JPH07508289A

JPH07508289A - 血栓造影用のテクネチウム‐９９ｍ標識ペプチド

Info

Publication number: JPH07508289A
Application number: JP6503844A
Authority: JP
Inventors: ディーン，リチャード・ティ; リスター−ジェイムズ，ジョン
Original assignee: ダイアテク，インコーポレイテッド
Priority date: 1992-05-21
Filing date: 1993-05-21
Publication date: 1995-09-14
Anticipated expiration: 2014-08-25
Also published as: ES2150945T3; JPH10291939A; EP0641222A1; JP3380738B2; AU4384593A; CA2136330C; ATE196094T1; DK0641222T3; CA2136330A1; WO1993023085A1; DE69329382D1; JP2941057B2; ATE329624T1; AU677208B2; US5925331A; EP1004322B1; EP1004322A3; EP0641222B1; DE69334033D1; EP1004322A2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】血栓造影用のテクネチウム−９９ｍ標識ペプチド本発明は、放射線診断試薬および標識放射線診断剤の製法に関する。さらに詳しくは、本発明は、テクネチウム −９９ｍ（Ｔｃ−９９ｍ）で標識しうる試薬、かがる試薬を製造し放射線標識する方法およびキット、ならびにかがる試薬を用いて哺乳動物体内の血栓形成部位を造影する方法に関する。

２　関連技術の説明血栓症および血栓塞栓症、特に深静脈血栓症（ＤＴＶ）および肺塞栓症（Ｐ　Ｅ）は、重篤な病状ならびに死亡に連がる一般的な臨床状態である。合衆国においては、年に約５００万人の轡者が１またはそれを超えるＤＴＶ罹病を経験し、５００゜０００を超えるケースのＰＥが発生し、その結果１００．０００人が死亡していると見積もられた（ジェイ、／−ボウルド（Ｊ　、　Ｓ　ｅａｂｏｌｄ）、ソサイエティー・オブ・ニューフレア・メディノン・アニュアル・ミーティング・１９９０（Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆＮｕｃｌｅａｒ　ＭｅｃＨｃｉｎｅ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　１９９０乃。また、早期のＤＴＶがら発生する全ての肺塞栓症は９０％を超えるとも見積もられている。幸いなことには、抗凝固治療を十分に早期に滝川した場合にはこれらの状態が治療されうる。

しかしなから、かかる治療は不必要な予防適用を排除する危険（例えば、内出血）を伴う。（組換え組織プラスミノーゲン活性化因子またはストレプトキナーゼのごとき）さらに進歩した血栓技術を急篤な場面に用いることができるが、これらの技術でさえ大きな危険を伴う。さらに、これらの技術を効果的に臨床適用することは、古療効果をモニターできるよう、進行する血栓部位を同定することを要する。

これらの理由により、イン・ビホ（ｉｎ〜□１ｖｏ）で血栓を局在する迅速な手段、最も好ましくは、非侵入的方法、が大変望ましい。血栓部位を同定するのに利用されている最近の方法は、コンスタント静脈造影（ｃｏｎｓｔａｎｔ　ｖｅｎｏｇｒａｐｈ〜ンおよび圧縮Ｂ−モード超音＃（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｂ −ｍｏｄｅ　ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）であり、どの技術を用いるかの選択は、血栓の予想位置による。しかしながら、前者の技術は侵入性であり、双方の技術とも磨者にとって不快である。加えて、これらの方法は数々の場合において、不遇か不明確な結果を得るかである。

核薬剤の分野では、（放射線トレーサーまたは放射性薬品と呼ばれている）放射線標識トレーサー化合物を少量内部投与してその分布を検出することにより、ある種の病理状態を局在し、またはそれらの広がりを評価する。これらの放射性薬品を検出する方法は、一般的に、造影法または放射線造影法として知られている。

放射線造影において、該放射線標識はガンマ線放射放射核であって、ガンマ線検出カメラを用いて放射線トレーサーの位置を決定する（しばしば、このプロセスはガンマ・ノンチグラフィーと呼ばれている）。該放射線トレーサーが病理部位（陽性コントラストという）に局在するか、または別法として、該放射性トレーサーがかかる病理部位に特に局在しないか（陰性コントラストという）のいずれかにより選抜されるので、造影部位が検出できる。

ヒトの光学的な放射線造影には、多くの因子を考慮しなければならない。検出効果を最大化するため、１００ないし２００ｋｅＶ範囲でのガンマエネルギーを放射する放射性核種が好ましい。密書への吸収放射線量を最小限にとどめるため、該放射線核種の物理学的半減期は、造影工程が許容する限りできるだけ短くすべきである。いつ何時でも検査を行えるよう、臨床部位で常に利用できる放射線核種源を有しておくことが有利である。

放射線造影に有用な種々の放射線核種が知られており、”　Ｇ　ａ　ｓ　””Ｔ　ｃ（Ｔｃ−９９ｍ）、Ｉｌｌ　ｌ　ｎ、　１２コｌ、１２５１．＋５ｏｙｂまｊユは１ｇ６Ｒｅを包含する。

１４０ｋｅｌ’のガンマ線を放射し、６時間の物理的半減期を有し、モリブデン −９９７テク不チウム一９９ｍ発生機を容易に該部位に利用できるため、Ｔｃ− ９９ｍが特に好ましい放射性核種である。

放射線造影、特にガンマノンチグラフィーは、イン・ビポの血栓の位置を検出する非侵入方法を提供する。イン・ビボに投与した場合には他の組織に優先して、血栓成分に特異的に結合するカンマ線放射性トレーサーは、血栓に結合した放射性トレーサーの位置を特定し血栓を増感させる外部ノンチグラフィーを提供しつる。

血栓には、いくつかの潜在的な放射性トレーサーの標的が存在する。血栓は赤血球、大きな血小板、網状に架橋したフィブリンがら構成される。静脈性血栓はフィブリノに富んでいる一方、動脈性血栓は血小板に富む。かくして、フィブリノおよび血小板は、各々複数の可能性のある標的部位を有する点において、血栓造影の放射性医薬品設計の明白な標的である。

循環血液中には通常見い出されないため、活性化血小板およびフィブリンが血栓放射線造影の標的として用いられている。循環血液は、不活性化血小板および（フィブリ／前駆体である）フィブリノーゲンを含有する。血栓形成は、フィブリノーゲンのフィブリンへの蛋白分解的変換、ならびに不活性化血小板の活性化状態への生理学的な変換を含有する。（その前駆体、フィブリノーゲンに対して）血流にはフィブリンが循環しておらず、循環血小板はほとんどが不活性化のものであるため、フィブリンおよび活性化血小板は、血栓以外のイン・ビボではいずこにも実質量範囲が認められないので、血栓造影の最良かつ特異的な標的である。

しかしながら、放射線造影用の放射ｉａ榎識フィブリノーゲンおよび放射線ｔＩＩｍ血小板の使用は多くの欠点を有する。放射線標識フィブリノ−ケンおよび血小板の血液および背景組織の消失は遅く、そのため注射と造影の間に長い遅延を要する。また、すてに血栓に存在するフィブリンおよび血小板は老化した血栓においても標的であるにもかかわらず、血栓年齢としての放射線標識血小板は非効率的な造影因子となる。

造影血栓用の放射線トレーサーを提供する試みは先行技術で知られている。これらは、口’Ｉｎまたは”’Ｔｃ（Ｔｃ−９９ｍ）のいずれかで標識した自家移植血小板、ならびに、１２３■−および１２５Ｉ−標識フィブリノーゲン（ガンマカメラに対して、後−ｌｒはカンマ／ンチレー／ヨン・プローブにｎＴＥシて検出する）を包含する。加えて、酵素（例えば、トロンビン）、酵素前駆体および他の因子のごとき凝固系の他の血栓関連成分も、トレーサーの血栓関連標的として有用であり得る。

血栓標識に用いるさらなる放射線標識化合物は、プラスミノ、プラスミノーゲン活性化因子、ヘパリン、フィブロネクチン、フィブリン断片Ｅ１ならびに抗−フィブリンおよび抗−血小板七ノクローナル抗体を包含する（ナイト（Ｋｎｉｇｈｔ）、１９９０年、セミナーズ・イン・ニューフレア・メディ／ン（Ｓ　ｅＩＩＮ　ｕｃｌ、　Ｍｅｄ、　）、第２０巻＋５２−６７頁をレビュー参照）。

先行技術で公知の血栓放射線標識方法のうち、最も有望とされている方法は、放射線標識血小板、放射線標識抗体および放射線標識フィブリン断片Ｅ１である。

これら全てが、ルーチン使用に関しては重大は欠点を有する。

血栓造影への放射線標識自家移植血小板の使用は、自家移植血液を抜き出し、次いで、血小板分離して無菌条件下にて放射線標識（加えて、放射線標識は該血小板を活性化させぬよう行なわなければならない）し、次いで、放射線標識血小板をＩ！Ｉ者に再投与することを要する。かかる放射線標識血小板は、長期の循環時間を有し、早期には非標的に対する標的の比が小さいため、当該放射線造影は２４ないし７２時間を経過した後にのみに行うことを要する。さらに、新らしい血小板を効率良く取り込まない老化血栓は視覚化しにくい。

また、放射線標識抗−フイブリンモノクローナル抗体および抗−血小板モツクローナル抗体も、先行技術において（典型的には、ＤＴＶを造影するために）用いられている。かかる試薬を用いる欠点は、抗体が（抗体断片でも）、遅い血液および一般組織消失特性を有し、最適造影に少なくとも数時間の経過を要する点である。加えて、免疫的試薬は、帝者中で免疫反応を誘導する能力を有する。さらに、かかる試薬は、哺乳動物細胞系（ハイブリドーマ）から調製しなければならず、かくして感染性のヒトウィルスが混入する危険を伴う。

放射線標識蛋白およびその蛋白分解断片を血栓造影に用いる方法が、先行技術に記載されている。例えば、断片Ｅ１は、凝集物由来のフィブリンの蛋白分解断片がフィブリノと架橋したものである。１２３ＩおよびＴｃ−９９ｍで標識して、ヒトの高品質造影を提供する。

オレキサ（○１ｅｘａ）ら、１９８２年、欧州特許出願番号Ｎｏ、　８２３０１７００９号は、架橋したフィブリンから単離したフラグメントＥ１、架橋フィブリンから単離したフラグメントＥ２ならびにフラグメントＥ１およびＥ２の間の中間のアミノ酸配列を有する蛋白分解断片、から選択される医薬上許容される放射線挿識蛋自分解物断片を開示している。残念なことには、これらの蛋白断片は研究室的にヒト・フィブリノーゲンから調製しなければならず、リーチン的製造には不適としている。

ハドリー（Ｈａｄｌｅｙ）ら、１９８８年、ＰＣＴ／Ｌ″５８８１０３３１８号は、（ａ）、ψ者に標識し弱毒化した血栓蛋白を投与し、そこで該標識がフィブリン結合ドメイン以外の血栓蛋白部位に結合し：（ｂ）懲者中の該標識血栓蛋白の分布バター７を検出する、段階よりなるフィブリン−血小板塊をイン・ビボで検出する方法を開示している。

ソベル（Ｓｏｂｅｌ）、１９８９年、ＰＣＴ／１Ｊｓ８９１０２６５６号は、酵素的に不活性化させた放射線標識組織プラスミノーゲン活性化因子を用いて動物中の１またはそれを超える血栓位買を決定する方法を開示している。

血栓結合能を有するペプチドは、先行技術で公知である。

Ｏスラーティ（Ｒｏｕｓｌａｈｔｉ）およびピアノユバソサー（Ｐ　１ｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ）、米国特許第４．５７８．０７９号は、Ｘ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ− 、へ５ｐ−Ｒ−”ｉ’（ここで、ＸおよびＹは■」またはアミノ酸であって、ＲはＴｈｒまたはＣｙｓ）の配列のペプチドを記載しており、該ペプチドはイン・ビホで血栓結合能を有する。

ロスジーテノＣＲｏｕｓｌａｈｔｉ）およびピアノユバノサー（Ｐ　１ｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ）、米国特許第４．７９２．５２５号は、へｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｘ（ここで、ＸはＳｅｒ、ＴｈｒまたはＣ〜Ｓ）の配ηｌｉのペプチドを記載しており、該ペプチドはイン・ビホて血栓結合能を有する。

クライノ（Ｋｌｅｉｎ）ら、１９９２年、米国特許第５．０８６．０６９号は、活性住血〆］＼板の細胞表面上に見い出され、ＧＰＩ］ｂ／Ｉ［Ｉａに結合するグアニン誘導体を開示している。

ビア”　ユバ’：’サー（Ｐ　１ｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ）ら、１９８９年、ＰＣＴ／ＴＪＳ８８．１０４４０３号は、細胞が基底（ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ）に結合する、立体構造が限定されたＲＧＤ含有含有ニブエト示している。

：ｆ：−ウノカ−（Ｈａｗｉｇｅｒ）ら、１９８９ＥＥ、ＰＣＴ／ＵＳ８９１０１７４２号は、蛋白の２つの結合部位の配列よりなるペプチドに関する。

ナツト（Ｎｕｔｔ）ら、１９９０年、欧州特許出願第９０２０２０１５．５号は、フィブリノーゲン受容体拮抗物である環状ＲＧＤペプチドを開示している。

ナツト（Ｎｕｔｔ）ら、１９９０年、欧州特許出願第９０２０２０３０．４号は、フィブリノーゲン受容体拮抗物である環状ＲＧＤペプチドを開示している。

ナツト（Ｎｕｔｔ）ら、１９９０年、欧州特許出願第９０２０２０３１．２号は、フィブリノーゲン受容体拮抗物である環状ＲＧＤペプチドを開示している。

ナツト（Ｎｕｔｔ）ら、１９９０年、欧州特許出願第９０２０２０３２．０号は、フィブリノーゲン受容体拮抗物である環状ＲＧＤペプチドを開示している。

ナツト（Ｎｕｔｔ）ら、１９９０年、欧州特許出願第９０３１１１４８．２号は、フィブリノ−ケン受容体拮抗物である環状ペプチドを開示している。

ナツト（Ｎｕｔｔ）ら、１９９０年、欧州特許出願第９０３１１１５１．６号は、フィブリノーゲン受容体拮抗物である環状ペプチドを開示している。

アリ（Ａｌｉ）ら、１９９０年、欧州特許出願第９０３１１５３７．６号は、フィブリノーゲン受容体拮抗物である環状ペプチドを開示している。

バーカー（Ｂａｒｋｅｒ）ら、１９９１年、ＰＣＴ／１Ｊｓ９０１０３７８８号は、血小板凝集を阻害する環状ペプチドを開示している。

ピアノユバノサー（Ｐ　１ｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ）ら、１９９１年、ＰＣＴ／ＵＳ９１１０２３５６号は、フィブリノーゲン受容体拮抗物である環状ペプチドを開示している。

エバートノン（Ｅｇｂｅｒｔｓｏｎ）ら、１９９２年、欧州特許出願第０１８３２８Ａ１号は、ＧＰＩｌｂ／ｌ１ｌａ受容体に高親和性で結合するチロノン誘導体を開示している。

オ／マ（Ｏｊｉｍａ）ら、１９９２年、第２０４回学会、アメリカン・ケミカル・ソサイエティー・アブストラクト（２０４ｔｈ　Ｍｅｅｔｉｎｇ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　Ａｂｓｔ、　）、４４は、血小板凝集阻害に有用な合成多価重合マルチメリックＲＤＧＦペプチドを開示している。

ハートマノ（ＨａｒｔＩＩａｎ）ら、１９９２年、ジャーナル・オブ・メゾイノナル・ケミストリー（Ｊ　、　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｗ、　）、第３５巻４６４０− ４６４２頁は、ＧＰＩＩｂ／ｍａ受容体に高親和性を有するチロツノ誘導体を記載してる。

血栓の放射線造影に有用な放射線標識ペプチドが技術報告されている。

ラノビー（Ｒａｎｂｙ）ら、１９８８年、ＰＣＴ／ＬＩＳ８８１０２２７６号は、フィブリンに放射線標識化合物を共有結合させることよりなる、動物のフィブリン沈殿を検出する方法を開示している。

スタソトル（Ｓ　ｔｕｔｔｌｅ）、１９９０年、ＰＣＴ／ＧＢ９０１００９３３号は、イン・ビボでＲＧＤ結合部位に結合でき、配列アルギニンーグリシンーアスパラギン酸（ＲＧＤ）よりなる３ないし１０アミノ酸を含有する放射性標識ペプチドを開示している。

０ノドウエル（Ｒｏｄｗｅｌｌ）ら、１９９１年、ＰＣＴ／ＩＪＳ９１１０３１１６号は、「ユフエクター・ドメイン（ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｄｏＩＩａｉｎ）Ｊと「分子認識単位」との結合物を開示しでいる。

マラガノア（Ｍａｒａｇａｎｏｒｅ）ら、１９９１年、ＰＣＴルＳ　９０１０４６４２号は、（ａ）阻害基：（ｂ）！ノンカー基、および（Ｃ）「アニオン結合外部部位」結合基よりなる放射線標識血栓阻害剤を開示している。

放射線標識ポリペプチドへのキレートＩＩの使用、ならびにペプチドおよびポリペプチドをＴｃ−９９ｍで標識する方法は先行技術で公知であり、（出典明示して本明細書の一部とみなす）同時係属出願米国特許出願番号第０７／６５３．０１２号、０７／８０７．０６２号、０７／８７１．２８２号、０７／８８６．７５２号、０７／８９３．９８１号、０７／９５５．４６６号、０８１０１９．８６４号および０８１０４４、８２５号、ならびにＰＣＴ国際出願　ＰＣＴ／ｌ、 ’５９２１００７５７号、ＰＣＴ／ＵＳ９２／１０７１６号、ＰＣＴ／ＵＳ９３１０２３２０およびＰＣＴ／ＵＳ９３／　に開示されている。

イン・ビボでの血栓造影に用いる、Ｔｃ−９９ｍで標識した（血液および背景組織の消失を向上させる）小さな、（ルーチンに産業上実施でき、容易に調整できる）合成分子の要望が未だ存在する。血栓成分に特異的に結合する、Ｔｃ−９９ｍで放射線標識した小さな合成ペプチドは、この要望を満たし、本発明により提供される。

本発明は、ノツチグラフィー造影剤である放射性標識試薬を提供する。さらに詳しくは、本発明は、テクネチウム−９９ｍ（Ｔｃ−９９ｍ）で放射線標識した血栓造影剤の製造用試薬を提供する。本発明のｔｉ薬は、各々、イン・ビボで血栓に特異的に結合し、かつ放射線標識結合部位に共有結合したペプチドを包含する特異的結合化合物よりなるが、ペプチドに限定されるものではない。

好ましい具体例において、本発明は、該特異的結合化合物が、４ないし１００個のアミノ酸のアミノ酸配列を有する線状または環状ペプチドである試薬を提供する。

好ましくは、約１０．０００ダルトン未満の分子量を有する小さな化合物を使用するの明確な商業的利点である。かがる小さな化合物は容易に製造しつる。さらに、それらは免疫原性ではな（、脈管構造から容易に消失するようであり、かくして、血栓をより良好かつより迅速に造影するのを可能とする。それに対して、抗体の断片または１０．０００ダルトンを超える他の生物学的由来ペプチドのごとき犬き）二分子は、製造するのにコストがががり、免疫原性があり、血流がら消失するのが両速であるため、イン・ビボの血栓を迅速に診断することを阻害するようである。

本発明の一態様は、式％式％）［式中、Ｃ（ｐｇｐ）’は保護ノスティンであって、（ａａ）はアミノ酸、好ましい具体例において、該アミノ酸はグリノンコのＴｃ−９９ｍ結合部位に共有結合した、血栓の少なくとも１の成分に特異的に結合する特異的結合化合物よりなる哺乳動物体内の血栓を造影するために放射線標識されつる血栓造影剤の製造用試薬を提供する。　もうｌの具体例において、本発明は、式％式％）［式中、４ヘハ、Ｈ，ＨＯＯＣ，Ｈ２Ｎ０Ｃ，（ベブｆ　ド）−ＮＨＯＣ，（べ −＃ｌ’）−〇ＯＣまたはＲ，；Ｂは、Ｈ，ＳＨもしくは−ＮＨＲ３、−ＮＣＲ ’）−（ペプチド）またはＲ’、Ｚ（１、ＨまたはＲ’、Ｘは、ＳＨもＬ＜１ｉ −ＮＨＲ３、−Ｎ（Ｒ３）−（ベブｆ　ド）また１１Ｒ”、Ｒ’、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立してｊ（または直鎮もしくは分岐鎖または環状の低級アルキル、ｎは０，１または２．ここに、（１）Ｂが−ＮＨＲ３または−Ｎ（Ｒ’）−（ペプチド）である場合、ＸはＳＨであってｎは１または２゜（２）Ｘが−ＮＨＲ３または−Ｎ（Ｒ３）−（ペプチド）である場合、ＢはＳ）（てあってｎは１または２＋（３）ＢがＨまたはＲ４である場合、ＡはＨＯＯＣＳＨ２ＮＯＣ。

（ペプチド）−ＮＨＯＣ，（ペプチド）−〇ＱＣ，ＸはＳＨてあってｎはＯまたは１゜（４）ＡがＨまたはＲ４の場合であってＢがＳＨである場合、Ｘは＝ＮＨＲ３または−Ｎ（Ｒ１）−（ペプチド）であって、ＸがＳＨであ８号合、Ｂは− ＮＨＲ’または−Ｎ（Ｒ，’）−（ペプチド）：（５）ＸがＨまたはＲ４である場合、ＡはＨＯＯＣ，）（２ＮＯＣ。

（ペプチド）−ＸＩ−１０ｃ、（ペプチド）−００Ｃ１’あっＴＢはｓＨ：（６）ＺがメチルＴある場合、Ｘはメチル１．へは）（ＯＯＣ１８２ＮＯＣ，（ペプチド）−ＮＨＯＣｌ（ペブニド）−〇〇Ｃ，ＢはＳＨであって、ｎはＯｌおよび（７）ＺがＳＨであってＸがＳＨである場合、ｎはＯでない、ここに、該チオール基は還元型］のＴｃ−９９ｍ結合部位に共有結合した、血栓の少なくとも１の成分に特異的に結合する特異的結合化合物よりなる哺乳動物体内の血栓を造影するために放射線標識しつる血栓造影剤の製造用試薬を提供する。

もう１つの具体例において、本発明は、式］本発明の目的では、二の構造式を有する放射線標識結合部位とは、ピコリン酸（Ｐ　１ｃ）−に基つく部位をいう二ととなろう］［本発明の目的では、この構造式を有する放射線標識結合部位は、ピコリルアミン（Ｐｉｃａ）に基づく部位をいうこととなろう］、（式中、ＸはＨまたは保護基、（アミン１！りはいずれかのアミノ酸、該放射線標識結合部位は、該ペプチドおよび該放射線標識結合部位の錯体に共有結合し、該放射線標識は電気的に中性である）の放射線標識結合部位に共有結合した、血栓の少なくとも１つの成分に特異的に結合する特異的結合化合物よりなる哺乳動物体内の血栓を造影するために放射線標識されうる血栓造影剤の製造用試薬を提供する。好ましい具体例において、該アミノ酸はグリノンであって、Ｘはアセトアミドメチル保護基である。さらなる好ましい具体例において、該特異的結合化合物は、アミノ酸、最も好ましくはグ１ノ／ンを介して、該放射線標識結合部位に共有結合する。

本発明のさらにもう１の具体例は、ビスアミノ　ビスチオール放射線標識結合部位である放射線標識結合部位に共有結合した、血栓の少なくともユの成分に特異的に結合する特異的結合化合物よりなる哺乳動物体内で血栓を造影するために放射線標識されつる血栓造影剤の製造用試薬を提供する。本発明のこの具体例における該ビスアミノ　ビスチオール基は・５式中、各Ｒ５は、独立して、日、ＣＨ３またはＣ２Ｈ５でもよく。

各（ｐｇｐ）５は、独立して、チオール保護基またはＨてもよ＜：ｍＳｎおよびｐは、独立して、２まｊ：は３．Ａは線状もしくは環状の低級アルキル、アリール、複素環、それらの組合せまたはそれらの置換誘導体であって、Ｘは特異的結合化合物、好ましくはペプチドである］、および（式中、各Ｒ５は、独立して、Ｈｌｌないし６個の炭素原子を有する低級アルキル、フェニルまたは低級アルキルもしくは低級アルコキンで置換されたフェニルｊｍ。

ｎおよびｐは、独立して、１または２．Ａは線状または環状の低級アルキル、アリール、複素環、それらの組合せまたはそれらの置換誘導体、ＶはＨまたはＣ○ −ペプチド、ＲｓはＨまたはペプチド、但し、■がＨの場合、Ｒ８はペプチドであり、Ｒ６がＨの場合、■はペプチド）［本発明の目的では、これらの構造式を有する放射線標識結合部位はｒＢＡＴｊ基をいうこととなろう。コよりなる群から選択される式を有する。好ましい具体例において、該試薬の該特異的結合化合物は、アミノ酸、最も好ましくはグリノンを介して該放射線標識結合部位に共有結合する。

本発明の前記態様の好ましい具体例において、該特異的結合化合物は、４ないし１００個のアミノ酸よりなるペプチドである。該放射線標識の最も好ましい具体例は、テクネチウム−９９ｍである。

本発明の該試薬は、該特異的結合化合物または該放射線標識結合部位が多価結合部位に共有結合しているよう形成しうる。本発明の多価結合部位は、特異的結合化合物または放射線標識結合部位に共有結合できる、少なくとも２個の同一リンカ−官能基（ｌｉｎｋｅｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｇｒｏｕｐ）よりなる。好ましいリンカ−官能基は、第一級もしくは第二級アミン、ヒドロキシル基、カルボン酸基またはチオール反応性基である。好ましい具体例において、該多価結合部位は、ビスースク／ノイミノルメチルエーテル（ＢＳＭＥ）、４−（２，２− ツメチルアセチル）安息香酸（ＤＭ、八Ｂ）、トリス（スクノンイミ／ルエチル）アミン（ＴＳＥＡ）、Ｎ−［２−（Ｎ−、Ｎ−ヒス（２−スクシンイミドエチル）アミノエチル）］−］Ｎ’、Ｎ’−ビス２−メチル−２−メルカプトプロピル）−６，９−ンアザノナンアミド（ＢＡＴ−ＢＳ）、４−（０−ＣＨ２ＣＯ− Ｇｌ、・−Ｇｌ）・−Ｃｙｓアミド）アセトフェノン（ＥＴＡＣ）およびビスースクノンイミトヘキサノ（Ｂ　Ｓ　Ｈ）よりなる。

また、本発明は、４ないし１００個のアミノ酸のアミノ酸配列および当該特異的結合ペプチドに共有結合したテクネチウム−９９ｍ結合部位を有する特異的結合ペプチドとぐここに、該ペプチドは、ＧＰＵｂ／］Ｉｌａ受容体についてのリガンドであって、アミノ酸配列（アルギニン−グリノン−アスパラギン酸）よりなるものではない線状および環状のペプチドよりなる群から選択される）、フィブリンの重合部位についてのりガントであるペプチドと、アミノ酸配列（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）よりなる環状ペプチドとからなる、哺乳動物体内の血栓を造影するだめの血栓造影剤も提供する。好ましい具体例において、フィブリンの重合部位についてのりガントであるアミノ酸配列は、配列（グリンルーブロリルーアルギニルーブロリル）の多重コピーよりなる。

また、本発明は、本発明の試薬とＴｃ−９９ｍとの錯体であるシンチグラフィー造影剤および本発明の該試薬をＴｃ−９９ｍで放射線標識する方法からなる。本発明により１２供される放射線標識錯体は、還元剤の存在下にて本発明の該試薬とＴｃ−９９ｍとを反応させることにより形成される。好ましい還元剤としては、亜／チオン酸塩イオン、第一スズイオンおよび第一鉄イオンを包含するが、それらに限定されるものではない。また、本発明の錯体は、本明細書中にて提供される予め還元したＴｃ〜９９ｍ錯体のリガンド交換によって、本発明の試薬をＴｃ−９９ｍで標識することにより形成させることもできる。

また、本発明は、本発明の試薬をＴｃ−９９ｍで放射線標識した試薬であるシンチグラフィー造影剤製造用キットも提供する。本発明の試薬をＴｃ−９９ｍで標識するためのキットは、予め定めた量の本発明の試薬またはその混合物および該試薬をＴｃ−９９ｍで標識するのに十分な量の還元剤を含有する密閉バイアルよりなる。

本発明は、イン・ビトロでの化学合成により本発明の試薬を製造する方法を提供する。好ましい具体例において、ペプチドは固相ペプチド合成法によって合成される。

本発明は、ガンマ・ノンチグラフィー造影をイン・ビボで得ることにより哺乳動物体内の血栓を造影するためのＴｃ−９９ｍ標識試薬である、シンチグラフィー造影剤を用いる方法を提供する。これらの方法は、診断有効量の本発明のＴ　ｃ −９９ｍ標識化合物を投与し、次いで、哺乳動物体内の血栓部位に局在したＴｃ −９９ｍ標識により放出されるガンマ線を検出することからなる。

本発明の特に好ましい具体例は、以下のある種の好ましい具体例および請求の範囲の、さらに詳細な説明から明らかとなるであろう。

発明の詳細な説明本発明は、哺乳動物体内の血栓を造影するための放射線標識血栓造影剤を製造するための、ペプチド試薬を含めた試薬を提供する。本発明により提供される該試薬は、血栓の少なくとも１の成分に結合しうる特異的結合化合物に共有結合している放射線標識結合部位よりなる。本発明の目的のため、血栓造影試薬なる語は、放射線標識結合部位に共有結合し、好ましくはＴｃ−９９ｍ、＋１１１ｎまたは”Ｇ　ａ　ｓ　Ｒも好ましくはＴｃ−９９ｍで放射線標識した特異的結合化合物よりなる本発明の具体例をいう。

この放射性同位元素の核種および放射能特性はそれを理想的なシンチグラフィー造影剤とするので、Ｔｃ−９９ｍで標識することは、本発明の利点である。

この放射性同位元素は、１４０ｋｅ〜′の単−光子工不ルギーならびに約６時間の放射性半減期を有し、ｅ９ＭＯ−９９“Ｔｃ発生機から容易に入手可能である。本発明のもう１つの利点は、（例えば、５Ｉのごとき）先行技術の他の放射線核種に比して、好ましい放射線核種のいずれもが毒でないことである。

Ｔｃ−９９ｍ結合部位と、本発明により提供されるチオール保護基［（ｐｇｐ） ’］に共有結合しているチオールを含有するかかる部位に共有結合した化合物とにおいて、該チオール保護基と、同一または異なっていてもよく−ＣＨ，−アｌノー　Ｊしくアリールはフェニルまたはアルキルもしくはアルキルオキシ置換フェニル）。

−ＣＨ−（了り−ル）２（アリールはフェニルまたはアルキルもしくはアルキルオキシ置換フェニル）一〇−（アリール）３（アリールはフェニルまたはアルキルもしくはアルキルオキ／置換フェニル）。

−ＣＩ−１２−Ｌ：４−メトキンフェニル）。

−ＣＨ−（４−ビリフル）（フェニル）２゜−Ｃ（ＣＨｌ）３ −９−フェニルフルオレニル。

−ＣＨ２ＮＨＣＯＲ（Ｒは非置換またはｌｆ置換アルキルしくはアリール）。

−ＣＨ２−ＮＨＣＯＯＲ（Ｒは非置換または置換アルキルもしくはアリール）ニーＣ０ＮＨＲ（Ｒは非置換または置換アルキルもしくはアリール）。

−ＣＨ２−３−ＣＨ２−フェニルでもよいが、これらに限定されるわけではない。

好ましい保護基は、式−ＣＨ２−ＮＨＣＯＲ（ここで、Ｒは１ないし８個の炭素原子を有する低級アルキル、フェニルまたは低級アルキル、ヒドロキシル、低級アルコキノ、カルボキノもしくは低級アルコキ７カルポニルで置換されたフェニル）を有する。最も好ましい保護基はアセトアミドメチル基である。

本発明の特異的結合ペプチドを含有する各々の具体例は、アミノ酸配列よりなる。本発明中にて用いるアミノ酸なる語は、全てのし−およびＤ−アミノ酸、天然発生およびその他のものを包含することを意味する。本発明により提供される特異的結合ペプチドよりなる試薬は、限定しないが、以下のものを包含する（特に示さない限り、以下のペプチド中のアミノ酸はＬ−アミノ酸である）・ＣＡｃｍＧＣＡｅｎＩＧＧＲＧＤＳＣＡｃＩＴＩＧＣＡｃｒｒｌＧＧＲＧＤＧＧＲＧＤＳＣＡｃＩＴ、ＧＣＡｃｒｒ、ＧＧＲＧＤＧＧＲＧＤＧＧＲＧＤＳＯＣＲ＾ＲＧＤＤＭＤＤＹＣＣＡｃｍＯＣＡｃｍＲ”λｌ且ＲＲＲＧＤＶＧＲＧＤＶＫＣＡｃｍＧＣＡｃｍ、７ミドＧＲＧＤｖＣＡＩ：ｒｒｌＧＣＡＣｒｒ？７ミド／Ｆｌｌ？Ｉｐ−ＧＧＧＲＧＤＦ７ｔチル−ＣＮＰ、Ａｐｃ、ＧＤＣｙセ＊ルーＲＯＤＣ，ｙＥ　ｙＲＧＤＣＧＲＧＤＦＧＧＣＡｃＩＴ。

ＭｔＩＢ、−ＧＧＲＧＤＦＣＡＣｍＧＧＧＲＧＤＦＧＲＧＤＧＧＧＧＣＯＲＯＤＧＧＣＡ、。

ｍａ−ＧＧＲＧＤＦ〜ＡＣ，，−ＧＧＧＲＧＤＦｍａ−ｆＬＧＤｆ− ｍａ−ＲＯＤ７セチルーＧ、Ａｐｅ、ＧＤＶ＾Ｐ”ＤＦＫＣＡＣｍＧＣＡＣＴｒ？ｙミド（ＣＣＡｃｍＧＣＡ（、ＩＣ０ＲＧＤＳ１３−ＴＳＥＡＩＢＡη、Ｈｌｙ、ＧＤＰ、）（Ｉｙ、ＧＤＦ、　７ミド［ＢＡＴ］Ｇ、Ａｐｃ、ＧＤＶ、Ａｐｃ、ＧＤＦ］Ｃ７Ｅ　ド０ｕＡＲＧＤＩＩｌ／ＮＤＤＹＣＯＧＴＡＲＴＶＣＲＬＡＲＧＤＷＮＤＤＹＣＴＧＫＳＳＤＣＤｔチｈ　−ＦＯＰＲＰＧ）２ＫＧＧＧＣ，７ミ　ＦＯＣ−−・■−Ｇ！ｒ　−Ｒご−−−−Ｓ・−・−＝Ｃ・−α≧いα−―ｏｃ−−−”ｘ−ａｓ−６Ｈ７Ｃ−−−−５・−＝−＝Ｃ−−−ＧＣａｔｍＧＣ７ミ（。

Ｔ’ＳＰＳＰＩＨＰＡＨＨＫＲＤＲＲＱＣＡＣｍＧＣＡｃｒｒ、、７Ｅ　Ｈ（アミノ酸の一字略語は、ノイ、ソバイ（Ｇ　、　Ｚ　ｕｂａｙ）、バイオケミストリ＝（Ｂ　１ｏｃｈｅＩＩｉｓｔｒｙ）、（第２版）、１９８８年（マクミラン・バブリノ＞ング　ニュー・ヨーク（＼ｌａｃ＼ｌ１ｌｌｅｎ　ＰｕｂＨｓｈｉｎｇ：Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、３３頁　他の略語は表Ｉの説明のごときものである）。本発明により提供される試薬のこのリストは、例示的なものであって限定または排除を！味するものではなく、本明細書中に開示したペプチドおよび本明ｌＦＢｗ中に開示したごとき結合基からなるキレート部位の組合せを含めた、かかるペプチドまたはその同等物の組合せからなる試薬が本発明のキレート部位のいずれかに共有結合しえること、およびそれらは本発明の範囲内にあることを当業者ならば理解するであろう。

血小板ＧＰ］１ｂ／Ｈａ受容体をコードするアミノ酸配列を有するペプチドよりなる本発明の具体例において、各々の該試薬は、０３μＭ以下の濃度で存在する場合に血小板に富む血漿中のヒト血小板凝集を５０％阻害することが可能である。

本発明の特異的結合ペプチドは、イン・ビトロで化学合成できる。本発明のペプチドは、一般的にはアミノ酸合成機で有利に製造てきる。本発明の該ペプチドは、当業者によ（知られた技術を用いて、イン・ビトロ化学合成する間に、該放射線ｆｆ！Ｘｉ−結合部位を該ペプチドに共有結合させて合成できる。共有結合の特異的部位を決定できるのて、合成の間にかかるペプチドを放射線結合部位に共有結合させるのが有利である。

ペプチド合成の間に、本発明の放射線標識結合部位を、標的特異的ペプチドに導入できる。ピコリン酸よりなる具体例［（Ｐ　１ｃ−）　：例えば、Ｐｉｃ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（保護基）〜］については、該放射線標識結合部位を合成中におけるｉ＆後の（すなわち、アミノ−末端）残基として合成できる。加えて、該ピコリン酸−含有放射線標識結合部位は、リジンのＥ−アミノ基に共有結合して、例えば、ペプチド鎖中のいずれの位置にも導入できるａ　Ｎ（Ｆｍｏｃ）−Ｌｙｓ −ＥＮ［Ｐｉｃ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（保護基）］を提供しうる。

該櫻的結合ペプチドへ簡単な様式にて導入できるため、この配列が特に有利である。

同ｔｉに、該ペプチド鏑の該カルボキシル末端に配列Ｃ−Ｃｙｓ（保護基）−Ｇｌｙ−］を含有させることにより、ペプチド合成の間にピコリルアミン（Ｐｉｃａ）−含有放射線標識部位［−Ｃｙｓ（保護基）−Ｇ　ｂ−Ｐ　ｉｃａ’、も製造できる。該樹脂からペプチドが切断させた後に、該ペプチドのカルボキシル末端を活性化し、ピコリルアミンにカップ）１／りさせる。この合成経路は、反応性の側鎖官能基がマスク（保護）されたままであって、該ピコリルアミンの結合の間には反応しないことを要する。

Ｐｉｅ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−および−Ｃｙｓ−Ｇ　ｌｙ−Ｐ　ｉｃａキレート剤を含有する小さな合成ペプチドの例は、以下に記載の実施例に提供する。本発明は、イン・ビボで血栓に特異的に結合し、Ｔｃ−９９ｍを有する放射線標識ペプチドを中性鎖体として保持できる実質的にいずれのペプチドに、これらのキレート剤を導入させることも提供する。

ま／：、本発明は、Ｔｃ−９９ｍで標識してもよいビスアミン　ビスチオール（ＢＡＴ）キレート剤を取り込む、特異的に結合する小さなペプチドも提供する。

本発明は、これらのキレート剤を、イン・ビポにて血栓に特異的に結合できる実質的にいずれものペプチドへ導入して、Ｔｃ−９９ｍを有する放射！Ｉ標識ペプチドを中性錯体として保持することを提供する。放射線標識結合部位としてのＢＡＴキレート剤を含有する小さな合成ペプチド試薬の例は、以下に記載の実施例に提供する。

放射性Ｔｃ−９９ｍと本発明の試薬との錯体の形成においては、該テクネチウム錯体、好ましくはＴｃ−９９ｍ過テクネチウム酸塩、を還元剤の存在下にて該試薬と反応させる。好ましい還元剤は、亜／チオン酸、第一スズおよび第一鉄イオンであり、最も好ましい還元剤は塩化第一スズである。かかる錯体を製造する手段は、標識すべき予め定めた量の本発明の試薬と、該試薬をＴｃ−９９ｍで標識するのに十分な量の還元剤とを含有する密閉バイアルよりなるキット形でにて簡便に提供される。別法として、該錯体は、本発明の該試薬と、テクネチウムおよび転移リカノド（ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｌｉｇａｎｄ）として公知のもう１つの化合物の予め形成させたジービル錯体とを反応させることによっても形成しうる。

このプロセスは、リガンド交換として公知であり、当業者によく知られている。

該ジービル銘体は、例えば、酒石酸、クエン酸、グルコン酸塩またはマンニトールのごとき転移りガントを用いて形成しつる。Ｔｃ−９９ｍ過テクネチウム酸塩の中で本発明に有用なものは、ナトリウム塩のごときアルカリ金属塩、もしくはアンモニウム塩または低級アルキルアンモニウム塩を包含する。

本発明の好ましい具体例において、テクネチウム標識試薬の製造用キ、トを提供する。Ｔｃ−９９ｍで該試薬を標識するのに十分な量の、塩化第一スズのごとき、還元剤を含有するバイアルに、過当量の該試薬を入れる。また、（例えば、酒石酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩またはマンニトールのごとき）記載したような適当量の転移リガンドも含有しうる。また、該キットは、例えば、浸透圧を調整するための医薬上許容される塩、緩衝液、保存料等のごとき通常の医薬用添加物も含有できる。キットの成分は、液体、凍結または乾燥の形態でもよい。好ましい具体例において、キット成分は凍結乾燥形態にて提供される。

本発明に関する放射線標識血栓造影試薬は、適量のＴｃ−９９ｍまたはＴｃ−９９ｍ錯体を該バイアルに添加し、以下の実施例２に記載した条件下にて反応させることにより製造しうる。

本発明により提供される放射性標識ノンチグラフィー造影剤は、適当な線量の放射活性を有する。Ｔｃ−９９ｍ放射性錯体の形成において、ｍＬ当たり約００１ミリキ、−リ−（ｍＣｉ）ないし１００ｍＣ４の濃度の放射能を含有する溶液中で放射性錯体を形成させるのが一般的に好ましい。

Ｔｃ−９９ｍで標識した場合には、本発明により提供される該血栓造影試薬は、哺乳動物体内の血栓を視覚化するのに用いることができる。本発明に従い、該Ｔｃ−９９ｍ標識試薬は１回ユニット注射用量にて投与する。本発明により提供される該Ｔｃ−９９ｍ標識試薬は、セーライン水性媒質または血漿媒質のごとき、いずれの静脈内注射用の通常の媒質で静脈内投与してもよい。一般的には、投与する該ユニット用量は、約Ｑ、Ｑ］、ｍＣｉないし約１００ｍＣ４，好ましくは１ｍＣ１ないし２０ｍＣ１の放射能を有する。ユニット用量にて注射する該溶液は、約０．０１ｍＬないし約１０ｍＬである。静脈内投与の後に、数分以内にイン・ビボの血栓造影が起こる。しかしながら、所望により、該放射線標識試薬を、密書に注射した後、数時間またはさらに長くにおいてさえ造影が起こる。はとんどの場合において、十分量の用量を投与すると、約０．１時間以内に造影する領域に蓄積しノンチフオト（ｓｃｉｎｔｔｉｐｈｏｔ○）が可能となるであろう。診断目的のノンチグラフィー造影のいずれの常法も、本発明と一致して利用することができる。

これらの化合物を製造し、Ｉｎする方法は、以下の実施例でさらに十分に説明する。これらの実施例は、前記した方法および有利な結果のある種の態様を説明している。これらの実施例は、例示的な方法で示されており、限定するものではない。

実施例］固相ペプチド合成ンクロロヘキシルカルホノイミド／ヒドロキシヘンシトリアゾールまたは２−（１）（−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフエート／ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴ）でカップリングした９−フルオレニルメチルオキ／カルボニル（Ｆ　ｍｏｃンアミノ末端保護を用い、カルボキシル末端酸にｐ−ヒドロキシメチルフェノキ７−メチルポリスチレン（ＨＭＰ）を用いるか、あるいはカルボキシル末端アミドにリンクアミド中指（Ｒｉｎｋ　ａｍｉｄｅ　ｒｅｓｉｎ）を用いて、アプライド・バイオシステムズ・モデル４３１Ａ−ペプチド・ノンセサイザ− （Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　４３１　Ａ　ＰｅｐｔｉｄｅＳ　ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いた０　２５ミリモル（＋ｎｍ○１）スケールで固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を行った。樹脂に結合する生成物は、１００：５：５：２．５：２の比にて室温で０５−３時間ｙＩ製したトリフルオロ酢酸、水、チオアニソール（アルギニノ残基が当該ペプチドよりなる場合）、エタノ／チオールおよびトリエチル７ランからなる溶液を用いてルーチン的に切断した。

適当には、ＮＭＰ（Ｎ−メチルビロリノノン）中の２０％Ｖ／νの無水酢酸で該樹脂に結合させた遊離Ｎ−末端アミノペプチドを３０分間処理することによりＮ −末端アセチル基を導入した。適当には、５ＰＰＳの間にカップリングさせるべき最後の残基として適当な２−ハロー酢酸を用いるか、あるいは、ＮＭＰ中の２ −ハロー酢酸／／イソプロピルカルホンイミド／Ｎ−ヒドロキシスクノンイミドまたはＮＭＰ中の２−ハロー無水酢酸／／イソプロピルエチルアミンで処理するかのいずれかにより、２−タロロアセチルおよ：Ｊ２−ブロモアセチル基を導入した。適当には、０．５−１．０ｍＭのＥ　Ｄ　Ｔ　Ａを含有するリン酸または重炭酸緩衝液（ｐＨ８）中の０．１−１．０ｍｇ／ｍＬ溶液を４８時間撹拌し、続いて酢酸で酸性化し、凍結乾燥してＨＰＬＣ精製することにより、２−ハロアセチル化ペプチドを環化させた。

適当には、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合環化は、ｐＨ７の緩衝液中の０．１ｍｇ／ｍＬの前駆体ノステインー遊離チオールペプチドを、アリコントの０．　ＯＯ６ＭのＦｅ５（ＣＮ）ａで黄色が安定して維持されるまで処理することにより行った。過剰量のオキシダントを過剰量の７ステインで還元し、該混合物を凍結乾燥し、次いて、ＨＰＬＣにより精製した。

適当には、ペプチド合成における最後の残基としてピッリン酸を用いることによりｒＰｉｃＪ基を導入した。適当には、ノイソプロビルカルボノイミドおよびＮ −ヒドロキシスクノノイミドを用いて、ピコリルアミンを前駆体ペプチドに結合させる二とによりｒＰｉｃａＪ基を導入した。過当には、５ＰＰＳの間にカンブリングさせるべき最後の残基として適当なりＡＴ酸を用いるか、あるいはＮＭＰ中のＢＡＴ酸／ノイソプロビルカルボノイミド／Ｎ−ヒドロキシスクノニミドで樹脂に結合するＮ−末端遊離アミノペプチドを処理することにより樹脂ＢＡＴリガンドを導入した。適当には、最初にＤＭＦ、ＮＭＰまたはＣＨ，ＣＩ　、中のジイソプロピルカルボノイミド／Ｎ−ヒドロキシスフランイミドまたはＨＢＴｔＪ／ＨＯＢ　ｔの混合物でペプチドのカルボキンレートを活性化し、続いてジイソプロピルエチルアミンの存在下にカップリングさせることにより［ＢＡＭ］を該ペプチドに結合させ、カップリングの後に、該結合物を前記のごとく脱保護化させた。

適当には、単一のチオールを含有するペプチド（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、５ないし５０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ８）を、アセトニトリルに予め溶解した０　５モラー当量のＢＭＭＥ（ビス−マレイミドメチルエーテル）と、室温にて約１ −１８時間反応させることによりＢＳＭＥ付加物をｙ４製した。該溶液を濃縮し、その生成物をＨＰＬＣで精製した。適当には、ＢＭＭＥの代わりにビス−マレイミドヘキサンを用いることによってＢＳＨ付加物を調製した。

適当には、アセトニトリルまたはＤＭＦに予め溶解した０　３３モラー当量のＴＭＥ、Ａ（トリス（２−マレイミドエチル）アミン、（出典明示して本明細書の一部とみなす）同時ｌ！続出願、米国特許出願第０７／９５５．４６６号参＠）と、１モラー当量のトリエタノールアミンの存在もしくは不存在下に、室温にて約１−１８時間（ＤＭＦ中の１０ないし１００ｍｇ／ｍＬペプチド１度、または５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐ）＋８）／アセトニトリルまたはＴＨＦ中の５ないし５０ｍｇ／ｍＬのペプチドの濃度で）単一のチオールを含有するペプチドを反応させることによりＴＳＥＡ付加物を調製した。付加物を含有するかかる反応混合物を濃縮し、次いで該付加物をＨＰＬＣを用いて精製した。

適当には、単一のチオールを含有するペプチドを（５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐ）１８）／アセトニトリルまたはＴＨＦ中の２ないし５０ｍｇ／ｍＬペプチド濃度で）、アセトニトリルまたはＴＨＦ中に予め溶解した０　５モラー当量のＢＡＴ−ＢＭ（Ｎ−ｆ２−（Ｎ’、Ｎ’−ビス（２−マレイミドエチル）アミノエチル）］−Ｎ’−（ｔ−ブトキメカルボニル）−Ｎ’、Ｎ’−ビス（２−メチル−２−トリフェニルメチルチオプロピル）−６，９−ノアザノナンアミド、同時継続出願である米国特許出願第０８１０４４゜８２５号参昭）と、室温にて約１−１８時間反応させることによりＢＡＴ−ＢＳ付加物を調製した。次いで、該溶液を蒸発乾固させ、１０ｍＬのＴＦＡおよび０．２ｍＬのトリエチル７ランで１時間処理することにより［ＢＡＴ−ＢＳ］−ペプチド結合物を脱保護化した。

その溶液を濃縮し、該生成付加物をエーテルで沈殿させ、次いで、ＨＰＬＣにより精製した。

ウォーターズ・デルタ・バック（Ｗａｔｅｒｓ　Ｄｅｌｔａ　Ｐａｋ）Ｃ１８カラムおよびアセトニトリルで修飾した水中の０１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いた勾配溶出液を用いた分取用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、粗精製ペプチドをＷ４製した。溶出した画分からアセトニトリルを留去させ、次いで、凍結転燥した。各々の生成物の同一性は、高速原子衝撃質量分析器（ＦＡＢＭＳ）により確認した。

実施例２Ｔｃ−９９ｍで放射線標識する常法実施例２て調製した０、１ｍｇのペプチド試薬を０．１ｍＬの水、または５０５０のエタノール水、あるいはリン酸緩衝セーライン（ＰＢＳ）、あるいはリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝　５．６または７４）に溶解した。グルコスカノ（Ｇｌｕｃｏｓｃａｎ）−バイアル（イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール社（Ｅ、　１．　ＤｕＰｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ。

］　ｎｃ、　）製）を、２ＱＱｍＣｉまでを含有するＴｃ−９９ｍ過テクネチウム酸すトリウムの１．０ｍＬで再生し、室温にて１５分間放置することによりＴｃ−９９ｍグルセプテ−１・をＥｌｌ！した。次いで、２５μｍのＴｃ−９９ｍグリセブテートを該ペプチドに添加し、室温または１００℃にて１５−３０分間反応を進行させ、次いで０２μｍのフィルターに通して濾過した。

該Ｔｃ−９９ｍ標識ペプチドの純度を、表Ｉの注脚に記載した条件を用いたＨＰＬＣにより測定した。放射性成分は、積算紀録機につなげたイン−ライン線量検出機によって検出した。Ｔｃ−９９ｍグルセブテートおよびＴｃ−９９ｍ過テクネチウム酵は、これらの条件下にて１ないし４分に溶出されたが、Ｔｃ−９９ｍ５ｍペプチドはさらにずっと後に溶出された。

以下の表は、本明細書記載の方法を用いた実施例１に従って調製したペプチドのＴｃ−９９ｍｍ識が首尾よく行われたことを示す。

水上付文字は、以下の標識条件を示す１　該ペプチドを５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，４）に溶解し、室温にて標識した。

２　該ペプチドを５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，４）に溶解し、１００℃にて標識した。

３　該ペプチドを水に溶解し、室温にてｖｓｍした。

４　該ペプチドを水に溶解し、１００℃にて標識した。

５　該ペプチドを５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，０）に溶解し、１００℃にて標識した。

６　該ペプチドを５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５，０）に溶解し、室温にて標識した。

７　該ペプチドをエタノール／水の５０：５０Ｕ合液に溶解し、１００℃にて標共通　溶媒Ａ　＝０１％のＣＦ　ｓ　ＣＯＯＨ／　Ｈ２０溶媒８７０　＝０　１％のＣＦ３Ｃ００８７７０％のＣＨ３ＣＮ　／　Ｈ２０溶媒Ｂ９ｏ　＝０．１％のＣＦ３ＣＯＯＨ／９０％のＣＨｓ　ＣＮ　／　Ｈ２０溶媒液速＝１ｍＬ／分ヒダツク・カラム（Ｖｙｄａｋ　ｃｏｌｕｍｎ）＝（ガードカラムを付けた）ヒダツク２１８ＴＰ５４ＲＰ−１８，５μＸ２２０ｍＩＩｘ４．６ｍｍ分析力ラムブラウンリー°カラム（Ｂ　ｒｏｗｎｌｅｅ　ｃｏｌｕｍｎ）　＝ウォーターズ・デルタ−バックＣ１８，５μｘ　１５０ｍＩＩｘ　３．９ｍｍカラム方法１　ブラウンリー・カラム　１０分間に１００％ＯＡないし１００％のＢ７゜方法２　ヒダツク・カラム　１０分間に１００％の人ないし１００％Ｂ方法３．　ビダック・カラム　１０分間に１００％の人ないし１００％のＢ７ｅ方法４　ウォーターズ・カラム　２０分間に１００％のＡないし１００％のＢｏ。

方法５．ウォーターズ・カラム　１０分間に１００％の人ないし１００％のＢ、。

＊＊＊ドデノル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミド電気泳動により確認した。

＊＊＊＊アフィニティーカラムへの該ペプチドの結合により確認した。

アミノ酸の一文字略語は、／イ、ソベイ（Ｇ、　Ｚｕｂａｙ）、バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏｃｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　（第２版（２ｄ、ｅｄ、）、１９８８年（マクミラン・パブリッシング（ＭａｃＭｉｌｌｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）ニュー佃−り（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）３３頁））参照：アンダーラインは、結合したアミノ酸の誘導基間でのチオール結合の形成を示す、ペプチドは、各ペプチド中の非保護ノステイン残基（Ｃ）の遊離チオール基を介してＢｓＨ，ＥＴＡＣ，ＢＳＭＥ、ＴＳＥＡまたは［ＢＡＴ−ＢＳ］リンカ−に結合しているペプチド：Ａｃ＝アセチル：Ｂｚ＝ベンゾイル；Ｐｉｃ＝ピコリノイル（ピリジン−２− カルボニル）　：　Ａ　ｃｌｌ−アセトアミドメチル＋Ｍｏｂ＝４−メトキノベンジル。

Ａｎｃ＝Ｌ−ｒｓ−（３−アミノプロピル）／スティン、Ｈ］Ｙ＝ホモリノンＦ。＝Ｄ−ファーニルアラニン：”１’Ｄ”Ｄ−チロノン：ｍａ＝２−メルカプト酢酸：ｍｍｐ＝２−メルカプト−２−メチルプロピオン酸、ＢＡＴ＝Ｎ６．Ｎ’ −ビス（２−メルカプト−２−メチルプロピル）−６，９−ノアザノナン酸：　Ｅ　Ｔ　Ａ　Ｃ＝　４−（０−ＣＨ２Ｃ０−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓアミド）アセトフェノン：ＢＡＴ−ＢＳ＝Ｎ−［２−Ｎ−、Ｎ−ビス（２−スフノンイミドエチル）アミノエチル３−Ｎ６．Ｎ９−ビス（２−メルカプト２−メチルプロピル）−６，９−ジアザノナンアミド：ＢＳＭＥ−ビスースフランイミドメチルエーテル。

ＴＳＥＡ＝トリス−（２−スフノンイミドエチル）アミン：ＮＥＳ＝Ｎ−エチルスクノ／イミド、ＢＳＨ＝１．６−ピスースクノンイミドヘキサン°＝電子スブＬ／　−（ｅｌ　ｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）質量分析［ＥＳＭＳ〕により確認した。

実施例３血小板凝集阻害アッセイ本質的にはソノカー（Ｚ　ｕｃｋｅｒ）による記載（１９８９年、メソソズ・イン・エンザイモｏ　）−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）、第１６９巻＋１１７−１３３頁）のごとく血小板凝集実験を行った。簡単には、マイクロリットル当たり３００．０００個の血小板よりなる新鮮なヒト血小板−リッチ血漿を用いて、予想される血小板凝集阻害化合物の存在下または不存在下で血小板凝集をアッセイした。アデノノンニリン酸溶液を最終１度１０ないし１５マイクロモラーにて添加することにより、血小板の凝集を誘導し、その血小板の凝集の程度をバイオ／データ・アブレボメーター（バイオ／データ・コーポレー／ヨン社、ホルノヤム、ペンノルバニア州（Ｂｉｏ／Ｄａｔａ　Ｃｏｒｐ、、　Ｈｏｒｓｈａｍ、　ＰＡ））を用いてモニターした。用いた血小板凝集阻害化合物の濃度はＯ］ないし５００μｇ／ｍＬで変化させた。血小板凝集の程度を５０％で減じる阻害剤１度（Ｃｌｓｏと定義されている）は、阻害剤濃度ＶＳ血小板凝集の程度をプロットすることによりめた。ペプチドＲＧＤＳについての阻害曲線は、陽性対照として試験した各血小板バンチに対して測定した。

これらの実験結果を表工に示す。表Ｉにおいて、試験した化合物は以下の通りであるＰ９７　＝　ＧＲＧＤＶＲＧＤＦＫＣＡｃｒｎＧＣＡ、、、アミドＰ３２　−　ＣＡｌ：ｒｒ、ＧＣＡｃｍ磨頃慢頃慢硫ＧＤＶＰ１４３−　ＱＩ５λ有」Ω立α χ℃＾ｃＴｒｌＯＣＡｃｍ７ミドＰ２４５　−　Ｑ１２ＣＣｏ【μユ、αンｘにに？ＡｃｍＧＣＡ（ｙｙｌＧＧＦＤＰＲＰＧ７　ミｌ’Ｐ９ｇ　−ＧＲＤＧＶＲＧＤＦＣＡＣｒｒ、ＧＣＡｃｍ７ミドＰ８１　−　Ｑ１２ＱΩ）ｌコｘＩＡｃｍＧＣ＾。７ミドＰＩ３４　−　ＱＩ２ΩΣＹｐΔｒｒｓＫｍに：ＧＧＧＣ八ｃｒｎへＣＡｃｍアミドＰ３１７　−　ｗ２ｃｃｕｐΔ−郊ｌＤＣＧＧＣＡＣＩＨＧＣＡＣｍＧＧＣ−７ミド１３−ＴＳＥ＾Ｐ３５７−（Ｑｌメエビｑ）ム膓≦コ１ココＧＣＡｃｒｎＧＣＡｃＩＴＩＧＧＣ−７ミド）２−［Ｂ＾Ｔ−ＢＳＩＰ３５７（略語は、表工の説明に見い出される）これらの結果は、本発明のペプチド試薬が、多くの場合において天然起源のＲＧＤＳ配列のものより、活性化血小板に高親和性をもって結合することを証明している。

表■ 実施例４雑種犬（２５−３５ｌｂ、−晩絶食させた）にケタミンおよびアセブロザミンの組合せを筋肉内注射して鎮静させ、次いで、ペンタパルビタールナトリウムを静脈内注射して麻酔した。各動物において、右大腿静脈の半末端に１８ゲージのアンギオカト（ａｎｇｉｏｃａｔｈ）を挿入し、８ｍｍのダクロン’（Ｄａｃｒｏｎ’）を巻いたステンレス・スチール塞症コイル（タック・コーポレイノヨン社（Ｃｏｏｋ　Ｃｏ、）、ブルーミントン、インディアナ州（ＢｌｏｏＩＩｉｎｇｔｔｏｎ　Ｉ　Ｎ））を大腿のおよそ中間部の大腿静脈に入れた。該カテーテルを取り出し、傷を縫合し、該コイルの位置をＸ線によって調べた。次いで、該動物を一晩で回復させた。

コイルを設置して１日後に、各々の動物を再度麻酔し、各々の前脚にセーラインを静脈内点滴し、膀胱カテーテルを挿入して尿を採取した。低エネルギー、全目的コリメーターを装備し、Ｔｃ−９９ｍにフォトビークを合わせたガンマカメラの下に該動物を仰向けに固定した。

丁ｃ−９９ｍ１１１１３１ペプチド［ユ８５−３７０ｍＢｑ（５−１０ｍＣｉ）８５−３７Ｏコをその挿入部位の１の前脚静脈ラインに連続して注射した。第２のラインは、血液採取のため残した。

ガンマカメラ造影を注射と同時に開始した。最初の１０分間にわたり心臓上の前側造影を動的試験で得（１０秒の造影を得た）、次いで、注射後１．２．３および４時間に静的造影を得た。脚部にわたる前側造影を５００．０００カウント、または２０分間（いずれｊ二せよ短い）、注射後１．２．３および４時間後に得た。

鉛ノールドを膀胱上方に覆って設置して脚部造影を採取した。

最後の造影の後に各々の動物をベンドパルビタールで深く麻酔した。２つの血液試料をヘパリン処理したシリンジを用いて心臓穿刺上に採取し、続いて安楽死させる量の塩化カリウム溶液を心臓内または静脈内ホーラス注財で投与した。血栓を含有する太り静脈、反対の（対照の）脚の同様な部位の静脈、血栓に隣接する静脈部位および腿筋肉の試料を注意深く切り取った。血栓、コイルおよびコイル・ダクロン繊［（ｃｏｄ　Ｄａｃｒｏｎ　ｆｉｂｒｅ）を血管から切り取った。

血栓、セーラインで洗浄した血管試料、コイル（ｃｏｉｌ）およびコイル・ダクロン繊維を分離し、各々の試料を予め重量を測定した試験管に入れた。その試料の重量を測定し、注射用量の既知画分と平行して、Ｔｃ−９９ｍチャンネルのカンマカウンターウェル中にて計測した。

新鮮な血栓重量、血栓中の％注射用量（％ＩＤ）／ｇおよび麻酔の直前に得た血液ならびに血栓／血液プｊらびに血栓／筋肉比を測定した。コンピューターに保存した造影から、血栓および隣接筋肉を掃引する、注目する領域（ＲＯＩ）において測定したカウント／ビクセルの分析によって、血栓／バックグラウンド比を測定した。

これらの実験からの組織データは以下の表に示す。Ｔｃ−９９ｍ標識ペプチドを用いてイ／・ビホ検出した静脈血栓の位置を示すノンチグラフイー画像は図１１＝示す。

これらの結果は、本発明のＴｃ−９９ｍｙｆｌ識試薬を用いてイン・ビボで深静脈血栓を容易かつ効率的に位置決定できることを示す。位置決定は注射後１時間以内に明らかに確立されるものであって、コントラストおよび焦点の鮮明度が増大したままで、注射後４時間近くにわたって持続する。

これまでの開示は本発明のある特別の具体例を強調したものであって、全ての修飾またはそれに同等の変法は、請求の範囲に記載するごとく、本発明の精神および範囲の中に入ることに注書すべきである。

表■ ［°ｎ＝このペプチドで行った実験回数］国驚臘審輻失国際調査報告　ｏｒｖｚｕｃ　Ｑｔ／ｎＡ７Ｑ４国際調査報告　Ｃ１ｒＴ／１１．０１／ｎＡ７Ｑ４

Claims

【特許請求の範囲】

１．テクネチウム−９９ｍ結合基に共有結合した、血栓の少なくとも１の成分に結合できる特異的結合化合物よりなり、ここに該テクネチウム結合基が、式：Ｃ（ＰｇＰ）５−（ａａ）−Ｃ（ＰｇＰ）３［式中、Ｃ（ｐｇｐ）５は保護チオール基を有するシステインで、（ａａ）はアミノ酸を意味する］を有する哺乳動物体内の血栓を造影するためのシンチグラフィー造影剤の製造用試薬。
２．テクネチウム−９９ｍで放射線標識した請求項１記載の試薬。
３．該特異的結合化合物とＣ（ｐｇｐ）５−（ａａ）−Ｃ（ｐｇｐ）５とが約１ないし約２０個のアミノ酸を通して共有結合している請求項１記載の試薬。
４．該保護システインが式： −ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ［式中、Ｒは１ないし６個の炭素原子を有する低級アルキル、２−、３−、４− ピリシル、フェニル、低級アルキル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、カルボキシ、または低級アルコキシカルボニルで置換されたフェニルを意味する］の保護基を有する請求項１記載の試薬。
５．Ｃ（ｐｇｐ）５−（ａａ）−Ｃ（ｐｇｐ）５が式：▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求項１記載の試薬。
６．該特異的結合化合物が、４ないし１００個のアミノ酸よりなるペプチドである請求項１記載の試薬。
７．式： ▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります ▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります ▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります ▼アミドアセチル▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミドアセチル▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼ アミドを有する請求項６記載の試薬。
８．還元剤の存在下に請求項１の試薬とテクネチウムー９９ｍを反応させることにより形成された錯体。
９．該還元剤が、亜ジチオン酸イオン、第一スズイオンおよび第一鉄イオンよりなる鮮から選択される請求項８記載の錯体。
１０．予め還元されたテクネチウムイオン−９９ｍ錯体のリガンド交換により、請求項１の試薬をテクネチウム−９９ｍで標識することにより形成された錯体。
１１．予め定めた量の請求項１の試薬と、該試薬をテクネチウム−９９ｍで標識するのに十分な量の還元剤とを含有する密閉バイアルよりなる放射性医薬製剤を製造するためのキット。
１２．還元剤の存在下に該試薬をテクネチウム−９９ｍと反応させることを特徴とする、請求項１記載の試薬を標識する方法。
１３．該還元剤が亜ジチオン酸イオン、第一スズイオンおよび第一鉄イオンよりなる群から選択される請項１２記載の方法。
１４．診断有効量の請求項２の試薬を投与し、次いで、血栓部位に局在したテクネチウム−９９ｍを検出することを特徴とする哺乳動物体内の血栓を造影する方法。
１５．該特異的結合ペプチドがイン・ビトロで化学合成された請求項１記載の試薬。
１６．該特異的結合ペプチドが固相ペプチド合成法により合成された請求項１５記載の試薬。
１７．イン・ビトロ化学合成の間に、該放射線標識待合基が該特異的結合ペプチドに共有結合する請求項１５記載の試薬。
１８．固相ペプチド合成の間に、該放射線標識結合基か該特異的結合ペプチドに共有結合する請求項１７記載の試薬。
１９．式： ▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります ▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド｛▲数式、化学式、表等があります▼｝▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミドアセチル ▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります ▼アミドアセチル▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミドアセチル▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼ アミドを有する試薬よりなる組成物。
２０．該試薬が、さらに、特異的結合化合物に共有結合し、かつ複数の放射線標識結合基にも共有結合した多価結合部位よりなり、多重多価シンチグラフィー造影剤を製造するための試薬を形成し、ここに、該多重多価シンチグラフィー造影剤の分子量は約２０，０００ダルトン未満である請求項１記載の試薬。
２１．該多重結合が、ビス−スクシンイミジルメチルエーテル、４−（２，２− ジメチルアセチル）安息香酸、Ｎ−［２−（Ｎ−，Ｎ−ビス（２−スクシンイミド−エチル）アミノエチル〕］−Ｎ６，Ｎ９−ビス（２−メチル−２−メルカプトプロピル）−６，９−ジアザノナンアミド、トリス（スクシンイミジルエチル）アミン、ビス−スクシンイミドヘキサン、４−（Ｏ−ＣＨ２ＣＯ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ．アミド）アセトフェノンまたはその誘導体である請求項２０記載の試薬。
２２．テクネチウム−９９ｍ結合部位に共有結合した、血栓の少なくとも１つの成分に結合できる特異的結合化合物よりなり、ここに該テクネチウム−９９ｍ結合部位が、式：Ａ−ＣＺ（Ｂ）−［Ｃ（Ｒ１Ｒ２）］ｎ−Ｘ［式中、ＡはＨ、ＨＯＯＣ、Ｈ２ＮＯＣ、（ペプチド）−ＮＨＯＣ、（ペプチド）−ＯＯＣまたはＲ４：ＢはＨ、ＳＨ、−ＮＨＲ３　、−Ｎ（Ｒ３）−（ペプチド）またはＲ４；ＸはＨ、ＳＨ、−ＮＨＲ３、−Ｎ（Ｒ３）−（ペプチド）またはＲ４；ＺはＨまたはＲ４；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈあるいは低級の直鎖もしくは分岐鎖または環状のアルキル：ｎは０、１または２：Ｂが−ＮＨＲ３または−Ｎ（Ｒ３）−（ペプチド）である場合、ＸはＳＨであって、ｎは１または２；Ｘが−ＮＨＲ３または−Ｎ（Ｒ３）−（ペプチド）である場合、ＸはＳＨであって、ｎは１または２；ＢがＨまたはＲ４である場合、ＡはＨＯＯＣ、Ｈ２ＮＯＣ、（ペプチド）−ＮＨＯＣ、（ペプチド）−ＯＯＣ、ＸはＳＨであって、ｎは０または１；ＡがＨまたはＲ４である場合、ＢはＳＨ、Ｘは−ＮＨＲ３または−Ｎ（Ｒ３）−（ペプチド）であり、ＸがＳＨである場合、Ｂは−ＮＨＲ３または−Ｎ（Ｒ３）−（ペプチド）；ＸがＨまたはＲ４である場合、ＡはＨＯＯＣ、Ｈ２ＮＯＣ、（ペプチド） −ＮＨＯＣ、（ペプチド）−ＯＯＣであってＢはメチル；Ｚがメチルである場合、Ｘはメチル、ＡはＨＯＯＣ、Ｈ２ＮＯＣ、（ペプチド）−ＮＨＯＣ、（ペプチド）−ＯＯＣ、ＢはＳＨであって、ｎは０；ＢがＳＨであってＸがＳＨである場合、ｎは０でない；ここに、チオール基は還元型を意味する〕を有する哺乳動物体内の血栓を造影するためのシンチグラフィー造影剤を製造するための試薬。
２３．該特異的結合化合物が４ないし１００個のアミノ酸よりなるペプチドである請求項１記載の試薬。
２４．テクネチウム−９９ｍで放射線標識されている請求項２２記載の試薬。
２５．該特異的結合化合物と、該テクネチルム−９９ｍ結合部位とが、約１ないし約２０個のアミノ酸を通して共有結合している請求項２２記載の試薬。
２６．還元剤の存在下に請求項２２記載の試薬と、テクネチウム−９９ｍとを反応させることにより形成させた錯体。
２７．該還元剤が、亜ジチオン酸イオン、第一スズイオンおよび第一鉄イオンよりなる群から選択される請求項２６記載の複合体。
２８．予め還元したテクネチウム−９９ｍ鉄体のリガンド交換により、請求項２２記載の試薬をテクネチウム−９９ｍで標識することにより形成させた錯体。
２９．請求項２２記載の試薬と第一スズイオンとよりなる組成物。
３０．予め定めた量の請求項２２記載の試薬と、該試薬をテクネチウム−９９ｍで標識するのに十分な量の還元剤とを含有する密閉バイアルよりなる放射性医薬製剤を製造するためのキット。
３１．還元剤の存在下に該試薬をテクネチウム−９９ｍと反応させることを特徴とする請求項２２記載の試薬を標識する方法。
３２．該還元剤が、亜ジチオン酸イオン、第一スズイオンおよび第一鉄イオンよりなる群から選択される請求項３１記載の方法。
３３．診断有効量の請求項２４記載の試薬を投与し、次いで、血栓部位に局在したテクネチウム−９９ｍを検出することを特徴とする哺乳動物体内の血栓を造影する方法。
３４．該特異的結合ペプチドがイン・ビトロで化学合成される請求項２２記載の試薬。
３５．該ペプチドを固相ペプチド合成法により合成する請求項３４記載の特異的結合ペプチド。
３６．イン・ビトロ化学合成の間に、該テクネチウム−９９ｍ結合部位が咳ペプチドに共有結合する請求項３４記載の次試薬。
３７．固相ペプチド合成の間に、該テクネチウム−９９ｍ結合部位が該ペプチドに共有結合する請求項３６記載の試薬。
３８．該試薬か、さらに、複数の特異的結合化合物に共有結合し、かつ複数の放射線標識結合部位にも共有結合した多価結合部位よりなり、多重多価シンチグラフィー造影剤を調製するための試薬を形成し、ここに該多重多価シンチグラフィー造影剤の分子量か約２０，０００ダルトン未満である請求項２２記載の試薬。
３９．該多価結合部位か、ビス−スクシンイミジルメチルエーテル、４−（２，２−ジメチルアセチル）安息香酸、Ｎ−［２−（Ｎ−，Ｎ−ビス（２−スクシンイミド−エチル）アミノエチル）〕−Ｎ６，Ｎ９−ビス（２−メチル−２−メルカブトブプピル）−６，９−ジァザノナンアミド、トリス（スクシンイミジルエチル）アミン、ビス−スクシンイミドヘキサン、４−（Ｏ−ＣＨ２ＣＯ−Ｇｌｙ −Ｇｌｙ−Ｃｙ５，アミド）アセトフェノンまたはその誘導体である請求項３８記載の試薬。
４０．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ アセチル▲数式、化学式、表等があります▼アセチル▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求項２２記載の試薬。
４１．式：▲数式、化学式、表等があります▼アセチル▲数式、化学式、表等があります▼アミドアセチル▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼ を有する試薬よりなる組成物。
４２．テクネチウム−９９ｍ結合部位に共有結合した、血栓の少なくとも１の成分に結合できる特異的結合化合物よりなり、ここに、該テクネチウム−９９ｍ結合部位がテクネチウム−９９ｍとで中性の錯体を形成する哺乳動物体内の血栓を造影するためのシンチグラフ−造影剤を製造するための試薬。
４３．テクネチウム−９９ｍ結合部位が：ＩＩＩ▲数式、化学式、表等があります▼（特異的結合化合物）ＩＶ（特異的結合化合物）▲数式、化学式、表等があります▼［式中、Ｘ＝Ｈまたは保護基；（アミノ酸）＝いずれかのアミノ酸〕Ｖ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、各々のＲ５は、独立して、Ｈ、ＣＨ３またはＣ２Ｈ５；各々の（ｐｇｐ）５は、独立して、チオール保護基またはＨ；ｍ、ｎおよびｐは、独立して、２または３；Ａ＝直鎖状もしくは環状の低級アルキル、アリール、複素環、その組合せまたはその誘導体〕ＶＩ▲数式、化学式、表等があります▼［式中、各々のＲ５は、独立して、Ｈ、１ないし６個の炭素原子を有する低級アルキル、フェニル、または低級アルキルもしくは低級アルコキシで置換されたフェニル；ｍ、ｎおよびｐは、独立して、１または２；Ａ＝直鎖状もしくは環状の低級アルキル、アリール、複素環、その組合せまたはその誘導体；Ｖ＝Ｈまたは−ＣＯ−ペプチド；Ｒ６＝Ｈまたはペプチド；Ｖ＝Ｈの場合、Ｒ６＝ペプチドであり、Ｒ６＝Ｈの場合、Ｖ＝−ＣＯ−ペプチド；ここに、該テクネチウム−９９ｍ結合部位は、テクネチウム−９９ｍで錯体を形成し、該放射線標識結合部位とテクネチウム−９９ｍとの錯体は電気的に中性である］よりなる群から選択される式を有する請求項４２記載の試薬。
４４．該特異的結合化合物が、４ないし１００個のアミノ酸よりなるペプチドである請求項４３記載の試薬。
４５．テクネチウム−９９ｍで放射線標識されている請求項４３記載の試薬。
４６．該特異的結合化合物と該テクネチウム−９９ｍ結合部位とが、約１ないし約２０個のアミノ酸を通して共有結合している請求項４３記載の試薬。
４７．還元剤の存在下で請求項４３の試薬とテクネチウム−９９ｍとを反応させることにより形成された錯体。
４８．該還元剤が、亜ジチオン酸イオン、第一スズイオンおよび第一鉄イオンよりなる群から選択される請求項４７記載の錯体。
４９．予め還元したテクネチウム−９９ｍ錯体のリガンド交換により、請求項４３記載の試薬をテクネチウム−９９ｍで標識することにより形成された錯体。
５０．予め定めた量の請求項４３記載の試薬と、該試薬をテクネチウム−９９ｍで標識するのに十分な量の還元剤とを含有する密閉バイアルよりなる放射性医薬調製剤を製造するためのキット。
５１．診断有効量の請求項４５記載の試薬を投与し、次いで、血栓部位に局在したテクネチウム−９９ｍを検出することを特徴とする哺乳動物体内の血栓を造影する方法。
５２．該特異的結合ペプチドかイン・ビトロで化学合成される請求項４３記載の試薬。
５３．該ペプチドを固相ペプチド合成法により合成する請求項５２記載の特異的結合ペプチド。
５４．イン・ビトロ化学合成の間に、該テクネチウム−９９ｍ結合基が該ペプチドに共有結合する請求項５２記載の試薬。
５５．固相ペプチド合成の間に、該テクネチウム−９９ｍ結合基が該ペプチドに共有結合する請求項５４記載の試薬。
５６．該試薬が、さらに、複数の特異的結合化合物に共有結合し、かつ複数の放射線標識結合部位にも共有結合した多価結合部位よりなり、多重多価シンチグラフィー造影剤を調製するための試薬を形成し、ここに、該多重多価シンチグラフィー造影剤の分子量が約２０，０００未満である請求項４３記載の試薬。
５７．該多価結合価部位が、ビス−スクシンイミジルメチルエーテル、４−（２，２−ジメチルアセチル）安息香酸、Ｎ−［２−（Ｎ−，Ｎ−ビス（２−スクシンイミド−エチル）アミノエチル）］−Ｎ６，Ｎ９−ビス（２−メチル−２−メルカプトプロピル）−６，９−ジアザノナンアミド、トリス（スクシンイミジルエチル）アミン、ビス−スクシンイミドヘキサン、４−（Ｏ−ＣＨ２ＣＯ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ．アミド）アセトフェノンまたはその誘導体である請求項５６記載の試薬。
５８．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼アミドアセチル▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミドを有する請求項４３記載の試薬。
５９．式： ▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります ▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミドを有する試薬よりなる組成物。
６０．４ないし１００個のアミノ酸のアミノ酸配列および当該特異的結合ペプチドに共有結合したテクネチウム−９９ｍ結合部位を有する特異的結合ペプチド、フィブリンの重合部位のためのリガンドであるペプチド、およびアミノ酸配列（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）からなる環状ペプチドよりなる群から選択されるものであって、アミノ酸配列（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）からなるものでないことを特徴とする哺乳動物体内で血栓を造影するための血栓造影剤を製造するための試薬。
６１．フィブリンの重金部位のためのリガンドであるペプチドの該アミノ酸配列が、配列（グリシループロリルーアルギニル−プロピル）の複数コピーよりなる請求項６０記載の試薬。
６２．式： ▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミドアセチル▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミドアセチル▲数式、化学式、表等があります▼アミド▲数式、化学式、表等があります▼ アミド▲数式、化学式、表等があります▼アミドを有する請求項６０記載の試薬。
６３．テクネチウム−９９ｍで放射線標識された請求項６０記載の試薬。
６４．該特異的結合ペプチドと該テクネチウム−９９ｍ結合部位が、約１ないし約２０個のアミノ酸を通して共有結合している請求項６０記載の試薬。
６５．還元剤の存在下に請求項６０記載の試薬とテクネチウム−９９ｍとを反応させることにより形成された錯体。
６６．該還元剤が、亜ジチオン酸イオン、第一スズイオンおよび第一鉄イオンよりなる群から選択される請求項６５記載の錯体。
６７．予め還元したテクネチウム−９９ｍ錯体のリガンド交換により、請求項６０記載の試薬をテクネチウム−９９ｍで標識することにより形成された錯体。
６８．請求項６０記載の試薬および第一スズイオンよりなる組成物。
６９．予め定めた量の請求項６０記載の試薬と、該試薬をテクネチウム−９９ｍで標識するのに十分な量の還元剤とを含有する密閉バイアルよりなる放射性医薬製剤を製造するためのキット。
７０．還元剤の存在下に請求項６０記載の試薬とテクネチウム−９９ｍとを反応させることを特徴とする請求項６０記載の試薬の標識方法。
７１．該試薬が、亜ジチオン酸イオン、第一スズイオンおよび第一鉄イオンよりなる群から選択される請求項７０記載の方法。
７２．診断有効量の請求項６５記載の試薬を投与し、次いで、血栓部位に局在したテクネチウム−９９ｍを検出することを特徴とする哺乳動物体内の血栓を造影する方法。
７３．該特異的結合ペプチドをイン・ビトロで化学合成する請求項６０記載の試薬。
７４．該ペプチドを固相ペプチド合成法により合成する請求項７３記載の特異的結合ペプチド。
７５．イン・ビトロ化学合成の間に、該テクネチウム−９９ｍ結合部位が該ペプチドに共有結合する請求項７３記載の試薬。
７６．固相ペプチド合成の間に、該テクネチウム−９９ｍ結合部位が該ペプチドに共有結合する請求項５４記載の試薬。
７７．該試薬が、さらに、複数の特異的結合化合物に共有結合し、かつ複数の放射線標識結合部位にも共有結合した多価結合部位よりなり、多重多価シンチグラフィー造影剤を調製するための試薬を形成し、ここに、該多重多価シンチグラフィー造影剤の分子量が約２０，０００ダルトン未満である請求項６０記載の試薬。
７８．該多価結合価部位が、ビス−スクシンイミジルメチルエーテル、４−（２，２−ジメチルアセチル）安息香酸、Ｎ−［２−（Ｎ−，Ｎ−ビス（２−スクシンイミド−エチル）アミノエチル）〕−Ｎ６．Ｎ９−ビス（２−メチル−２−メルカプトプロピル）−６，９−ジアザノナンアミド、トリス（スクシンイミジルエチル）アミン、ビス−スクシンイミドヘキサン、４−（Ｏ−ＣＨ２ＣＯ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ．アミド）アセトフェノンまたはその誘導体である請求項５６記載の試薬。