JPH05508699A - テクネチウムまたはレニウムでの抗体または他のタンパク質の直接放射能標識 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本出願は、“Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｉｎｇ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　 ０ｔｈｅｒＰｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｉｔｈ　Ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ　ｏｒ　Ｒｈｅ ｎｉｕｍ　ｂｙ　ＲｅｇｕｌａｔｅｄＲｅｄｕｃｔｉｏｎ“という題目の１９８ ９年８月９日に出願の米国特許出順環０７／３９１．４７４号の一部継続出願で ある。前記出願の教示は本明細書に参考として組み込まれる。

本発明は、抗体を包含するタンパク質をテクネチウムまたはレニウムの放射性同 位体例えばテクネチウム−９９ｍで放射能標識するための方法、組成物およびキ ットに関する。

タンパク質を放射能標識するための放射性同位体の使用は公知である。それらの 組成物はアッセイにおいて利用することができ、体の種々の部分の機能を視覚化 またはモニタリングするためにあるいは特定の抗原、抗体、ホルモン等の存在お よび位置を決定するために人体に投与することができ、そして種々の病的状態の 治療に使用することができる。様々な放射性同位体、例えばヨウ素、テクネチウ ム、インジウムおよびレニウムの放射性同位体が使用されている。タンパク質分 子をテクネチウム−９９ｍで標識して診断剤または画像診断剤を形成せしめるこ とができることも公知である。

テクネチウム−９９ｍは、過テクネチウム酸ナトリウムを使用する方法により、 タンパク質、キレート剤、ホスホネート骨走査用組成物等を放射能標識するのに 使用されている。ここでテクネチウムは最初は＋７状態にある。テクネチウム− ９９ｍは通常、過テクネチウム酸ナトリウムとしてのみ入手可能である。過テク ネチウム酸塩は、テクネチウムを＋３．＋４または＋５の酸化状態まで還元する ために、放射能標識しようとするタンパク質、キレート剤または同様な物質の存 在下において還元剤、例えば塩化第一錫と接触させなければならない。テクネチ ウム分子と放射能標識しようとする基質との間の化学結合を維持するためにテク ネチウムをこの還元状態に維持しなければならない。還元されたテクネチウムが 、アッセイ媒質中、患者の血液中または放射能標識物質が使用されるであろう他 の媒質中に存在する別の分子または別のタンパク質に転移しないように、テクネ チウムをタンパク質に強固に結合せしめることも必要である。

幾つかの異なる方法は、タンパク質、特にモノクローナル抗体をテクネチウム− ９９ｍで放射能標識することを使っている。この方法は２つの一般的アプローチ を含む。１つは間接アプローチであり、二価性キレート剤が１つの官能基を介し てタンパク質に取りけられ、そしてもう１つの官能基またはキレート基を介して テクネチウム−９９ｍが取り付けられる。

この方法はＫｒｅｊｅａｒｅｋ、　Ｇ、Ｅ、およびＴｕｃｋｅｒ、　Ｋ、Ｌ。（ ”Ｃｏｖａ　ｆｅｎ　ｔＡｔｔａｃｈｒｎｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　 Ｇｒｏｕｐｓ　ｔｏ　ＭａｃｒｏｍｏｌｅｅｕｌｅｓどＢｉｏｃｈｅｍｉｅａｌ 　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔ ｉｏｎｓ第７７巻、　５８１−５８５頁、　１９７７）により導入され、そして 種々の二価性キレート剤、例えばＷｅｎｓｅｌおよびＭｅａｒｅｓ　（Ｗｅｎｓ ｅｌ、　Ｔ−Ｇ、およびＭｅａｒｅｓ、　Ｃ，Ｆ、、“Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａ ｌ　Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　Ａｇｅｎｔｓｆｏｒ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｍｅｔａｌ　 Ｉｏｎｓ　ｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、”Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｓ、Ｗ、　Ｂｕｒｃｈｉｅｌ およびＢ−Ａ、　Ｒｈｏｄｅｓ編、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ 　Ｃｏ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１８５−１９６頁、１９８３）に記載された ものを使って、多数の変形において広く使用されている。別の方法がＨｎａｔＯ ＷｉＣｈ、　Ｄ、Ｊ、、米国特許！４．６６８゜５０３号および第４．４７９． ９３０号により、Ｈａｂｅｒ、　Ｅ、およびＫｈａｗ、Ｂ、　Ａ、、米国特許第 ４．４２１．７３５号により、Ｆｒｉｔｚｂｅｒｇ、　Ａ、Ｒ，およびＫａｓｉ ｎａ、　Ｓ、、米国特許第４．６７０．５４５号により、並びにＢａ１ｄｏｏ、 　Ｋ、Ｅ、ら、“””　Ｔｃ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：　 ［ｎ１ｔｉａｌＥｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｏｖｅｌ　Ｄｉａｍｉｎｅｄｉ ｔｈｉｏｌ　ＢｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌＣｈｅｌａｔｉｎｇ　Ａｇｅｎｔ、”　 Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　（Ｓｕｐｐ）第５０巻、　７９９ｓ−８０３ｓ頁、１９ ９０により、開示されている。これらの二価性キレート方法は全て、放射能標識 手順の複雑さ、放射能標識を達成するのに要する時間、並びにタンパク質に影響 を与え得る物質の導入および存在といった明白な制限を有する。

もう１つの一般的アプローチは直接標識である。幾つかの直接法が報告されてい るけれども、生体内適用のためのタンパク質とテクネチウム−９９ｍとの間に十 分に強い結合を提供することができる最初の直接法は、”Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ 　Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌ−ｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｉｔｈ　Ｔｅｃｈｎｅ ｔｉｕｍ−９９ｍ　”という題目のＣｒｏｃｋｆｏｒｄ。

Ｄ、　Ｒ，およびＲｈｏｄｅｓ、　Ｂ、Ａ、への米国特許第４．４２４．４００ 号に記載された直接または予備錫はんだ法であった。この方法では、塩化第一錫 ［５ｎ（ＩＩ）］と酒石酸塩およびフタル酸塩から成る単一還元溶液が使用され る。この溶液は、（１）タンパク質を還元し、それによって反応性スルヒト基を 暴露せしめ、（２）還元されたタンパク質の反応性スルフィド基を保護し、（３ ）過テクネＳ　チウム酸ナトリウムを還元し、そして（４）還元されたＴｃ−９ ９ｍと）　錯生成させそれを還元されたタンパク質のスルフィド結合部位に転移 させるために働く。この方法を使って、多数のタンパク質を好結果にテクネチウ ム−９９ｍで放射能標識することができる。何人かの発明者らがこの方法の利用 について報告している（Ｒｈｏｄｅｓ、　Ｂ、Ａ、ら、’Ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ −９９ｍ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｏｆＭｕｒｉｎｅ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎ ｔｉｂｏｄｙ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、”　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＮｕｃｌｅａｒ 　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　２７巻、　６８５−６９３頁、　１９８６　；　Ｓｏｍ 、　Ｐ、ら、”Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ　ｏｆ　ＥＸｐｅｒｉｍ ｅｎｔａｌ　Ｔｈｒｏｍｂｉ　ｉｎ　ＤｏｇｓＬｌｓｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｅｔｉ ｕｍ−９９ｍ−Ｌａｂｅｌｅｄ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ＡｎｔｉｂｏｄｙＦｒ ａｇｍｅｎｔｓ　Ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｗｉｔｈ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓ、”　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＮｕｃｌｅａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２７巻、 第８号、　１３１５−１３２０頁、　１９８６）。

他の初期の直接標識法も報告されているが、安定なＴｃ−タンパク質結合を与え なかった。従来方法（Ｓｔｅｒｎ、　Ｈ，Ｓ、ら、ら、　’Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｆｅ （Ｉｔ）　ｏｒ　５ｎ（ＩＩ）　Ａｌｏｎｅ　ｆｏｒ　Ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｎ＋ Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｏｆ　Ａｌｂｕｍｉｎ、”　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｕｃ ｌｅａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１２巻、第５号、　２０４−２１１頁、　１９ ７０　：　Ｅｃｋｅｌｍａｎ、　Ｗ、Ｃ，ら、””　Ｔｃ−Ｈｕ＋ｎａｎ　Ｓｅ ｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ、”　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＮｕｃｌｅａｒＭｅｄｉ ｃｉｎｅ、第１２巻、第１１号、　７０７−７１０頁、　１９７１　；　Ｗｏｎ ｇ、　Ｄ、Ｗ、ら、　“Ａ　Ｒａｐｉｄ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｏ ｆ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｈｕｍａｎ　ＰｌａｓｍａＰｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｉｔｈ 　””　Ｔｃ−Ｐｅｒｔｅｃｈｎｅｔａｔｅ　ａｔ　ｐＨ７，４，’Ｉｎｔｅｒ ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｒａｄｉａｔｉｏ ｎ　ａｎｄ　ｌ５ｏｔｏｐｅｓ。

第２９巻、　２５１−２５３頁、１９７８　；　Ｃｏｌｏｍｂｅｔｔｉ、　Ｌ、 Ｇ、ら、“ＡＲａｐｉｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ＩｇＧ　 ｗｉｔｈ　９９ｍ−Ｔｃ、”　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＮｕｃｌｅａｒ　Ｍｅｄｉ ｃｉｎｅ、第２０巻、６５２頁、　１９７９　：　Ｒｈｏｄｅｓ、　Ｂ、Ａ、。

米国特許第４．３０５．９９２号、“ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｗ ｉｔｈ　９９ｍ−Ｔｅｂｙ　Ｌｉｇａｎｄ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ”　）におけるＴ ｃ−タンパク質結合の不安定性の理由は、タンパク質と還元された放射性核種と の間の強力な結合の形成に必要である反応性スルフィド基を提供するようにタン パク質が還元されなかったことであった。

その後、米国特許第４．４２４．２００号の方法の変形を使った多数の方法が報 告された。それらの変形は一般に次のものの１つまたは複数を含む＝（１）タン パク質を還元するのに５ｎ（ＩＩ）以外のジスルフィド還元剤、例えば２−メル カプトエタノール、ジチオトレイトールおよびそれらの類似体を使用する；（２ ）　５ｎ（Ｉｔ）以外の反応性スルフィド基保護剤、例えば２ｎ（Ｉｆ）を使用 する；（３）釦（Ｉｔ）以外の過テクネチウム酸塩還元剤、例えばジチオトレイ トールを使用する：および（４）還元されたテクネチウムを結合しそしてそれを タンパク質のスルフィド基に転移させるのに酒石酸塩以外の錯生成剤、例えばホ スホネートを使用する。

それらの方法は、一般に、米国特許第４．４２４．２００号の方法を上回る改善 をもたらさなかった。開示された方法はいずれも、本明細書において開示される 方法、組成物およびキットを使って達成されるものに匹敵する結果を与えない。

Ｓｃｈｗａｒｚ、　Ａ、および５ｔｅｉｎｓｔｒｕａｂｅｒ、　Ａ、、Ａ　Ｎｏ ｖｅｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　Ｔｃ−９９ｍ−Ｌａｂｅｌｅｄ　Ｍｏｎｏｃ ｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、”　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｎｕｃｌｅａｒ 　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２８巻、７２１頁、　１９８７、並びにＢｒｅｍｅｒ。

Ｋ、　Ｈ，ら、欧州特許出願第０２７１８０６　Ａ２　（１９８７年１２月８日 出願）は、タンパク質のジスルフィド基をモノチオール、例えば２−メルカプト エタノールまたは２−メルカプトエチルアミンで還元している。過テクネチウム 酸塩を還元するのに５ｎ（Ｉ［）を使用し、そして還元されたテクネチウムをホ スホネートまたはピロホスフェートと錯生成させる。この方法は、放射能標識を 達成するのに２以上のバイアルおよび多数の段階を必要とする。使用されるホス ホネートは最終生成物中にラジオコロイド不純物を生成しうる。その上、ジスル フィド基を還元するのに用いる化学物質、例えば２−メルカプトエタノールは、 潜在的に毒性である。

Ｒｅｎｏ、　Ｊ、Ｗ、ら、米国特許第４．８７７、８６８号、　Ｒａｄｉｏｎｕ ｃｌｉｄｅＡｆｌｔｉｂＯ（ＩＹ　Ｃｏｕｐｌｉｎｇおよび欧州特許出願第０２ ３７１５０号（１９８７年１月１９日出願）は、タンパク質のジスルフィド基を 還元するのにジチオトレイトール（ＤＴＴ）を使用し、次いでＺｎ（Ｉ［）また は他のスルフヒドリル基誘導試薬で反応性スルフィトを保護している。それらは 還元された放射性核種と錯生成しそしてそれらを転移せしめるのに酒石酸塩を用 いる。

この方法は、抗体を還元するのに潜在的に毒性の化学物質、例えばジチオトレイ トールを使用している。この方法もタンパク質を放射能標識するのに多数の段階 を必要とする。

Ｐａｋ、　Ｋ、Ｙ、ら、“Ａ　Ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｍｅ ｔｈｏｄ　ｆｏｒＬａｂｅｌｉｎｇ　ＩｇＧ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｗｉｔｈ 　ＴＣ−９９０）　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｔ。

Ｔｃ−９９ｍ　Ｆａｂ’　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、”’　Ｊｏ ｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＮｕｃｌｅａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ、第３０巻、７９３頁、　 １９８９、および特許協力条約（ＰＣＴ）国際特許出順環ＮＯ８８１０７３８２ 号（１９８８年４月１日出願）は、抗体を還元するのにジチオトレイトールを使 用している。酒石酸塩もしくはグルコヘプトン酸塩またはそれらの類似体を添加 し、還元された放射性核種と錯生成しそして転移せしめる。この方法も同様に潜 在的に毒性の化学物質を使用しており、放射能標識するのに複数の段階を必要と する。

５ｃｈｏｃｈａｔ、　Ｄ、ら、欧州特許出順環’０３３６６７８号（１９８９年 ４月３日出願）は、従来のジスルフィド還元剤、例えばシスティン、ジチオトレ イトール、２−メルカプトエタノール、ジチオニット等を使用する。それらは米 国特許第４．４２４．２００号の予備はんだ法が十分に機能しないことを主張し ており、血液もしくは他の体液または組織の存在下で比較的不安定である部位に 放射性金属がいくらか結合することを指摘している。

それらは用途において単一の例、即ちＴｃ−９９ｍ−抗−ＣＥＡ−Ｆａｂ’の調 製、を与えており、この例は正確には上記特許第’　２００号のものであると思 われる。過テクネチウム酸ナトリウムを還元するための５ｎ（ＩＩ）の使用は従 来技術において公知であり、そして上記特許第’　２００号や他の参考文献に開 示されている。

他の方法を上回るタンパク質のジスルフィドを還元する５ｎ（ＩＩ）法の利点は 、５ｎ（Ｉ［）がジスルフィド結合を還元し且つ還元により形成されたスルフィ ドと錯生成して非反応性ジスルフィドに戻らないようにスルフィドを保護するこ とである。タンパク質のジスルフィド基を還元するのにＤＴＴのような有機還元 剤を使用する時には、スルフィド保護剤を付加する前に還元剤を除去しなければ ならない。そうでなければ、通常は沈澱の形成によって、保護基が還元剤と反応 してしまうだろう。還元剤とスルフィド保護剤との反応を回避するために還元剤 を先ず除去する場合、還元されたタンパク質は一定期間の間装置され、その間に 反応性スルフィド基が非反応性ジスルフィド結合を再形成し得る。本発明に記載 される５ｎ（ＩＩ）還元法は、それがジスルフィドの同時還元・錯体化を可能に するという点で新規である。

上記の４段階法とは化学的に異なる他の直接標識法も報告されている。Ｐａ１ｋ 、　Ｃ，Ｈ，ら、米国特許第４．６５２．４４０号。

“Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　５ｔａｂｌｙ　Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｉｎｇ　Ａｎｔｉ ｂｏｄｉｅｓ　ｗｉｔｈＴｅｃｈｎｅｔｉｕｍ　ａｎｄ　Ｒｈｅｎｉｕｍ”は、 還元された放射性核種を目当てに競争する強いキレート剤ＤＴＰＡの存在下での ５ｎ（Ｉ［）還元によりタンパク質を標識している。タンパク質の強力結合Ｔｃ −９９ｍ標識のみが好ましくはタンパク質の生来の遊離スルフヒドリル基への結 合によって起こる。しかしながら、相当な量のＴｃ−９９ｍ−ＤＴＰＡも形成さ れるので、標識タンパク質を使用する前にこれを除去しなければならない。この 方法は、高収率の強力に結合した放射性核種を獲得するのに必要とされるジスル フィド結合の還元の第一段階を欠いている。

Ｓｕｎｄｒｅｈａｇｅｎ、　Ｅ、、　ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ８５１０３２３１ （１９８５年１月１８日出願）は、過テクネチウム酸塩を還元するのに使用する 低濃度の５ｎ（ＩＩ）を安定化するのにゲンチシン酸を使用している。この方法 は、ラジオコロイドおよび酸化された放射性核種といった放射化学不純物を最小 にするのに有用である。この方法は、高収率の強力に結合した放射性核種を獲得 するのに必要とされるジスルフィド結合の還元の第一段階を欠いている。

Ｌｅｅｓ、　Ｒ，Ｓ、、米国特許第４．６４７．４４５号、“Ｒａｄｉｏｌａｂ ｅｌ　１ｅｄＬｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｍａ ｋｉｎｇ　Ｓａｍｅ″は、過テクネチウム酸塩とりボタンバク質を同時に還元す るのにｐＨ８〜９でジチオニットを使用している。この方法は、使用前に標識生 成物をカラムクロマトグラフィーにより精製して放射性核種不純物を除去するこ とを必要とする。

Ｂｒｅｅｄｖｅｌｄ、Ｆ、Ｃ，ら、“踊ａｇｉｎｇ　ｏｆ　Ｉｎｆｌａｍｍａｔ ｏｒｙ　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓｗｉｔｈ　Ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ−９９ｍ−Ｌａｂ ｅｌｅｄ　ＩｇＧ、”　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＮｕｃｌｅａｒＭｅｄｉｃｉｎ ｅ、第３０巻、第１２号、　２０１７−２０２１頁、　１９８９は、まず過テク ネチウム酸塩を塩酸で還元し、次いで放射性核種を抽出、転移、還元、乾固させ る。この乾燥した還元された放射性核種を含む容器にタンパク質を添加する。４ ０℃で６０分間のインキュベージクン中に標識が達成される。この方法は、放射 性核種の多大な前処理を必要とし、よって薬剤を標識および製剤するためのイン スタントキット法には容易に応用されない。

ＭｃＫｅｎｚｉｅ、Ｅ、ら、“Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　””Ｔｅｃｈ ｎｅｔｉｕｍ−Ｎｉｔｒｉｄ。

Ｇｒｏｕｐ　ｔｏ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｎｄ　Ｌｌｓ ｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　 ｏｆ　Ｔｕｍｏｒｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｅ、’　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅＮａ ｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、第７７巻、　４３１−４３ ９頁、　１９８６、およびＰＣＴ国際特許出願ＷＯ８７１０４１６４（１９８６ 年１月６日出願）は、抗体を還元して遊離スルフヒドリル基結合部位を提供する かまたは遊離スルフヒドリル基結合部位基を導入し、そして該部位を０”ＴｃＮ （ＣＩ）ａ−で標識する。その生成物は、使用前に放射性核種不純物を減らすた めのゲルクロマトグラフィーによる精製を必要とする。

従来方法はいずれも、育意な放射化学不純物を含まない注入可能な生成物、標識 しようとするタンパク質が抗体である時は免疫反応性を変えずに放射性核種がタ ンパク質に定量的に且つ強力に結合する生成物、を１５分以内に提供する一段階 標識用キットおよび方法を提供することができなかった。その上、多くの従来方 法は潜在的に毒性の化学物質を使用する。

ＣｒｏｃｋｆｏｒｄおよびＲｈｏｄｅ３の予備はんだ法は、タンパク質に強力に 結合した放射性核種を約８５％与える迅速な一段階標識方法を提供することがで きたけれども、放射化学純度は全てのモノローナル抗体の臨床適用に十分なほど 高くはなく、そして生成物によっては患者への投与前に最後の精製を必要とした 。本発明では、一段階標識の簡便性を保持したまま、タンパク質を還元するため の最適条件と放射性核種を還元するための最適条件の両方を達成することができ る。これは製造工程に段階を追加することにより達成される。Ｃｒｏｅｋｆｏｒ ｄおよびＲｈｏｄｅｓにより記載された初期の予備はんだ法と同様にしてタンパ ク質を５ｎ（ＩＩ）で還元する。還元が完了した後、還元されたタンパク質を精 製または複合体形成段階に付し、過剰の還元剤および反応副生成物、例えば塩化 第二錫または他の５ｏ（ＩＶ）剤を除去する。あるいは、有機還元剤を使ってタ ンパク質を還元し、有機還元剤および反応生成物を取り出し、そして５ｎ（ＩＦ ）を添加して５ｎ（ＩＩ）および硫黄含有タンパク質複合体を形成させる。５ｎ （ＩＩ）放射性核種還元剤は、その後の放射能標識に最適である濃度において且 つその後の放射能標識に最適である錯生成剤と共に、還元されたタンパク質溶液 に添加される。放射性核種還元溶液と還元されたタンパク質とを了りコートに分 け、凍結し、そして所望により放射能標識に必要になるまで凍結乾燥保存する。

別法は、タンパク質を還元しそして５ｎ（ＩＩ）および硫黄含有タンパク質複合 体を形成させるのに最適な試薬の濃度において上記特許第２００号に開示された ＣｒｏｃｋｆｏｒｄおよびＲｈｏｄｅｓの予備はんだ法を使って抗体を還元し、 次いでこの溶液を試薬で希釈して、放射性核種を還元しそれをタンパク質に転移 させるのに最適な条件を獲得することである。

本発明によれば、タンパク質をテクネチウムまたはレニウムで放射能標識する方 法であって、還元剤を使ってタンパク質中のジスルフィド結合を還元し：過剰の 還元剤、反応副生成物およびあらゆる不純物を除去し：そして、最適な低濃度お よび限定量の過テクネチウム酸塩または過レニウム酸塩還元剤を添加し、過テク ネチウム酸ナトリウムまたは過レニウム酸ナトリウムを還元し、リガンド交換反 応による還元されたタンパク質の迅速な標識を促進する方法が提供される。

好ましい態様では、放射能標識しようとするタンパク質基質を、約４．５〜約８ ．５のｐＨ１好ましくは約ｐＨ５，６を有する塩化錫（Ｉ［）組成物の溶液と混 合する。該溶液は酒石酸カリウムナトリウムとフタル酸水素カリウムの混合物を 更に含有し、ｐＨは水酸化ナトリウムを使って約５．６±０．０５に調整され、 生じた溶液は酸素パージされる。あるいは、該溶液が他の塩、例えば塩化ナトリ ウム、酢酸ナトリウム、ゲンチシン酸、またはフッ化第−錫を含んでもよい。釦 （Ｉｆ）塩溶液は無酸素環境下でタンパク質に添加され、タンパク質と５ｎ（Ｉ ［）塩溶液は酸素の非存在下で室温で数時間（通常は２１時間）インキュベート される。あるいは、インキュベーション期間との対応する逆変化を使って、例え ばインキュベーション温度を増加させるとインキュベーション期間を減少させる といったようにして、高いまたは低いインキュベーション温度を使用することが できる。ある種のタンパク質には、反応時間を２１時間未満短縮して抗体タンパ ク質の過剰な断片化を防ぐことができ、タンパク質が既に反応性スルフィド基を 含む場合には更に反応時間を減少させることができる。

あるいは、タンパク質をジスルフィド基還元剤、例えばジチオトレイトール（Ｄ ＴＴ）と共に、水溶液１−あたりタンパク質５■あたり１０■のＤＴＴの比にお いてｐＨ７，５〜９．０で室温にて３０分間インキュベートすることにより、タ ンパク質を一層迅速に還元することができる。任意の手段による精製により還元 剤を除去する。この後、希ＨＣＩを添加してｐＨを５．６±０．０５に低下させ 、次いでｐＨ５，６±０．０５において５ｎ（ＩＩ）酒石酸塩を添加する。

インキュベーション後、タンパク質と５ｎ（ＩＩ）塩溶液を凍結させて還元反応 を停止させるか、または塩類溶液で平衡化されたカラム中の適当なゲルを使って サイズ排除クロマトグラフィーにより精製する。タンパク質および緩衝化された Ｓｎ（■）塩溶液をカラム上に負荷し、塩類溶液を使って溶出させ、溶出液の分 子量をモニタリングし、そして関連する分画を収集する。必要であれば、少量の ５ｎ（ＩＩ）溶液を添加する。放射能標識しようとするタンパク質に該当する分 画を収集し、プールし、限外濾過により濃縮する。あるいは、タンパク質を他の 任意の適当な手段、例えば透析、限外濾過、沈澱、分収用高性能液体クロマトグ ラフィー、アフィニティーりロマトグラフィー、他の形態のクロマトグラフィー 、または分取用等電点電気泳動により精製してもよい。過剰の５ｎ（ＩＩ）溶液 、５ｎ（ｆｆ）塩、汚染物または放射能標識しようとするタンパク質以外の分子 量のタンパク質を実質的に含まない得られたタンパク質を、無酸素バイアル中で 凍結せしめることができる。

精製され還元されそして５ｎ（ＩＩ）複合体形成された凍結タンパク質に、塩類 溶液中の過テクネチウム酸ナトリウムまたは過レニウム酸ナトリウムを還元する ことのできる溶液を、この２溶液の即座混合を防ぐような方法で添加する。純粋 な錫ペレットを各々のバイアルに添加することもできる。得られた２溶液の組合 せは凍結溶液の層として調製されるか、またはそうでなければ、還元され精製さ れそして凍結されたタンパク質と、過テクネチウム酸ナトリウムまたは過レニウ ム酸ナトリウムを還元するための溶液との間の反応を起こすことのないように調 製される。還元され精製されたタンパク質の放射線分解を防ぐために、そして表 面、例えばバイアル壁への還元され精製されたタンパク質の付着を防ぐために、 単体タンパク質を添加してもよい。担体タンパク質、例えば非還元ヒト血清アル ブミンまたは他の不活性希釈剤、例えばイノシトール、または他の不活性な糖も しくはアミノ酸、例えばグリシン、の層を添加し、そして層を凍結させるかまた は他の方法で使用まで他の溶液と混合しないように調製する。

２つの未混合の溶液を含むバイアルから酸素を排気せしめる。

放射能標識を希望する時の再構成まで、このバイアルを凍結保存するかまたは凍 結乾燥して保存する。過テクネチウム酸ナトリウムまたは過レニウム酸ナトリウ ムを還元するための溶液は、塩化第一錫、および酒石酸ナトリウムカリウムとフ タル酸水素カリウムの混合物を含んで成り、ｐｔ＋は水酸化ナトリウムを使って 約５．６±０．０５に調整され、生じた溶液は酸素パージされる。実際には、同 一の５ｎ（Ｉ［）溶液を使ってタンパク質と過テクネチウム酸ナトリウムまたは 過レニウム酸すトリウムの両方を還元することができる。しかしながら、過テク ネチウム酸ナトリウムまたは過レニウム酸ナトリウムを還元するのに使われる５ ｎ（ＩＩ）塩の量および濃度は、タンパク質を還元するのに使われる５ｎ（ＩＩ ）塩の量および濃度よりも実質的に少ない。あるいは、過テクネチウム酸ナトリ ウムまたは過レニウム酸ナトリウムを還元するのに使う溶液は、過テクネチウム 酸ナトリウムまたは過レニウム酸ナトリウムを効率的に還元し且つ放射能標識し ようとするタンパク質を変化させないような任意の物質、例えば酒石酸第一錫、 ホスホン酸第−錫、グルコン酸第−錫、グルコヘプトン酸第−錫、または過テク ネチウム酸塩もしくは過レニウム酸塩を還元することのできる他の物質から成る ことができる。塩化第一錫およびあらゆるそのような他の第一錫化合物を、明細 書および請求項において５ｎ（Ｉ［）と呼称する。過テクネチウム酸ナトリウム または過レニウム酸ナトリウムを還元するのに過テクネチウム酸塩または過レニ ウム酸塩還元溶液以外のものは全く必要でない。これは、主として放射性核種還 元剤の作用によるジスルフィド結合の更なる開裂によって起こりうるタンパク質 分解を防ぐために行われる。

固体の高純度金属錫を、凍結時にまたは凍結後に、酸化されていない錫ペレット の形でバイアルに添加することができる。金属錫の添加は、保存および再構成中 の酸化損失を防ぐことができる。

錫ペレット、担体タンパク質および他の不活性希釈剤と一緒の、得られた還元・ 精製精製された５ｎ（ＩＩ）および硫黄含有タンパク質複合体と放射性核種還元 溶液との凍結または凍結乾燥組合せは、酸素の導入を避けながら、Ｔｅ−９９ｍ 過テクネチウム酸すトリウムまたは過レニウム酸ナトリウム溶液と混合される。

次いでテクネチウムまたはレニウムの還元および還元され５ｎ（ＩＩ）複合体形 成されたタンパク質へのテクネチウムまたはレニウムの結合を考慮して、混合物 をある期間（通常は１５分間）室温でインキュベートする。担体タンパク質がも とのバイアル中に含まれなかった場合には、通常の塩類溶液中のヒト血清アルブ ミンまたは他の同様なタンパク質の添加により、この混合物を安定化することが できる。

従って本発明は、タンパク質を第一の還元剤と共にインキュベートしてジスルフ ィド結合を部分的に還元し、還元され５ｎ（ＩＩ）錯生成されたタンパク質を精 製して過剰の第一の還元剤およびあらゆる不純物を除去し、そして過テクネチウ ム酸塩または過レニウム酸塩を還元するのに必要である分だけの第二の還元剤を 添加することによる、反応性スルフィド基を含むタンパク質をテクネチウムまた はレニウムの放射性核種で放射能標識して安定な標識物を得る方法を提供する。

好ましい第一の還元剤は、約５．０〜６．０のｐｔ＋を育するアルカリ金属フタ ル酸水素塩とアルカリ金属酒石酸塩の混合物から成る溶液中の５ｎ（Ｉｔ）源で ある。第一の還元剤は２−メルカプトエタノール、■、４−ジチオトレイトール 、２，３−ジヒドロキシブタン−１，４−ジチオール、２−アミノエタンチオー ルＨＣＩ塩、２−メルカプトエチルアミン、チオグリコレート、シアニド、シス ティン、またはジスルフィド結合を還元することのできる他の物質である。次い で５ｎ（Ｉｆ）を添加して中間体の釦（Ｉｎ）および硫黄含有複合体を形成せし める。

好ましい第二の還元剤は、好ましくは約５．０〜６，０のｐＨを有するアルカリ 金属フタル酸水素塩とアルカリ金属酒石酸塩の混合物から成る溶液中の５ｎ（Ｉ Ｆ）源である。第二の還元剤は酒石酸５ｎ（Ｉ［）、グルコン酸５ｎ（ＩＩ）　 、グルコヘプトン酸５ｎ（Ｉｔ）　、ホスホン酸釦（■）、ジチオニット、また は過テクネチウム酸塩もしくは過レニウム酸塩を還元することのできる他の物質 であってもよい。タンパク質複合体の精製後、精製されたタンパク質複合体を凍 結させ、第二の還元剤を添加し、そして使用のために解凍する前に精製タンパク 質複合体と第二の還元剤との間で化学反応が起こらないように第二の還元剤を即 座に凍結させる。タンパク質複合体と第二の還元剤の凍結後、該組成物を凍結乾 燥することも可能である。

第二の還元剤の添加時またはその後、タンパク質複合体と第二の還元剤との組合 せに、酸化されていない固体の金属錫を添加することができる。タンパク質複合 体をサイズ排除クロマトグラフィーカラムに通過させることにより、または脱塩 カラム、透析、限外濾過、沈澱、分取用高性能液体クロマトグラフィー、アフィ ニティークロマトグラフィーもしくは分取用等電点電気泳動の使用により精製を 行うことができる。

タンパク質複合体と第二の還元剤中のタンパク質の濃度が少なくとも１■／−溶 液であり、そしてタンパク質複合体と第二の還元剤の容量が少なくとも２ｍｔ’ である時、最適な結果が得られる。

本発明は、テクネチウムまたはレニウムの放射性核種の安定な標識を有するタン パク質を調製する際の使用に適する組成物を提供する。この組成物は、放射性核 種および硫黄含有複合体を形成することができるように還元されているタンパク 質：該タンパク質の更なる還元を引き起こすことなく過テクネチウム酸塩または 過レニウム酸塩を還元するであろう分だけの過テクネチウム酸塩または過レニウ ム酸塩還元用５ｎ（Ｉ［）含有化合物：および所望により、酸化されていない純 粋な金属錫を含んで成る。酸化されていない純粋な金属錫の源は錫ペレットであ ることができる。該組成物は還元されたタンパク質として還元された抗体または 抗体断片を使って作製することができる。不活性な担体物質、例えば不活性なま たは還元されない不活性なタンパク質を組成物に追加してもよい。該組成物は凍 結され、好ましくは４〜６のｐ）ｆに緩衝化される。

必要であれば安定剤と共に、ｆ＊ｉ！された５ｎ（Ｉｆ）および硫黄含有複合体 と放射性核種還元溶液との凍結または凍結乾燥組合せを単一の無酸素バイアル中 に含む、放射能標識にすぐ使用できるキットも提供される。

モノスルフィドまたはジスルフィド結合を有するタンパク質は、第一の５ｎ（Ｉ Ｉ）剤または上述したような他の還元剤とのインキュベーションにより放射性核 種、例えばテクネチウムまたはレニウムで放射能標識することができる。インキ ュベーション期間は、５ｎ（ＩＩ）および硫黄含有複合体の形成を可能にするほ ど十分でなければならない。複合体形成の結果として、５ｎ（ＩＶ）反応副生成 物、例えば塩化第二錫、および他の不純物、例えばタンパク質断片または重合体 が形成され得る。次いで精製段階を使って５ｎ（ＩＶ）および他の不純物を実質 的に除去する。次いで５ｎ（Ｉｆ）および硫黄含有タンパク質複合体に、放射性 核種を還元するのに十分な量の第二の５ｋ１（ＩＩ）剤を添加する。放射能標識 物を添加することにより放射能標識を行い、それによって第二の５ｎ（ＩＩ）剤 が放射性核種を還元し、そして還元された放射性核種がタンパク質中で放射性核 種および硫黄含有複合体を形成する。

放射能標識は、第二の５ｎ（ＩＩ）剤の添加の段階を省略することによって行う こともできる。この場合、残りの第一の５ｎ（ＩＩ）剤が放射性核種を還元し、 そして還元された放射性核種がタンパク質中で放射性核種および硫黄含有複合体 を形成する。これは、５ｎ（ＩＩ）および硫黄含有タンパク質複合体を形成せし めた後に反応混合物を希釈することによって行うこともできる。

それらの方法は、特に過テクネチウム酸ナトリウムの形のテクネチウム−９９０ １に適用可能である。第一の５ｎ（ＩＩ）剤も第二の５ｎ（ＩＦ）剤も、最適に は５．０〜６．０のｐＨを有するアルカリ金属酒石酸塩を含む溶液中に存在する 。第二の５ｎ（ＩＩ）剤は、グルコヘプトン酸第−錫、グルコン酸第−錫、ホス ホン酸第−錫、ジチオニットといった物質、または放射性核種を還元することの できる他の物質から成ることもできる。

それらの方法は、特にモノクローナル抗体、モノクローナル抗体断片およびポリ クローナル抗体に適用可能である。この方法を使って生成物を製造することがで き、過テクネチウム酸ナトリウムまたは過レニウム酸ナトリウムの導入およびイ ンキュベーション期間によりテクネチウムまたはレニウムで放射能標識した時の 生成物が、８５％またはそれ以上のタンパク質に強力に結合したテクネチウムま たはレニウムを有することにより更に特徴づけられる。更に、モノクローナル抗 体またはモノクローナル抗体断片を使って生成物を作る時、該生成物の免疫反応 性は、第一の５ｎ（ＩＩ）剤とのインキュベーション前の抗体の免疫反応性と実 質的に同じである。生成物は凍結乾燥することができ、そして患者への生体内投 与前に濾過または精製を必要としない。

モノスルフィドまたはジスルフィド結合を有するタンパク質は、上記方法の変形 を使ってテクネチウムまたはレニウムのような放射性核種で放射能標識すること もできる。タンパク質を第一の５ｎ（Ｉ［）剤（これは上記と同様であってもよ い）と共にインキュベートする。インキュベーション期間は５ｎ（ＩＩ）および 硫黄含有複合体の形成を可能にするのに十分でなければならない。複合体形成の 結果として、５ｎ（ｆｆ）反応副生成物および他の不純物が形成され得る。次い で５ｎ（ＩＶ）反応副生成物をポリアミノカルボン酸、例えばエチレンジアミン 四酢酸（ＥＤＴＡ）またはジエチレントリアミノペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）と錯生 成させることができる。放射性核種を添加することによって放射能標識が行われ 、これによって残余の第一の５ｎ（Ｉ［）剤が放射性核種を還元し、そして還元 された放射性核種がタンパク質中で放射性核種および硫黄含有複合体を形成する 。

放射能標識は、最適には、ポリアミノカルボン酸のような錯生成剤の添加後、放 射性核種の還元を促進するために、第二の５ｎ（ＩＩ）剤の添加によって行うこ とができる。

ポリアミノカルボン酸を使った方法は、特に過テクネチウム酸ナトリウムの形の テクネチウム−９９ｎ＋に適用可能である。

好ましくは、第一の５ｎ（ＩＩ）剤も第二の釦（ＩＩ）剤も両方とも、５．０〜 ６．０のｐｔｔのアルカリ金属酒石酸塩を含む溶液中に存在する。第二の５ｎ（ Ｉ［）剤は、グルコヘプトン酸第−錫、グルコン酸第−錫、ホスホン酸第−錫と いった物質、または放射性を還元することのできる他の物質から成ることもでき る。

ポリアミノカルボン酸を使った方法は、特にモノクローナル抗体、モノクローナ ル抗体断片およびポリクローナル抗体に適用可能である。この方法は、過テクネ チウム酸ナトリウムまたは過レニウム酸ナトリウムの導入およびインキュベーシ ョン期間によりテクネチウムまたはレニウムで放射能標識した時の生成物が８５ ％またはそれ以上のタンパク質に強力に結合したテクネチウムまたはレニウムを 有することにより更に特徴づけられる生成物を製造するのに用いることができる 。

更に、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体断片を使って生成物を作る 時、該生成物の免疫反応性は、第一の５ｎ（ＩＩ）剤とのインキュベーション前 の抗体の免疫反応性と実質的に同じである。生成物は凍結乾燥することができ、 そして患者への生体内投与前に濾過または精製を必要としない。

上記方法は全て、５ｎ（ＩＩ）と錯生成した反応性スルフィド基を含んで成る５ ｎ（ＩＩ）および硫黄含有複合体が認められるタンパク様組成物をもたらし、該 組成物はテクネチウムおよびレニウムといった放射性核種での放射能標識に適当 である。

この組成物は、放射性核種を還元するのに十分な量の５ｎ（ＩＩ）還元剤も含ん で成ることができ、そして錯生成剤、好ましくはポリアミノカルボン酸、例えば ＥＤＴＡまたはＤＴＰＡを更に含んでもよい。タンパク質はモノクローナル抗体 、モノクローナル抗体断片またはポリクローナル抗体であることができ、そして 生成物に変換することができる。生成物は凍結乾燥することができる。過テクネ チウム酸ナトリウムの導入およびインキュベーション期間によりテクネチウムで 標識する場合、生成物がタンパク質に強力に結合した８５％またはそれ以上のテ クネチウムを有することにより更に特徴づけられる。それは１５分間またはそれ 未満のインキュベーション期間を必要とすることによっても更に特徴づけられる 。

従って、本発明の目的は、テクネチウムまたはレニウムでのタンパク質の直接標 識方法を提供することであり、該方法は最終生成物から望ましくない断片または 分解されたタンパク質成分を排除するであろう。

本発明の他の目的は、放射性同位体としてテクネチウムまたはレニウムを使った 放射能標識効率の増加をもたらす方法を提供することである。

本発明の更なる目的は、放射能標識工程によって抗体または抗体断片の親和力の 低下を引き起こすことなく、抗体または抗体断片を放射能標識する方法を提供す ることである。

本発明の更なる目的は、潜在的に毒性のまたは危険な化学物質を方法に使用しな い、テクネチウムまたはレニウムでタンパク質を標識する方法を提供することで ある。

本発明の他の目的は、還元された抗体と第一錫イオンの両方を含有し、そして酸 化損失に対して保護する一方で少量の第一錫イオンを維持するための手段を更に 含有する単一バイアルを使って、最終使用者により放射能標識を行うことを可能 にする方法およびキットを提供することである。該方法は放射能標識を行うのに 一段階のみを必要とし、即ち過テクネチウム酸ナトリウムの導入の段階のみを必 要とする。

本発明の他の目的、利点および新規特徴並びに更なる適用可能性の範囲は、一部 分は下記の詳細な記載においてそして一部分は下記を吟味する時に当業者に明ら かとなるであろうし、または本発明の実施によりわかるであろう。本発明の目的 および利点は、添付の請求の範囲において特に指摘される手段および組合せを使 って実現および達成することができる。

還元され得るｌもしくは複数のモノスルフィドもしくはジスルフィド結合を含む 任意のタンパク質、キレート剤または他の基質を、本発明に従って放射能標識す ることができる。

代表的な適当な基質としては、いずれかの源の、ヒト血清アルブミン、フィブリ ノーゲン、ウロギーーゼ、γ−グロブリン、糖タンパク質、他のタンパク質およ び抗体、または抗体断片が挙げられ、そして任意の手段により作製されたポリク ローナル抗体およびモノクローナル抗体、並びにキメラ抗体および遺伝子操作さ れた抗体、並びに上記の全ての抗体断片が挙げられる。これにはヒトを含む任意 の種起源の任意のクラスの免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、　（ｇＭ、　！ｇＡ 、　［ｇＤまたはＩｇＭ　、二または複数の抗原もしくはエピトープ特異性を有 するキメラ抗体またはハイブリット抗体、および上記の全ての断片、例えばＦ（ ａｂ’）ｚ、　Ｆ（ａｂ）ｚ、　Ｆａｂ’、　Ｆａｂ、および他の断片、例えば ハイブリッド断片が挙げられ、そして更に任意の免疫グロブリンまたは、特異的 抗原と結合して複合体を形成することにより機能的に抗体のように振る舞う任意 の天然の、合成のもしくは遺伝子操作されたタンパク質が挙げられる。本明細書 および請求の範囲を通して使用される「抗体」なる用語および「モノクローナル 抗体成分」なる用語は、そのような抗体および抗体断片を全て含むものを意味す る。

精製段階および付随の過剰な還元剤の除去の包括から、本発明は多数の有意な利 点を育する。放射能標識しようとするタンパク質以外のあらゆる種の還元された タンパク質（大きいまたは小さい分子量種を含む）の除去により、還元されたＴ ｃ−９９ｍを目当てにした競合が排除される。これは有意に高い放射能標識収率 をもたらす。過テクネチウム酸塩または過レニウム酸塩還元溶液中の第一錫イオ ンおよび第二錫イオンの総量をできるだけ低く維持することにより、追加の還元 されたタンパク質種の形成が最小限にされる。通常、タンパク質中のジスルフィ ド結合を還元するのに要するよりもずっと少量の第一錫イオンが過テクネチウム 酸塩または過レニウム酸塩を還元するのに必要であり、従って放射能標識しよう とするタンパク質中のジスルフィドの追加の還元なしに過テクネチウム酸塩また は過レニウム酸塩の還元を可能にする。この追加の還元は放射能標識しようとす るタンパク質以外のタンパク質種を生成し得る。

本発明は、最終使用者が放射能標識を行うのに一段階のみ、即ち過テクネチウム 酸ナトリウムまたは過レニウム酸ナトリウムの添加および付随のインキュベーシ ョンの段階のみを必要とするので、有意な利点を有する。この有意な単純化は、 第一錫イオンと還元された抗体の両方が担体タンパク質および他の不活性希釈剤 と一緒に同一パイアル中で凍結され、所望により凍結乾燥されるので、可能であ る。錫ペレットまたは別の源の精製された酸化されていない金属錫の添加は、低 濃度の第一錫イオンを保存しそして貯蔵または再構成中の酸化による放射能標識 の損失を防ぐのに役立つ。

本発明を次の非限定例により更に説明する。

実施例■ 酒石酸塩−フタル酸塩溶液中の塩化第一錫から成る５ｎ（ＩＩ）還元溶液を作製 した。塩化第一錫は、濃塩酸中に塩化第一錫結晶を０．５Ｍになるように溶解し 、１７ｎｌあたり約９４．８■の塩化第一錫の溶液を得た。使用するまでこの溶 液を密閉され窒素でパージされたバイアル中で保存した。塩化第一錫の他の源を 使うこともでき、例えば濃塩酸と接触させた酸化されていない固体の錫ベレット を使用することができる。

酒石酸カリウムナトリウムとフタル酸水素カリウムの混合物の酒石酸塩−フタル 酸塩溶液を調製した。０．２８２ｇの酒石酸カリウムナトリウムを１００１ｎｌ の蒸留水に溶解し、これに０．８１７ｇのフタル酸水素カリウムを添加した。Ｉ ＯＮ水酸化ナトリウムを使ってｐＨを約５．０に調整し、次いでＩＮ水酸化ナト リウムを使ってｐ［（を５．６±０．０５に調整した。得られた溶液を攪拌し、 そして不活性ガス、例えば窒素、ヘリウム等をバブリングすることによりこの物 質から酸素をパージした。

パージされた酒石酸塩−フタル酸塩溶液の一部をフラスコ中に測り取り、それに 一定量の塩化第一錫をゆっくり添加することにより、５ｎ（Ｉ［）還元溶液を作 製した。塩化第一錫を該溶液に添加する時に攪拌捧または類似の機械を使って攪 拌して塩化第一錫の混合を確実にすることが好ましい。１００容の緩衝液に対し て約１容の塩化第一錫を使った。ｐＨを連続してモニタリングし、塩化第一錫が 添加されたら、ＩＯＮ水酸化ナトリウムを使ってｐＨを約５．０に調整し、次い でＩＮ水酸化ナトリウムを使ってｐＨを５．６±０．０５に調整した。

全ての段階は無酸素環境下で行われ、溶液に不活性ガスをバブリングしながら行 ってもよい。得られた溶液に不活性ガス、例えば窒素、ヘリウム等をバブリング することによりこの物質から酸素をパージする。

あるいは、別のジスルフィド還元剤、例えば２−メルカプトエタノール、１，４ −ジチオトレイトール、２，３−ジヒドロキシブタン−１，４−ジチオール、２ −アミノエタンチオールｆ（ＣＩ、２−メルカプトエチルアミン、チオグリコレ ート、シアニド、システィンまたは他のジスルフィド開裂試薬を使って抗体還元 用溶液を作製することができる。

還元しようとするタンパク質を窒素でパージされた密閉バイアル中に入れる。モ ノクローナル抗体またはその断片を標識しようとする場合、最少で０．１■、好 ましくは少なくとも２■のモノクローナル抗体またはその断片を、１■／ｄまた はそれ以上、好ましくは１．７■／ｍｌの濃度で使用する。モノクローナル抗体 、断片または他のタンパク質は通常の塩類溶液中に希釈することができ、または 必要であるなら限外濾過により濃縮することができる。３容のタンパク質対２容 の５ｎ（Ｉ［）還元溶液のおよその比において、タンパク質に５ｎ（ＩＩ）還元 溶液を添加する。次いでタンパク質と５ｎ（ＩＩ）還元溶液とを含むバイアルを 、好ましくは無酸素環境中で、例えば窒素または他の不活性ガスが充填された容 器中で、インキュベートする。タンパク質中のジスルフィド結合の還元を可能に するのに十分な時間室温でバイアルをインキュベートする。

通常、室温で１〜２４時間のインキュベーションが適当であり、大部分の完全免 疫グロブリンについては室温で２１時間のインキュベーションが好ましい。温度 を高くすればインキュベーション時間が減少し、逆に、低温でのインキュベーシ ョンはそれに応じて長いインキュベーション時間を必要とする。タンパク質と釦 （Ｉ［）還元溶液の混合物を凍結させるか、希釈するか、またはすぐに精製に入 ることによってインキュベーションを終了させる。

別の還元剤、例えば２−メルカプトエタノール、１．　４−ジチオトレイトール 、２，３−ジヒドロキシブタン−１，４−ジチオール、２−アミノエタンチオー ルＨＣＩ、２−メルカプトエチルアミン、チオグリコレート、シアニド、システ ィンまたは他のジスルフィド開裂試薬を使用する時、インキュベーション時間は 使用する特定の還元剤に合わせて調整しなければならない。一般により短いイン キュベーション時間が要求される。還元溶液を除去した後、５ｎ（Ｉ［）塩を添 加して５ｎ（ＩＩ）および硫黄含有複合体を形成せしめ、それによって還元され たジスルフィド基を次の精製段階の間保存する。それらの還元剤を使って行った 精製段階は実質的に全ての還元剤を除去しなければならない。

タンパク質と５ｎ（ＩＦ）還元溶液または他の還元溶液との混合物は、好ましく はサイズ排除クロマトグラフィーによって精製される。カラムには適当なゲル、 例えば低分子量モノクローナル抗体Ｆ（ａｂ’）ｚ断片の使用には、例えば５ｅ ｐｈａｃｒｙｌ−２００ゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、 　ＮＪ）が充填される。カラムを適当な溶出緩衝液、例えばゲンチシン酸塩緩衝 化塩溶液で平衡化する。タンパク質と還元溶液の混合物をカラムに適用し、溶出 緩衝液を使って分画する。紫外検出器または同様な装置を使って分画プロフィー ルを得、そして放射能標識しようとするタンパク質を含む分画を収集し、プール する。得られた還元されたタンパク質を、必要であれば、好ましくは１．７■／ ｄの濃度に濃縮する。ａ給は限外濾過によって行うことができる。得られた濃縮 物を通常の塩類溶液に対して透析して残余の５ｎ（ＩＶ）塩または他の残余の還 元剤を除去することも可能である。

あるいは、５ｎ（ＩＩ）および硫黄含有タンパク質複合体と５ｎ（ＩＩ）還元溶 液または他の還元溶液との混合物は、脱塩カラムに該混合物を通し、還元された タンパク質を収集し、そして５ｎ（ＩＶ）塩および過剰の還元剤を除去すること により精製することができる。必要なら得られた溶出液を濃縮しそして透析する ことができる。この方法は、過剰の５ｎ（ＩＩ）溶液、５ｎ（Ｎ）反応副生成物 および他の還元試薬を除去するであろうが、必ずしも他の不純物、例えばタンパ ク質中のジスルフィド結合の過剰還元から生じるタンパク質の小断片、または還 元されたタンパク質の凝集物を除去するわけではない。それらの小断片または大 凝集物は、モノクローナル抗体の場合、免疫反応性でないことがあり、または所 望のタンパク質のものとは異なった生体分布を有することがあり、最終生成物か ら除去する必要がある。

あるいは、還元されたタンパク質と５ｎ（ＩＩ）還元溶液または他の還元溶液と の混合物は、外の手段により、例えば透析、限外濾過、沈澱、分取用高性能クロ マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、他の形態のクロマトグラ フィー、分取用等電点電気泳動、および当業界で常用される他の精製手段により 、精製してもよい。

還元され５ｎ（ＩＩ）と複合体形成され精製されたタンパク質を、好ましくは窒 素のような不活性ガスを溶液にバブリングすることにより酸素をパージし、そし て無酸素バイアル中で凍結させることができる。凍結されたタンパク質溶液を含 む各バイアルに、過テクネチウム酸塩還元溶液を添加し、そして凍結されたタン パク質溶液と過テクネチウム酸塩還元溶液との間で反応が起こらないように内容 物を即座に凍結または凍結乾燥せしめる。酸化されていない錫ペレットをこのバ イアルに添加してもよい。この錫ペレットは極微量の５ｎ（Ｉ［）に取って代わ り、そして過テクネチウム酸塩還元溶液中の低濃度の第一錫イオンを安定化する のに役立ち、更に放射能標識生成物の貯蔵中の再酸化による放射能標識の損失を 防ぐのに役立つだろう。過テクネチウム酸塩還元溶液は、約１容の０．５Ｍ塩化 第一錫を約５．０００容の酒石酸塩−フタル酸塩溶液に添加し、約０．１　ミリ モルの過テクネチウム酸塩還元溶液を得ること以外は、５ｎ（Ｉ［）還元溶液と 同様にして作製した。

約１容の過テクネチウム酸塩還元溶液を２容の還元され５ｎ（Ｉｆ）と複合体形 成され精製されたタンパク質溶液に添加する。最適には、タンパク質溶液が約１ ．７■／−であり、そして還元され５ｎ（ＩＩ）と複合体形成され精製されたタ ンパク質溶液各１．３２ｒＩｄ！に、約０．６８ｍ７’の過テクネチウム酸塩還 元溶液を添加する。

あるいは、グルコヘプトン酸５ｎ（ＩＩ）　、酒石酸５ｎ（ＩＩ）、ホスホン酸 ５ｎ（ＩＦ）　、ジチオニットおよび他の常用されるＴｅ−９９ｍ放射性医薬キ ットを使って、過テクネチウム酸塩還元溶液を作製することができる。

過テクネチウム酸塩還元溶液は過レニウム酸塩を還元するのにも使用することが できる。本明細書を通した過テクネチウム酸塩および過レニウム酸塩化合物の記 載は、過レニウム酸塩および過テクネチウム酸塩にも適用することができる。

同様に、本明細書を通したテクネチウムおよびそれの化合物の記載は、レニウム およびそれの化合物に適用することができる。

放射能標識するためには、所望の活性の過テクネチウム酸ナトリウム−Ｔｅ−９ ９ｍを添加し、混合し、そして混合物をある期間、通常は約１５分間、インキュ ベ−１・する。この段階は、大気中の酸素の導入を避けながらまたは最小にしな がら行われる。所望であれば、通常の塩類溶液中の１％ヒ）・血清アルブミンま たは他の適当な保護タンパク質の添加により、得られた放射能標識タンパク質を 安定化することができる。

テクネチウム−Ｔｅ−９９ｍの源は、従来９９Ｍｏ／９９ｍＴｃ発生器から過テ クネチウム酸ナトリウム−Ｔｃ−９９ｍとして得られる。本発明では任意の源の 医薬上許容されるテクネチウム−Ｔｅ−９９ｍ源を使用することができる。

あるいはテクネチウムの他の放射性同位体およびレニウムの同位体、例えばＲｅ −１８６およびＲｅ−１８８を使用してもよい。過テクネチウム酸塩よりもむし ろ過レニウム酸塩を還元する時、通常は反応を完了させるためにより高温および より長い放射能標識時間を必要とする。

実施例■ この実施例は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を標識するための本発明の方法を例 示する。ＩｇＧは、ヒツジ、ヤギ、マウスまたはヒトといった動物から得られる 。過テクネチウム酸ナトリウム−Ｔｃ−９９ｍ　Ｕ、Ｓ、Ｐ、は任意の商業的入 手源から得られる。

濃ＨＣＩ　（１２Ｍ）中の０．５Ｍ塩化第一錫０．２−を４０ｍＭ７タル酸水素 カリウムおよび１０ｍＭ酒石酸ナトリウムの溶液（ｐＨ５，６）２０ｍ７７に添 加することにより、５ｎ（ＩＩ）ジスルフィド結合還元剤を調製した。曇った色 の酸化第一錫を含まない表面を有する酸化されていない５ｎＣＩ、ペレットに濃 塩酸を添加することにより、塩化第一錫溶液を１１！また。次いで得られた還元 溶液のｐＨをＩＯＭ　ＮａＯＨの添加により５．５に調整し、そしてＩＭＮａＯ Ｈの添加により最終のｐＨ５，６±０．０５に調整した。

０．２５−の免疫グロブリン（ヒト）　Ｕ、Ｓ、Ｐ、（Ｃｕｔｔｅｒ　Ｂｉｏｌ ｏｇｉｃａｌ；タンパク質含量１５−１８％、　０．２１−０．３２　Ｍのグリ シンで安定化されている）を７．２５ＴＩＬｌの注射用蒸留水Ｕ、　Ｓ、　Ｐ、 で希釈し、そして０．２２ミクロンのフィルターに通して濾過することにより、 ＩｇＧ製剤を調製した。５−の５ｎ（Ｉ［）還元溶液を７．５−のＩｇＧ製剤と 混合した。混合溶液を含むバイアルを封管し、酸素を除去するためにＮ２ガスで フラッシュした。この混合溶液を遮光下で室温にて２１時間保存してジスルフィ ド結合の部分還元を許容し、以後還元されたタンパク質と呼称されるものを形成 せしめた。２１時間インキュベーション後、バイアルの内容物をＰＤ−１０脱塩 カラム（Ｐｈａｒｏ＋ａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。

Ｐｉｓｅａｔａｗａｙ、　ＮＪ）に通し、タンパク質含有分画を収集し、そして ５ｎ（ＩＩ）、　５ｎ（ＩＶ）および他の塩を含む残りの溶出液を捨てた。還元 され５ｎ（ＩＩ）と　複合体形成されたタンパク質分画を限外濾過により１．７ ■／ｄの濃度に濃縮した。還元され５ｎ（Ｉ［）複合体形成されたタンパク質の ０．５■アリコートを、Ｎ２ガス充填され封管された血清バイアル中にいれ、凍 結させた。ｐＨ５，６の４０ｍＭフタル酸水素カリウム／１０ｄ酒石酸ナトリウ ム中の０．１ｄ　５ｎＣ１ｚ　０．５−から５ｎ（ＩＩ）過テクネチウム酸塩還 元溶液を作製した。還元された抗体を解凍させることな（，５ｎ（ＩＩ）過テク ネチウム酸塩還元溶液を添加し、この溶液を再度凍結させた。無菌の直径３ｍｏ ｘの金属錫を添加し、バイアルをＮ２でフラッシュし、そして放射能標識に必要 になるまで一２０°Ｃで保存した。

ガンマグロブリン製剤をＴｃ−９９ｍで放射能標識するために、２．５ｍＣｘの 放射能を含む過テクネチウム酸ナトリウム−Ｔｃ−９９ｍＵ、Ｓ、Ｐ、　１．０ ｒｎｌをバイアルに添加し、そしてバイアルと内容物を室温に戻し、混合し、１ ５分間放置しておいた。生成物の薄層クロマトグラフィー分析は、放射能の９９ ．６％がタンパク質に結合していることを示した。ＵＶとラジオアイソトープ検 出器の両方を使った高性能液体クロマトグラフィーは、Ｔｃ−９９ｍ溶出がタン パク質溶出プロフィールと平行であることを示した。

実施例■ この実施例は、ＩｇＧおよび１ｇＭクラスのモノクローナル抗体を標識するため の本発明の方法を例示する。該抗体をマウス腹水またはバイオリアクター液から 得、９５％以上に精製し、そして０．９％ＮａＣｌ溶液中１■／−より高い濃度 に調製した。

実施例■と同様にして５ｎ（Ｉｆ）還元溶液を調製した。２種類の完全抗体調製 物、即ちＩｇＧマウス抗体８７２．３およびＩｇＭマウス抗体抗５ＳＥＡ−１を 試験した。各抗体調製物は１６７■／−のタンパク質濃度であった。精製タンパ ク質溶液各１−にＣＬ　６６ｍｔ’の５ｎ（ＩＦ）還元溶液を添加した。実施例 ■と同様に混合溶液をインキュベートし、ＰＤ−１０カラムに通した。還元され たタンパク質分画を限外濾過により２■／−の濃度に濃縮した。０．５〜２．０ ■のタンパク質を含む還元タンパク質のアリコートを、Ｎ２ガス充填され封管さ れた血清バイアルに入れ、凍結させた。

５０■のゲンチシン酸、０．３７５μＨの５ｕＣ１ｔおよび９７５μｇの酒石酸 カリウムナトリウムを、Ｎ２ガスを２〜３分間バブリングさせることにより予め 脱酸素されている蒸留水５０−に溶解することにより、過テクネチウム酸塩還元 溶液を調製した。

非常に希薄な（０，０５Ｍ）　ＮａＯＨの添加によりｐｆ（を７．０に調製した 。同容量のこの溶液を、還元され５ｎ（Ｉｆ）複合体形成され凍結されたタンパ ク質溶液の上に重層し、この溶液を凍結させた。無菌の直径３ＩＩ！Ｉの錫金属 シタットを添加し、バイアルにＮ２ガスをフラッシュし、そして放射能標識に必 要になるまで一２０℃で保存した。

■ｇＧまたは［ｇＭ製剤をτｃ−９９ｍで放射能標識するために、２．５ｍｃｉ の放射能を含む過テクネチウム酸ナトリウム−Ｔｃ−９９ｍ、　ｕ、ｓ、ｐ、　 １．０−を各バイアルに添加し、そしてバイアルと内容物を室温に戻し、混合し 、１５分間放置しておいた。生成物の薄層クロマトグラフィー分析は、放射能の ９０．０％〜９６．５％がタンパク質に結合していることを示した。ＵＶとラジ オアイソトープ検出器の両方を使った高性能液体クロマトグラフィーは、ＴＣ− ９９ｍ溶出がタンパク質溶出プロフィールと平行であることを示した。ＨＰＬＣ 分析によりタンパク質に結合していない放射能は検出されなかった。

実施例■ この実施例はモノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）ｚ断片を標識するための本発明 の方法を例示する。この実施例は、放射能標識生成物の組成が、使用する方法と ジスルフィド結合還元試薬の種類によって異なることも示す。この実施例は、本 方法が、この特定のモノクローナル抗体断片については、“ＭＥＴＨＯＤ　ＦＯ ＲＲＡＤＩＯＬＡＢＥＬＩＮＧ　ＰＲＯＴＥＩＮＳ　ＷＩＴＨＴＥＣＨＮＥＴ［ ＵＭ−９９Ｍ“という名称のＣｒｏｅｋｆｏｒｄおよびＲｈｏｄｅｓの米国特許 第４．４２４．２００号の初期の直接標識法よりも優れていることも示す。Ｆ（ ａｂ’）ｚ断片は、マウスモノクローナル抗体のペプシン消化後、ペプシン消化 物中に認められる他の物質からＦ（ａｂ’）ｚ断片を分離するクロマトグラフィ ー精製により、９５％より高い純度で得られた。

この実施例で使用するモノクローナル抗体は５ｏｒｉｎ　Ｂｉｏ−ｔｅｅｈｎｉ ｅａ、　Ｉｔａｌｙから入手した。それは予備実験によって予備はんだ法を使っ た非常に乏しいＴｃ−９９＋＋＋放射能標識が示されているマウス抗−ＣＥＡ　 Ｆ（ａｂ’　）２であった。

４つの異なる放射能標識方法を使った。１つは米国特許第４、４２４．２００号 に記載された初期の予備はんだ法であり、その他の３つは本発明において教示さ れる方法を使った。それらの４つの方法は下記のように要約することができる。

１、米国特許第４．４２４．２００号に記載された初期の予備はんだ法であり、 実施例■に記載のように５ｎ（ＩＩ）還元溶液を調製したが、精製段階を使用せ ず、そして過テクネチウム酸塩還元溶液を添加しなかった。

Ｚ　実施例■に記載のように抗体断片中のジスルフィド結合を還元するのに５ｎ （Ｉ［）還元溶液を使い、第一錫塩と錫ペレットから成る過テクネチウム酸塩還 元溶液を使用し、ＰＤ−１０脱塩カラムを使った精製段階を含む本発明の方法。

３、　抗体断片中のジスルフィド結合を還元するのに２−メルカプトエタノール を使った本発明の方法。２−メルカプトエタノールの５％溶液をｐＨ８，０の０ ．１Ｍリン酸緩衝液中に調製した。この溶液ｌ−を凍結乾燥された抗体断片タン パク質１■に添加し、混合して溶解させた。室温で１時間インキュベーション後 、１．６−の塩溶液を添加し、そしてＰＤ−１０脱塩カラムに通すことにより溶 液中の他の成分から部分還元タンパク質を分離した。このタンパク質を限外濾過 により１．７■／ｉに濃縮した。次いで実施例■に記載のような第一錫塩と錫ベ レットとから成る過テクネチウム酸塩還元溶液を適用し４、抗体断片中のジスル フィド結合を還元するのにジチオトレイトールを使った本発明の方法。１５．４ ■のｄｉ−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓおよび１ｍＭ　 ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０の溶液１０−に溶解した。還元しようとするタンパク質 １■につき、０、３３ｍ７’の還元溶液を添加し、混合してタンパク質を溶解さ せた。還元混合物を３７℃で１時間反応させた。部分還元されたタンパク質をサ イズ排除クロマトグラフィーにより精製し、そしてもとのＦ（ａｂ’）を抗体断 片の分子量に相当するタンパク質分画を収集した。クロマトグラフィー精製断片 を限外濾過により０．９％食塩溶液中１．７■／ｒｒｄ！に濃縮した。次いで実 施例■に記載の第一錫塩と錫ペレットとから成る過テクネチウム酸塩還元溶液を 適用した。

この４つの調製物それぞれについて、凍結されバイアルに入れられた抗体断片を 放射能標識し、実施例■に記載のようにして試験した。同一の抗体断片を使った ４つの異なる方法の結果を表１に要約する。

表１は、精製段階を含まず、限定された量の過テクネチウム酸塩還元溶液の添加 も含まない米国特許第４．４２４．２００号に開示された最初の予備はんだ法を 使った時、この特定のＦ（ａｂ’）ｔマウスモノクローナル抗体断片を効率的に 放射能標識することができなかったが、本発明の方法を使った時、特にジスルフ ィド結合を還元するのに５ｎ（Ｉ［）以外の剤を使った時、該抗体断片が効率的 に放射能標識されたことを示す。

同じ過テクネチウム酸塩還元剤、ここでは５ｎ（Ｉ［）　、を各方法に使用した 。８５％より高い結合を得るように操作条件を最適化しなかつた。比較の目的は 、本発明の方法を使うことにより結合がどれくらい大幅に改善されるかを示すこ とであった。

実施例Ｖ この実施例は、従来の直接もしくは予備はんだ法によりまたは他の同等な直接標 識法により上手く標識することができないモノクローナル抗体を標識するための 本発明の方法を例示する。成る種のモノクローナル抗体を用いた以前の直接標識 法の失敗の原因は、抗体の還元中に抗体の断片化または凝集が起こり、これが異 なった分子量のタンパク質種を生成するためであった。この例は、５ｏｒｉｎ　 Ｂｉｏｍｅｄｉａ、　Ｉｔａｌｙにより提供される抗−ＣＥＡマウスモノクロー ナル［ｇＧである。この抗体を５ｎ（ＩＩ）塩で還元すると、還元されたＴｃ− ９９ｍで優先的に標識される少量の断片が形成される。この抗体をジチオトレイ トールまたは２−メルカプトエタノールで還元すると、還元されたＩｇＧの二量 体またはポリマーが形成され、これもＴｅ−９９ｍで標識される。本発明の方法 では、ジスルフィド結合還元段階の後、サイズ排除クロマトグラフィーカラムへ の通過により抗体が精製される。もとの抗体の分子量にのみ相当するカラム溶出 液は、より小さいまたは大きいタンパク質種から分離されている。過テクネチウ ム酸ナトリウムを還元するのには十分であるが抗体中のジスルフィド結合を更に 還元しないような量の過テクネチウム酸塩還元溶液を添加し、抗体を放射能標識 した。得られたＴｅ−９９ｍ標識タンパク質は正しい分子量のものであり、それ より小さいまたは大きい分子量の汚染物を含まなかった。

実施例■ この実施例は高いＨＰＬＣ収率を得るための精製およびＥＤＴＡの使用を例示す る。

キメラＩｇＧモノクローナル抗体の４つの了りコートを実施例■と同様にしてＳ ｎ（π）還元剤で還元した。２つのアリコートをＰＤ−１０カラムへの通過によ り精製した後、５ｎ（ＩＩ）過テクネチウム酸塩還元溶液を添加した。残りの２ つのアリコートは精製せず、追加の５ｎ（ＩＩ）過テクネチウム酸塩還元溶液を 添加しなかった。この２組のアリコートの各々の一方に、エチレンジアミン四酢 酸（ＥＤＴＡ）を放射能標識前に添加した。

ＨＰ　ＬＣ収率により定量的放射化学純度を決定した。この方法では、強力に結 合したＴｅ−９９ｍの存在は、注入された全Ｔｃ−９９ｍ中の）（ＰＬＣサイズ 排除クロマトグラフィーにおいて回収されるＴｃ−９９ｍの比率に、ＩｇＭタン パク質ピークの元でのＴｃ−９９ｍの比率をかけたものとして測定される。弱く 結合したＴｃ−９９ｍはほとんど完全にＨＰＬＣカラムに転移してカラムに結合 し、そして未還元のＴＣ−９９ｍはタンパク質ピークとは別個に溶出する。従っ てこの方法は強力に結合したＴｃ−９ｈ＋の測定を提供する。

実施例■ この実施例は、５ｎ（ＩＩ）によるおよびジチオトレイトール（ＤＴＴ）による ジスルフィド結合の還元の際の反応性スルフィド基の形成を例示する。ヨードビ ーズ法を使ってマウスモノクローナルＩｇＭ抗体をｌ−１２５で標識した。アリ コートを実施例■のように調製した５ｎ（ＩＩ）還元溶液と共にインキュベート し、２１時間までの様々な時間間隔でアリコートを取り出し、そしてＰＤ−１０ カラムに通して還元反応を停止させた。アリコートをＤＴＴともインキュベート した。塩化ナトリウムを対照として使った。反応性スルフィド基の再酸化を防ぐ ために、窒素でパージした塩溶液でＰＤ−１０カラムを溶出させた。各アリコー トの一部を遊離の反応性スルフィド基の測定に使用し、他の一部をＴｃ−９９ｍ 標識および強力に結合したＴｅ−９９ｍの比率の測定に使用した。

反応性スルフィド基形成は、Ｔｈ１ｏ　Ａｖｉｄｇｅｌ　Ｆ　（Ｂｉｏｐｒｏｂ ｅ。

Ｊｕｓｔｉｎ、　ＣＡ）へのｌ−１２５標識抗体の相対的結合によって決定した 。　Ｔｈｊｏ　Ａｖｊｄｇｅｌ　Ｆは、遊離スルフヒドリル基または反応性スル フィド基を有するタンパク質を結合する。そのような基が還元剤とのインキュベ ージジン中に形成されるならば、抗体結合率は反応性スルフィド基に比例するだ ろう。Ｔｅ−９９ｍ標識は、実施例■のようにＥｌ！Ｌこれにヒト血清アルブミ ンとイノシトールを添加した５ｎ（Ｉ［）過テクネチウム酸還元剤液を使って行 った。強力に結合したＴｃ−９９ｍの比率は、実施例■に記載のＨＰＬＣ収率に よって測定した。

実施例■ この実施例は、実施例■の５ｎ（ＩＩ）還元剤を使った後でＰＤ−１０カラムへ 通過させる本発明の方法が、モノクローナル抗体の免疫反応性に影響を及ぼさな いことを例証する。ミオシンに特異的なＦ（ａｂ’）２抗体をｌ−１２５標識ポ リクローナル免疫グロブリンで短期標識した。一部を記載のように還元し、ＰＤ −１０カラムに通した。還元されたＦ（ａｂ’　）２と未還元のＦ（ａｂ’）ｚ の両者のアリコートを、標準としてｌ−１２５標識ポリクローナル免疫グロブリ ンを使って同じ濃度になるように調整した。減少する濃度のＦ（ａｂ’）ｚ抗体 を使って両アリコートにおいて精製重鎮ミオシン抗原に対するＥＬＩＳＡを行っ た。

１／２プラト一最大吸光度においてアフィニティ一定数を算出すると、同等であ ることがわかった。

一般的にもしくは特定的に記載した本発明の反応体および／または操作条件を上 記実施例で使用したものに置き換えることにより、同様な成功を伴って上記実施 例を繰り返すことができる。特に、別のタンパク質、キレート剤、または還元す ることのできるモノスルフィドもしくはジスルフィド結合を含む基質をＩｇＧ、 　ＩｇＭおよびＦ（ａｂ’　）ｔモノクローナル抗体の代わりに使用することが でき；放射能標識しようとする物質中のジスルフィド結合を還元するのに別の還 元剤を使用することができ；還元剤を除去するのに別の精製方法を使用すること ができ；過テクネチウム酸ナトリウムを還元するのに別の過テクネチウム酸塩還 元剤を使うことができ：そしてテクネチウムの同位体の他にレニウムの同位体を 使用することができる。上記は単に例示であり、他の同等な態様も可能であり、 考慮に入れられる。

本発明をそれらの好ましい態様に関して記載してきたが、他の態様も同じ結果を 達成することができ、本発明の変形および改良は当業者にとって明白であり、そ してそのような変形および同等物は全て、添付された請求の範囲に包含されるだ ろう。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成４年２月７Ｂ

Claims (76)

【特許請求の範囲】
1. １．１もしくは複数のモノスルフィドまたはジスルフィド結合を含むタンパク質 を放射性核種で放射能標識して安定な標識を得る方法であって、ここで前記放射 性核種はテクネチウムおよびレニウムから成る群から選択されたメンバーを含ん で成り、次の段階： ａ）モノスルフィドまたはジスルフィド結合を含むタンパク質を第一のＳｎ（Ｉ Ｉ）剤と共にインキュベートし、ここでインキュベーション期間は、タンパク質 の過剰な断片化を防ぐ一方で、Ｓｎ（ＩＩ）含有および硫黄含有錯体の形成とＳ ｎ（ＩＶ）反応副生成物の形成を可能にするのに十分であり；ｂ）還元されたタ ンパク質を精製してＳｎ（ＩＶ）剤および他の不純物を実質的に除去し；そして ｃ）放射性核種を添加し、それによってＳｎ（ＩＩ）剤が放射性核種を還元し、 そして還元された放射性核種が放射性核種含有および硫黄含有錯体を形成するこ とにより、Ｓｎ（ＩＩ）含有および硫黄含錯体を有する精製タンパク質を放射能 標識する、 を含んで成る方法。
2. ２．１もしくは複数のモノスルフィドまたはジスルフィド結合を含むタンパク質 を放射性核種で放射能標識して安定な標識を得る方法であって、ここで前記放射 性核種はテクネチウムおよびレニウムから成る群から選択されたメンバーを含ん で成り、次の段階： ａ）モノスルフィドまたはジスルフィド結合を含むタンパク質を第一のＳｎ（Ｉ Ｉ）剤と共にインキュベートし、ここでインキュベーション期間は、タンパク質 の過剰な断片化を防ぐ一方で、Ｓｎ（ＩＩ）含有および硫黄含有錯体の形成とＳ ｎ（ＩＶ）反応副生成物の形成を可能にするのに十分であり；ｂ）還元されたタ ンパク質を精製してＳｎ（ＩＶ）剤および他の不純物を実質的に除去し；そして ｃ）Ｓｎ（ＩＩ）含有および硫黄含有錯体を有する精製されたタンパク質に、放 射性核種を還元するのに十分な量の第二のＳｎ（ＩＩ）剤を添加し、そして ｄ）放射性核種を添加し、それによって第二のＳｎ（ＩＩ）剤が放射性核＊を還 元し、そして還元された放射性核種が放射性核種含有および硫黄含有錯体を形成 することにより、Ｓｎ（ＩＩ）含有および硫黄含有錯体を有する精製タンパク質 を放射能標識する、 を含んで成る方法。
3. ３．前記放射性核＊がテクネチウム−９９ｍである、請求項１または２のいずれ か一項の方法。
4. ４．前記テクネチウム−９９ｍが過テクネチウム酸ナトリウムの形である、請求 項３の方法。
5. ５．前記第一のＳｎ（ＩＩ）剤の源がアルカリ金属酒石酸塩を含む溶液中に存在 する、請求項１または２のいずれか一項の方法。
6. ６．前記アルカリ金属酒石酸塩を含む溶液が約５．０〜６．０のｐＨを有する、 請求項５の方法。
7. ７．第二のＳｎ（ＩＩ）剤の源がアルカリ金属酒石酸塩を含む溶液中に存在する 、請求項２の方法。
8. ８．前記アルカリ金属酒石酸塩を含む溶液が約５．０〜６．０のｐＨを有する、 請求項７の方法。
9. ９．前記第二のＳｎ（ＩＩ）剤の源が、グルコヘプトン酸第一錫、グルコン酸第 一錫およびホスホン酸第一錫から成る群から選択された少なくとも１つのメンバ ーである、請求項２の方法。
10. １０．前記タンパク質がモノクローナル抗体、モノクローナル抗体断片およびポ リクローナル抗体から成る群から選択されたメンバーである、請求項１または２ の方法。
11. １１．請求項１，２，３，４，５，６，７，８，９または１０のいずれか一項の 方法により製造された生成物。
12. １２．前記放射性核＊の８５％以上が前記タンパク質に強力に結合している、請 求項１１の生成物。
13. １３．前記タンパク質の免疫反応性が、アフィニティー定数測定により決定する と、第一のＳｎ（ＩＩ）剤とのインキュベーション前のタンパク質の免疫反応性 と実質的に同じである、請求項１０の方法により製造された生成物。
14. １４．生体内投与の前に全く精製段階を必要としない、請求項１１の生成物。
15. １５．生成物が凍結乾燥される、請求項１１の生成物。
16. １６．１もしくは複数のモノスルフィドまたはジスルフィド結合を含むタンパク 質を放射性核＊で放射能標識して安定な標識を得る方法であって、ここで前記放 射性核種はテクネチウムおよびレニウムから成る群から選択されたメンバーを含 んで成り、次の段階： ａ）モノスルフィドまたはジスルフィド結合を含むタンパク質を第一のＳｎ（Ｉ Ｉ）剤と共にインキュベートし、ここでインキュベーション期間は、タンパク質 の過剰な断片化を防ぐ一方で、Ｓｎ（ＩＩ）含有および硫黄含有錯体の形成とＳ ｎ（ＩＶ）反応副生成物の形成を可能にするのに十分であり；ｂ）錯生成剤を用 いてＳｎ（ＩＶ）反応副生成物を錯生成せしめ；そして ｃ）放射性核＊を添加し、それによって残余の第一のＳｎ（ＩＩ）剤が放射性核 ＊を還元し、そして還元された放射性核種が放射性核＊含有および硫黄含有錯体 を形成することにより、Ｓｎ（ＩＩ）含有および硫黄含有錯体を有する精製タン パク質を放射能標識する、 を含んで成る方法。
17. １７．段階ｂ）の後に、錯生成剤とＳｎ（ＩＩ）含有および硫黄含有錯体を有す るタンパク質との組合せに、放射性核種を還元するのに十分な量の第二のＳｎ（ ＩＩ）剤を添加し、それによって第二のＳｎ（ＩＩ）剤が放射性核＊を還元し、 そして還元された放射性核種が放射性核＊含有および硫黄含有複合体を形成する 、請求項１６の方法。
18. １８．前記錯生成剤がポリアミノカルボン酸である、請求項１６の方法。
19. １９．前記ポリアミノカルボン酸がＥＤＴＡおよびＤＴＰＡから成る群から選択 された少なくとも１つのメンバーである、請求項１８の方法。
20. ２０．前記放射性核種が過テクネチウム酸ナトリウムの形のテクネチウム−９９ ｍである、請求項１６の方法。
21. ２１．前記第一のＳｎ（ＩＩ）剤の源がアルカリ金属酒石酸塩を含む溶液中に存 在する、請求項１６の方法。
22. ２２．前記アルカリ金属酒石酸塩を含む溶液が約５．０〜６．０のｐＨを有する 、請求項２１の方法。
23. ２３．前記第二のＳｎ（ＩＩ）剤の源がアルカリ金属酒石酸塩を含む溶液中に存 在する、請求項１７の方法。
24. ２４．前記アルカリ金属酒石酸塩を含む溶液が約５．０〜６．０のｐＨを有する 、請求項２３の方法。
25. ２５．前記第二のＳｎ（ＩＩ）剤の源が、グルコヘプトン酸第一錫、グルコン酸 第一錫およびホスホン酸第一錫から選択された少なくとも１つのメンバーである 、請求項１７の方法。
26. ２６．前記タンパク質がモノクローナル抗体、モノクローナル抗体断片およびポ リクローナル抗体から成る群から選択されたメンバーである、請求項１６の方法 。
27. ２７．請求項１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５ま たは２６のいずれか一項の方法により製造された生成物。
28. ２８．前記放射性核種の８５％以上が前記タンパク質に強力に結合している、請 求項２７の生成物。
29. ２９．前記タンパク質の免疫反応性が、アフィニティー定数測定により決定する と、Ｓｎ（ＩＩ）剤とのインキュベーション前のタンパク質の免疫反応性と実質 的に同じである、請求項２６の方法により製造された生成物。
30. ３０．生体内投与の前に全く精製段階を必要としない、請求項２７の生成物。
31. ３１．生成物が凍結乾燥される、請求項２７の生成物。
32. ３２．放射性核種で放射能標識するのに適当なＳｎ（ＩＩ）含有および硫黄含有 錯体を有するタンパク様組成物であって、前記放射性核種はテクネチウムおよび レニウムから成る群から選択され、前記Ｓｎ（ＩＩ）含有および硫黄含有錯体は １または複数の反応性スルフィド基を含み、前記反応性スルフィド基がＳｎ（Ｉ Ｉ）剤と錯生成することを特徴とする、タンパク様組成物。
33. ３３．前記放射性核＊を還元するのに十分な量のＳｎ（ＩＩ）還元剤を更に含ん で成る、請求項３２の組成物。
34. ３４．ＥＤＴＡおよびＤＴＰＡから成る群から選択されたポリアミノカルボン酸 を更に含んで成る、請求項３２の組成物。
35. ３５．前記タンパク質がモノクローナル抗体、モノクローナル抗体断片およびポ リクローナル抗体から成る群から選択されたメンバーを含んで成る、請求項３２ の組成物。
36. ３６．前記組成物が凍結乾燥されている、請求項３３の組成物。
37. ３７．十分な期間インキュベートしそして放射性核＊で放射能標識した時の生成 物が、８５％以上のタンパク質に強力に結合した放射性核＊を有する、請求項３ ２の組成物を含んで成る生成物。
38. ３８．前記放射性核＊が過テクネチウム酸塩ナトリウムの形のテクネチウムであ る、請求項３７の生成物。
39. ３９．前記インキュベーション期間が１５分間またはそれ未満である、請求項３ ８の生成物。
40. ４０．１もしくは複数のモノスルフィドまたはジスルフィド結合を有するタンパ ク質を放射性核＊で放射能標識して安定な標識を得る方法であって、ここで前記 放射性核種はテクネチウムおよびレニウムから成る群から選択されたメンバーを 含んで成り、次の段階： ａ）モノスルフィドまたはジスルフィド結合を含むタンパク質を第一の還元剤と 共にインキュベートし、ここでインキュベーション期間は、タンパク質の過剰な 断片化を防ぐ一方で、利用可能なモノスルフィドまたはジスルフィド結合を反応 性スルフィド基に還元するのに十分であり；ｂ）還元されたタンパク質を精製し て前記第一の還元剤および他の不純物を実質的に除去し；そしてｃ）精製された 還元されたタンパク質に、放射性核種を還元するのに十分な量の第二の還元剤を 添加し、そしてｄ）放射性核＊を添加し、それによって第二の還元剤が放射性核 種を還元し、そして放射性核＊が前記の精製された還元されたタンパク質に結合 することにより、前記精製された還元されたタンパク質を放射能標識する、を含 んで成る方法。
41. ４１．前記放射性核種がテクネチウム−９９ｍである、請求項４０の方法。
42. ４２．前記テクネチウム−９９ｍが過テクネチウム酸ナトリウムの形である、請 求項４１の方法。
43. ４３．前記第一の還元剤がＳｎ（ＩＩ）源を含んで成る、請求項４０の方法。
44. ４４．前記Ｓｎ（ＩＩ）源がアルカリ金属酒石酸塩の混合物を含む溶液中に存在 する、請求項４３の方法。
45. ４５．前記アルカリ金属酒石酸塩の混合物を含む溶液が約５．０〜６．０のｐＨ を有する、請求項４４の方法。
46. ４６．前記第一の還元剤が２−メルカプトエタノール、１，４−ジチオトレイト ール、２，３−ジヒドロキシプタン−１，４−ジチオール、２−アミノエタンチ オールＨＣｌ、２−メルカプトエチルアミン、チオグリコレート、シアニドおよ びシステインから成る群から選択されたメンバーを含んで成る、請求項４０の方 法。
47. ４７．前記段階ｃ）の前に、Ｓｎ（ＩＩ）源を添加してＳｎ（ＩＩ）含有および 硫黄含有タンパク質複合体を形成せしめる、請求項４６の方法。
48. ４８．前記第二の還元剤がＳｎ（ＩＩ）源である、請求項４０，４１，４２，４ ３，４４，４５，４６または４７のいずれか一項の方法。
49. ４９．前記Ｓｎ（ＩＩ）源がアルカリ金属酒石酸塩を含む溶液中に存在する、請 求項４８の方法。
50. ５０．前記アルカリ金属酒石酸塩を含む溶液が約５．０〜６．０のｐＨを有する 、請求項４９の方法。
51. ５１．前記Ｓｎ（ＩＩ）源が、グルコヘプトン酸第一錫、グルコン酸第一錫およ びホスホン酸第一錫から選択されたメンバーを含んで成る、請求項４８の方法。
52. ５２．前記第二の還元剤がジチオニットである、請求項４０，４１，４２，４３ ，４４，４５，４６または４７のいずれか一項の方法。
53. ５３．前記段階ｂ）における還元されたタンパク質の精製後、還元され精製され たタンパク質を凍結させる、請求項４０の方法。
54. ５４．段階ｃ）における第二の還元剤の添加後、段階ｄ）における放射性核＊の 添加前に、前記還元され精製され凍結されたタンパク質と前記第二の還元剤との 間に本質的に全く化学反応が起こらないように、前記第二の還元剤を凍結させる 、請求項５３の方法。
55. ５５．前記第二の還元剤の凍結後、前記還元され精製され凍結されたタンパク質 と前記凍結された第二の還元剤とを凍結乾燥する、請求項５４の方法。
56. ５６．段階ｃ）における第二の還元剤の添加の最中または後に、前記還元され精 製されたタンパク質と前記第二の還元剤との組合せに、酸化されていない固体の 金属錫を添加する、請求項５４の方法。
57. ５７．段階ｂ）における還元されたタンパク質の精製が、還元されたタンパク質 および第一の還元剤をサイズ排除クロマトグラフィーカラムに通すことを含んで 成る、請求項４０の方法。
58. ５８．段階ｂ）における還元されたタンパク質の精製が、脱塩カラム、透析、限 外濾過、沈澱、分取用高性能液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマト グラフィーおよび分取用等電点電気泳動から成る群から選択された方法を含んで 成る、請求項４０の方法。
59. ５９．段階ｃ）における還元され精製されたタンパク質と第二の還元剤の溶液中 のタンパク質濃度が少なくとも１ｍｇ／ｍｌ溶液である、請求項４０の方法。
60. ６０．段階ｃ）における還元され精製されたタンパク質と第二の還元剤の溶液の 容量が少なくとも２ｍｌである、請求項５９の方法。
61. ６１．放射性核種での安定な標識を有するモノスルフィドまたはジスルフィド結 合を含むタンパク質を調製する際の使用に適当な組成物であって、ここで前記放 射性核＊はテクネチウムおよびレニウムから成る群から選択され、反応性スルフ ィドが暴露されるように十分に還元されており、そして実質的に全ての不純物お よび過剰の還元剤を除去するために精製されているタンパク質；および前記タン パク質を更に還元することなく放射性核＊を還元するのに十分な量の還元剤 を含んで成る組成物。
62. ６２．前記放射性核＊が過テクネチウム酸ナトリウムの形のテクネチウム−９９ ｍであり、そして前記還元剤がＳｎ（ＩＩ）含有物質である、請求項６１の組成 物。
63. ６３．前記組成物が実質的に純粋な酸化されていない金属錫を更に含んで成る、 請求項６１の組成物。
64. ６４．前記実質的に純粋な酸化されていない金属錫が錫ペレットである、請求項 ６３の組成物。
65. ６５．前記還元されたタンパク質が、還元された抗体および還元された抗体断片 から成る群から選択されたメンバーを含んで成る、請求項６１の組成物。
66. ６６．前記組成物が担体を更に含んで成石、請求項６１の組成物。
67. ６７．前記担体が不活性の糖、還元されないタンパク質およびアミノ酸から成る 群から選択された物質を含んで成る、請求項６６の組成物。
68. ６８．請求項６１，６２，６３，６４，６５，６６または６７のいずれかの組成 物の溶液を凍結乾燥することにより製造される、凍結乾燥組成物。
69. ６９．前記溶液が約４〜約６のｐＨに緩衝化される、請求項６８の組成物。
70. ７０．テクネチウム−９９ｍで安定に標識されたタンパク質の製造方法であって 、請求項６８の凍結乾燥組成物を過テクネチウム酸ナトリウムの溶液と反応させ 、それによってテクネチウム−９９ｍ標識タンパク質の溶液が得られる段階を含 んで成る方法。
71. ７１．モノスルフィドまたはジスルフィド結合を含むタンパク質を放射能標識し て放射性核種での安定な標識を得るためのキットであって、前記放射性核＊はテ クネチウムおよびレニウムから成る群から選択されたメンバーを含んで成り、該 組成物はバイアルおよび内容物を含んで成り、ここで前記内容物が、 反応性スルフィドが暴露されるように十分に還元されており、そして全ての不純 物および過剰の還元剤を実質的に除去するために精製されている、放射能標識し ようとするタンパク質；および 放射性核種の導入後放射性核種を還元しそして還元されたタンパク質上の反応性 スルフィド基に結合するような、導入しようとする放射性核種の量を還元するの に十分な量の還元剤 を含んで成る、キット。
72. ７２．前記バイアルの前記内容物が、放射性核種の導入前にタンパク質と還元剤 との間に本質的に全く化学反応が起こらないように凍結される、請求項７１のキ ット。
73. ７３．前記バイアルの前記内容物が、放射性核＊の導入前にタンパク質と還元剤 との間に本質的に全く化学反応が起こらないように凍結乾燥される、請求項７１ のキット。
74. ７４．前記放射性核種が過テムネチウム酸ナトリウムの形のテクネチウム−９９ ｍである、請求項７１のキット。
75. ７５．前記バイアルの前記内容物が実質的に純粋な酸化されていない金属錫を更 に含んで成る、請求項７１のキット。
76. ７６．前記バイアルの前記内容物が担体物質を更に含んで成る、請求項７１のキ ット。