JPS62270600A - キヤリヤ−分子の金属イオン標識化 - Google Patents
キヤリヤ−分子の金属イオン標識化Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
金属イオンは、通達物質としてはきわめて有効なもので
あり、極微量の場合でも放射性物質の放出、蛍光、電子
スピン共鳴、核磁気共鳴緩和操作等を用いて検知可能で
ある。抗体または抗原のごときキャリヤー分子に付加さ
せるとその濃度または位置を知らせることができる。こ
のキャリヤー分子は、病変に関連する分子、たとえば腫
瘍性の抗原に対して親和力を示すことがある。したがっ
て、金属イオンに配合されたキャリヤー分子は、生体内
、外での診断手段として、体内での疾患の有無および/
または位置を知るために使用することができる。ある種
の放射線放出性金属イオンはまた、腫瘍細胞面抗原に対
する抗体として、キャリヤー分子に付加させることによ
シ、金属イオンを腫瘍部位に搬送して、腫瘍患部を照射
する目的に使用できる。
あり、極微量の場合でも放射性物質の放出、蛍光、電子
スピン共鳴、核磁気共鳴緩和操作等を用いて検知可能で
ある。抗体または抗原のごときキャリヤー分子に付加さ
せるとその濃度または位置を知らせることができる。こ
のキャリヤー分子は、病変に関連する分子、たとえば腫
瘍性の抗原に対して親和力を示すことがある。したがっ
て、金属イオンに配合されたキャリヤー分子は、生体内
、外での診断手段として、体内での疾患の有無および/
または位置を知るために使用することができる。ある種
の放射線放出性金属イオンはまた、腫瘍細胞面抗原に対
する抗体として、キャリヤー分子に付加させることによ
シ、金属イオンを腫瘍部位に搬送して、腫瘍患部を照射
する目的に使用できる。
キャリヤー分子を、金属イオンで標識する場合に若干問
題となることがある。すなわち、金属イオンを安定化さ
せる条件とキャリヤー分子の安定性とは両立しないこと
があり、その逆も同様である。この不一致の例は、蛋白
質またはポリペプチドとIn−111,tたはGa−6
7で蛋白質またはポリペプチドを標識する場合に生ずる
。金属イオンは、蛋白質またはポリペプチドの誘導体を
形成したのち、蛋白質またはポリペプチドに合体させる
ことができる。この誘導体は金属イオンとキレート化合
物を形成させる端末キレート基の一部を備えている。た
とえば、本願出願による米国特許出願筒650,127
号には、放射性核種金属イオンを、抗体断片の遊離スル
フヒドリル基と反応させて得る三官能カップリング剤を
用い、抗体断片に合体させる方法が記載され、同時に金
属イオンを錯体化し得るキレート基のことも記述してh
る。
題となることがある。すなわち、金属イオンを安定化さ
せる条件とキャリヤー分子の安定性とは両立しないこと
があり、その逆も同様である。この不一致の例は、蛋白
質またはポリペプチドとIn−111,tたはGa−6
7で蛋白質またはポリペプチドを標識する場合に生ずる
。金属イオンは、蛋白質またはポリペプチドの誘導体を
形成したのち、蛋白質またはポリペプチドに合体させる
ことができる。この誘導体は金属イオンとキレート化合
物を形成させる端末キレート基の一部を備えている。た
とえば、本願出願による米国特許出願筒650,127
号には、放射性核種金属イオンを、抗体断片の遊離スル
フヒドリル基と反応させて得る三官能カップリング剤を
用い、抗体断片に合体させる方法が記載され、同時に金
属イオンを錯体化し得るキレート基のことも記述してh
る。
さらに英国特許出願Gi3第2109.407号はキレ
ート誘導化抗体を利用して、腫瘍造影用の抗体−金属イ
オン配位体を形成する方法が記載されている。キレート
−誘導化蛋白質をインジウム−111またはガリウム−
67で標識化する場合、問題点が二つある。すなわち、
この金属イオンはその塩化物塩類の形態で利用し、これ
はPH3,5以下の水溶液中に保持しなければならない
。さもないと、水と反応して不溶性の金属水酸化物を生
じ、この酸性−条件が、蛋白質またはポリペプチドの安
定性あるいは生物的活性に悪影響を及ぼす。
ート誘導化抗体を利用して、腫瘍造影用の抗体−金属イ
オン配位体を形成する方法が記載されている。キレート
−誘導化蛋白質をインジウム−111またはガリウム−
67で標識化する場合、問題点が二つある。すなわち、
この金属イオンはその塩化物塩類の形態で利用し、これ
はPH3,5以下の水溶液中に保持しなければならない
。さもないと、水と反応して不溶性の金属水酸化物を生
じ、この酸性−条件が、蛋白質またはポリペプチドの安
定性あるいは生物的活性に悪影響を及ぼす。
テクネチウムは、蛋白質標識に際し、別の問題点を与え
る。テクネチウムには7つの酸化形態があり、最も安定
した状態は過テクネチウム酸塩(Tc0+)としての+
7である。+5状態もキレート化合物およびキレート化
蛋白質標識に対しきわめて効果的ではあるが、この酸化
状態は簡単に達成されない。(+5)状態の準安定テク
ネチウムは容易に(+4)状態に還元され、過剰の還元
剤存在下で還元−加水分解化したT c O2として捕
集される。このテクネチウムはキレートまたは蛋白質の
標識用としては役立たない。その理由は、このものが自
己会合するか、特定の表面結合性を示さぬからである。
る。テクネチウムには7つの酸化形態があり、最も安定
した状態は過テクネチウム酸塩(Tc0+)としての+
7である。+5状態もキレート化合物およびキレート化
蛋白質標識に対しきわめて効果的ではあるが、この酸化
状態は簡単に達成されない。(+5)状態の準安定テク
ネチウムは容易に(+4)状態に還元され、過剰の還元
剤存在下で還元−加水分解化したT c O2として捕
集される。このテクネチウムはキレートまたは蛋白質の
標識用としては役立たない。その理由は、このものが自
己会合するか、特定の表面結合性を示さぬからである。
計算量の還元剤を用いる場合、その還元状態はきわめて
効率の悪いものである。
効率の悪いものである。
この結果、生成した+5Tcは、還元剤が使い果たされ
ると、再度過テクネチウム塩に酸化される傾向を示す。
ると、再度過テクネチウム塩に酸化される傾向を示す。
蛋白質またはポリペプチド分子上の官能基が原因となり
、キレート錯体形成で別の問題が生じる。
、キレート錯体形成で別の問題が生じる。
アミンおよびカルボキシル端末基、アミド結合組織、ア
スパラギン酸、グルタミン酸、リシン、システィン、チ
ロシン、ヒスチジン等で蛋白質およびポリペプチド中に
見出だされる側鎖残基はすべて、キレート配位子特性を
有して因る。分子内アミノ酸構成、およびその第三構造
の結果、このキレート配位子が合体して強固な多歯状の
金属イオン結合部位を形成するに至る。このため、蛋白
質はそれぞれ金属結合性を示すスペクトルを持つことに
なり、その弱体部位は、血流中の金属イオンを、他の血
漿蛋白質または低分子量成分中に浸出させることができ
る。強固な部位は蛋白の代謝作用に妨害となる。この結
果常時、肝臓および腎臓のごとき主要な蛋白質異化作用
の行われる部位に放射性核種が保留される。
スパラギン酸、グルタミン酸、リシン、システィン、チ
ロシン、ヒスチジン等で蛋白質およびポリペプチド中に
見出だされる側鎖残基はすべて、キレート配位子特性を
有して因る。分子内アミノ酸構成、およびその第三構造
の結果、このキレート配位子が合体して強固な多歯状の
金属イオン結合部位を形成するに至る。このため、蛋白
質はそれぞれ金属結合性を示すスペクトルを持つことに
なり、その弱体部位は、血流中の金属イオンを、他の血
漿蛋白質または低分子量成分中に浸出させることができ
る。強固な部位は蛋白の代謝作用に妨害となる。この結
果常時、肝臓および腎臓のごとき主要な蛋白質異化作用
の行われる部位に放射性核種が保留される。
過テクネチウム酸塩のその部位での還元中における抗体
のテクネチウムによる標識化で見受けられる別の難点は
、蛋白質二値化物結合の付随還元である。派生するスル
フヒドリル基は、優先的に、テクネチウムを共役キレー
トに結びつける〔ベイク(P(10)k、C,f(、)
とその協同研究者、J、Nucl。
のテクネチウムによる標識化で見受けられる別の難点は
、蛋白質二値化物結合の付随還元である。派生するスル
フヒドリル基は、優先的に、テクネチウムを共役キレー
トに結びつける〔ベイク(P(10)k、C,f(、)
とその協同研究者、J、Nucl。
Med、Biol、、 12:3 (1985年)参照
〕。この合成標識化抗体は、代謝物質を形成し、このも
のは肝臓または腎臓から除かれない。このことは正常な
肝臓の造影のためのテクネチウム標識化ミクロ集積アル
ブミンにとっては理想的な特性であるが、放射性核種を
肝臓から除去したい場合、生体内診断利用の標識化抗体
にとってはきわめて好ましくないことである。
〕。この合成標識化抗体は、代謝物質を形成し、このも
のは肝臓または腎臓から除かれない。このことは正常な
肝臓の造影のためのテクネチウム標識化ミクロ集積アル
ブミンにとっては理想的な特性であるが、放射性核種を
肝臓から除去したい場合、生体内診断利用の標識化抗体
にとってはきわめて好ましくないことである。
この除去問題点の程度は、標識化する抗体の代謝作用の
行方を考えれば理解できる。I1m!癌を見出す標識化
抗体を使用する場合、常時行うべき測定は、注入線量の
微量部分のみが目標とする固体腫瘍に向かうということ
である〔チロシン(LarsonS 、M )とその協
同研究者、、 J 、 Cl1n 、 Invest
、 。
行方を考えれば理解できる。I1m!癌を見出す標識化
抗体を使用する場合、常時行うべき測定は、注入線量の
微量部分のみが目標とする固体腫瘍に向かうということ
である〔チロシン(LarsonS 、M )とその協
同研究者、、 J 、 Cl1n 、 Invest
、 。
72:2101−2114ページ(1983年):ブラ
ギ(Buraggi 、 G、 L )と協同研究者、
、 Cancer Res、 。
ギ(Buraggi 、 G、 L )と協同研究者、
、 Cancer Res、 。
(す3378−3387ページ(1985年):ハルプ
ルy (Halpern 、 8.E )とその協同研
究者。
ルy (Halpern 、 8.E )とその協同研
究者。
Diagnostic Imaging (診断造影術
)、6月、40−47ページ(1983年)の資料等参
照〕。このことは、腫瘍が比較的低い血流を有しており
、血管の浸透性が小さいことによる。すなわち、競合状
態の標識化抗体の吸収異化経路に比し、腫瘍の標識化抗
体としての吸収効率がきわめて低めことを示す。最適条
件下では、目標組織は注入量の3〜10%を吸収するは
ずであり、吸収されるII!1!瘍が1%以下であるこ
とは、さらに多い。残部の90チ以上は肝・腎臓により
吸収されねばならない。
)、6月、40−47ページ(1983年)の資料等参
照〕。このことは、腫瘍が比較的低い血流を有しており
、血管の浸透性が小さいことによる。すなわち、競合状
態の標識化抗体の吸収異化経路に比し、腫瘍の標識化抗
体としての吸収効率がきわめて低めことを示す。最適条
件下では、目標組織は注入量の3〜10%を吸収するは
ずであり、吸収されるII!1!瘍が1%以下であるこ
とは、さらに多い。残部の90チ以上は肝・腎臓により
吸収されねばならない。
従来技術による放射性核種金属イオンで標識する抗体は
、この部位から放射線標識される異化代謝物質を急速に
洗い出すことはできない。この放射性核種保留による欠
点は二つある。肝臓または腎臓から放出される高放射線
レベルは、目標とする腫瘍から得られる低レベルの放射
線を掩蔽してし甘う。さらに大切なことは、もつとも放
射線に敏感な組織に属する肝臓と腎臓とが許容し得ぬ放
射線量を蓄積することである。線量計測eよ標識濃度と
直線関係にあるが、曝露時間に対しては指数的関係にあ
る。したがって、肝臓と腎臓との曝露時間を、全く除去
されぬ時点から放射性核種の半減期に至る時点1で低め
ると線量の目立った減少が得られる。
、この部位から放射線標識される異化代謝物質を急速に
洗い出すことはできない。この放射性核種保留による欠
点は二つある。肝臓または腎臓から放出される高放射線
レベルは、目標とする腫瘍から得られる低レベルの放射
線を掩蔽してし甘う。さらに大切なことは、もつとも放
射線に敏感な組織に属する肝臓と腎臓とが許容し得ぬ放
射線量を蓄積することである。線量計測eよ標識濃度と
直線関係にあるが、曝露時間に対しては指数的関係にあ
る。したがって、肝臓と腎臓との曝露時間を、全く除去
されぬ時点から放射性核種の半減期に至る時点1で低め
ると線量の目立った減少が得られる。
放射性核種が、少なくとも2倍の半減期にわたって、目
標とする腫瘍細胞の表面上に保留されるが、一方、正常
の清掃性をもつ器官内では60分以内の生物学的半減期
を有する標識化代謝物質を辱えるような抗体標識化方法
を考案することは、きわめてのぞ葦しいことである。
標とする腫瘍細胞の表面上に保留されるが、一方、正常
の清掃性をもつ器官内では60分以内の生物学的半減期
を有する標識化代謝物質を辱えるような抗体標識化方法
を考案することは、きわめてのぞ葦しいことである。
たとえば一種の抗体のごとき、キレート−誘導蛋白質ま
たはポリペプチドを標識化する一つの方法は、いわゆる
「転移配位子」を使用することである。この転移配位子
保有の金属イオン錯体は、蛋白質の安定条件下で可溶性
である。転移配位子と金属イオン間の錯体では、金属イ
オンが、この転移配位子より金属イオンに対し強いキレ
ート親和力を示すキレ−1・−誘導蛋白質と触れること
により転移を受ける。欧州特許出願第82201602
゜8は、蛋白質を放射性核種金属イオンで標識化する方
法について記載しており、この方法は、金属イオンの中
間錯体としてカルボン酸塩、ジチオカルボン酸塩、エル
レート、またはその混合物を用いている。
たはポリペプチドを標識化する一つの方法は、いわゆる
「転移配位子」を使用することである。この転移配位子
保有の金属イオン錯体は、蛋白質の安定条件下で可溶性
である。転移配位子と金属イオン間の錯体では、金属イ
オンが、この転移配位子より金属イオンに対し強いキレ
ート親和力を示すキレ−1・−誘導蛋白質と触れること
により転移を受ける。欧州特許出願第82201602
゜8は、蛋白質を放射性核種金属イオンで標識化する方
法について記載しており、この方法は、金属イオンの中
間錯体としてカルボン酸塩、ジチオカルボン酸塩、エル
レート、またはその混合物を用いている。
種々の理由から、従来使用していた転移配位子ば、完全
に満足のいくものでなかった。理想的な転移配位子は、
性質において漸新な一面を持っている。インジウム−1
,11およびガリウム−67のごとき、安定酸化状態を
有する放射性核種と共用する場合、その特性として挙げ
られる事項は以下のとおりである。
に満足のいくものでなかった。理想的な転移配位子は、
性質において漸新な一面を持っている。インジウム−1
,11およびガリウム−67のごとき、安定酸化状態を
有する放射性核種と共用する場合、その特性として挙げ
られる事項は以下のとおりである。
■、 pi(中性状態で、放射性核種金属イオンが、
生理的緩衝剤中で金属水酸化物を形成しないこと。
生理的緩衝剤中で金属水酸化物を形成しないこと。
2、天然筐たはキレート−誘導蛋白質の中程度の強さの
外因性キレート配位子と、放射性核種金属イオンとの急
速かつ定量的な結合を行わせないこと。
外因性キレート配位子と、放射性核種金属イオンとの急
速かつ定量的な結合を行わせないこと。
3、放射性核種金属イオンを急速かつ定量的に蛋白質結
合の強度のキレ−1・基に転移させること。
合の強度のキレ−1・基に転移させること。
4、水溶性、非毒性かつ非変異誘発性であること。
5、入手しやすく、できれば安価であること。
テクネチウムのごとき、酸化性能に敏感な放射性核種と
共用する場合、転移配位子は以下の性質を持つべきであ
る。
共用する場合、転移配位子は以下の性質を持つべきであ
る。
6、引きつづくキレート化のための還元プロセスの間、
適癌な酸化状態のもとに、放射性核種金属イオンを定量
的に捕集すること。
適癌な酸化状態のもとに、放射性核種金属イオンを定量
的に捕集すること。
7、還元剤を除去した場合、放射性核種金属イオンの再
酸化をおとさぬこと。
酸化をおとさぬこと。
以上の条件に適合するには転移配位子は二つの物理化学
的性質を持たねばならない。すなわち、放射性核種イオ
ンとの錯体は、動力学的に不安定でろって、熱力学的に
安定な長歯状配位子とともに存在するときには急速に交
換可能なものでなければならない。さらに、転移配位子
は十分な熱力学的安定性を有し、生理学的pi(の緩衝
水溶液中、蛋白質分子上での水酸化イオンまたは外因性
キレート部位では交換ができないものでなければならな
い。前者の特性は、EDTA錯体滴定法で使用される金
属イオン指示薬の一般的な特性であるが、きわめて少数
の金属イオン指示薬または弱キレート化剤(欧州特許出
願第82201602,8号記載のもの)は、理想的転
移配位子として上記7項目をすべてみたす理想的な物質
である。
的性質を持たねばならない。すなわち、放射性核種イオ
ンとの錯体は、動力学的に不安定でろって、熱力学的に
安定な長歯状配位子とともに存在するときには急速に交
換可能なものでなければならない。さらに、転移配位子
は十分な熱力学的安定性を有し、生理学的pi(の緩衝
水溶液中、蛋白質分子上での水酸化イオンまたは外因性
キレート部位では交換ができないものでなければならな
い。前者の特性は、EDTA錯体滴定法で使用される金
属イオン指示薬の一般的な特性であるが、きわめて少数
の金属イオン指示薬または弱キレート化剤(欧州特許出
願第82201602,8号記載のもの)は、理想的転
移配位子として上記7項目をすべてみたす理想的な物質
である。
本発明は、金属イオンと蛋白質またはポリベプチドとの
配合体の製造方法に関する。この発明方法によシ得られ
る配合体は、生体外および生体内の診断のだめの通達物
質として、そしである種の放射性核種の金属イオンの場
合には標的移行のための治療剤として有用なものである
。この方法にヨレハ、4.5−ジヒドロオキシル−m−
ベンゼンジスルホン酸またはその塩類および一種の金属
イオンから構成された金属イオン転移錯体を、外因性キ
レ−1・基に共有結合させた蛋白質またはポリペプチド
と反応させる。外因キレート基の金属イオンに対する親
和力は、4,5−ジヒドロオキシル−m−ベンゼンジス
ルホン酸塩より高い。反応は、蛋白質またはポリペプチ
ドが安定性を示すPH条件丁、水溶液媒体中で行わせる
。ここで、4,5−ジヒドロオキシル−m−ベンゼンジ
スルホン酸(ティロン(tiron )ど呼称)が前記
7条件をみたすため、金属イオンをキレート誘導蛋白質
またはポリペプチドと結合する理想的転移配位子である
ことが分かった。
配合体の製造方法に関する。この発明方法によシ得られ
る配合体は、生体外および生体内の診断のだめの通達物
質として、そしである種の放射性核種の金属イオンの場
合には標的移行のための治療剤として有用なものである
。この方法にヨレハ、4.5−ジヒドロオキシル−m−
ベンゼンジスルホン酸またはその塩類および一種の金属
イオンから構成された金属イオン転移錯体を、外因性キ
レ−1・基に共有結合させた蛋白質またはポリペプチド
と反応させる。外因キレート基の金属イオンに対する親
和力は、4,5−ジヒドロオキシル−m−ベンゼンジス
ルホン酸塩より高い。反応は、蛋白質またはポリペプチ
ドが安定性を示すPH条件丁、水溶液媒体中で行わせる
。ここで、4,5−ジヒドロオキシル−m−ベンゼンジ
スルホン酸(ティロン(tiron )ど呼称)が前記
7条件をみたすため、金属イオンをキレート誘導蛋白質
またはポリペプチドと結合する理想的転移配位子である
ことが分かった。
この発明の一実施態様として示すと、1ず蛋白質または
ポリペプチドとテクネチウムイオン、たとえばTc−9
9m(この場合テクネチウムイオン一:+7以−ドの還
元状態)との配合体を調製する。
ポリペプチドとテクネチウムイオン、たとえばTc−9
9m(この場合テクネチウムイオン一:+7以−ドの還
元状態)との配合体を調製する。
この態様によれば、4,5−ジヒドロオキシ−m −ベ
ンゼンジスルホン酸と過テクネテートイオンとを、水溶
液媒体中で反応させ、さらに過テクネテートイオンを水
溶液媒体中電解還元し、テクネチウムイオンが還元状態
にある転移錯体を形成さぜる。この転移錯体と蛋白質ま
たはポリペプチドとを反応させ、蛋白質またはポリペプ
チドを外因キレート・基、すなわちその還元テクネチウ
ムイオンに対するキレ−1・親和力が、4,5−ジヒド
ロオキシル−m−ベンゼンジスルホン酸よす大キい上記
キレート基に共有結合させる。反応は蛋白質またはポリ
ペプチドが安定であるpl(条件のもとで、水溶液媒体
中で行わせる。4,5−ジヒドロオキシル−rn−ベン
ゼンジスルホン酸は、テクネチウムを低い酸化状態で捕
捉し、還元剤が除去された場合の再酸化を防いでいる。
ンゼンジスルホン酸と過テクネテートイオンとを、水溶
液媒体中で反応させ、さらに過テクネテートイオンを水
溶液媒体中電解還元し、テクネチウムイオンが還元状態
にある転移錯体を形成さぜる。この転移錯体と蛋白質ま
たはポリペプチドとを反応させ、蛋白質またはポリペプ
チドを外因キレート・基、すなわちその還元テクネチウ
ムイオンに対するキレ−1・親和力が、4,5−ジヒド
ロオキシル−m−ベンゼンジスルホン酸よす大キい上記
キレート基に共有結合させる。反応は蛋白質またはポリ
ペプチドが安定であるpl(条件のもとで、水溶液媒体
中で行わせる。4,5−ジヒドロオキシル−rn−ベン
ゼンジスルホン酸は、テクネチウムを低い酸化状態で捕
捉し、還元剤が除去された場合の再酸化を防いでいる。
本発明は、蛋白質またはポリペプチドと金属イオンとの
配合体を製造する方法を提供する。得られた配合体は有
用な放射線医薬品として利用される。本B 明け、 4
、5−ジヒドロオキシル−m−ベンゼンジスルホン酸
、つマシテイロン(tiron)がこの配合体製造に理
想的な転移配位子であるという新たな知見に基づいてい
る。ティロンのキレート自体は公知のものであり、ティ
ロンはたとえば、A−(3B+ 、 Ga8+ 、 ■
n8+のどとき金属イオ7(D錯体利用滴定のキレート
剤として用いられている。
配合体を製造する方法を提供する。得られた配合体は有
用な放射線医薬品として利用される。本B 明け、 4
、5−ジヒドロオキシル−m−ベンゼンジスルホン酸
、つマシテイロン(tiron)がこの配合体製造に理
想的な転移配位子であるという新たな知見に基づいてい
る。ティロンのキレート自体は公知のものであり、ティ
ロンはたとえば、A−(3B+ 、 Ga8+ 、 ■
n8+のどとき金属イオ7(D錯体利用滴定のキレート
剤として用いられている。
葦だ、ティロンは他のキレート化合物と共用するか、ま
たけ単独で、過剰鉄の処理および鉛、アンチモンならび
に急性ウランの中毒解毒剤としても用いられてきた〔ベ
ージンガ(Bas inger 、 M、A、 )およ
びジョーン(Jones 、M、M )による11.e
s 、 Corrrn 。
たけ単独で、過剰鉄の処理および鉛、アンチモンならび
に急性ウランの中毒解毒剤としても用いられてきた〔ベ
ージンガ(Bas inger 、 M、A、 )およ
びジョーン(Jones 、M、M )による11.e
s 、 Corrrn 。
in Chem、 Path、 and Pharm、
34 : 351ペ一ジ1981年〕。さらに最近に
なり、Tc−99mティロンロン上腎臓用造影剤として
有効なことが分かった。〔テクネチウム化学、原子核医
学におけるand Nuclear Medicine
、eds 、Deutsch、14.。
34 : 351ペ一ジ1981年〕。さらに最近に
なり、Tc−99mティロンロン上腎臓用造影剤として
有効なことが分かった。〔テクネチウム化学、原子核医
学におけるand Nuclear Medicine
、eds 、Deutsch、14.。
N1colini 、M、and Wagner、H,
N、、p、113.RavenPress (1983
年)〕。ただしテティンを、本明細書で示す放射線医薬
調製の際の転移配位子として使用する記載はどこにも見
当らない。
N、、p、113.RavenPress (1983
年)〕。ただしテティンを、本明細書で示す放射線医薬
調製の際の転移配位子として使用する記載はどこにも見
当らない。
本発明によれば、標識することを望む蛋白質またはポリ
ペプチドの種類を問わず、このものと金属イオンとの配
合体の製造が可能である。以下、本発明は、蛋白質との
結合に関して説明されているが、ポリペプチドまたは遊
離キレートにも利用できると理解されるべきである。共
有結合し得る蛋白質には、抗原、抗体お」:びその他蛋
白質を含み、これらは金属イオンと結合させると、生体
内。
ペプチドの種類を問わず、このものと金属イオンとの配
合体の製造が可能である。以下、本発明は、蛋白質との
結合に関して説明されているが、ポリペプチドまたは遊
離キレートにも利用できると理解されるべきである。共
有結合し得る蛋白質には、抗原、抗体お」:びその他蛋
白質を含み、これらは金属イオンと結合させると、生体
内。
生体外の診断、治療分野に利用するととができる。
蛋白質の断片も使用できるのは言う寸でもない。
この発明の一態様では、使用される蛋白質は一種の抗体
、F ((10)′1’)2筐たけその断片であるFa
b’が使われる。
、F ((10)′1’)2筐たけその断片であるFa
b’が使われる。
この発明の方法によって金属イオンと共役結合された蛋
白質は、外因キレート基と共有結合さぜることによって
変性される。「外因性キレートグループ」と言うのは、
通常、蛋白質分子上には存在しないキレート基を意味す
る。外因キレート基の金属イオンに対する親和力は、テ
ィロンのそれより大である必要がある。ティロンより熱
力学的に安定した長歯状配位子およびテクネチウム標識
の除用いる1以上のスルフヒドリル基を含むすべての配
位子も使用して差し支えない。
白質は、外因キレート基と共有結合さぜることによって
変性される。「外因性キレートグループ」と言うのは、
通常、蛋白質分子上には存在しないキレート基を意味す
る。外因キレート基の金属イオンに対する親和力は、テ
ィロンのそれより大である必要がある。ティロンより熱
力学的に安定した長歯状配位子およびテクネチウム標識
の除用いる1以上のスルフヒドリル基を含むすべての配
位子も使用して差し支えない。
多種の各歯状キレート基の種類を問わず、蛋白質の変性
にこれを使用することができる。外因キレート基は、蛋
白質分子内の1以上のアミノ酸残留分の側鎖と反応する
有機結合基の一部を介してその蛋白質分子と共有結合す
ることができる。
にこれを使用することができる。外因キレート基は、蛋
白質分子内の1以上のアミノ酸残留分の側鎖と反応する
有機結合基の一部を介してその蛋白質分子と共有結合す
ることができる。
発明の方法によって標識化できる変性抗体断片は、遊離
のスルフヒドリル基保有の抗体のFab’断片と、上式
(I) のカップリング剤とを反応させ得られる。ここで、R,
はアルキレン(cl−20) またはフェニレンのどと
き2価の有機基をあられし、マレイミドの一部とR′と
を結合させるのに役立ち、R′はキレート基の一つを示
す。
のスルフヒドリル基保有の抗体のFab’断片と、上式
(I) のカップリング剤とを反応させ得られる。ここで、R,
はアルキレン(cl−20) またはフェニレンのどと
き2価の有機基をあられし、マレイミドの一部とR′と
を結合させるのに役立ち、R′はキレート基の一つを示
す。
このカップリング剤と抗体の断片とを反応させると、式
(11)の変性抗体断片が得られる。
(11)の変性抗体断片が得られる。
(J
ここで、RおよびR′は上記のごとくであり、Abは抗
体Fab’断片の残分をあられす。Fab’抗体断片は
、従来の方法を用い抗体全部を酵素分割により調製する
。式(1)のカップリング剤を用い、キレート基を任意
の蛋白質またはその断片(システィン側鎖、すなわち遊
離スルフヒドリル基保有)に共有結合させることが可能
である。本発明で使用し得る、蛋白質を変性するのに用
いる示した(1)式のカップリング剤には、式(Ia)
および(ib)の物質が含まれる。
体Fab’断片の残分をあられす。Fab’抗体断片は
、従来の方法を用い抗体全部を酵素分割により調製する
。式(1)のカップリング剤を用い、キレート基を任意
の蛋白質またはその断片(システィン側鎖、すなわち遊
離スルフヒドリル基保有)に共有結合させることが可能
である。本発明で使用し得る、蛋白質を変性するのに用
いる示した(1)式のカップリング剤には、式(Ia)
および(ib)の物質が含まれる。
式(Ia)の化合物および類似化合物は、以下の反応機
構に従って得られる。
構に従って得られる。
NC(cH2)6N(cI(2CH2NH2)2■−■
2N(cH2)7NCCH2C112N(cH2CO3
I()2〕2式 (Ib)の化合物と類似化合物はつぎ
の反応機構に従って得られる。
2N(cH2)7NCCH2C112N(cH2CO3
I()2〕2式 (Ib)の化合物と類似化合物はつぎ
の反応機構に従って得られる。
(c21−15CH2) 2N(cH2)5C1(co
2HH2 (c6f(、CH2)2N (c1j2)、CHCON
H2(c6H,CH2)2N(cH2)、Cl−ICl
−12NH□(c6H5CH2)2N(cI−1□)5
C1−ICl−12N(cI−I2C0,2)I)
2H2N(cII2)5CIICH2N(cI−12C
O2■−■)2N(cH2CO2H)2 す 蛋白質を変成してこのものにキレート剤を共有結合させ
るのに用い、Tc−99mのごときテクネチウムイオン
をもって蛋白質を標識したい場合に好んで用いられる、
その他好適のカップリング剤の一般式はつぎの(ffl
)弐またけ(rV)式であられされる。
2HH2 (c6f(、CH2)2N (c1j2)、CHCON
H2(c6H,CH2)2N(cH2)、Cl−ICl
−12NH□(c6H5CH2)2N(cI−1□)5
C1−ICl−12N(cI−I2C0,2)I)
2H2N(cII2)5CIICH2N(cI−12C
O2■−■)2N(cH2CO2H)2 す 蛋白質を変成してこのものにキレート剤を共有結合させ
るのに用い、Tc−99mのごときテクネチウムイオン
をもって蛋白質を標識したい場合に好んで用いられる、
その他好適のカップリング剤の一般式はつぎの(ffl
)弐またけ(rV)式であられされる。
ここで、”1 +几2および几8は同一または異種のも
のとし、それぞれは1〜6個の炭素原子をもつアルキル
、6〜8個の炭素原子をもつアリル、7〜9個炭素原子
をもつアラルキル構成の基から選定された一つの基をあ
られし、その何れもが一以上のヒドロキシル、アルコキ
シ、カルボキシまたはスルホネート基と置換することが
でき:nは1または2をあられし;AAは相互にアミド
結合により結ばれた別個のαまたはβアミノ酸残留物;
iは2〜6までの整数;Xは蛋白質またはポリペプチド
のε−アミノ基とアミド結合を形成し得る一つの活性基
、を表わす。好ましくはXは、ハロゲン、スルホサクシ
ンイミドイルナトリウム、N8゜構成の基の中から選定
されたものであるとよい。
のとし、それぞれは1〜6個の炭素原子をもつアルキル
、6〜8個の炭素原子をもつアリル、7〜9個炭素原子
をもつアラルキル構成の基から選定された一つの基をあ
られし、その何れもが一以上のヒドロキシル、アルコキ
シ、カルボキシまたはスルホネート基と置換することが
でき:nは1または2をあられし;AAは相互にアミド
結合により結ばれた別個のαまたはβアミノ酸残留物;
iは2〜6までの整数;Xは蛋白質またはポリペプチド
のε−アミノ基とアミド結合を形成し得る一つの活性基
、を表わす。好ましくはXは、ハロゲン、スルホサクシ
ンイミドイルナトリウム、N8゜構成の基の中から選定
されたものであるとよい。
以下の物質は式(1)のカップリング剤の一例を示し、
蛋白質にキレート剤を共有結合させて蛋白質を変成する
のに用いることができる。
蛋白質にキレート剤を共有結合させて蛋白質を変成する
のに用いることができる。
以下の物質は式(IV)のカップリング剤の一例を示し
、これは放射性核種金属イオンを抗体のε−アミノ基に
結合させるために用いることができる。
、これは放射性核種金属イオンを抗体のε−アミノ基に
結合させるために用いることができる。
c6H5C6)i5
弐■のカップリング剤は式X−01:(の化合物を(V
)式 のカルボキシル酸と、カルボキシル基のエステル化が行
われるように反応させて得られる。弐■の化合物は順次
、ポリペプチドH+A、Aう一1cO2)(から調製可
能である。ポリペプチドはクロロアセチルクロライドの
ごときクロロアシルクロライド。
)式 のカルボキシル酸と、カルボキシル基のエステル化が行
われるように反応させて得られる。弐■の化合物は順次
、ポリペプチドH+A、Aう一1cO2)(から調製可
能である。ポリペプチドはクロロアセチルクロライドの
ごときクロロアシルクロライド。
と反応させ、(■1)式の化合物
を得、乙。
つぎに、式(Vl)の化合物と Na S−〇R1とを
反応させると(V)式の化合物が得られる。
反応させると(V)式の化合物が得られる。
式(V)の化合物を得る上記の例にならって、以下゛の
S−ベンゾイルメルカプトアセチルグリシルグリシルグ
リシンが得られる。
S−ベンゾイルメルカプトアセチルグリシルグリシルグ
リシンが得られる。
CI CH2CONHCH2CONHCH3CON)I
CIi□CO□H8−ベンゾイルメルカプトアセチルグ
リシルグリシルグリシン酸塩は、たとえばN−ヒドロキ
シースルホサクシンイミドナトリウムと反応させると、
式(III)の化合物、すなわちソジウムスルホサクン
ンイミドール(S−ベンゾイルメルカプトアセチルグリ
シルグリシルグリシン)が得られ、同様にソジウムチオ
ベンゾエートの代りにソジウノ・チオアセテートを用い
、ソジウムスルホサクシンイミドイル(S−アセチルメ
ルカプトグリシルグリシルグリシネート)を得ることが
できる。
CIi□CO□H8−ベンゾイルメルカプトアセチルグ
リシルグリシルグリシン酸塩は、たとえばN−ヒドロキ
シースルホサクシンイミドナトリウムと反応させると、
式(III)の化合物、すなわちソジウムスルホサクン
ンイミドール(S−ベンゾイルメルカプトアセチルグリ
シルグリシルグリシン)が得られ、同様にソジウムチオ
ベンゾエートの代りにソジウノ・チオアセテートを用い
、ソジウムスルホサクシンイミドイル(S−アセチルメ
ルカプトグリシルグリシルグリシネート)を得ることが
できる。
式(IV)のカップリング剤は、式X −Oi(化合物
と式(Vll) のカルボン酸と反応させ得られる。
と式(Vll) のカルボン酸と反応させ得られる。
式(Vll)のカルボン酸の生成工程は、たとえば次の
ごとぐあられされる。
ごとぐあられされる。
CI CH2CONE−]
ft−C−8−C112CON丁■CH2CfIC02
I■「 f%−(、S −C112CONH 式(III) tたは(IV)のカップリング剤を一種
の抗体葦たはその断片の任意の蛋白質のε−アミノ側鎖
と反応させると、本発明の方法に有用なキレート改質蛋
白質が州られる。
I■「 f%−(、S −C112CONH 式(III) tたは(IV)のカップリング剤を一種
の抗体葦たはその断片の任意の蛋白質のε−アミノ側鎖
と反応させると、本発明の方法に有用なキレート改質蛋
白質が州られる。
共有結合方式により外因キレ−1・基を導入するその他
愛性蛋白質生成法は、英国特許出願082109407
号に記載されており、ここで参考のためかかげた。
愛性蛋白質生成法は、英国特許出願082109407
号に記載されており、ここで参考のためかかげた。
−に記載7たカップリング剤は、単に一例を示したにす
ぎず、このものを用いて、外因性キレート剤を蛋白質と
結合させ、本発明実施に有用な変成蛋白質を得ることが
できる。
ぎず、このものを用いて、外因性キレート剤を蛋白質と
結合させ、本発明実施に有用な変成蛋白質を得ることが
できる。
この場合、外因キレート基の金属イオンに対する親和力
がティロンより高くさえあれば、とのような共有結合キ
レート基含有の蛋白質でも使用して差支えない。
がティロンより高くさえあれば、とのような共有結合キ
レート基含有の蛋白質でも使用して差支えない。
本方法により蛋白質を配合できる金属イオンは、Mg
、AI 、Ca 、Sc 、Ti 、 V 、Cr 、
Mn 、Fe 、Co。
、AI 、Ca 、Sc 、Ti 、 V 、Cr 、
Mn 、Fe 、Co。
Ni 、Cu 、Zn 、Ga 、Sr 、Y 、Zr
、Mo 、Tc 、Pd。
、Mo 、Tc 、Pd。
Cd 、In 、8n 、Sb 、Ba 、Hf 、W
、Re 、Hg 、TI。
、Re 、Hg 、TI。
Pb 、Bi 、La 、Ce 、几h 、Pr 、
Nd 、Sm 、nu 、Gd。
Nd 、Sm 、nu 、Gd。
Tb 、Dy 、Ho 、Er 、Tm 、Yd 、
Th 、U 、Puおよびその同位元素の中から選定す
ることができる。
Th 、U 、Puおよびその同位元素の中から選定す
ることができる。
使用する特定金属イオンは、金属イオン/蛋白質配合体
の最終用途によってき着る。診断、治療用としては、各
種金属の放射性同位元素が有用である。たとえば、生成
配合体をIff!瘍検知全検知とするシンチグラム診断
に利用する場合は、インジウム−111、ガリウム−6
7、テクネチウム−99mのごとき、r線放射性核種金
属イオンが好適である。レニウム−186,188,1
89、ロジウム−105、サマリウム−153,イツト
リウム90および銅−67のごときβ線放射同位元素は
腫瘍の臨床処置に配合体を使用する場合、有用な元素で
ある。
の最終用途によってき着る。診断、治療用としては、各
種金属の放射性同位元素が有用である。たとえば、生成
配合体をIff!瘍検知全検知とするシンチグラム診断
に利用する場合は、インジウム−111、ガリウム−6
7、テクネチウム−99mのごとき、r線放射性核種金
属イオンが好適である。レニウム−186,188,1
89、ロジウム−105、サマリウム−153,イツト
リウム90および銅−67のごときβ線放射同位元素は
腫瘍の臨床処置に配合体を使用する場合、有用な元素で
ある。
配合体を腫瘍の生体内検知または処置用に使う場合、選
定蛋白質は通常、発癌性抗原CEA 、α−胎生蛋白、
ヒトの絨毛性腺刺激ホルモンまたはそのβサブ単位、結
腸特殊抗原−p、腫瘍特殊糖蛋白、その他のごとき腫瘍
マーカーとして知られる抗原の一種に対する抗体または
その断片である。
定蛋白質は通常、発癌性抗原CEA 、α−胎生蛋白、
ヒトの絨毛性腺刺激ホルモンまたはそのβサブ単位、結
腸特殊抗原−p、腫瘍特殊糖蛋白、その他のごとき腫瘍
マーカーとして知られる抗原の一種に対する抗体または
その断片である。
本発明の方法では、キレート誘導の蛋白質をティロンお
よび金属イオン含有の金属イオン転移錯体と反応させる
。転移錯体は通常(ニ)ナトリウム塩形態のティロンと
金属イオンとを、その金属イオンが溶液中安定化する条
件、たとえばそのイオンが溶液からその水酸化物として
析出しない条件のもとで反応させて得られる。たとえば
、インジウム−111,ガリウム−67いずれの場合で
も金属の塩化物を−(<3.5の条件で水溶液媒体中で
反応させる。
よび金属イオン含有の金属イオン転移錯体と反応させる
。転移錯体は通常(ニ)ナトリウム塩形態のティロンと
金属イオンとを、その金属イオンが溶液中安定化する条
件、たとえばそのイオンが溶液からその水酸化物として
析出しない条件のもとで反応させて得られる。たとえば
、インジウム−111,ガリウム−67いずれの場合で
も金属の塩化物を−(<3.5の条件で水溶液媒体中で
反応させる。
外因キレート剤と共有結合する蛋白質と金属イオン転移
錯体との反応は、蛋白質の安定化する−(条件にある水
溶液媒体中で行わせる。「安定」というのは蛋白質が溶
解性を維持し、かつその生物活性度を持続する、との意
味である。通常、反応に好適なPHは、約5〜8の生理
的PHと見てよい。
錯体との反応は、蛋白質の安定化する−(条件にある水
溶液媒体中で行わせる。「安定」というのは蛋白質が溶
解性を維持し、かつその生物活性度を持続する、との意
味である。通常、反応に好適なPHは、約5〜8の生理
的PHと見てよい。
金属イオン転移錯体と蛋白質とを、できれば約20〜6
0℃、理想的には還元剤の計算量を用いるだけでは、反
応学的に還元は有効に行われない。形成されたTc
は、還元剤が消費されてし貰うと直ちに過テクネチウム
酸塩に再酸化される傾向がある。
0℃、理想的には還元剤の計算量を用いるだけでは、反
応学的に還元は有効に行われない。形成されたTc
は、還元剤が消費されてし貰うと直ちに過テクネチウム
酸塩に再酸化される傾向がある。
テクネチウムの電解還元はのぞましいものであるが、還
元はまた5nC22またはN a”BH+のごとき物質
とテクネチウムとを結合させる従来の化羊還元剤を用い
て行わせることができる。
元はまた5nC22またはN a”BH+のごとき物質
とテクネチウムとを結合させる従来の化羊還元剤を用い
て行わせることができる。
ティロンを還元テクネチウムとの転移配位子として用い
る場合、テクネチウムは+5酸化状態を維持しやすいこ
と、さらにこの還元剤を除去しても再酸化されないこと
が知られている。テクネチウム含有の転移錯体は、Na
Tc04のごとき過テクネチウム酸塩化合物と、
ティロンの(ニ)ナトリウム塩形態のものを密閉容器中
、水溶液媒体中で反応させて得ることができる。容器の
上部空間は、アルゴンのごとき不活性ガスで交換して、
テクネチウムを電解還元させ、転移錯体をこれに付随し
て形成させる。電解還元は、ジルコニウム電極を水溶液
媒体中に挿入し、約20〜37℃の温度で、金属イオン
がティロンから蛋白質上の外因キレート基に移行するの
に十分な時間培養する。
る場合、テクネチウムは+5酸化状態を維持しやすいこ
と、さらにこの還元剤を除去しても再酸化されないこと
が知られている。テクネチウム含有の転移錯体は、Na
Tc04のごとき過テクネチウム酸塩化合物と、
ティロンの(ニ)ナトリウム塩形態のものを密閉容器中
、水溶液媒体中で反応させて得ることができる。容器の
上部空間は、アルゴンのごとき不活性ガスで交換して、
テクネチウムを電解還元させ、転移錯体をこれに付随し
て形成させる。電解還元は、ジルコニウム電極を水溶液
媒体中に挿入し、約20〜37℃の温度で、金属イオン
がティロンから蛋白質上の外因キレート基に移行するの
に十分な時間培養する。
通常、反応完結の時間は1時間以内で十分とされる。金
属イオン標識化蛋白は、たとえば、高圧液体クロマトグ
ラフィーを用いた従来の蛋白回収技術により回収できる
。
属イオン標識化蛋白は、たとえば、高圧液体クロマトグ
ラフィーを用いた従来の蛋白回収技術により回収できる
。
Tc−99mを使用する場合、金属イオンの電解還元反
応を、金属イオン転移錯体の形成に合わせて行うとよい
。テクネチウムは7酸化状態で存在するとされ、もつと
も安定なのは、過テクネチウム酸塩(Tc04 )と
しての+7の状態である。
応を、金属イオン転移錯体の形成に合わせて行うとよい
。テクネチウムは7酸化状態で存在するとされ、もつと
も安定なのは、過テクネチウム酸塩(Tc04 )と
しての+7の状態である。
+5状態でもシンチグラフイ診断に使用される標識化キ
レート誘導蛋白質用として、きわめて有用なものである
が、Tc は準安定でおり、容易にTc+4に還元さ
れ、過剰の還元剤存在下で還元性加水分解化T c O
2として捕捉されやすい。この形態のi” c 02は
、蛋白質標識用には適当でない。その理由は、このもの
が自己会合しやすいか、特定の表面結合性を示さぬから
である。媒体中に十分な電流、たとえば約100ミリア
ンペアを約2分間通じて完了させる。生成した転移錯体
は、+5酸化状態のテクネチウムとともにキレ−1・誘
導蛋白質標識用として使用可能である。
レート誘導蛋白質用として、きわめて有用なものである
が、Tc は準安定でおり、容易にTc+4に還元さ
れ、過剰の還元剤存在下で還元性加水分解化T c O
2として捕捉されやすい。この形態のi” c 02は
、蛋白質標識用には適当でない。その理由は、このもの
が自己会合しやすいか、特定の表面結合性を示さぬから
である。媒体中に十分な電流、たとえば約100ミリア
ンペアを約2分間通じて完了させる。生成した転移錯体
は、+5酸化状態のテクネチウムとともにキレ−1・誘
導蛋白質標識用として使用可能である。
この発明によれば、外因キレート基の位置できわめて効
果的かつ選択的な蛋白質標識作用が発揮できる。ティロ
ンは金属イオンを、蛋白質上比較的微力な外因キレート
基に搬送させることはない。
果的かつ選択的な蛋白質標識作用が発揮できる。ティロ
ンは金属イオンを、蛋白質上比較的微力な外因キレート
基に搬送させることはない。
以下に示す実施例は、本発明を一層詳細に説明するだめ
のものであり、発明の範囲を限定するだめのものではな
い。実施例で用いる原料は以下のごとく14製する。
のものであり、発明の範囲を限定するだめのものではな
い。実施例で用いる原料は以下のごとく14製する。
う酢酸。
ねずみの抗CEA率分枝形抗体を(NH4)2S04沈
殿法およびイオン交換クロマトグラフ法により腹水液か
ら精製油I月する。無疵の抗体の酵素断片からF(ab
’)2を形成させるためには、パラムにもとづき、チオ
ールを含まない予備活性化パパインを使用する。W製さ
れたF(a +〕’ )2断片は、引きつづきワット−
q 7 (Whatman ) I)g−52およびセ
ファデックス(5ephadex ) G −1,0O
L/レジン用のクロマトグラフカラムを通して得られる
。変質ゲル電気泳動(81)S−PAGE )によれば
、単離蛋白質の純度は95%以上となる。
殿法およびイオン交換クロマトグラフ法により腹水液か
ら精製油I月する。無疵の抗体の酵素断片からF(ab
’)2を形成させるためには、パラムにもとづき、チオ
ールを含まない予備活性化パパインを使用する。W製さ
れたF(a +〕’ )2断片は、引きつづきワット−
q 7 (Whatman ) I)g−52およびセ
ファデックス(5ephadex ) G −1,0O
L/レジン用のクロマトグラフカラムを通して得られる
。変質ゲル電気泳動(81)S−PAGE )によれば
、単離蛋白質の純度は95%以上となる。
抗−CEA単分枝形抗体のパパイン開裂により生成する
F(ab’)2断片は、2個の重質鎖と合体する鏡開二
硫化物結合を1個有することがわかった。
F(ab’)2断片は、2個の重質鎖と合体する鏡開二
硫化物結合を1個有することがわかった。
この判定は、弱還元条件下にジチオスレイトル(D i
” ’1’ )とF(ab’)2抗体断片とを還元し、
2個の重質鎖と合体する鏡開二硫化物結合を断つととも
に、重質、軽質側れの鎖とも結合する鏡開二硫化物結合
をも断ち、一方、上記二値化物結合は破壊1〜ない状態
とすることによりなされる。ついで、還元断片物質を8
H−NBM(遊離スルフヒドリル基と反応)と反応させ
、さらにS I) S−ポリアクリルアミドゲル上を通
過させ、それぞれ遊離の含トリチウムスルフヒドリル基
保有の重質、重質鎖に対応するバンドを形成させる。ゲ
ルは蛋白質と混合させ蛍光発生素浸漬ののち、乾燥、X
線フィルムに露出させ、重質および重質鎖バンド内での
相対強度を測る。蛍光素浸漬バンドを切断除去したのち
、シンチレーションカウンターにかける。
” ’1’ )とF(ab’)2抗体断片とを還元し、
2個の重質鎖と合体する鏡開二硫化物結合を断つととも
に、重質、軽質側れの鎖とも結合する鏡開二硫化物結合
をも断ち、一方、上記二値化物結合は破壊1〜ない状態
とすることによりなされる。ついで、還元断片物質を8
H−NBM(遊離スルフヒドリル基と反応)と反応させ
、さらにS I) S−ポリアクリルアミドゲル上を通
過させ、それぞれ遊離の含トリチウムスルフヒドリル基
保有の重質、重質鎖に対応するバンドを形成させる。ゲ
ルは蛋白質と混合させ蛍光発生素浸漬ののち、乾燥、X
線フィルムに露出させ、重質および重質鎖バンド内での
相対強度を測る。蛍光素浸漬バンドを切断除去したのち
、シンチレーションカウンターにかける。
一つのスルフヒドリル基を測定する手段として、光鎖帯
に対する毎分のカウント数を用いると、重質鎖が二つの
スルフヒドリル基を有することがわかる。その一つは光
線鎖と結合の鏡開二硫化物に相当し、その結果性のスル
フヒドリル基は、全CEA抗体のパパイン開裂によ多形
成されるF(ab’)2断片の重質鏡開、単一の鏡開二
硫化物結合に相当する。
に対する毎分のカウント数を用いると、重質鎖が二つの
スルフヒドリル基を有することがわかる。その一つは光
線鎖と結合の鏡開二硫化物に相当し、その結果性のスル
フヒドリル基は、全CEA抗体のパパイン開裂によ多形
成されるF(ab’)2断片の重質鏡開、単一の鏡開二
硫化物結合に相当する。
全抗体のパパイン開裂によ多形成された単−分枝形の抗
CEAのF(ab’)2断片物質を、PH約7.4の緩
衝溶液中室温下で1〜2時間還元し最終的に濃度5〜2
0mMのDTTとする。
CEAのF(ab’)2断片物質を、PH約7.4の緩
衝溶液中室温下で1〜2時間還元し最終的に濃度5〜2
0mMのDTTとする。
上記手順で得た還元性抗CE A Fab’蛋白質から
N2気流中、i)MIO半透膜により濾過しつつ5 Q
mM M E S 、 2 mM Na2 EDTA
、中、PH6,5〜6.8のもとで徹底的に緩衝液交換
させ、過剰のチオール反応剤を除く。生成液の分取試料
を既知比放射能の8H−NgMを用いて滴定し、還元反
応で生成するFab’分子当りの遊離S H基数を計算
する。残部は上記記載の手順、すなわち、(((7−マ
レイミドヘプチル)イミノ)ビス(エチレンニトリロ)
〕テトう酢酸、室温で2〜4時間、のち4 ’Cで一夜
放置の手順で生成のカップリング剤10−25 mMと
反応させる。
N2気流中、i)MIO半透膜により濾過しつつ5 Q
mM M E S 、 2 mM Na2 EDTA
、中、PH6,5〜6.8のもとで徹底的に緩衝液交換
させ、過剰のチオール反応剤を除く。生成液の分取試料
を既知比放射能の8H−NgMを用いて滴定し、還元反
応で生成するFab’分子当りの遊離S H基数を計算
する。残部は上記記載の手順、すなわち、(((7−マ
レイミドヘプチル)イミノ)ビス(エチレンニトリロ)
〕テトう酢酸、室温で2〜4時間、のち4 ’Cで一夜
放置の手順で生成のカップリング剤10−25 mMと
反応させる。
実施例1
転移配位子としてティロンを用いたIn−111と抗−
CEAFab’キレート錯体配合物の調製50 mM、
HC/3 (Bad −Pharm )巾約50〜
100μci相当の111 In C13B 1.
Oμ2を、pi−12,4,4mMHc、、g中10m
Mティロン5μ形に加え、5分間室温で培養した。さら
にここでpi46.0の200mMM ESの10μ−
elおよび前記記載の手順により得た抗−CE A F
a l)’と、キレートカップリング剤との配合体2
〜15mt27mlの物質10μmeを添加し、最終P
■1を5.0〜5.5とした。反応混合物を室温中1時
間培養し、そのちと2〜5μ−〇を酢酸セルローズス)
IJツブ上に滴下して電気泳動分析にかけた。電気泳
動操作には、PI(7,Qの50mM Hepesを電
極緩衝液として使用する。電気泳動条件下では、111
1n−キレート化抗−CPCAFab’配合体は当初か
ら残留し、未反応のIn−111は泳動して別種ピーク
を示した。分離方式電気泳動では、キレート−配合体反
応混合物の7μ沼を電気泳動操作に先立ち、pi(6,
0の200 mM Na2EDTAの2μ石とともに1
ず培養した。E I) T Aを添加すると、未反応テ
ィロン−In−111ピーク中、移動を生ずるが、キレ
ート−配合体のピークには影響が及ばなかった。このこ
とは、キレート化抗体配合物は、 l 11−In−
ティロンキレートより安定性の高−ことを示す。この結
果の複合体を第1図に示す。
CEAFab’キレート錯体配合物の調製50 mM、
HC/3 (Bad −Pharm )巾約50〜
100μci相当の111 In C13B 1.
Oμ2を、pi−12,4,4mMHc、、g中10m
Mティロン5μ形に加え、5分間室温で培養した。さら
にここでpi46.0の200mMM ESの10μ−
elおよび前記記載の手順により得た抗−CE A F
a l)’と、キレートカップリング剤との配合体2
〜15mt27mlの物質10μmeを添加し、最終P
■1を5.0〜5.5とした。反応混合物を室温中1時
間培養し、そのちと2〜5μ−〇を酢酸セルローズス)
IJツブ上に滴下して電気泳動分析にかけた。電気泳
動操作には、PI(7,Qの50mM Hepesを電
極緩衝液として使用する。電気泳動条件下では、111
1n−キレート化抗−CPCAFab’配合体は当初か
ら残留し、未反応のIn−111は泳動して別種ピーク
を示した。分離方式電気泳動では、キレート−配合体反
応混合物の7μ沼を電気泳動操作に先立ち、pi(6,
0の200 mM Na2EDTAの2μ石とともに1
ず培養した。E I) T Aを添加すると、未反応テ
ィロン−In−111ピーク中、移動を生ずるが、キレ
ート−配合体のピークには影響が及ばなかった。このこ
とは、キレート化抗体配合物は、 l 11−In−
ティロンキレートより安定性の高−ことを示す。この結
果の複合体を第1図に示す。
抗−〇 EA F”ab’/ In −111配合体は
、腫瘍造影剤、たとえば公知の光走査技術を用いた、結
腸の腫瘍造影用として、生理的に許容された緩衝液の形
で静脈内注入投与することができる。
、腫瘍造影剤、たとえば公知の光走査技術を用いた、結
腸の腫瘍造影用として、生理的に許容された緩衝液の形
で静脈内注入投与することができる。
実施例■
転移配位子としてティロンを用いるGa−67と抗−C
W A F ab’キレート錯配錯体合体製非金属製滅
萌チューブ6本の各チューブ内で、Ga −67(10
mCj 7mgを50 mM Ho、8中に溶解したも
の)10μ形と10mMティロン(Tiron)5μ!
とを混合する。混合物のpi(を、200 mMMES
緩衝液10μ形を用いて6.0に調節した。
W A F ab’キレート錯配錯体合体製非金属製滅
萌チューブ6本の各チューブ内で、Ga −67(10
mCj 7mgを50 mM Ho、8中に溶解したも
の)10μ形と10mMティロン(Tiron)5μ!
とを混合する。混合物のpi(を、200 mMMES
緩衝液10μ形を用いて6.0に調節した。
3本のチューブに、
a)pt46.0の50 mM M E 8緩衝液10
μ石b)全抗−CBA単分枝形抗体7.7 m97m1
ノ10μ形 C)[5−マレイミドペンチル(エチレンジニ)・リロ
)〕テトラ酢酸に共有結合した抗−CB A Fab’
6 my 7mgの1oμmeの何れかを加えた。こ
のチューブ内容物を室温下で1時間培養した。培養後、
各チューブから7μ沼を抽出し、室温下で30分間、エ
チレンジアミン四酢酸0.2Mの2μ沼を用いて培養す
る。つぎにサンプルを実施例1記載の酢酸セルローズ電
気泳動にかけて分析した。
μ石b)全抗−CBA単分枝形抗体7.7 m97m1
ノ10μ形 C)[5−マレイミドペンチル(エチレンジニ)・リロ
)〕テトラ酢酸に共有結合した抗−CB A Fab’
6 my 7mgの1oμmeの何れかを加えた。こ
のチューブ内容物を室温下で1時間培養した。培養後、
各チューブから7μ沼を抽出し、室温下で30分間、エ
チレンジアミン四酢酸0.2Mの2μ沼を用いて培養す
る。つぎにサンプルを実施例1記載の酢酸セルローズ電
気泳動にかけて分析した。
電気泳動による挙動パターンは、Ga−67が共有結合
のキレート基を含む抗−CE A Fab’に向はティ
ロンで搬送されることを示した。なお、この要領で抗−
CEAFab’に結合したGa−67は]cDTAでは
抽出されなり。比較として、電気泳動パターンは、Ga
−67がティロン/Ga−67転移錯体からはD I)
T Aで抽出されるが、ティロン/Ga−67を用い
培養した全抗体(共有結合キレート基を有しない)に向
っては、Ga−67は全く移行しないことを示した。
のキレート基を含む抗−CE A Fab’に向はティ
ロンで搬送されることを示した。なお、この要領で抗−
CEAFab’に結合したGa−67は]cDTAでは
抽出されなり。比較として、電気泳動パターンは、Ga
−67がティロン/Ga−67転移錯体からはD I)
T Aで抽出されるが、ティロン/Ga−67を用い
培養した全抗体(共有結合キレート基を有しない)に向
っては、Ga−67は全く移行しないことを示した。
実施例■
テクネチウム−99m用転移配位子として使用するティ
ロン(Tiron ) TO−99m用に転移配位子として使用するティロンと
、グルコヘプトネート、グルコネート、サッカレートの
どときカルボキシル化糖の使用比較を行った。カルボキ
シル化糖は’re−99m向は転移配位子としてもつと
も多く使われている。ここで三つの要因について調査し
た。この要因とは、単一かつ均質な錯体として、これが
テクネチウムを捕集する転移配位子性能、培養時間に対
する転移錯体としての安定性、および配位子からキレー
ト置換抗体に至るテクネチウムの転移性能がそれである
。
ロン(Tiron ) TO−99m用に転移配位子として使用するティロンと
、グルコヘプトネート、グルコネート、サッカレートの
どときカルボキシル化糖の使用比較を行った。カルボキ
シル化糖は’re−99m向は転移配位子としてもつと
も多く使われている。ここで三つの要因について調査し
た。この要因とは、単一かつ均質な錯体として、これが
テクネチウムを捕集する転移配位子性能、培養時間に対
する転移錯体としての安定性、および配位子からキレー
ト置換抗体に至るテクネチウムの転移性能がそれである
。
第1表は、1ft解還元操作中、転移性酸化状態の下で
、数種のカルボキシル化糖とティロンとのテクネチウム
捕捉性能を示したものである。電解還元反応用小びんに
は、それぞれの試験用配位子の50In9、飽和重炭酸
ナトリウムを用いpi(7,0に調節した水の1mg、
テクネチウム発生器からの過テクネチウム酸塩1 ml
を含むものとした。小びんを封止後、アルゴンで5分間
パージする。この小びんに(直径2.0111の)ジル
コン電極を挿入し、小びんを転倒さぜ、IOV、100
mAの電流を2分間溶液内に流す。得られるTc−99
m配位子錯体を、アセトニトリル、水(60:40)の
上向ベーパクロマトグラフを用い、放射化クロマトグラ
ム走査により測定する。3組のカルボキシル化糖のそれ
ぞれ試料では、連続してテクネチウム還元を防止するこ
とができず、したがって放射能の24〜30チがT c
02ラジオクロマトグラムビークをあられした。ティ
ロンはテクネチウムの78チを均一ピークとしてとらえ
、僅か放射能5.3%分のみがさらに’1’ c 02
を還元するのに使用される。
、数種のカルボキシル化糖とティロンとのテクネチウム
捕捉性能を示したものである。電解還元反応用小びんに
は、それぞれの試験用配位子の50In9、飽和重炭酸
ナトリウムを用いpi(7,0に調節した水の1mg、
テクネチウム発生器からの過テクネチウム酸塩1 ml
を含むものとした。小びんを封止後、アルゴンで5分間
パージする。この小びんに(直径2.0111の)ジル
コン電極を挿入し、小びんを転倒さぜ、IOV、100
mAの電流を2分間溶液内に流す。得られるTc−99
m配位子錯体を、アセトニトリル、水(60:40)の
上向ベーパクロマトグラフを用い、放射化クロマトグラ
ム走査により測定する。3組のカルボキシル化糖のそれ
ぞれ試料では、連続してテクネチウム還元を防止するこ
とができず、したがって放射能の24〜30チがT c
02ラジオクロマトグラムビークをあられした。ティ
ロンはテクネチウムの78チを均一ピークとしてとらえ
、僅か放射能5.3%分のみがさらに’1’ c 02
を還元するのに使用される。
ティロン−テクネチウム錯体の電解還元をつづけても、
Tc02をさらに蓄積させることにはならなかった。
Tc02をさらに蓄積させることにはならなかった。
第 1 表
各種転移配位子対捕捉還元
テクネチウムの相対効率
*
グルコヘプトネート 70,0 24.3
1.2グルコネ−) 62,0 29
.9 1.4サツカレート 51,2 23.
9 9.8テ イ ロ ン 7
8.0 5.3
4.9本全ラジオクロマトグラム放射能のチ 第2表は、培養時間に対するティロンまたはサッカレー
トテクネチウム錯体の安定性を示す。
1.2グルコネ−) 62,0 29
.9 1.4サツカレート 51,2 23.
9 9.8テ イ ロ ン 7
8.0 5.3
4.9本全ラジオクロマトグラム放射能のチ 第2表は、培養時間に対するティロンまたはサッカレー
トテクネチウム錯体の安定性を示す。
1”c−99m−ティロン、およびTc−99m−サッ
カレートは、上記記載事項に準じて得られた。サッカレ
ートは、テクネチウム錯体を69.8%から51.1%
に順次消費し、これに伴って還元加水分解化テクネチウ
ムは、5時間の培養期間を通じ15.9%から30.4
%と減退加水分解テクネチウムの増となってあられれ
るのが分かる。ティロン錯体は、同一反応期中でもほと
んど大した変動を示さない。
カレートは、上記記載事項に準じて得られた。サッカレ
ートは、テクネチウム錯体を69.8%から51.1%
に順次消費し、これに伴って還元加水分解化テクネチウ
ムは、5時間の培養期間を通じ15.9%から30.4
%と減退加水分解テクネチウムの増となってあられれ
るのが分かる。ティロン錯体は、同一反応期中でもほと
んど大した変動を示さない。
Tc−ティロン、Tc−サッカレートの時間に対する相
対安定性 サッカレート 時間(hr、 ) 錯 体 T c 02
0.5 69.8チ 15.9%2.0
62.4% 24.8%5.0 51.
1饅 30.4%ティロン 0.5 78.0% 5.8%2.0 6
5.6% 12.6%5.0 68.5%
8.9%第2図は、ティロン錯体から、S−アセチル
メルカプトグリシルグリシルグリシン酸塩(Ac −M
AG8)−または2,3ビス(アセチルメルカプトアセ
トアミド)プロピオン酸塩(Ac −CO2DAD S
)と結合した抗体断片物質へとテクネチウムが転移す
る性能を比較したものである。上記ティロン存在下での
過テクネチウム酸塩の電解還元により、はぼ定量的な錯
体の形成(89,2%)が見られた。
対安定性 サッカレート 時間(hr、 ) 錯 体 T c 02
0.5 69.8チ 15.9%2.0
62.4% 24.8%5.0 51.
1饅 30.4%ティロン 0.5 78.0% 5.8%2.0 6
5.6% 12.6%5.0 68.5%
8.9%第2図は、ティロン錯体から、S−アセチル
メルカプトグリシルグリシルグリシン酸塩(Ac −M
AG8)−または2,3ビス(アセチルメルカプトアセ
トアミド)プロピオン酸塩(Ac −CO2DAD S
)と結合した抗体断片物質へとテクネチウムが転移す
る性能を比較したものである。上記ティロン存在下での
過テクネチウム酸塩の電解還元により、はぼ定量的な錯
体の形成(89,2%)が見られた。
コノ錯体をA c −M A G BまたはAc −C
O2D A D Sの置換F(ab’)2断片物質何れ
かで攻撃すると、それぞれの抗体に対し、テクネチウム
が86.3%および88.2%移行転移した。しかし、
アセチル置換のF(ab’)2で攻撃した場合は、テク
ネチウムの6%のみが、ラジオクロマトグラムの始発時
点に見られただけであった。すなわちティロン−テクネ
チウム錯体は、テクネチウムを強固にキレート結合した
抗体のみに移行させ、同様に非キレート基とアシル化し
た抗体には転移することがない。
O2D A D Sの置換F(ab’)2断片物質何れ
かで攻撃すると、それぞれの抗体に対し、テクネチウム
が86.3%および88.2%移行転移した。しかし、
アセチル置換のF(ab’)2で攻撃した場合は、テク
ネチウムの6%のみが、ラジオクロマトグラムの始発時
点に見られただけであった。すなわちティロン−テクネ
チウム錯体は、テクネチウムを強固にキレート結合した
抗体のみに移行させ、同様に非キレート基とアシル化し
た抗体には転移することがない。
第1図はティロンl1l−In錯体とティロンill
−In抗体の錯体とをEDTAで処理する前後における
電気泳動挙動を示すグラフ図である。 第2図は、ティロン−T c 04錯体1電解還元後の
上記錯体;還元Tc−ティロン錯体とキレート基MAG
8とをカプリングさせたF(ab’)2抗体断片物と
の反応生成物;および還元Tc−ティロン錯体とアセチ
ル化F(ab’)2抗体との反応生成物等のラジオクロ
マトグラムを示すグラフ図である。 特許出願人 マリンクロット・インコーポレイテッド代
理人 弁理士 1)澤 博 昭 (外2名) Tc0+ (89,5%)十ティCン電解還元前
−一一テイロソー錯体(89,
2%) 電解1!元後 −m−F(2h
′)。−Mへ61+ 第2図 1−一′ご I′″′ロ 1 ティロン含昔体
86.3F(a b’)2− CO2DADS +テイ
ロソ含昔体 88
.2F(ab’>2−ア七ナル+
−In抗体の錯体とをEDTAで処理する前後における
電気泳動挙動を示すグラフ図である。 第2図は、ティロン−T c 04錯体1電解還元後の
上記錯体;還元Tc−ティロン錯体とキレート基MAG
8とをカプリングさせたF(ab’)2抗体断片物と
の反応生成物;および還元Tc−ティロン錯体とアセチ
ル化F(ab’)2抗体との反応生成物等のラジオクロ
マトグラムを示すグラフ図である。 特許出願人 マリンクロット・インコーポレイテッド代
理人 弁理士 1)澤 博 昭 (外2名) Tc0+ (89,5%)十ティCン電解還元前
−一一テイロソー錯体(89,
2%) 電解1!元後 −m−F(2h
′)。−Mへ61+ 第2図 1−一′ご I′″′ロ 1 ティロン含昔体
86.3F(a b’)2− CO2DADS +テイ
ロソ含昔体 88
.2F(ab’>2−ア七ナル+
Claims (11)
- (1)4,5−ジヒドロオキシル−m−ベンゼンジスル
ホン酸またはその塩のキレートを含む金属イオン転移錯
体を、外因キレート基に共有結合する蛋白質またはポリ
ペプチドと反応させることを含む、蛋白質またはポリペ
プチドと金属イオンとの配合体の製造方法であつて、上
記外因キレート基が、金属イオンに対し、4,5−ジヒ
ドロオキシル−m−ベンゼンジスルホン酸より高いキレ
ート親和力を有し、その反応が蛋白質またはポリペプチ
ドが安定化するpH条件の水溶液媒体中で行われること
からなる方法。 - (2)前記蛋白質またはポリペプチドが、抗体または抗
体の断片である特許請求の範囲第1項記載の方法。 - (3)前記蛋白質またはポリペプチドが腫瘍性抗原に対
する抗体または抗体の断片である特許請求の範囲第1項
記載の方法。 - (4)前記蛋白質またはポリペプチドが、発癌性抗原に
対する抗体または抗体の断片である特許請求の範囲第1
項記載の方法。 - (5)前記金属イオンが、Mg、Al、Ca、Sc、T
i、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、
Ga、Sr、Y、Zr、Mo、Tc、Pd、Cd、In
、Sn、Sb、Ba、Hf、W、Re、Hg、Tl、R
h、Pd、Bi、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu
、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Th、
UおよびPuとその同位元素からなる群から選ばれる特
許請求の範囲第1項記載の方法。 - (6)前記金属イオンが、インジウム、ガリウム、テク
ネチウムおよびその同位元素からなる群から選ばれる特
許請求の範囲第1項記載の方法。 - (7)(a)4,5−ジヒドロオキシル−m−ベンゼン
ジスルホン酸と過テクネチウム酸塩とを水溶液反応媒体
中で反応させること、 (b)工程(a)の反応媒体中の過テクネチウム酸塩イ
オンを+7以下の酸化状態で電解還元すること、(c)
工程(a)および(b)で得られる還元テクネテウムキ
レートを、外因キレート基に共有結合の蛋白質またはポ
リペプチドと反応させることを備え、上記外因キレート
基がテクネチウムイオンに対し、4,5−ジヒドロオキ
シル−m−ベンゼンジスルホン酸より高いキレート親和
力を有し、その反応が蛋白質またはポリペプチドが安定
化するpH条件の水溶液媒体中で行われること、 から成る、蛋白質またはポリペプチドとテクネチウムイ
オンとの配合体の製造方法。 - (8)テクネチウムイオンがTc−99mである特許請
求の範囲第7項記載の方法。 - (9)金属イオンがIn−111、Ga−67およびT
c−99mからなる群から選ばれる特許請求の範囲第2
項、第3項または第4項記載の方法。 - (10)蛋白質またはポリペプチドが一種の抗体または
その抗体の断片であり、これが ▲数式、化学式、表等があります▼( I ) で示されるカップリング剤(ここでRは二価の有機基、
R′はキレート基)との反応により、外因キレート基と
共有結合される特許請求の範囲第2項、第3項または第
4項記載の方法。 - (11)蛋白質またはポリペプチドを、 ▲数式、化学式、表等があります▼(III) または ▲数式、化学式、表等があります▼(IV) から成る群から選ばれたカップリング剤と反応させるこ
とにより、外因キレート基と共有結合される特許請求の
範囲第1項記載の方法。 ここで、R_1、R_2、およびR_3は同一または異
なるものとし、それぞれは1〜6個の炭素原子をもつア
ルキル、6〜8個の炭素原子をもつアリル、7〜9個の
炭素原子をもつアラルキル構成の族から選ばれた基の一
つを示し、その何れもが一個以上のヒドロキシル、アル
コキシ、カルボキシ、またはスルホネート基と置換可能
であり;nは1または2であり;AAはそれぞれ別個の
、相互にアミド結合のαまたはβアミノ酸の一部;iは
2〜6の整数;Xは蛋白質またはポリペプチドのε−ア
ミノ基またはアミノ末端基とともにアミド結合を形成す
ることのできる活性基の一つをあらわす。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US836535 | 1986-03-05 | ||
US06/836,535 US4732974A (en) | 1986-03-05 | 1986-03-05 | Metal ion labeling of carrier molecules |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62270600A true JPS62270600A (ja) | 1987-11-24 |
JPH0791317B2 JPH0791317B2 (ja) | 1995-10-04 |
Family
ID=25272173
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62047871A Expired - Lifetime JPH0791317B2 (ja) | 1986-03-05 | 1987-03-04 | キヤリヤ−分子の金属イオン標識化 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4732974A (ja) |
EP (1) | EP0248506B1 (ja) |
JP (1) | JPH0791317B2 (ja) |
AT (1) | ATE79278T1 (ja) |
AU (1) | AU596828B2 (ja) |
CA (1) | CA1288197C (ja) |
DE (1) | DE3781031T2 (ja) |
ES (1) | ES2035041T3 (ja) |
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1987
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