導入する。反応混合液を、周囲温度で12時間撹拌し、次に、揮発性物質を、減圧下の周囲温度で蒸発する。ＴＭＳＢｒを、ジクロロメタンで同時蒸発する（この手順を2回繰り返す）。白色沈殿を得る。10ｍLのメタノールを添加し、周囲温度で、減圧下で、直ちに蒸発する。この手順を2回繰り返す。得られた白色沈殿は、ジクロロメタンで、次に、メタノールで洗浄し、ルチジニウムモノホスホナートの形態で、褐色粉末の配位子L2を得るが、その特徴は以下の通りである：
1H NMR (D2O-NaOD, 200 MHz): δ 1.28 (m, 4H); 1.83 (m, 2H); 2.15 (m, 2H); 2.30 (d, J = 12.1 Hz, 8H); 2.91 (s, 6H); 3.66 (s, 4H); 6.37 (s, 2H); 6.70 (d, J = 7.6 Hz, 2H); 7.22 (m, 3H); 8.18 (s, 2H).
31P NMR (CDCl3, 161.9 MHz): δ 16.89.
分析計算値C28H38N8O16P4・C7H9N・4H2O: C, 40.20; H, 5.30; N, 12.05 実測値 : C, 40.26; H, 5.24; N, 12.07
IR (cm-1, ATR): ν 2157, 1837, 1781, 1736, 1611, 1203, 987, 795.
ESI- / MS: m/z 865.15 ([L2-H]-, 30%); 768.14 ([L2-NHS]-, 100%).
実施例３：配位子L3の製造
配位子Ｌ3は、以下の合成図に従って得られた：
化合物1５の製造：
20 mLの新たに蒸留したＴＨＦおよび8ｍＬのトリエチルアミンの溶液中にある、400mg（0.42mmol）の化合物10、191mg（0.67mmol）の化合物14および15mg（0.021mmol）の[Pd(PPh3)2Cl2]を、250ｍＬの２つ口のフラスコに導入する。溶液を、30分間、窒素の連続流を通過させて脱気する。8ｍｇ（0.04mmol）のCuIを添加し、次に、反応混合液を60℃で15時間加熱する。溶媒を蒸発と、次に、ジクロロメタンによる同時蒸発により除去する。得られた油性残査は、60ｍLのCH2Cl2/H2O混合液（50／50）に採り、水相は抽出した。有機相は、飽和NaCl溶液で洗浄し、次に、Na2SO4で乾燥する。残査は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製する。使用した溶離液は、CH2Cl2 / MeOH混合液（100／0から93／７）である。428mｇ（0.37mmol）の化合物15は、褐色オイルの形態、つまり、88%の収率で得られる。化合物15は、以下の特徴を有する：
Rf = 0.17; SiO2; CH2Cl2 / MeOH (90 / 10).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 1.31 (t, 24 H, J = 7.1 Hz); 1.41 (s, 9H); 1
.54-1.74 (m, 4H); 1.75-1.92 (m, 2H); 2.25 (t, J = 7.2Hz, 2H); 2.47 (t, J = 6.8 Hz, 2H); 3.34-3.06 (m, 12H); 3.93-4.28 (m, 22 H); 6.52 (d, J = 2.6 Hz, 2H); 7.72 (s, 2H); 8.44 (d, 2H, J = 2.6 Hz).
13C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 16.4 (d, J = 6.1 Hz); 19.3; 25.0; 27.9; 28.4; 30.2; 35.8; 36.1; 37.0; 49.9 (d, J = 159.4 Hz); 53.9; 62.0; 62.1; 78.6; 79.2; 96.6; 108.6; 111.2; 127.8; 137.3; 150.0; 152.5; 172.9.
31P NMR (CDCl3, 161.9 MHz): δ 24.50.
分析計算値C48H83N9O15P4・2MeOH: C, 49.46; H, 7.55; N, 10.38 実測値：C, 49.31; H, 7.39; N, 10.01
ESI+ / MS: m/z 1172.5 ([15+Na]+, 100%).
化合物1６の製造：
10ｍLのCH2Cl2溶液中の120mgの化合物15（0.10 mmol）を、100ｍL の1つ口のフラスコに導入する。78 μL (1 mmol)のトリフルオロ酢酸を、添加し、次に、反応混合液を周囲温度で15時間撹拌する。揮発性化合物を蒸発で、次に、ジクロロメタンで一連の同時蒸発により除去する。150mgの化合物16（アンモニウムトリフラート）を、褐色オイルの形態で得るが、その特徴は以下である：
1H NMR (CD3OD, 300 MHz): δ 1.20-1.26 (m, 24 H); 1.52-1.65 (m, 2H); 1.66-1.81 (m, 2H); 1.85-2.01 (m, 2H); 2.13-2.27 (m, 2H); 2.39-2.54 (m, 2H); 2.79-3.01 (m, 2H) 3.07-3.28 (m, 18H); 3.93-4.19 (m, 16H); 6.51 (m, 2H); 7.63 (s, 2H); 8.55-8.66 (m, 2H).
31P NMR (CDCl3, 161.9 MHz): δ 24.83.
IR (cm-1, ATR): ν 2158, 1676, 1200, 1015, 797.
ESI+ / MS: m/z 1050.5 ([16+H]+, 100%).
化合物1７の製造：
57mg（0.05mmol）の化合物16、27mg（0.09mmol）のN,N'-炭酸ジスクシンイミジル、50μLのトリエチルアミンおよび15ｍＬのCH2Cl2を50ｍＬの1つ口のフラスコに導入する。反応混合液を、窒素雰囲気下で12時間撹拌する。次に、反応混合液を蒸発乾固し、20ｍＬのCH2Cl2に採り、引き続いて、NH4Clの飽和水性溶液および水で洗浄する。有機相は、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、次に、蒸発乾固する。50ｍｇの化合物17 は、淡黄色オイルの形態で得られ、以下の特徴を有する。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): 1.08-1.48 (m, 26H); 1.71 (m, 2H); 1.83 (m, 2H); 2.28 (t, J = 7.3 Hz, 2H); 2.50 (t, J = 6.7 Hz, 2H); 2.79 (s, 4H); 3.10-3.44 (m, 12H); 4.03-4.26 (m, 20H); 6.52 (d, J = 2.5 Hz, 2H); 7.73 (s, 2H); 8.45 (d, J = 2.6 Hz, 2H).
13C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 16.7 (d, J = 6.2 Hz); 19.5; 25.3; 25.7; 28.1; 29.8; 36.3; 38.9; 50.2 (dd, J = 159 Hz, J = 8.4 Hz); 53.9; 54.1; 62.3 (d, J = 6.9 Hz); 108.9; 111.4; 128.0; 150.0; 152.7; 170.0; 173.8; 180.2; 186.1; 195.1; 205.2.
31P NMR (CDCl3, 161.9 MHz): δ 24.54.
IR (cm-1, ATR): ν 2239, 1812, 1781, 1736, 1611, 1204, 1060, 794.
ESI+ / MS: m/z 1213.4 ([17+Na]+, 90%).
配位子Ｌ3の製造
204mg（2.21mmol）のルチジンおよび232mg（1.68mmol）のＴＭＳＢｒを、10ｍL のジクロロメタン中の50mgの化合物17（42μmol）溶液を含む50ｍLの1つ口のフラスコに添加する。反応混合液を、周囲温度で12時間撹拌し、次に、揮発性物質を、減圧下の周囲温度で蒸発する。ＴＭＳＢｒを、ジクロロメタンで同時蒸発する（この手順を2回繰り返す）。その結果、白色の沈殿物が得られる。10ｍLのメタノールを添加し、直ちに、周囲温度で、減圧下で蒸発する。ルチジニウムモノホスホナートの形態で得た、配位子L3は、以下の特徴を持つ。
1H NMR (D2O-NaOD, 300 MHz): δ 1.47-1.89 (m, 6H); 2.30 (m, 2H); 2.41 (m, 4H); 2.54 (m, 2H); 2.70 (d, J = 11.2 Hz, 8H); 3.01 (m, 2H); 3.20 (m, 2H); 4.08 (s, 4H); 6.78 (s, 2H); 7.07 (d, J = 7.8 Hz, 1H); 7.52-7.69 (m, 2.5H); 8.58 (s, 2H).
31P NMR (CDCl3, 161.9 MHz): δ 16.68.
ESI- / MS: m/z: 965.2 ([L3-H]-, 30%).
実施例４：配位子Ｌ4の製造
配位子Ｌ4は、以下の合成図に従って得られた：
化合物1９の製造：
2、6‐ビス(ブロモメチル)ピリジン18を、Tetrahedron, 2003, 59, 5039に記載のT. Vermodenらによる手順で製造した。
炎処理した後のＫ2ＣＯ3（391.13mg；2.83mmol）の20ｍＬの アセトニトリル中の溶液に、窒素下で、アミン6（359.13mg；1.13mmol）を添加し、次に、2、6‐ビス(ブロモメチル)ピリジン18（300mg；1.13mmol）を添加する。混合液を更に6時間、65℃で加熱し、次に、一晩、周囲温度で静置する。濾過後、溶媒を蒸発させて、粗生成物を、シリカカラム（CH2Cl2 / MeOH勾配：100／0から94／6まで）で精製する。得られた生成物19の重量は、253mg（44%、オイル）である。化合物19の特徴は、以下の通りである：
Rf = 0.6; SiO2; CH2Cl2 / MeOH (90 / 10)
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 1.29 (t, J = 7.3 Hz, 12H); 3.23 (d, J = 9.7 Hz, 4H); 4.11 (m, 10H); 4.51 (s, 2H); 7.31 (d, J = 7.6 Hz, 1H); 7.51 (d, J = 7.6 Hz, 1H); 7.68 (t, J = 7.8 Hz, 1H).
13C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 16.6 (t, J = 3.1 Hz); 34.0; 50.4 (dd, J = 159.8 Hz, J = 7.4 Hz); 62.2; 122.1; 123.1; 137.6; 156.0; 158.8.
31P NMR (CDCl3, 161.9 MHz): δ 24.4.
IR (cm-1, ATR): ν 3415, 962-1016, 1592-1675, 1392.
ESI+ / MS (CH2Cl2): m/z 363.0 (22%); 417.9 (44%); 501.1 ([19+H]+, 54%); 503.1 ([19+H]+, 54%); 523.1 ([19+Na]+, 70%); 525.1 ([19+Na]+, 70%); 598.2 (17%); 737.0 (42%); 752.3 (100%); 759.3 (94%).
化合物21の製造：
炎処理した後のＫ2ＣＯ3（1.98g；14.31mmol）の20mL の アセトニトリル中の溶液に、1.20g（4.77mmol）のｔｅｒｔ‐ブチル 6-ブロモヘキサノアート20（M. S. Shchepinov ヨーロッパ特許出願 EP1506959A2, 2005に記載の手順に従って製造）および1.02ｇのベンジルアミン（9.52mmol）を、窒素下で、添加し、次に、混合液を65℃で24時間維持する。濾過後、水を添加し、次に、水相は、ジクロロメタンで抽出する。有機相は、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、濃縮する。粗生成物を、シリカカラム（CH2Cl2 / MeOH勾配：100／0から90／10まで）で精製する。得られた生成物21の重量は、1.32g（56%、オイル）である。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 1.44 (m, 15H); 2.16 (t, J = 7.3 Hz, 2H); 2.58 (t, J = 7.2 Hz, 2H); 3.73 (s, 2H); 7.19-7.27 (m, 5H).
13C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 25.1; 26.9; 28.2; 29.9; 35.6; 49.3; 54.1; 80.1; 127.0; 128.3; 128.5; 140.5; 173.3.
分析計算値C17H27NO2: C, 73.61; H, 9.81; N, 5.05 実測値：C, 73.59; H, 9.90; N, 5.07
IR (cm-1, ATR): ν 2931; 1604; 1727.
ESI+ / MS (CH2Cl2): m/z 222.1 ([21-C4H9+H]+, 66%); 278.2 ([21+H]+, 100%); 392.3 (16%); 432.2 (31%); 481.3 (31%); 709.5 (19%).
化合物22の製造：
300mｇ（1.08mmol）の化合物21および223.21mgの亜リン酸ジエチル（1.62mmol）を、混合し、次に、ホルムアルデヒド（水中で37%）（174．63mg；2.15mmol）を滴下する。反応混合液を100℃で3時間加熱する。蒸発乾固後、粗生成物を、シリカカラム（CH2Cl2 / MeOH勾配：100／0から99／1まで）で精製する。290mgのアミン22が、オイルの形態で得られ、収率は63％である。生成物22は、以下の特徴を持つ：
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 1.21-1.57 (m, 21H); 2.17 (t, J = 7.5 Hz, 2H); 2.60 (t, J = 7.1 Hz, 2H); 2.86 (d, J = 10.3 Hz, 2H); 3.74 (s, 2H); 4.09 (qt, J = 9.6 Hz, 4H); 7.17-7.33 (m, 5H).
13C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 16.6 (d, J = 5.8 Hz); 25.1; 26.7; 28.2; 32.8; 35.7; 49.2 (d, J = 156.2 Hz); 54.9 (d, J = 8.3 Hz); 59.7 (d, J = 8.3 Hz); 61.8 (d, J = 6.8 Hz); 80.0; 127.1; 128.3; 129.1; 139.1; 173.2.
31P NMR (CDCl3, 161.9 MHz): δ 25.8.
IR (cm-1, ATR): ν 2932; 1727; 1679; 1052.
化合物23の製造：
水素発生器（0.1 bar）を用いて水素を、250mg（0.584mmol）のアミン22および20ｍLのエタノール中の150mgの木炭上パラジウムを含む溶液に送り込む。混合液は、還流下で、3.5時間加熱する。セライトで濾過および溶媒の蒸発後、160mgの化合物23をオイルの形態で取得する（つまり、収率81%）。生成物23は、以下の特徴を持つ。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) 1.31 (m, 8H); 1.41-1.61 (m, 13H); 2.18 (t, J = 7.5 Hz, 2H); 2.65 (t, J = 7.1 Hz, 2H); 2.95 (d, J = 12.5 Hz, 2H); 4.13 (m, 4H).
13C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 16.6 (d, J = 5.4 Hz); 25.0; 26.7; 28.2; 29.5; 35.6; 45.3 (d, J = 154.3 Hz); 51.3 (d, J = 15.3 Hz); 62.1 (d, J = 6.7 Hz); 80.1; 173.2.
31P NMR (CDCl3, 161.9 MHz): δ 26.4.
ESI+ / MS (CH2Cl2): m/z 338.2 ([23+H]+, 100%); 369.0 (45%); 373.6 (56%); 675.5 (21%); 780.4 (96%).
化合物24の製造：
炎処理した後のＫ2ＣＯ3（2.17g；15.70mmol）の8mLの アセトニトリル中の溶液に、化合物23（125mg；0.37mmol）およびモノ置換生成物19（250mg；0.498mmol）を、窒素下で添加し、次に、混合液を70℃で一晩加熱する。濾過後、溶媒を蒸発させて、粗生成物を、シリカカラム（CH2Cl2 / MeOH勾配：100／0から95／5まで）で精製する。得られた生成物24の重量は、259mg（92%）である。
1H NMR (CDCl3, 200 MHz) 1.26-1.59 (m, 37H); 2.18 (m, 2H); 2.63 (m, 2H); 2.94 (d, J = 10.4 Hz, 2H); 3.21 (d, J = 9.9 Hz, 2H); 3.88 (distorted s, 2H); 4.11 (m, 16H); 7.44 (m, 2H); 7.64 (m, 1H, H4).
31P NMR (CDCl3, 161.9 MHz): δ 26.1.
IR (cm-1, ATR): ν 3476-2933, 1727, 1020.
ESI+ / MS (CH2Cl2): m/z 780.4 ([24+Na]+, 100%).
化合物25の製造：
0.78ｍＬ（10 .54 mmol）のトリフルオロ酢酸を、0℃の窒素下で、ジクロロメタン中のエステル24 （400 mg; 0.527mmol）の溶液に添加する。次に、周囲温度で一晩かけて混合液を作る。溶媒を蒸発させて、粗生成物を、シリカカラム（CH2Cl2 / MeOH勾配：100／0から95／5まで）で精製する。得られた生成物25の重量は、254mg（69%）である。化合物25の特徴は以下の通りである：
1H NMR (アセトン-d6, 300 MHz): δ 1.26-1.33 (m, 20H); 1.49-1.66 (m, 4H); 2.05 (m, 2H); 2.24 (t, J = 7.2 Hz, 2H); 2.80 (m, 2H); 3.31 (m, 4H); 4.08-4.27 (m, 16H); 7.56 (m, 2H); 7.93 (t, J = 7.8 Hz, 1H).
31P NMR (CDCl3, 161.9 MHz): δ 23.7-26.0 (ブロード m).
IR (cm-1, ATR): ν 3477-2934, 1727, 1020.
ESI+ / MS (CH2Cl2): m/z 430.2 (6%); 552.3 (8%); 594.6 (8%); 702.3 ([25+H]+, 100%); 757.2 (27%); 774.4 (14%); 934.15 (10%).
化合物26の製造：
152.42mg（0.595mmol）のN,N'-炭酸ジスクシンイミジルおよび0.19mL（1.35mmol）のトリエチルアミンを、10mLのCH2Cl2中の190mg（0.270mmol）の酸25に添加する。反応の終了にともない、反応混合物を蒸発乾固し、CH2Cl2に採り、引き続いて、ＤＳＣが消失するまでNH4Clの飽和水性溶液で数回洗浄する（ＴＬＣで検査）。有機相は、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、次に、蒸発乾固する。133.5mgのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル26を得るが（62%）、その特徴は以下の通りである：
1H NMR (CDCl3, 200 MHz): δ 1.26-1.75 (m, 23H); 2.59 (m, 4H); 2.83 (変形した s, 5H); 2.94 (d, J = 10.6 Hz, 2H); 3.21 (d, J = 10.2 Hz, 2H); 3.88 (変形した s, 2H); 4.11 (m, 16H); 7.43 (m, 2H); 7.65 (m, 1H).
31P NMR (CDCl3, 161.9 MHz): δ 24.5.
ESI+ / MS (CH2Cl2): m/z 799.3 ([26+H]+, 100%); 822.0 (20%).
化合物Ｌ4の製造
0.16ｍL （1.40 mmol）のルチジンおよび0.15ｍＬ（1.12 mmol）のＴＭＳＢｒを、ジクロロメタン中のエステル26（30 mg; 0.0375 mmol）の溶液に、窒素下で、添加する。約22時間撹拌する。次に、溶媒を蒸発する。粗組成物を、メタノール中で採り、次に、蒸発する。これをその後2回実施する。得られた固体をジクロロメタンおよびメタノールで数回洗浄する。最終生成物Ｌ4を、ルチジニウム塩（茶色固体）の形態で得る。粗化合物Ｌ4の特徴は、以下の通りである：
1H NMR (D2O, 300 MHz): δ 1.38 (m, 3H); 1.62 (m, 3H); 1.84 (m, 3H); 2.39 (m, 2H); 2.70 (s, 3H); 2.77 (s, 4H); 3.28-3.75 (m, 13H); 4.92 (m, 3H); 7.45-7.64 (m, 4H); 7.99 (t, J = 7.8 Hz, 1H); 8.25 (m, 0.4H).
実施例５：配位子Ｌ2でトレプトアビジンの標識
5.1手順
水20μL中の溶液中のストレプトアビジン（0.2ｍｇ；3.3nmol）を、重炭酸アンモニウム緩衝液（pH＝8.05；C=200．10-3mol.L-1）の200μL水溶液中にある配位子L2（0.13mg；13.2x10-9mol）を含む１mLのフラスコに添加する。得られた溶液を周囲温度で15時間撹拌する。反応混合液は、濃縮され、過剰の配位子は超遠心分離により（VIVASPIN 500 Sartorius Stedim, cut-off 5000MWCO PES, 回転数: 1500 r.p.m.）除去する。溶液を、各サイクルが2分で、緩衝液100 μLを添加して、5サイクルの遠心分離にかける。この処理後、100μLの遠心分離物を回収する。後者は、2つの方法で分析する：可視紫外吸収分光法および質量分析。
5.2．質量分析による解析：
遠心分離物はMALDI-MSで解析した。
マトリックス：α‐シアノ‐4‐ヒドロキシけい皮酸
沈着方法：乾燥液滴
非標識ストレプトアビジンの質量スペクトル（図１）は、ｍ／ｚ値の13038ユニットで主ピークを示す。標識ストレプトアビジンの質量スペクトル解析（図2）は、3つの主ピークを13049、13860、14549で示すが、それぞれ、非標識ストレプトアビジンのモノマー（Strep）、配位子Ｌ2で標識されたモノマー（Strep-(L2)）、2回標識されたモノマー（Strep(L2)2）に対応する。
5.3．可視紫外分光法：
遠心分離物25 μL、または0.83nmolのStrepL2の滴定は、TbCl3.6H2O (C=5.36×10-5 mol.L-1)の溶液を用いて実施する。
ストレプトアビジンに結合した配位子のホスホナート基による金属の錯体形成は、試料の吸収極大を320nmから329nmに移動する。この波長は、210μLのＴｂ添加、または1：1錯体を形成する11.3nmolのStrepTbL2に達する。これから、ストレプトアビジンあたり１３の配位子L2を標識する平均度を推定する。
実施例６：配位子L1でB28．13抗体の標識
B28．13抗体は、腫瘍（大腸癌など）近傍で発現する細胞外糖蛋白である、テナシンに対する抗体である。
6.1 HPLC分析
抗体のHPLC分析法を開発した。この分析は、Waters2996ダイオードアレイ付きのUV検知器を装備しているAlliance 2695 HPLC chain (Waters)で実施した。分離の実施は、Poros R1 1x150 mmカラム(10 μm) (Applied Biosystems)で行う。流速は、0.4mL／分に固定し、カラム温度は50℃を維持し、使用した勾配は、溶媒A：酸性化水（0.1% TFA）、溶媒B: 酸性化アセトニトリル（0.1% TFA）である。勾配を、5%の溶媒Bで開始し、5分間維持し、次に、25分間85%まで直線的に増大させ、更に、再び1分間95%まで増大させ、かつ、95%で3分間を維持する。5%の溶媒Bでのカラム平衡のステップは、溶出に従う。溶出は、210ｎｍでモニターする（図3）。
6.2 MALDI‐TOF MS分析
MALDI‐TOF分析を、抗体に対して実施した。抗体の溶液は、ZipTip C18 (Millipore)を用いて脱塩する。70 pmolの抗体を載せて、次に、5 μLのH2O/アセトニトリル/HCOOH 20/75/5(v/v/v)に溶出する。0.6μLの試料（約8pmol）を、0.6μLのシナピニン酸（50% アセトニトリル中2 mg/mLで）を用いて、MALDI MTP348プレート（Brucker Daltonics）上に3重に沈着させる。分析は、正モードで実施し、かつ、質量分析計（Autoflex, Brucker Daltonics）は、BSAを用いて20000から190000のm/z範囲で測定した。結果を図4に示した。
この結果から、148000Dａ近傍のB28．13抗体の質量評価ができた。
6.3抗体の標識
標識実験は、0.86mgの固体配位子L1（純度30%）、3.5x10-7molを添加した、230 μg (つまり、1.55x10-9 mol)のB28．13抗体で実施された。これは、各抗体に対して配位子L1の230当量を意味する。ｐHを、PBS緩衝液で7の値に調整し、反応混合物を周囲温度で1時間撹拌した。
次いで、過剰な配位子L1を除去するために、反応混合物を、カットオフが30ｋDａのvivaspin500モジュール（Sartorius）を用いて限外濾過法で精製し、ｐＨ７で、Tris-HCl 0.01 M緩衝液を用いて数回洗浄（20サイクル）する。
次に、ZipTip C18により脱塩した後で、前記のMALDIプレート上で反応混合物を沈着する。結果を図5に示した。
質量スペクトルから、抗体の質量に添加された配位子L1の質量により、[M+H]+ピークが僅かに右側に移動していることが示された。最大値では、800Daの差があり、これは抗体当たり１配位子L1に相当する。
6.4 標識後の抗体の活性
標識B28．13抗体の活性は、ヒト大腸癌からの切片に標識され、続けて、色素を含む2次抗体で明示されることで試験した。この試験は、抗体が依然として、その標的に対して親和性を有していたことを示した（図6）。
実施例7：配位子L2でdreg55抗体の標識
dreg55抗体は、L-セレクチンに対して非常に強い親和性を有するモノクローナル抗体である。
7.1 HPLC分析
抗体のHPLC分析法を開発した。この分析は、Waters2996ダイオードアレイ付きのUV検知器を装備しているAlliance 2695 HPLC chain (Waters)で実施した。分離の実施は、Poros R1 1x150 mmカラム(10 μm) (Applied Biosystems)で行う。流速は、0.4mL／分に固定し、カラム温度は50℃を維持し、使用した勾配は、溶媒A：酸性化水（0.1% TFA）、溶媒B: 酸性化アセトニトリル（0.1% TFA）である。勾配を、5%の溶媒Bで開始し、5分間維持し、次に、25分間85%まで直線的に増大させ、更に、再び1分間95%まで増大させ、かつ、95%で3分間を維持する。5%の溶媒Bでのカラム平衡は、溶出に従う。溶出は、210ｎｍでモニターする（図7）。
7.2 MALDI‐TOF MS分析
MALDI‐TOF分析を、抗体に対して実施した。抗体の溶液は、ZipTip C18 (Millipore)を用いて脱塩する。70 pmolの抗体を載せて、次に、5 μLのH2O/アセトニトリル/HCOOH 20/75/5(v/v/v)に溶出する。0.6μLの試料（約8pmol）を、0.6μLのシナピニン酸（50% アセトニトリル中2 mg/mLで）を用いて、MALDI MTP348プレート（Brucker Daltonics）上に3重で沈着する。分析は、正モードで実施（図8）し、かつ、質量分析計（Autoflex, Brucker Daltonics）は、BSAを用いて20000から190000のm/z範囲で測定した。
この結果から、148000Dａ近傍のdreg55抗体の質量評価ができた。
7.3抗体の標識
標識実験は、0.65mgの固体配位子L2（17％のルチジニウム塩を含む3.4x10-8 molの配位子L2）を添加した、400 μg (4mg/mLでの100μLの溶液、つまり、2.7x10-9 mol)のdreg55抗体で実施され、これは、各抗体に対して配位子L2の230当量を意味する。ｐHを、PBS緩衝液で7.3の値に調整し、反応混合物を周囲温度で1時間撹拌した。
次いで、過剰な配位子L2を除去するために、反応混合物を、カットオフが30ｋDａのvivaspin500モジュール（Sartorius）を用いて限外濾過法で精製し、ｐＨ７.4で、Tris-HCl 0.01 M緩衝液を用いて数回洗浄（20サイクル）した。
次に、ZipTip C18により脱塩した後で、前記のMALDIプレート上で反応混合物（11pmol）を沈着させた（図9）。
質量スペクトルから、抗体の質量に添加された配位子L2の質量により、[M+H]+ピークが右側に移動していることが示された。最大値では、7000Daの差があり、これは抗体当たり約9配位子L2に相当する。
7.4 蛍光アッセイ
また、蛍光アッセイにより、抗体当たりの配位子L2の数の評価が確立した。このアッセイは、Tris-HCl 0.01 M ｐH7（20 μL/添加）の溶液中で調製された5×10-6 MでのTbCl3溶液の連続的添加により、6.7×10-11 molの標識抗体で実施された。
測定は、390nmのフィルタおよび励起波長λexcitation = 328 nmを用いて、HORIBA Jobin Yvon分光蛍光光度計で実施した。発光スペクトルが、400から750nmで取得され、544nmで、テルビウムのピーク発光が測定された。
544nmで計測された蛍光の直線的増大が、2×10-9 molのTbCl3の近傍で開始するプラトーの前で、観測される（図10）。２つの直線の交差点は、アッセイの当量点に対応する。この量の溶液中に存在する抗体の量に対する比率から、抗体当たりの配位子L2の数を得る。この数は、30配位子L2/抗体と評価される。
7.5 テルビウムによる錯体化
次に、標識抗体は、Tris-HCl 0.01 M pH 7溶液中で、5.35x10-4 M で3当量のTbCl3溶液を添加して、Tb3+で錯体化した。反応混合物を限外濾過法（vivaspin500、カットオフ 30 kDa）で再度精製し、かつ、過剰なTb3+を除去するために、ｐH７でTris-HCl 0.01 M緩衝液で数回（20サイクル）洗浄した。
7.6 蛍光での標識dreg55抗体の解析
測定は、pH 7でのTris-HCl 0.01 Mの溶液中で、HORIBA Jobin Yvon Fluoromax分光蛍光光度計で実施した。
7.6.1 発光
発光スペクトル測定に使用した励起波長は、328nmである。取得は、400から750nmまでの間で実施され、最大発光は544 nmで測定された（図11）。
7.6.2 励起
励起スペクトルは、544nmで発光に対して測定し、かつ、250から450nmとの間で取得した（図12）。
励起スペクトルは、328nmで最大値を示す。
7.6.3 寿命
錯体の寿命は、予め策定された励起および発光波長（λexcitation = 328 nmおよびλemission = 544 nm）を用いて計測した（図13）。
曲線は、溶液中で発光する単一種の存在を示唆する、ミネッセンスの単一指数的な低下を示す。測定された寿命は、1.6msである。
実施例８：配位子L2でdreg200抗体の標識
dreg200抗体は、L-セレクチンに対するマウス抗体である。
8.1 MALDI‐TOF MS分析
MALDI‐TOF分析を、抗体に対して実施した。抗体の溶液は、ZipTip C18を用いて脱塩され、次に、上記のMALDI標的に沈着した。結果を図14に示す。
MALDI質量スペクトルは、dreg200抗体が約150000Daのモル質量を有することを示す。
8.2 dreg200の標識
標識実験は、0.27mgの固体配位子L2（17％のルチジニウム塩を含む2.58x10-7 molの配位子L2）を添加した、200μg (8mg/mLでの25μLの溶液、つまり、1.32x10-9 mol)のdreg200抗体で実施され、これは、各抗体に対して配位子L2の200当量を意味する。ｐHを、PBS緩衝液で7.3の値に調整し、反応混合物を周囲温度で1時間撹拌した。
次いで、過剰な配位子L2を除去するために、反応混合物を、カットオフが30ｋDａのvivaspin500モジュールを用いて限外濾過法で精製し、ｐH７で、Tris-HCl 0.01 M緩衝液を用いて数回洗浄（20サイクル）した。
次に、ZipTip C18により脱塩した後で、前記のMALDIプレート上で反応混合物（11pmol）を沈着させた。結果は、図15に示す。
MALDIスペクトルから、8000Daの値での[M+H]+ピークが右側に移動していることが示された。この質量差は、約10配位子L2/抗体に対応する。
8.3 蛍光アッセイ
また、蛍光アッセイにより、抗体当たりの配位子L2の数の評価が確立した。このアッセイは、Tris-HCl 0.01 M ｐH7（20 μL/添加）の溶液中で調製された10-6 MでのTbCl3溶液の連続的添加により、3.8×10-11 molの標識抗体で実施された。
544nmで計測された蛍光の直線的増大が、8×10-10 molのTbCl3の近傍で開始するプラトーの前で、観測される（図16）。２つの直線の交差点は、アッセイの当量点に対応する。この量の溶液中に存在する抗体の量に対する比率から、抗体当たりの配位子L2の数を得る。この数は、21配位子L2/抗体と評価される。
8.4 テルビウムによる錯体化
次に、標識抗体は、pH 7でのTris-HCl 0.01 M溶液中で、7.4x10-5 M で2当量のTbCl3溶液を添加して、Tb3+で錯体化した。反応混合物を限外濾過法（vivaspin500、カットオフ 30 kDa）で再度精製し、かつ、過剰なTb3+を除去するために、ｐH７でTris-HCl 0.01 M緩衝液で数回（20サイクル）洗浄した。
実施例9：配位子L2でL-セレクチンの標識
実験は、50μgのL-セレクチン（組換えヒトタンパク質）で実施した。
9.1 HPLC分析
L-セレクチンのHPLC分析法を開発した。この分析は、Waters2996ダイオードアレイ付きのUV検知器を装備しているAlliance 2695 HPLC chain (Waters)で実施した。分離の実施は、Symmetry C18カラム3.5 μm, 4.6 x 75 mm (Waters)で行う。流速は、0.5mL／分に固定し、カラム温度は40℃を維持し、使用した勾配は、溶媒A：酸性化水（0.1% TFA）、溶媒B: 酸性化アセトニトリル（0.1% TFA）である。勾配を、5%の溶媒Bで開始し、5分間維持し、次に、25分間85%まで直線的に増大させ、更に、再び1分間95%まで増大させ、かつ、95%で3分間を維持する。5%の溶媒Bでのカラム平衡のステップは、溶出に従う。溶出は、210ｎｍでモニターする（図17）。
9.2 MALDI‐TOF MS分析
MALDI‐TOF分析を、試料に対して実施した。抗体の溶液は、ZipTip C18を用いて脱塩され、次に、上記のMALDI標的に沈着した。得られた[M+H]+ピークは、比較的広く、L-セレクチンに対する72 kDaの質量を示す（図18）。
9.3 L-セレクチンの標識
標識実験は、0.005%HCI（ｐH〜3）で調製し、1.02mg/ｍL（17%のルチジニウム塩を含む）で配位子L2 の10μL溶液を添加した、46μg（6.4x10-9 mol）の量のL-セレクチンで実施され、これは、L-セレクチンの各当量に関して配位子L2の15当量を意味する。ｐHを、PBS緩衝液で7.3の値に調整し、反応混合物を周囲温度で1時間撹拌した。
次いで、過剰な配位子L2を除去するために、反応混合物を、カットオフが7ｋDａ（単一通過）のZebaカラム(Thermo Scientific)で精製した。カラムは、ｐH７で、Tris-HCl 0.01 M緩衝液を用いて調製した。
次に、ZipTip C18により脱塩した後で、前記のMALDI標的上で反応混合物を沈着させた（図19）。
MALDIスペクトルから、2000Daの値での[M+H]+ピークが右側に移動していることが示された。この質量差は、約3配位子L2/ L-セレクチンに対応する。
9.4 テルビウムによる錯体化
次に、標識L-セレクチンの試料は、pH 7でのTris-HCl 0.01 M溶液中で、10-3 Mで5当量のTbCl3溶液を添加して、Tb3+で錯体化した。反応混合物を、過剰なTb3+を除去するために、ｐH７で、Tris-HCl 0.01 M緩衝液を用いて調製したZebaカラム（単一通過）で再度精製した。
実施例10：配位子L2でPSS233抗体の標識
PSS233抗体は、抗PSA （前立腺特異的抗原）抗体である。
10.1 MALDI‐TOF MS分析
MALDI‐TOF分析を、モル質量を測定するために標識する前に、抗体に対して実施した。抗体は、ZipTip C18を用いて脱塩され、次に、マトリクスとしてシナピニン酸を用いて、上記のMALDI標的に沈着した（図20）。
MALDI‐MS分析は、PSS233抗体が約150000Daのモル質量を有することを示す。
10.2 PSS233の標識
標識実験は、0.8mgの固体配位子L2（17％のルチジニウム塩を含む7.7x10-7 molの配位子L2）を添加した、108μg (7.2x10-10 mol)のPSS233で実施され、これは、各抗体に対して配位子L2の1065当量を意味する。ｐHを、PBS緩衝液で7.1の値に調整し、反応混合物を周囲温度で1時間撹拌した。
次いで、過剰な配位子L2を除去するために、反応混合物を、カットオフが30ｋDａのvivaspin500モジュールを用いて限外濾過法で精製し、ｐH７で、Tris-HCl 0.01 M緩衝液を用いて数回洗浄（20サイクル）した。
次に、ZipTip C18により脱塩した後で、前記のMALDIプレート上で反応混合物を沈着させた（図21）。
MALDIスペクトルから、5500Daの値での[M+H]+ピークが右側に移動していることが示された。この質量差は、約7配位子L2/抗体に対応する。
10.3 テルビウムによる錯体化
次に、標識抗体は、pH 7でのTris-HCl 0.01 M溶液中で、2.2x10-8 mol のTbCl3溶液を添加して、Tb3+で錯体化した。反応混合物を限外濾過法（vivaspin500、カットオフ 30 kDa）で再度精製し、かつ、過剰なTb3+を除去するために、ｐH７でTris-HCl 0.01 M緩衝液で数回（20サイクル）洗浄した。
10.4 蛍光での標識PSS233抗体の解析
測定は、pH 7でのTris-HCl 0.01 Mの溶液中で、HORIBA Jobin Yvon Fluoromax分光蛍光光度計で実施した。
10.4.1 発光
発光スペクトル測定に使用した励起波長は、328nmである。取得は、400から750nmまでで実施され、最大発光は544 nmで測定された（図22）。
10.4.2 励起
励起スペクトルは、544nmで発光に対して測定し、かつ、250から450nmとの間で取得した（図23）。
励起スペクトルは、329nmで最大値を示す。
10.4.3 寿命
錯体の寿命は、予め策定された励起および発光波長（λexcitation = 328 nmおよびλemission = 544 nm）を用いて計測した（図24）。
曲線は、溶液中で発光する単一種の存在を示唆する、ミネッセンスの単一指数的な低下を示す。測定された寿命は、1.94msである。
実施例11：配位子L2でPSR222抗体の標識
PSR222抗体は、抗PSA （前立腺特異的抗原）抗体である。
11.1 MALDI‐TOF MS分析
MALDI‐TOF分析を、モル質量を測定するために標識する前に、抗体に対して実施した。抗体は、ZipTip C18を用いて脱塩され、次に、マトリクスとしてシナピニン酸を用いて、上記のMALDI標的に沈着した（図25）。
MALDI‐MS分析は、PSR222抗体が約147500Daのモル質量を有することを示す。
11.2 PSR222の標識
標識実験は、0.13mgの固体配位子L2（17％のルチジニウム塩を含む1.25x10-7 molの配位子L2）を添加した、75μg (5x10-10 mol)のPSR233で実施され、これは、各抗体に対して配位子L2の250当量を意味する。ｐHを、PBS緩衝液で7.1の値に調整し、反応混合物を周囲温度で1時間撹拌した。
次いで、過剰な配位子L2を除去するために、反応混合物を、カットオフが30ｋDａのvivaspin500モジュールを用いて限外濾過法で精製し、ｐH７で、Tris-HCl 0.01 M緩衝液を用いて数回洗浄（20サイクル）した。
次に、ZipTip C18により脱塩した後で、前記のMALDIプレート上で反応混合物を沈着させた（図26）。
MALDIスペクトルから、2500Daの値での[M+H]+ピークが右側に移動していることが示された。この質量差は、約3配位子L2/抗体に対応する。
11.3 テルビウムによる錯体化
次に、標識抗体は、pH 7でのTris-HCl 0.01 M溶液中で、5.25x10-9 mol のTbCl3溶液を添加して、Tb3+で錯体化した。反応混合物を限外濾過法（vivaspin500、カットオフ 30 kDa）で再度精製し、かつ、過剰なTb3+を除去するために、ｐH７でTris-HCl 0.01 M緩衝液で数回（20サイクル）洗浄した。
11.4 蛍光での標識PSR222抗体の解析
測定は、pH 7でのTris-HCl 0.01 Mの溶液中で、HORIBA Jobin Yvon Fluoromax分光蛍光光度計で実施した。
11.4.1 発光
発光スペクトル測定に使用した励起波長は、328nmである。取得は、400から750nmまでで実施され、最大発光は544 nmで測定された（図27）。
11.4.2 励起
励起スペクトルは、544nmで発光に対して測定し、かつ、250から450nmとの間で取得した（図28）。
励起スペクトルは、328nmで最大値を示す。
11.4.3 寿命
錯体の寿命は、予め策定された励起および発光波長（λexcitation = 328 nmおよびλemission = 544 nm）を用いて計測した（図29）。
曲線は、溶液中で発光する単一種の存在を示唆する、ミネッセンスの単一指数的な低下を示す。測定された寿命は、2.17msである。
実施例12：配位子L2でEgB4抗体フラグメントの標識
EgB4は、上皮成長因子（EGF）に対する（抗体の１つの可変単量体ドメインから成る）抗体フラグメントである。
12.1 MALDI‐TOF MS分析
MALDI‐TOF分析を、抗体フラグメントに対して実施した。抗体フラグメントの溶液は、マトZipTip C18を用いて脱塩され、次に、リクスとしてシナピニン酸を用いて、15pmolの量の試料をMALDI標的に沈着した。取得は、正モードで、4000から40000のm/z範囲で実施した。質量分析計は、ミオグロビンを用いて測定した（図30）。
MALDI分析は、EgB4抗体フラグメントが17200Daのモル質量を有することを示す。
12.2 EgB4抗体フラグメントの標識
標識は、1.58mgの固体配位子L2（27％のルチジニウム塩を含む1.33x10-6 molの配位子L2）を添加した、270μg (1.57x10-8 mol)のEgB4で実施され、これは、各抗体フラグメントに対して配位子L2の85当量を意味する。ｐHを、PBS緩衝液で7の値に調整し、反応混合物を周囲温度で1時間撹拌した。
次いで、過剰な配位子L2を除去するために、反応混合物を、カットオフが10ｋDａのvivaspin500モジュールを用いて限外濾過法で精製し、ｐH７で、Tris-HCl 0.01 M緩衝液を用いて数回洗浄（20サイクル）した。
次に、ZipTip C18により脱塩した後で、前記のMALDIプレート上で反応混合物を沈着させたがシグナルは観察されない。
12.3 トリシンゲルSDS-PAGE
標識の度を知るために、標識抗体フラグメントは、トリシンSDSポリアクリルアミドゲルに沈着した。ゲルは、H. Schagger and G. Von Jagow (Analytical Biochemistry, 1987, 166, 368)に記載された手順に従って製造した。通常のゲル中のグリシンをトリシンで置換えると、低分子量のタンパク質の良好な分離ができる。H. SchaggerおよびG. Von Jagowによって述べられたスペーサーゲルは省略し、かつ、ゲルに使用したアクリルアミド濃度は、16.5％Tである。
U. K. Laemmli (Nature, 1970, 277, 680)が述べている製造に従い、ゲル沈着の前に、試料を、レムリ緩衝液中で希釈（少なくとも1：4の比率で）する。
ゲルは、抗体フラグメントが完全に標識され、かつ、2から10配位子L2/抗体フラグメントの間の標識の度に対応する、標識生成物が19から25ｋDaの間の質量分布であることを示す。
12.4 テルビウムによる錯体化
次に、標識抗体フラグメントの溶液は、pH 7でのTris-HCl 0.01 M溶液中で、2.35x10-7mol のTbCl3溶液を添加してTb3+で、または、15当量のTb3+で錯体化した。反応混合物を限外濾過法（vivaspin500、カットオフ 10 kDa）で再度精製し、かつ、過剰なTb3+を除去するために、ｐH７でTris-HCl 0.01 M緩衝液で数回（20サイクル）洗浄した。Tb3+溶液を添加後、沈殿物が形成される。
実施例13：配位子L2でEgA１抗体フラグメントの標識
EgA1は、上皮成長因子（EGF）に対する抗体フラグメントである。
13.1 MALDI‐TOF MS分析
MALDI‐TOF分析を、抗体フラグメントに対して実施した。抗体フラグメントの溶液は、ZipTip C18を用いて脱塩され、次に、マトリクスとしてシナピニン酸を用いて、15pmolの量の試料をMALDI標的に沈着した（図32）。
MALDI分析は、EgA1抗体フラグメントが17100Daのモル質量を有することを示す。
13.2 EgA1抗体フラグメントの標識
標識は、1.38mgの固体配位子L2（27％のルチジニウム塩を含む1.1x10-6 molの配位子L2）を添加した、115μg (6.7x10-9 mol)のEgA1で実施され、これは、各抗体フラグメントに対して配位子L2の170当量を意味する。ｐHを、PBS緩衝液で7の値に調整し、反応混合物を周囲温度で1時間撹拌した。
次いで、過剰な配位子L2を除去するために、反応混合物を、カットオフが10ｋDａのvivaspin500モジュールを用いて限外濾過法で精製し、ｐH７で、Tris-HCl 0.01 M緩衝液を用いて数回洗浄（20サイクル）した。
次に、ZipTip C18により脱塩した後で、前記のMALDI標的上で反応混合物を沈着させたが、シグナルは観察されない。
13.3 SDS-PAGE
13.3.1 トリシンゲルSDS-PAGE
標識の度を知るために、標識抗体フラグメントは、トリシンSDSポリアクリルアミドゲルに沈着した。ゲルは上記のように調整し、かつ、ゲルに使用したアクリルアミド濃度は、16.5％Tである。
ゲル沈着の前に、試料を、レムリ緩衝液中で希釈（少なくとも1：4の比率で）する。
図33に示すように、ゲルは、標識抗体フラグメントのレベルで質量のばらつきを示さない。抗体フラグメントの画分は、非標識抗体フラグメントと比べて、低質量のように思われる。このゲルからは結論は導かれない。
13.3.2 グリシンSDS-PAGEゲル
また、15％Tのアクリルアミド濃度で、この試料用に、グリシンSDS-PAGEゲルを調整した。ゲル沈着の前に、試料を、レムリ緩衝液中で希釈（少なくとも1：4の比率で）する。
ゲル（図34）は、抗体フラグメントが完全に標識され、かつ、1から10配位子L2/抗体フラグメントの間の標識の度に対応する、標識生成物が18から24ｋDaの間の質量分布であることを示す。
13.4 テルビウムによる錯体化
次に、標識抗体フラグメントの溶液は、pH 7でのTris-HCl 0.01 M溶液中で、1x10-7mol のTbCl3溶液を添加してTb3+で、または、15当量のTb3+で錯体化した。反応混合物を限外濾過法（vivaspin500、カットオフ 10 kDa）で再度精製し、かつ、過剰なTb3+を除去するために、ｐH７でTris-HCl 0.01 M緩衝液で数回（20サイクル）洗浄した。Tb3+溶液を添加後、沈殿物が形成される。

Claims (19)

  1. 以下の式（Ｉ）の化合物：
    （ここで、
    Ａは以下を表す
    − 窒素原子か、
    − 環および芳香環が所望により、Ｎ、Ｏ、Ｓから選択される1つ以上のヘテロ原子を含み、３から６の炭素原子を含む環、または５から１０のメンバーを含む芳香環、
    Ｗは、以下を表す
    − 臭素原子か、ヨウ素原子かのいずれか、
    − または、以下を有するＥ−Ｇ−Ｑ基、ここで
    *Ｅは、酸素原子、
    mが0から5までの整数である(CH2)m基、そして-CONH-基を含む群から選択される、
    *Ｇは、以下を含む群から選択される
    ｉ）ｏが0から5の間の整数である-(CH2)o、
    ｉｉ）ｎが0から5の間の整数である-(CH2)n-NH-、
    iii）ｐとｑが0から5の間の整数である-(CH2)p-CO-NH-(CH2)q-NH-、
    ｉｖ）
    （ここで、ｒ、s、ｔは、各々独立し、0から5までの整数であり、かつ、Ｒ2およびＲ3は、各々独立して、水素原子、(C1-C4)アルキル基、または加水分解性基を表す）、
    *Ｑは、水素原子か、アミノ保護基か、一級および二級アミン、アルコール、チオールと共有結合の形成が可能な官能基のいずれかを表し、
    ＸとＹは、各々独立して、次のいずれかを表し、
    − 水素原子か、
    − または
    基を表し、ここで、ｕは０か１の整数であり、同一であっても異なっていてもよく、ｖとｗは、１か２の整数であり、Ｒ2およびＲ3が、各々独立して、水素原子、(C1-C4)アルキル基、または、エステルならびにアミドを含む群から選択される加水分解性基を表し、かつ、Ｊは-CH2であるか、または、５から１０メンバーおよび所望によりＮ、Ｏ、Ｓから選択される1つ以上のヘテロ原子を含む芳香環のいずれかである、
    − または
    基を表し、ここで、ｒ1、ｓ1、ｔ1は、各々独立して、１と２の間の整数であり、Ｒ2とＲ3は、各々独立して、水素原子、(C1-C4)アルキル基、または、エステルならびにアミドを含む群から選択される加水分解性基を表し、
    ただし、条件としては、Ｘ、Ｗ、Ｙが同時にＨではない）
    およびそれらの塩。
  2. − ＸおよびＹ、または
    − Ｘ、ＷおよびＹ
    が同時にＨではなく、
    および、以下の式の化合物：
    （ここで、Ｒ'はＨまたはＥｔを表す）
    は除かれる、請求項1に記載の化合物。
  3. Ａが５から１０メンバーおよび所望によりＮ、Ｏ、Ｓから選択される1つ以上のヘテロ原子を含む芳香環である、請求項2に記載の化合物。
  4. Ａがピリジンを表す、請求項3に記載の化合物。
  5. ＸおよびＹが、ピジリンの窒素のオルト位にあり、かつ、Ｗがピジリンの窒素のパラ位にあることを特徴とする、請求項4に記載の化合物。
  6. Ｗが、
    *Br
    *-O-(CH2)3NHBoc
    を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１から5までのいずれか一項に記載の化合物。
  7. XおよびYがそれぞれ以下の基、
    を表すことを特徴とする、請求項１から6までのいずれか一項に記載の化合物。
  8. Ｊがピラゾール‐1‐イル基またはピリジン‐2‐イル基を表す、請求項１から７までのいずれか一項に記載の化合物。
  9. ＸおよびＷが、ピジリンの窒素のオルト位にあり、かつ、Ｙがピジリンの窒素のパラ位にあるることを特徴とする、請求項4に記載の化合物。
  10. ＷがＥ−Ｇ−Ｑ基を表す、ここで：
    *Ｅは、mが0から5までの整数である(CH2)m基を表し
    *Ｇは、以下を含む基を表し
    ｉ）
    （ここで、ｒ、s、ｔは、各々独立して、0から5までの整数であり、かつ、Ｒ2およびＲ3は、各々独立して、水素原子、(C1-C4)アルキル基、または加水分解性基を表す）、
    *Ｑは、水素原子か、アミノ保護基か、一級および二級アミン、アルコール、チオールと共有結合の形成が可能な官能基にいずれかを表し、
    Ｘは以下を表し：
    そして、ＹはＨを表す、
    請求項9に記載の化合物。
  11. ホスホン酸エステルの選択的脱保護のステップを含むことを特徴とし、該ステップが、活性化された官能基および少なくとも1つのホスホン酸エステル官能基を有する式（Ｉ）の化合物を、ルチジンの存在下で、ジクロロメタンまたはクロロホルムなどの溶液中のトリメチルシリルブロミドと接触させ、続いて、アルコール、特に、メタノールで、シリル化エステルの脱保護をすることを含む、請求項１から10までのいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の製造法。
  12. 金属イオンと請求項１から10までのいずれか一項に記載の二官能性配位子との間の錯体。
  13. 錯体が、さらに、生物学的に活性な化合物または担体を含む群から選択される標的構造に結合していることを特徴し、したがって、式（Ｉ）
    （ここで、
    Ａは以下を表す
    − 窒素原子か、
    − 環および芳香環が所望により、Ｎ、Ｏ、Ｓから選択される1つ以上のヘテロ原子を含み、３から６の炭素原子を含む環、または５から１０のメンバーを含む芳香環のいずれか、
    Ｗは以下を表す
    − Ｅ−Ｇ−Ｑ基、ここで
    *Ｅは、酸素原子、
    mが0から5までの整数である(CH2)m基、そして-CONH-基を含む群から選択される、
    *Ｇは、以下を含む群から選択される
    ｉ）ｏが0から5の間の整数である-(CH2)o、
    ｉｉ）ｎが0から5の間の整数である-(CH2)n-NH-、
    iii）ｐとｑが0から5の間の整数である-(CH2)p-CO-NH-(CH2)q-NH-、
    ｉｖ）-（CH2）m-CO-NH-（CH2）p-NHZ、および
    ｖ）
    （ここで、ｒ、s、ｔは、各々独立し、0から5までの整数であり、かつ、Ｒ2およびＲ3は、各々独立して、水素原子、(C1-C4)アルキル基、または加水分解性基を表す）、
    *Ｑは、一級および二級アミン、アルコール、チオールと共有結合の形成が可能な官能基を表す、および
    ＸとＹは、各々独立して、次のいずれかを表し、
    − 水素原子か、
    − または
    基を表し、ここで、ｕは０か１の整数であり、同一であっても異なっていてもよく、ｖとｗは、１か２の整数であり、Ｒ2およびＲ3が、各々独立して、水素原子、(C1-C4)アルキル基、または、エステルならびにアミドを含む群から選択される加水分解性基を表し、かつ、Ｊは-CH2であるか、または、５から１０メンバーおよび所望によりＮ、Ｏ、Ｓから選択される1つ以上のヘテロ原子を含む芳香環のいずれかである、
    − または
    基を表し、ここで、ｒ1、ｓ1、ｔ1は、各々独立して、１と２の間の整数であり、Ｒ2とＲ3は、各々独立して、水素原子、(C1-C4)ルキル基、または、エステルならびにアミドを含む群から選択される加水分解性基を表し、
    しかし、条件としては、Ｘ、Ｗ、Ｙが同時にＨではない）
    およびその医学的に許容される塩が共役錯体を構成していることを特徴とする、請求項12に記載の錯体。
  14. 請求項10に定義した式（I）の二官能性配位子および生物学的に活性な化合物または担体を含む共役系。
  15. 二官能性配位子が、
    L1：
    L2:
    L3:
    およびL4:
    を含む群から選択されることを特徴とする、請求項12および13のいずれかの１つに記載の錯体、または、請求項14に記載の系。
  16. 請求項12、13および15のいずれか一項に記載の少なくとも1つの錯体または請求項14に記載の少なくとも1つの系および医薬的に許容されるビヒクルを含む診断薬。
  17. 薬剤としての使用するための、請求項12、13および15のいずれか一項に記載の錯体、または、請求項11に記載の少なくとも1つの系。
  18. 請求項10に定義した二官能性配位子を含む診断薬の製造用キット。
  19. （１）請求項10に定義した二官能性配位子
    （２）金属放射性核種の塩またはキレートの溶液
    を含む、請求項18に記載の診断薬の製造用キット。
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