JP2000053590A - テクネチウムまたはレニウムでの抗体または他のタンパク質の直接放射能標識 - Google Patents
テクネチウムまたはレニウムでの抗体または他のタンパク質の直接放射能標識Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 抗体を包含するタンパク質を放射性核種で放
射能標識するのに適当なタンパク様剤の調製に使用され
る組成物を提供する。 【解決手段】 前記組成物はSn(II)と錯生成する１また
は複数の反応性基を含有する還元されたタンパク質；お
よび添加される放射性核種の量の完全な還元を可能にす
るのに十分な濃度であって且つそれが前記タンパク質の
それ以上の還元を促進しないような濃度のSn(II)還元剤
を含んで成る。
射能標識するのに適当なタンパク様剤の調製に使用され
る組成物を提供する。 【解決手段】 前記組成物はSn(II)と錯生成する１また
は複数の反応性基を含有する還元されたタンパク質；お
よび添加される放射性核種の量の完全な還元を可能にす
るのに十分な濃度であって且つそれが前記タンパク質の
それ以上の還元を促進しないような濃度のSn(II)還元剤
を含んで成る。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、抗体を包含するタ
ンパク質をテクネチウムまたはレニウムの放射性同位体
例えばテクネチウム−99m で放射能標識することにより
製造された放射能標識されたタンパク質生成物、組成物
およびキットに関する。
ンパク質をテクネチウムまたはレニウムの放射性同位体
例えばテクネチウム−99m で放射能標識することにより
製造された放射能標識されたタンパク質生成物、組成物
およびキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】タンパク質を放射能標識するための放射
性同位体の使用は公知である。それらの組成物はアッセ
イにおいて利用することができ、体の種々の部分を視覚
化またはモニタリングするためにあるいは特定の抗原、
抗体、ホルモン等の存在および位置を決定するために人
体に投与することができ、そして種々の病的状態の治療
に使用することができる。様々な放射性同位体、例えば
ヨウ素、テクネチウム、インジウムおよびレニウムの放
射性同位体が使用されている。タンパク質分子をテクネ
チウム−99m で標識して診断剤または造影剤を形成せし
めることができることも公知である。
性同位体の使用は公知である。それらの組成物はアッセ
イにおいて利用することができ、体の種々の部分を視覚
化またはモニタリングするためにあるいは特定の抗原、
抗体、ホルモン等の存在および位置を決定するために人
体に投与することができ、そして種々の病的状態の治療
に使用することができる。様々な放射性同位体、例えば
ヨウ素、テクネチウム、インジウムおよびレニウムの放
射性同位体が使用されている。タンパク質分子をテクネ
チウム−99m で標識して診断剤または造影剤を形成せし
めることができることも公知である。
【０００３】テクネチウム−99m は、過テクネチウム酸
ナトリウムを使用する方法により、タンパク質、キレー
ト化剤、ホスホネート骨走査用組成物等を放射能標識す
るのに使用されている。ここでテクネチウムは最初は＋
７状態にある。テクネチウム−99m は通常、過テクネチ
ウム酸ナトリウムとしてのみ入手可能である。過テクネ
チウム酸塩は、テクネチウムを＋３，＋４または＋５の
酸化状態に還元するために、放射能標識しようとするタ
ンパク質、キレート化剤または同様な物質の存在下にお
いて還元剤、例えば塩化第一錫と接触させなければなら
ない。テクネチウム分子と放射能標識しようとする基質
との間の化学結合を維持するためにテクネチウムをこの
還元状態に維持しなければならない。還元されたテクネ
チウムが、アッセイ媒質中、患者の血液中もしくは放射
能標識物質が使用されるであろう他の媒質中に存在する
別の分子または別のタンパク質に転移しないように、テ
クネチウムをタンパク質に強固に結合せしめることも必
要である。
ナトリウムを使用する方法により、タンパク質、キレー
ト化剤、ホスホネート骨走査用組成物等を放射能標識す
るのに使用されている。ここでテクネチウムは最初は＋
７状態にある。テクネチウム−99m は通常、過テクネチ
ウム酸ナトリウムとしてのみ入手可能である。過テクネ
チウム酸塩は、テクネチウムを＋３，＋４または＋５の
酸化状態に還元するために、放射能標識しようとするタ
ンパク質、キレート化剤または同様な物質の存在下にお
いて還元剤、例えば塩化第一錫と接触させなければなら
ない。テクネチウム分子と放射能標識しようとする基質
との間の化学結合を維持するためにテクネチウムをこの
還元状態に維持しなければならない。還元されたテクネ
チウムが、アッセイ媒質中、患者の血液中もしくは放射
能標識物質が使用されるであろう他の媒質中に存在する
別の分子または別のタンパク質に転移しないように、テ
クネチウムをタンパク質に強固に結合せしめることも必
要である。
【０００４】幾つかの異なる方法は、タンパク質、特に
モノクローナル抗体をテクネチウム−99m で放射能標識
することを使っている。この方法は２つの一般的アプロ
ーチを含む。１つは間接アプローチであり、二価性キレ
ート化剤が１つの官能基を介してタンパク質に取り付ら
れ、そしてもう１つの官能基またはキレート基を介して
テクネチウム−99m が取り付けられる。この方法は Kre
jcarek, G.E.およびTucker, K.L. ("Covelent Attachme
nt of Chelating Groups to Macromolecules,"Biochemi
cal and Biophysical Research Communications, 第77
巻, 581-585 頁, 1977) により導入され、そして種々の
二価性キレート化剤、例えばWenselおよびMeares (Wens
el, T.G.およびMeares, C.F., "Bifunctional Chelatin
g Agentsfor Binding Metal Ions to Proteins," Radio
immunoimaging and Radioimmunotherapy, S.W. Burchi
el およびB.A. Rhodes 編, Elsevier Publishing Co.,
New York, 185-196頁) に記載されたものを使って、多
数の変形において広く使用されている。別の方法が Hna
towich, D.J., 米国特許第4,668,503 号および第4,479,
930 号明細書により、Haber, E. およびKhaw, B.A., 米
国特許第4,421,735号明細書により、Fritzberg, A.R.
およびKasina, S., 米国特許第4,670,545 号明細書によ
り、並びにBaidoo, K.E.ら, "99m Tc Labelling of Pro
teins: Initial Evaluation of Novel Diaminedithiol
Bifunctional Chelating Agent,"Cancer Res (Suppl)
第50巻, 799s-803s, 1990 により、開示されている。こ
れらの二価性キレート化方法は、放射能標識手順の複雑
さ、放射能標識を達成するのに要する時間、並びにタン
パク質に影響を与え得る物質の導入および存在といった
明白な制限を有する。
モノクローナル抗体をテクネチウム−99m で放射能標識
することを使っている。この方法は２つの一般的アプロ
ーチを含む。１つは間接アプローチであり、二価性キレ
ート化剤が１つの官能基を介してタンパク質に取り付ら
れ、そしてもう１つの官能基またはキレート基を介して
テクネチウム−99m が取り付けられる。この方法は Kre
jcarek, G.E.およびTucker, K.L. ("Covelent Attachme
nt of Chelating Groups to Macromolecules,"Biochemi
cal and Biophysical Research Communications, 第77
巻, 581-585 頁, 1977) により導入され、そして種々の
二価性キレート化剤、例えばWenselおよびMeares (Wens
el, T.G.およびMeares, C.F., "Bifunctional Chelatin
g Agentsfor Binding Metal Ions to Proteins," Radio
immunoimaging and Radioimmunotherapy, S.W. Burchi
el およびB.A. Rhodes 編, Elsevier Publishing Co.,
New York, 185-196頁) に記載されたものを使って、多
数の変形において広く使用されている。別の方法が Hna
towich, D.J., 米国特許第4,668,503 号および第4,479,
930 号明細書により、Haber, E. およびKhaw, B.A., 米
国特許第4,421,735号明細書により、Fritzberg, A.R.
およびKasina, S., 米国特許第4,670,545 号明細書によ
り、並びにBaidoo, K.E.ら, "99m Tc Labelling of Pro
teins: Initial Evaluation of Novel Diaminedithiol
Bifunctional Chelating Agent,"Cancer Res (Suppl)
第50巻, 799s-803s, 1990 により、開示されている。こ
れらの二価性キレート化方法は、放射能標識手順の複雑
さ、放射能標識を達成するのに要する時間、並びにタン
パク質に影響を与え得る物質の導入および存在といった
明白な制限を有する。
【０００５】もう１つの一般的アプローチは直接標識で
ある。幾つかの直接法が報告されているけれども、生体
内適用のためのタンパク質とテクネチウム−99m との間
に十分に強い結合を提供することができる第一の直接法
は、"Method for Radiolabelling Proteins with Techn
etium-99m," という題目のCrockford, D.R. およびRhod
es, B.A.への米国特許第4,424,400 号明細書に記載され
た直接または予備錫はんだ法であった。この方法では、
塩化第一錫[Sn(II)]と酒石酸塩およびフタル酸塩から成
る単一還元溶液が使用される。この溶液は、(1) タンパ
ク質を還元し、それによって反応性スルフィド基を暴露
せしめ、(2) 還元されたタンパク質の反応性スルフィド
基を保護し、(3) 過テクネチウム酸ナトリウムを還元
し、そして(4) 還元されたTc-99mと錯体形成させそれを
還元されたタンパク質のスルフィド結合部位に転移させ
るために働く。この方法を使って、多数のタンパク質を
好結果にテクネチウム−99m で放射能標識することがで
きる。何人かの発明者らがこの方法の利用について報告
している（Rhodes, B.A.ら、"Technetium-99m Labeling
of Murine Monoclonal Antibody Fragments," Journal
of Nuclear Medicine, 27巻, 685-693 頁, 1986 ; So
m, P.ら、"Radioimmunoimaging of Experimental Throm
bi in Dogs Using Technetium-99m-Labeled Monoclonal
Antibody Fragments Reactive with Human Platelet
s," Journal of Nuclear Medicine, 第27巻, 第８号, 1
315-1320 頁, 1986）。
ある。幾つかの直接法が報告されているけれども、生体
内適用のためのタンパク質とテクネチウム−99m との間
に十分に強い結合を提供することができる第一の直接法
は、"Method for Radiolabelling Proteins with Techn
etium-99m," という題目のCrockford, D.R. およびRhod
es, B.A.への米国特許第4,424,400 号明細書に記載され
た直接または予備錫はんだ法であった。この方法では、
塩化第一錫[Sn(II)]と酒石酸塩およびフタル酸塩から成
る単一還元溶液が使用される。この溶液は、(1) タンパ
ク質を還元し、それによって反応性スルフィド基を暴露
せしめ、(2) 還元されたタンパク質の反応性スルフィド
基を保護し、(3) 過テクネチウム酸ナトリウムを還元
し、そして(4) 還元されたTc-99mと錯体形成させそれを
還元されたタンパク質のスルフィド結合部位に転移させ
るために働く。この方法を使って、多数のタンパク質を
好結果にテクネチウム−99m で放射能標識することがで
きる。何人かの発明者らがこの方法の利用について報告
している（Rhodes, B.A.ら、"Technetium-99m Labeling
of Murine Monoclonal Antibody Fragments," Journal
of Nuclear Medicine, 27巻, 685-693 頁, 1986 ; So
m, P.ら、"Radioimmunoimaging of Experimental Throm
bi in Dogs Using Technetium-99m-Labeled Monoclonal
Antibody Fragments Reactive with Human Platelet
s," Journal of Nuclear Medicine, 第27巻, 第８号, 1
315-1320 頁, 1986）。
【０００６】他の初期の直接標識法も報告されている
が、安定なTc−タンパク質結合を生じなかった。従来方
法〔Stern, H.S. ら、Radioactive Pharmaceuticals,
U.S. Atomic Energy Commission (1966),テキスト19章,
359-375 ; Lin, M.S. ら、"Useof Fe(II) or Sn(II) A
lone for Technetium Labeling of Albumin," Journal
of Nuclear Medicine, 第12巻, 第11号, 707-710 頁, 1
971 ; Wong, D.W. ら、"A Rapid Chemical Method of L
abeling Human Plasma Proteins with 99m Tc-Pertechn
etate at pH 7.4," International Journal of Applie
d Radiation andIsotopes,第29巻, 251-253 頁, 1978 ;
Colombetti, L.G. ら、"A Rapid Method for Labeling
IgG with 99m-Tc," Journal of Nuclear Medicine, 第
20巻, 652 頁, 1979 ; Rhodes, B.A.,米国特許第4,305,
992 号明細書, "Labeling Proteins with 99m-Tc by Li
gand Exchange"〕におけるTc−タンパク質結合の不安定
性の理由は、タンパク質と還元された放射性核種との間
の強力な結合の形成に必要である反応性スルフィド基を
提供するようにタンパク質が還元されなかったことであ
った。
が、安定なTc−タンパク質結合を生じなかった。従来方
法〔Stern, H.S. ら、Radioactive Pharmaceuticals,
U.S. Atomic Energy Commission (1966),テキスト19章,
359-375 ; Lin, M.S. ら、"Useof Fe(II) or Sn(II) A
lone for Technetium Labeling of Albumin," Journal
of Nuclear Medicine, 第12巻, 第11号, 707-710 頁, 1
971 ; Wong, D.W. ら、"A Rapid Chemical Method of L
abeling Human Plasma Proteins with 99m Tc-Pertechn
etate at pH 7.4," International Journal of Applie
d Radiation andIsotopes,第29巻, 251-253 頁, 1978 ;
Colombetti, L.G. ら、"A Rapid Method for Labeling
IgG with 99m-Tc," Journal of Nuclear Medicine, 第
20巻, 652 頁, 1979 ; Rhodes, B.A.,米国特許第4,305,
992 号明細書, "Labeling Proteins with 99m-Tc by Li
gand Exchange"〕におけるTc−タンパク質結合の不安定
性の理由は、タンパク質と還元された放射性核種との間
の強力な結合の形成に必要である反応性スルフィド基を
提供するようにタンパク質が還元されなかったことであ
った。
【０００７】その後、米国特許第4,424,200 号明細書の
方法の変形を使った多数の方法が報告された。それらの
変形は、次のものの１つまたは複数を含む：(1) タンパ
ク質を還元するのに Sn(II) 以外のジスルフィド還元
剤、例えば２−メルカプトエタノール、ジチオトレイト
ールおよびそれらの類似体を使用する；(2) Sn(II)以外
の反応性スルフィド基保護剤、例えば Zn(II) を使用す
る；(3) Sn(II)以外の過テクネチウム酸塩還元剤、例え
ばジチオトレイトールを使用する；および(4) 還元され
たテクネチウムを結合しそしてそれをタンパク質のスル
フィド基に転移させるのに酒石酸塩以外の錯生成剤、例
えばホスホネートを使用する。
方法の変形を使った多数の方法が報告された。それらの
変形は、次のものの１つまたは複数を含む：(1) タンパ
ク質を還元するのに Sn(II) 以外のジスルフィド還元
剤、例えば２−メルカプトエタノール、ジチオトレイト
ールおよびそれらの類似体を使用する；(2) Sn(II)以外
の反応性スルフィド基保護剤、例えば Zn(II) を使用す
る；(3) Sn(II)以外の過テクネチウム酸塩還元剤、例え
ばジチオトレイトールを使用する；および(4) 還元され
たテクネチウムを結合しそしてそれをタンパク質のスル
フィド基に転移させるのに酒石酸塩以外の錯生成剤、例
えばホスホネートを使用する。
【０００８】それらの方法は、一般に、米国特許第4,42
4,200 号の方法を上回る改善をもたらさなかった。開示
された方法はいずれも、本明細書において開示される方
法、組成物およびキットに匹敵する結果を与えない。
4,200 号の方法を上回る改善をもたらさなかった。開示
された方法はいずれも、本明細書において開示される方
法、組成物およびキットに匹敵する結果を与えない。
【０００９】Schwarz, A. およびSteinstruaber, A.,
"A Novel Approach to Tc-99m-Labeled Monoclonal Ant
ibodies," Journal of Nuclear Medicine, 第28巻, 721
頁,1987、並びにBremer, K.H.ら、欧州特許出願第 0 2
71 806 A2 号公報(1987 年12月８日出願) は、タンパク
質のスルフィド基をモノチオール、例えば２−メルカプ
トエタノールまたは２−メルカプトエチルアミンで還元
している。過テクネチウム酸塩を還元するのに Sn(II)
を使用し、そして還元されたテクネチウムをホスホネー
トまたはピロホスフェートと錯生成させる。この方法
は、放射能標識を達成するのに２以上のバイアルおよび
多数の段階を必要とする。使用されるホスホネートは最
終生成物中にラジオコロイド不純物を生成しうる。その
上、ジスルフィド基を還元するのに用いる化学物質、例
えば２−メルカプトエタノールは、潜在的に毒性であ
る。
"A Novel Approach to Tc-99m-Labeled Monoclonal Ant
ibodies," Journal of Nuclear Medicine, 第28巻, 721
頁,1987、並びにBremer, K.H.ら、欧州特許出願第 0 2
71 806 A2 号公報(1987 年12月８日出願) は、タンパク
質のスルフィド基をモノチオール、例えば２−メルカプ
トエタノールまたは２−メルカプトエチルアミンで還元
している。過テクネチウム酸塩を還元するのに Sn(II)
を使用し、そして還元されたテクネチウムをホスホネー
トまたはピロホスフェートと錯生成させる。この方法
は、放射能標識を達成するのに２以上のバイアルおよび
多数の段階を必要とする。使用されるホスホネートは最
終生成物中にラジオコロイド不純物を生成しうる。その
上、ジスルフィド基を還元するのに用いる化学物質、例
えば２−メルカプトエタノールは、潜在的に毒性であ
る。
【００１０】Reno, J.W.ら、米国特許第4,877,868 号明
細書, Radionuclide Antibody Couplingおよび欧州特許
出願第 0 237 150号公報（1987年１月19日出願）は、タ
ンパク質のジスルフィド基を還元するのにジチオトレイ
トール(DTT) を使用し、次いで Zn(II) または他のスル
フヒドリル基誘導試薬で反応性スルフィドを保護してい
る。それらは還元された放射性核種と錯生成しそしてそ
れらを転移せしめるのに酒石酸塩を用いる。この方法
は、抗体を還元するのに潜在的に毒性の化学物質、例え
ばジチオトレイトールを使用している。この方法もタン
パク質を放射能標識するのに多数の段階を必要とする。
細書, Radionuclide Antibody Couplingおよび欧州特許
出願第 0 237 150号公報（1987年１月19日出願）は、タ
ンパク質のジスルフィド基を還元するのにジチオトレイ
トール(DTT) を使用し、次いで Zn(II) または他のスル
フヒドリル基誘導試薬で反応性スルフィドを保護してい
る。それらは還元された放射性核種と錯生成しそしてそ
れらを転移せしめるのに酒石酸塩を用いる。この方法
は、抗体を還元するのに潜在的に毒性の化学物質、例え
ばジチオトレイトールを使用している。この方法もタン
パク質を放射能標識するのに多数の段階を必要とする。
【００１１】Pak, K.Y. ら、"A Rapid and Efficient M
ethod for Labeling IgG Antibodies with Tc-99m and
Comparison to Tc-99m Fab' Antibody Fragments," Jou
rnalof Nuclear Medicine, 第30巻, 793 頁, 1989、お
よび特許協力条約（ＰＣＴ）国際出願公開第WO 88/0738
2 号公報（1988年４月１日出願）は、抗体を還元するの
にジチオトレイトールを使用している。酒石酸塩もしく
はグルコヘプトン酸塩またはそれらの類似体を添加し、
還元された放射性核種を錯体化しそして転移せしめる。
この方法も同様に潜在的に毒性の化学物質を使用してお
り、放射能標識するのに複数の段階を必要とする。
ethod for Labeling IgG Antibodies with Tc-99m and
Comparison to Tc-99m Fab' Antibody Fragments," Jou
rnalof Nuclear Medicine, 第30巻, 793 頁, 1989、お
よび特許協力条約（ＰＣＴ）国際出願公開第WO 88/0738
2 号公報（1988年４月１日出願）は、抗体を還元するの
にジチオトレイトールを使用している。酒石酸塩もしく
はグルコヘプトン酸塩またはそれらの類似体を添加し、
還元された放射性核種を錯体化しそして転移せしめる。
この方法も同様に潜在的に毒性の化学物質を使用してお
り、放射能標識するのに複数の段階を必要とする。
【００１２】Schochat, D.ら、欧州特許出願第 0 336 6
78号公報（1989年４月３日出願）は、従来のジスルフィ
ド還元剤、例えばシステイン、ジチオトレイトール、２
−メルカプトエタノール、ジチオニット等を使用する。
それらは米国特許第4,424,200 号明細書の予備錫はんだ
法が十分に機能しないと主張しており、血液もしくは他
の体液または組織の存在下で比較的不安定である部位に
放射性金属がいくらか結合することを指摘している。そ
れらは用途において単一の例、即ちTc-99m−抗-CEA-Fa
b' の調製、を与えており、この例は正確には上記特許
第'200号明細書のものであると思われる。過テクネチウ
ム酸ナトリウムを還元するための Sn(II)の使用は従来
技術において公知であり、そして上記特許第'200号明細
書や他の参考文献に開示されている。
78号公報（1989年４月３日出願）は、従来のジスルフィ
ド還元剤、例えばシステイン、ジチオトレイトール、２
−メルカプトエタノール、ジチオニット等を使用する。
それらは米国特許第4,424,200 号明細書の予備錫はんだ
法が十分に機能しないと主張しており、血液もしくは他
の体液または組織の存在下で比較的不安定である部位に
放射性金属がいくらか結合することを指摘している。そ
れらは用途において単一の例、即ちTc-99m−抗-CEA-Fa
b' の調製、を与えており、この例は正確には上記特許
第'200号明細書のものであると思われる。過テクネチウ
ム酸ナトリウムを還元するための Sn(II)の使用は従来
技術において公知であり、そして上記特許第'200号明細
書や他の参考文献に開示されている。
【００１３】他の方法を上回るタンパク質のジスルフィ
ドを還元する Sn(II) 法の利点は、Sn(II) がジスルフ
ィド結合を還元し且つ還元により形成されたスルフィド
と錯生成して非反応性ジスルフィドに戻らないようにス
ルフィドを保護することである。タンパク質のジスルフ
ィドを還元するのにDTT のような有機還元剤を使用する
時には、スルフィド保護剤を付加する前に還元剤を除去
しなければならない。そうでなければ、通常は沈澱の形
成によって、保護基が還元剤と反応してしまうだろう。
還元剤とスルフィド保護剤との反応を回避するために還
元剤を先ず除去する場合、還元されたタンパク質は一定
期間の間放置され、その間に反応性スルフィド基が非反
応性ジスルフィド結合が再形成し得る。本発明に記載さ
れる Sn(II) 還元法は、それがジスルフィドの同時還元
・錯化を可能にするという点で新規である。
ドを還元する Sn(II) 法の利点は、Sn(II) がジスルフ
ィド結合を還元し且つ還元により形成されたスルフィド
と錯生成して非反応性ジスルフィドに戻らないようにス
ルフィドを保護することである。タンパク質のジスルフ
ィドを還元するのにDTT のような有機還元剤を使用する
時には、スルフィド保護剤を付加する前に還元剤を除去
しなければならない。そうでなければ、通常は沈澱の形
成によって、保護基が還元剤と反応してしまうだろう。
還元剤とスルフィド保護剤との反応を回避するために還
元剤を先ず除去する場合、還元されたタンパク質は一定
期間の間放置され、その間に反応性スルフィド基が非反
応性ジスルフィド結合が再形成し得る。本発明に記載さ
れる Sn(II) 還元法は、それがジスルフィドの同時還元
・錯化を可能にするという点で新規である。
【００１４】上記の４段階法とは化学的に異なる他の直
接標識法も報告されている。Paik,C.H.ら、米国特許第
4,652,440 号明細書, "Method of Stably Radiolabelin
g Antibodies with Technetium and Rhenium" は、還元
された放射性核種を目当てに競争する強いキレート化剤
DTPAの存在下で、 Sn(II) 還元によりタンパク質を標識
している。タンパク質の強力結合Tc-99m標識のみが好ま
しくはタンパク質の生来の遊離スルフヒドリル基への結
合によって起こる。しかしながら、相当な量のTc-99m-D
TPA も形成されるので、標識されたタンパク質を使用す
る前にこれを除去しなければならない。この方法は、強
力に結合する放射性核種を高収率で獲得するのに必要と
されるジスルフィド結合の還元の第一段階を欠いてい
る。
接標識法も報告されている。Paik,C.H.ら、米国特許第
4,652,440 号明細書, "Method of Stably Radiolabelin
g Antibodies with Technetium and Rhenium" は、還元
された放射性核種を目当てに競争する強いキレート化剤
DTPAの存在下で、 Sn(II) 還元によりタンパク質を標識
している。タンパク質の強力結合Tc-99m標識のみが好ま
しくはタンパク質の生来の遊離スルフヒドリル基への結
合によって起こる。しかしながら、相当な量のTc-99m-D
TPA も形成されるので、標識されたタンパク質を使用す
る前にこれを除去しなければならない。この方法は、強
力に結合する放射性核種を高収率で獲得するのに必要と
されるジスルフィド結合の還元の第一段階を欠いてい
る。
【００１５】Sundrehagen, E., PCT国際出願公開WO 85/
03231 公報（1985年１月18日出願）は、過テクネチウム
酸塩を還元するのに使用した低濃度の Sn(II) を安定化
するのにゲンチジン酸を使用している。この方法は、ラ
ジオコロイドおよび酸化された放射性核種といった放射
化学不純物を最小にするのに有用である。この方法は、
強力に結合する放射性核種を高収率で獲得するのに必要
とされるジスルフィド結合の還元の第一段階を欠いてい
る。
03231 公報（1985年１月18日出願）は、過テクネチウム
酸塩を還元するのに使用した低濃度の Sn(II) を安定化
するのにゲンチジン酸を使用している。この方法は、ラ
ジオコロイドおよび酸化された放射性核種といった放射
化学不純物を最小にするのに有用である。この方法は、
強力に結合する放射性核種を高収率で獲得するのに必要
とされるジスルフィド結合の還元の第一段階を欠いてい
る。
【００１６】Lees, R.S., 米国特許第4,647,445 号明細
書, "Rdaiolabelled Lipoproteinsand Method for Maki
ng Same" は、過テクネチウム酸塩とリポタンパク質を
同時に還元するのにpH 8〜9 でジチオニットを使用して
いる。この方法は、使用前に標識生成物をカラムクロマ
トグラフィーにより精製して放射性核種不純物を除去す
ることを必要とする。
書, "Rdaiolabelled Lipoproteinsand Method for Maki
ng Same" は、過テクネチウム酸塩とリポタンパク質を
同時に還元するのにpH 8〜9 でジチオニットを使用して
いる。この方法は、使用前に標識生成物をカラムクロマ
トグラフィーにより精製して放射性核種不純物を除去す
ることを必要とする。
【００１７】Breedveld, F.C. ら、"Imaging of Inflam
matory Arthristis with Technetium-99m-Labeled Ig
G," Journal of Nuclear Medicine, 第30巻, 第12号,
2017-2021 頁, 1989は、まず過テクネチウム酸塩を塩酸
で還元し、次いで放射性核種を抽出、転移、蒸発乾固さ
せる。この乾燥した還元された放射性核種を含む容器に
タンパク質を添加する。40℃で60分間のインキュベーシ
ョン中に標識が達成される。この方法は、放射性核種の
多大な前処理を必要とし、よって薬剤を標識および製剤
するためのインスタントキット法には容易に応用されな
い。
matory Arthristis with Technetium-99m-Labeled Ig
G," Journal of Nuclear Medicine, 第30巻, 第12号,
2017-2021 頁, 1989は、まず過テクネチウム酸塩を塩酸
で還元し、次いで放射性核種を抽出、転移、蒸発乾固さ
せる。この乾燥した還元された放射性核種を含む容器に
タンパク質を添加する。40℃で60分間のインキュベーシ
ョン中に標識が達成される。この方法は、放射性核種の
多大な前処理を必要とし、よって薬剤を標識および製剤
するためのインスタントキット法には容易に応用されな
い。
【００１８】McKenzie, I.ら、"Coupling of the 99mTe
chnetium-Nitrido Group to Monoclonal Antibody and
Use of the Complexes for the Detection of Tumors i
n Mice," Journal of the National Cancer Institut
e, 第77巻, 431-439 頁, 1986、およびPCT 国際出願公
開WO 87/04164 公報（1986年１月６日出願）は、抗体を
還元して遊離スルフヒドリル基結合部位を提供するかま
たは遊離スルフヒドリル結合部位基を導入し、そして該
部位を 99mTcN(Cl)4 - で標識する。その生成物は、使用
前に放射性核種不純物を減らすためのゲルクロマトグラ
フィーによる精製を必要とする。
chnetium-Nitrido Group to Monoclonal Antibody and
Use of the Complexes for the Detection of Tumors i
n Mice," Journal of the National Cancer Institut
e, 第77巻, 431-439 頁, 1986、およびPCT 国際出願公
開WO 87/04164 公報（1986年１月６日出願）は、抗体を
還元して遊離スルフヒドリル基結合部位を提供するかま
たは遊離スルフヒドリル結合部位基を導入し、そして該
部位を 99mTcN(Cl)4 - で標識する。その生成物は、使用
前に放射性核種不純物を減らすためのゲルクロマトグラ
フィーによる精製を必要とする。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】従来方法はいずれも、
有意な放射化学不純物を含まない注入可能な生成物、そ
して標識しようとするタンパク質が抗体である時は免疫
反応性を変えることなしに放射性核種がタンパク質に定
量的に且つ強力に結合するような生成物、を15分以内に
提供する一段階標識用キットおよび方法を提供すること
ができなかった。その上、多くの従来方法は潜在的に毒
性の化学物質を使用する。Crockford およびRhodesの予
備錫はんだ法は、タンパク質に強力に結合する約85％の
放射性核種を与える迅速な一段階標識方法を提供するこ
とができたけれども、放射化学純度は全てのモノローナ
ル抗体の臨床適用に十分なほど高くはなく、そして生成
物によっては患者への投与前に最後の精製を必要とし
た。
有意な放射化学不純物を含まない注入可能な生成物、そ
して標識しようとするタンパク質が抗体である時は免疫
反応性を変えることなしに放射性核種がタンパク質に定
量的に且つ強力に結合するような生成物、を15分以内に
提供する一段階標識用キットおよび方法を提供すること
ができなかった。その上、多くの従来方法は潜在的に毒
性の化学物質を使用する。Crockford およびRhodesの予
備錫はんだ法は、タンパク質に強力に結合する約85％の
放射性核種を与える迅速な一段階標識方法を提供するこ
とができたけれども、放射化学純度は全てのモノローナ
ル抗体の臨床適用に十分なほど高くはなく、そして生成
物によっては患者への投与前に最後の精製を必要とし
た。
【００２０】
【課題を解決するための手段】本発明では、一段階標識
の簡便性を保持したまま、タンパク質を還元するための
最適条件と放射性核種を還元するための最適条件の両方
を達成することができる。これは製造工程に段階を追加
することにより達成される。Crockford およびRhodesに
より記載された元の予備はんだ法と同様にしてタンパク
質を Sn(II) で還元する。還元が完了した後、還元され
たタンパク質を精製または複合体形成段階に付し、過剰
の還元剤および反応副生成物、例えば塩化第一錫または
他の Sn(IV) 剤を除去する。あるいは、有機還元剤を使
ってタンパク質を還元し、有機還元剤および反応生成物
を取り出し、そして Sn(II) を添加して Sn(II) および
硫黄含有タンパク質複合体を形成させる。 Sn(II) 放射
性核種還元剤は、その後の放射能標識に最適である濃度
において且つその後の放射能標識に最適である錯生成剤
と共に、還元されたタンパク質溶液に添加される。放射
性核種還元剤溶液と還元されたタンパク質とをアリコー
トに分け、凍結し、そして所望により放射能標識に必要
になるまで凍結乾燥保存する。
の簡便性を保持したまま、タンパク質を還元するための
最適条件と放射性核種を還元するための最適条件の両方
を達成することができる。これは製造工程に段階を追加
することにより達成される。Crockford およびRhodesに
より記載された元の予備はんだ法と同様にしてタンパク
質を Sn(II) で還元する。還元が完了した後、還元され
たタンパク質を精製または複合体形成段階に付し、過剰
の還元剤および反応副生成物、例えば塩化第一錫または
他の Sn(IV) 剤を除去する。あるいは、有機還元剤を使
ってタンパク質を還元し、有機還元剤および反応生成物
を取り出し、そして Sn(II) を添加して Sn(II) および
硫黄含有タンパク質複合体を形成させる。 Sn(II) 放射
性核種還元剤は、その後の放射能標識に最適である濃度
において且つその後の放射能標識に最適である錯生成剤
と共に、還元されたタンパク質溶液に添加される。放射
性核種還元剤溶液と還元されたタンパク質とをアリコー
トに分け、凍結し、そして所望により放射能標識に必要
になるまで凍結乾燥保存する。
【００２１】別法は、タンパク質を還元しそして Sn(I
I) および硫黄を含むタンパク質複合体を形成させるの
に最適な試薬の濃度において上記特許第'200号明細書に
開示されたCrockford およびRhodesの予備はんだ法を使
って抗体を還元し、次いでこの溶液を試薬で希釈して、
放射性核種を還元しそしてそれをタンパク質に転移させ
るのに最適な条件を獲得することである。
I) および硫黄を含むタンパク質複合体を形成させるの
に最適な試薬の濃度において上記特許第'200号明細書に
開示されたCrockford およびRhodesの予備はんだ法を使
って抗体を還元し、次いでこの溶液を試薬で希釈して、
放射性核種を還元しそしてそれをタンパク質に転移させ
るのに最適な条件を獲得することである。
【００２２】本発明によれば、タンパク質をテクネチウ
ムまたはレニウムで放射能標識する方法であって、還元
剤を使ってタンパク質中のジスルフィド結合を還元し；
過剰の還元剤、反応副生成物およびあらゆる不純物を除
去し；そして最適な低濃度および限定量の過テクネチウ
ム酸塩または過レニウム酸塩還元剤を添加し、過テクネ
チウム酸ナトリウムまたは過レニウム酸ナトリウムを還
元し、リガンド交換反応による還元されたタンパク質の
迅速な標識を促進する方法が提供される。
ムまたはレニウムで放射能標識する方法であって、還元
剤を使ってタンパク質中のジスルフィド結合を還元し；
過剰の還元剤、反応副生成物およびあらゆる不純物を除
去し；そして最適な低濃度および限定量の過テクネチウ
ム酸塩または過レニウム酸塩還元剤を添加し、過テクネ
チウム酸ナトリウムまたは過レニウム酸ナトリウムを還
元し、リガンド交換反応による還元されたタンパク質の
迅速な標識を促進する方法が提供される。
【００２３】好ましい態様では、放射能標識しようとす
るタンパク質基質を、約4.5 〜約8.5 のpH、好ましくは
約pH 5.6を有する塩化錫 (II) 組成物の溶液と混合す
る。該溶液は酒石酸カリウムナトリウムとフタル酸水素
カリウムの混合物を更に含有し、pHは水酸化ナトリウム
を使って約 5.6±0.05に調整され、生じた溶液を酸素で
パージされる。あるいは、該溶液が他の塩、例えば塩化
ナトリウム、酢酸ナトリウム、ゲンチジン酸、またはフ
ッ化第一錫を含んでもよい。 Sn(II) 塩溶液は酸素の非
存在下で室温でタンパク質に添加され、タンパク質と S
n(II) 塩溶液が酸素の非存在下で室温で数時間（通常は
21時間）インキュベートされる。あるいは、インキュベ
ーション期間との対応する逆変化を使って、例えばイン
キュベーション温度を増加させるとインキュベーション
期間を減少させるといったようにして、高いまたは低い
インキュベーション温度を使用することができる。ある
種のタンパク質には、反応時間を21時間未満短縮して抗
体タンパク質の過剰の断片化を防ぐことができ、タンパ
ク質が既に反応性スルフィド基を含む場合には更に反応
時間を減少させることができる。
るタンパク質基質を、約4.5 〜約8.5 のpH、好ましくは
約pH 5.6を有する塩化錫 (II) 組成物の溶液と混合す
る。該溶液は酒石酸カリウムナトリウムとフタル酸水素
カリウムの混合物を更に含有し、pHは水酸化ナトリウム
を使って約 5.6±0.05に調整され、生じた溶液を酸素で
パージされる。あるいは、該溶液が他の塩、例えば塩化
ナトリウム、酢酸ナトリウム、ゲンチジン酸、またはフ
ッ化第一錫を含んでもよい。 Sn(II) 塩溶液は酸素の非
存在下で室温でタンパク質に添加され、タンパク質と S
n(II) 塩溶液が酸素の非存在下で室温で数時間（通常は
21時間）インキュベートされる。あるいは、インキュベ
ーション期間との対応する逆変化を使って、例えばイン
キュベーション温度を増加させるとインキュベーション
期間を減少させるといったようにして、高いまたは低い
インキュベーション温度を使用することができる。ある
種のタンパク質には、反応時間を21時間未満短縮して抗
体タンパク質の過剰の断片化を防ぐことができ、タンパ
ク質が既に反応性スルフィド基を含む場合には更に反応
時間を減少させることができる。
【００２４】あるいは、タンパク質をジスルフィド基還
元剤、例えばジチオトレイトール(DTT) と共に、水溶液
１mlあたりタンパク質５mgあたり10mgのDTT の比におい
て室温で30分間インキュベートすることにより、タンパ
ク質を一層迅速に還元することができる。任意の手段に
よる精製により還元剤を除去する。この後、希HCl を添
加してpHを 5.6±0.05に低下させ、次いでpH 5.6±0.05
において Sn(II) 酒石酸塩溶液を添加する。
元剤、例えばジチオトレイトール(DTT) と共に、水溶液
１mlあたりタンパク質５mgあたり10mgのDTT の比におい
て室温で30分間インキュベートすることにより、タンパ
ク質を一層迅速に還元することができる。任意の手段に
よる精製により還元剤を除去する。この後、希HCl を添
加してpHを 5.6±0.05に低下させ、次いでpH 5.6±0.05
において Sn(II) 酒石酸塩溶液を添加する。
【００２５】インキュベーション後、タンパク質とSn(I
I)塩溶液を凍結させて還元反応を停止させるか、または
塩類溶液で平衡化されたカラム中の適当なゲルを使って
サイズ排除クロマトグラフィーにより精製する。タンパ
ク質および緩衝化されたSn(II)塩溶液をカラム上に負荷
し、塩類溶液を使って溶出させ、溶出液の分子量をモニ
タリングし、そして関連する分画を収集する。必要であ
れば、少量の Sn(II)溶液を添加する。放射能標識しよ
うとするタンパク質に該当する分画を収集し、プール
し、限外濾過により濃縮する。あるいは、タンパク質を
他の任意の適当な手段、例えば透析、限外濾過、沈澱、
分取用高性能液体クロマトグラフィー、アフィニティー
クロマトグラフィー、他の形態のクロマトグラフィー、
または分取用等電点電気泳動により精製してもよい。過
剰のSn(II)溶液、Sn(IV)塩、汚染物または放射能標識し
ようとするタンパク質以外の分子量のタンパク質を実質
的に含まない得られたタンパク質を、無酸素バイアル中
で凍結せしめることができる。
I)塩溶液を凍結させて還元反応を停止させるか、または
塩類溶液で平衡化されたカラム中の適当なゲルを使って
サイズ排除クロマトグラフィーにより精製する。タンパ
ク質および緩衝化されたSn(II)塩溶液をカラム上に負荷
し、塩類溶液を使って溶出させ、溶出液の分子量をモニ
タリングし、そして関連する分画を収集する。必要であ
れば、少量の Sn(II)溶液を添加する。放射能標識しよ
うとするタンパク質に該当する分画を収集し、プール
し、限外濾過により濃縮する。あるいは、タンパク質を
他の任意の適当な手段、例えば透析、限外濾過、沈澱、
分取用高性能液体クロマトグラフィー、アフィニティー
クロマトグラフィー、他の形態のクロマトグラフィー、
または分取用等電点電気泳動により精製してもよい。過
剰のSn(II)溶液、Sn(IV)塩、汚染物または放射能標識し
ようとするタンパク質以外の分子量のタンパク質を実質
的に含まない得られたタンパク質を、無酸素バイアル中
で凍結せしめることができる。
【００２６】精製され還元されそして Sn(II) 錯生成さ
れた凍結タンパク質に、塩類溶液中の過テクネチウム酸
ナトリウムまたは過レニウム酸ナトリウムを還元するこ
とのできる溶液を、この２溶液の即座混合を防ぐような
方法で添加する。純粋な錫ペレットを各々のバイアルに
添加することもできる。得られた２溶液の組合せは凍結
溶液の層として調製されるか、またはそうでなければ還
元され、精製されそして凍結されたタンパク質と、過テ
クネチウム酸ナトリウムまたは過レニウム酸ナトリウム
を還元するための溶液との間の反応を起こすことのない
ように調製される。還元され精製されたタンパク質の放
射線分解を防ぐために、そして表面、例えばバイアル壁
への還元され精製されたタンパク質の付着を防ぐため
に、担体タンパク質を添加してもよい。担体タンパク
質、例えば非還元ヒト血清アルブミンまたは他の不活性
希釈剤、例えばイノシトール、または他の不活性な糖も
しくはアミノ酸、例えばグリシン、の層を添加し、そし
て層を凍結させるかまたは他の方法で使用まで他の溶液
と混合しないように調製する。２つの未混合の溶液を含
むバイアルから酸素を排気せしめる。放射能標識を希望
する時の再構成まで、このバイアルを凍結保存するかま
たは凍結乾燥して保存する。過テクネチウム酸ナトリウ
ムまたは過レニウム酸ナトリウムを還元するための溶液
は、塩化第一錫、および酒石酸ナトリウムカリウムとフ
タル酸水素カリウムの混合物を含んで成り、pHは水酸化
ナトリウムを使って約 5.6±0.05に調整され、生じた溶
液は酸素パージされる。実際には、同一の Sn(II) 溶液
を使ってタンパク質と過テクネチウム酸ナトリウムまた
は過レニウム酸ナトリウムの両方を還元することができ
る。
れた凍結タンパク質に、塩類溶液中の過テクネチウム酸
ナトリウムまたは過レニウム酸ナトリウムを還元するこ
とのできる溶液を、この２溶液の即座混合を防ぐような
方法で添加する。純粋な錫ペレットを各々のバイアルに
添加することもできる。得られた２溶液の組合せは凍結
溶液の層として調製されるか、またはそうでなければ還
元され、精製されそして凍結されたタンパク質と、過テ
クネチウム酸ナトリウムまたは過レニウム酸ナトリウム
を還元するための溶液との間の反応を起こすことのない
ように調製される。還元され精製されたタンパク質の放
射線分解を防ぐために、そして表面、例えばバイアル壁
への還元され精製されたタンパク質の付着を防ぐため
に、担体タンパク質を添加してもよい。担体タンパク
質、例えば非還元ヒト血清アルブミンまたは他の不活性
希釈剤、例えばイノシトール、または他の不活性な糖も
しくはアミノ酸、例えばグリシン、の層を添加し、そし
て層を凍結させるかまたは他の方法で使用まで他の溶液
と混合しないように調製する。２つの未混合の溶液を含
むバイアルから酸素を排気せしめる。放射能標識を希望
する時の再構成まで、このバイアルを凍結保存するかま
たは凍結乾燥して保存する。過テクネチウム酸ナトリウ
ムまたは過レニウム酸ナトリウムを還元するための溶液
は、塩化第一錫、および酒石酸ナトリウムカリウムとフ
タル酸水素カリウムの混合物を含んで成り、pHは水酸化
ナトリウムを使って約 5.6±0.05に調整され、生じた溶
液は酸素パージされる。実際には、同一の Sn(II) 溶液
を使ってタンパク質と過テクネチウム酸ナトリウムまた
は過レニウム酸ナトリウムの両方を還元することができ
る。
【００２７】しかしながら、過テクネチウム酸ナトリウ
ムまたは過レニウム酸ナトリウムを還元するのに使われ
る Sn(II) 塩の量および濃度は、タンパク質を還元する
のに使われる Sn(II) 塩の量および濃度よりも実質的に
少ない。あるいは、過テクネチウム酸ナトリウムまたは
過レニウム酸ナトリウムを還元するのに使う溶液は、過
テクネチウム酸ナトリウムまたは過レニウム酸ナトリウ
ムを効率的に還元し且つ放射能標識しようとするタンパ
ク質を変化させない任意の物質、例えば酒石酸第一錫、
グルコン酸第一錫、グルコヘプトン酸第一錫、または過
テクネチウム酸ナトリウムもしくは過レニウム酸ナトリ
ウムを還元することのできる他の物質から成ることがで
きる。塩化第一錫およびあらゆるそのような他の第一錫
化合物を、明細書および請求の範囲において Sn(II) と
呼称する。過テクネチウム酸ナトリウムまたは過レニウ
ム酸ナトリウムを還元するのに過テクネチウム酸ナトリ
ウムまたは過レニウム酸ナトリウム還元溶液以外のもの
は全く必要でない。これは、主として放射性核種還元剤
の作用によるジスルフィド結合の更なる開裂によって起
こりうるタンパク質分解を防ぐ。
ムまたは過レニウム酸ナトリウムを還元するのに使われ
る Sn(II) 塩の量および濃度は、タンパク質を還元する
のに使われる Sn(II) 塩の量および濃度よりも実質的に
少ない。あるいは、過テクネチウム酸ナトリウムまたは
過レニウム酸ナトリウムを還元するのに使う溶液は、過
テクネチウム酸ナトリウムまたは過レニウム酸ナトリウ
ムを効率的に還元し且つ放射能標識しようとするタンパ
ク質を変化させない任意の物質、例えば酒石酸第一錫、
グルコン酸第一錫、グルコヘプトン酸第一錫、または過
テクネチウム酸ナトリウムもしくは過レニウム酸ナトリ
ウムを還元することのできる他の物質から成ることがで
きる。塩化第一錫およびあらゆるそのような他の第一錫
化合物を、明細書および請求の範囲において Sn(II) と
呼称する。過テクネチウム酸ナトリウムまたは過レニウ
ム酸ナトリウムを還元するのに過テクネチウム酸ナトリ
ウムまたは過レニウム酸ナトリウム還元溶液以外のもの
は全く必要でない。これは、主として放射性核種還元剤
の作用によるジスルフィド結合の更なる開裂によって起
こりうるタンパク質分解を防ぐ。
【００２８】固体の高純度金属錫を、凍結時にまたは凍
結後に、酸化されていない錫ペレットの形でバイアルに
添加することができる。金属錫の添加は、保存および再
構成中の酸化損失を防ぐことができる。
結後に、酸化されていない錫ペレットの形でバイアルに
添加することができる。金属錫の添加は、保存および再
構成中の酸化損失を防ぐことができる。
【００２９】錫ペレット、担体タンパク質および他の不
活性希釈剤と一緒の、得られた還元・精製された Sn(I
I) および硫黄含有タンパク質複合体と放射性核種還元
溶液との凍結または凍結乾燥組成物は、酸素の導入を避
けながら、Tc-99m過テクネチウム酸ナトリウムまたは過
レニウム酸ナトリウム溶液と混合される。次いでテクネ
チウムまたはレニウムの還元および還元され Sn(II) 錯
生成されたタンパク質へのテクネチウムまたはレニウム
の結合を考慮して、混合物をある期間（通常は15分間）
室温でインキュベートする。担体タンパク質がもとのバ
イアル中に含まれなかった場合には、通常の塩類溶液中
のヒト血清アルブミンまたは他の同様なタンパク質の添
加により、この混合物を安定化することができる。
活性希釈剤と一緒の、得られた還元・精製された Sn(I
I) および硫黄含有タンパク質複合体と放射性核種還元
溶液との凍結または凍結乾燥組成物は、酸素の導入を避
けながら、Tc-99m過テクネチウム酸ナトリウムまたは過
レニウム酸ナトリウム溶液と混合される。次いでテクネ
チウムまたはレニウムの還元および還元され Sn(II) 錯
生成されたタンパク質へのテクネチウムまたはレニウム
の結合を考慮して、混合物をある期間（通常は15分間）
室温でインキュベートする。担体タンパク質がもとのバ
イアル中に含まれなかった場合には、通常の塩類溶液中
のヒト血清アルブミンまたは他の同様なタンパク質の添
加により、この混合物を安定化することができる。
【００３０】従って本発明は、タンパク質を第一の還元
剤と共にインキュベートしてジスルフィド結合を部分的
に還元し、還元され Sn(II) 錯生成されたタンパク質を
精製して過剰の第一の還元剤およびあらゆる不純物を除
去し、そして過テクネチウム酸塩または過レニウム酸塩
を還元するのに必要である分だけの第二の還元剤を添加
することによる、反応性スルフィド基を含むタンパク質
をテクネチウムまたはレニウムの放射性核種で放射能標
識して安定な標識物を得る方法を提供する。好ましい第
一の還元剤は、約5.0 〜6.0 のpHを有するアルカリ金属
フタル酸水素塩とアルカリ金属酒石酸塩の混合物から成
る溶液中の Sn(II) 源である。第一の還元剤は２−メル
カプトエタノール、１，４−ジチオトレイトール、２，
３−ジヒドロキシブタン−１，４−ジチオール、２−ア
ミノエタンチオールHCl 塩、２−メルカプトエチルアミ
ン、チオグリコレート、シアニド、システイン、または
ジスルフィド結合を還元することのできる他の物質であ
る。次いで Sn(II) を添加して中間体の Sn(II) および
硫黄含有複合体を形成せしめる。好ましい第二の還元剤
は、好ましくは約5.0 〜6.0 のpHを有するアルカリ金属
フタル酸水素塩とアルカリ金属酒石酸塩の混合物から成
る溶液中の Sn(II) 源である。第二の還元剤は酒石酸 S
n(II) 、グルコン酸 Sn(II) 、グルコヘプトン酸 Sn(I
I) 、ホスホン酸 Sn(II) 、ジチオニット、または過テ
クネチウム酸塩もしくは過レニウム酸塩を還元すること
のできる他の物質であってもよい。タンパク質複合体の
精製後、精製されたタンパク質複合体を凍結させ、第二
の還元剤を添加し、そして使用のために解凍する前に精
製タンパク質複合体と第二の還元剤との間で化学反応が
起こらないように第二の還元剤を即座に凍結させる。タ
ンパク質複合体と第二の還元剤の凍結後、該組成物を凍
結乾燥することも可能である。第二の還元剤の添加時ま
たはその後、タンパク質複合体と第二の還元剤との組合
せに、酸化されていない固体の金属錫を添加することが
できる。タンパク質複合体をサイズ排除クロマトグラフ
ィーカラムに通過させることにより、または脱塩カラ
ム、透析、限外濾過、沈澱、分取用高性能液体クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィーもしく
は分取用等電点電気泳動の使用により精製を行うことが
できる。タンパク質複合体と第二の還元剤中のタンパク
質の濃度が少なくとも１mg／ml溶液であり、そしてタン
パク質複合体と第二の還元剤の容量が少なくとも２mlで
ある時、最適な結果が得られる。
剤と共にインキュベートしてジスルフィド結合を部分的
に還元し、還元され Sn(II) 錯生成されたタンパク質を
精製して過剰の第一の還元剤およびあらゆる不純物を除
去し、そして過テクネチウム酸塩または過レニウム酸塩
を還元するのに必要である分だけの第二の還元剤を添加
することによる、反応性スルフィド基を含むタンパク質
をテクネチウムまたはレニウムの放射性核種で放射能標
識して安定な標識物を得る方法を提供する。好ましい第
一の還元剤は、約5.0 〜6.0 のpHを有するアルカリ金属
フタル酸水素塩とアルカリ金属酒石酸塩の混合物から成
る溶液中の Sn(II) 源である。第一の還元剤は２−メル
カプトエタノール、１，４−ジチオトレイトール、２，
３−ジヒドロキシブタン−１，４−ジチオール、２−ア
ミノエタンチオールHCl 塩、２−メルカプトエチルアミ
ン、チオグリコレート、シアニド、システイン、または
ジスルフィド結合を還元することのできる他の物質であ
る。次いで Sn(II) を添加して中間体の Sn(II) および
硫黄含有複合体を形成せしめる。好ましい第二の還元剤
は、好ましくは約5.0 〜6.0 のpHを有するアルカリ金属
フタル酸水素塩とアルカリ金属酒石酸塩の混合物から成
る溶液中の Sn(II) 源である。第二の還元剤は酒石酸 S
n(II) 、グルコン酸 Sn(II) 、グルコヘプトン酸 Sn(I
I) 、ホスホン酸 Sn(II) 、ジチオニット、または過テ
クネチウム酸塩もしくは過レニウム酸塩を還元すること
のできる他の物質であってもよい。タンパク質複合体の
精製後、精製されたタンパク質複合体を凍結させ、第二
の還元剤を添加し、そして使用のために解凍する前に精
製タンパク質複合体と第二の還元剤との間で化学反応が
起こらないように第二の還元剤を即座に凍結させる。タ
ンパク質複合体と第二の還元剤の凍結後、該組成物を凍
結乾燥することも可能である。第二の還元剤の添加時ま
たはその後、タンパク質複合体と第二の還元剤との組合
せに、酸化されていない固体の金属錫を添加することが
できる。タンパク質複合体をサイズ排除クロマトグラフ
ィーカラムに通過させることにより、または脱塩カラ
ム、透析、限外濾過、沈澱、分取用高性能液体クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィーもしく
は分取用等電点電気泳動の使用により精製を行うことが
できる。タンパク質複合体と第二の還元剤中のタンパク
質の濃度が少なくとも１mg／ml溶液であり、そしてタン
パク質複合体と第二の還元剤の容量が少なくとも２mlで
ある時、最適な結果が得られる。
【００３１】本発明は、テクネチウムまたはレニウムの
放射性核種の安定な標識を有するタンパク質を調製する
際の使用に適する組成物を提供する。この組成物は、放
射性核種および硫黄を含む複合体が形成されるように還
元されているタンパク質；該タンパク質の更なる還元を
引き起こすことなく過テクネチウム酸塩または過レニウ
ム酸塩を還元するであろう分だけの Sn(II) ；および所
望により、酸化されていない純粋な金属錫を含んで成
る。酸化されていない純粋な金属錫の源は錫ペレットで
あることができる。該組成物は還元されたタンパク質と
して還元された抗体または抗体断片を使って作製するこ
とができる。不活性な担体物質、例えば不活性なまたは
還元されない不活性なタンパク質を組成物に添加しても
よい。該組成物は凍結され、好ましくは４〜６のpHに緩
衝化される。
放射性核種の安定な標識を有するタンパク質を調製する
際の使用に適する組成物を提供する。この組成物は、放
射性核種および硫黄を含む複合体が形成されるように還
元されているタンパク質；該タンパク質の更なる還元を
引き起こすことなく過テクネチウム酸塩または過レニウ
ム酸塩を還元するであろう分だけの Sn(II) ；および所
望により、酸化されていない純粋な金属錫を含んで成
る。酸化されていない純粋な金属錫の源は錫ペレットで
あることができる。該組成物は還元されたタンパク質と
して還元された抗体または抗体断片を使って作製するこ
とができる。不活性な担体物質、例えば不活性なまたは
還元されない不活性なタンパク質を組成物に添加しても
よい。該組成物は凍結され、好ましくは４〜６のpHに緩
衝化される。
【００３２】必要であれば安定剤と共に、精製された S
n(II) および硫黄含有複合体と放射性核種還元溶液との
凍結または凍結乾燥組合せを単一の無酸素バイアル中に
含む、放射能標識にすぐ使用できるキットも提供され
る。
n(II) および硫黄含有複合体と放射性核種還元溶液との
凍結または凍結乾燥組合せを単一の無酸素バイアル中に
含む、放射能標識にすぐ使用できるキットも提供され
る。
【００３３】モノスルフィドまたはジスルフィド結合を
有するタンパク質は、第一の Sn(II) 剤または上述した
ような他の還元剤とのインキュベーションにより放射性
核種、例えばテクネチウムまたはレニウムで放射能標識
することができる。インキュベーション期間は、 Sn(I
I) および硫黄含有複合体の形成を可能にするほど十分
でなければならない。複合体形成の結果として、 Sn(I
V) 反応副生成物、例えば塩化第二錫、および他の不純
物、例えばタンパク質断片または重合体が形成され得
る。次いで精製段階を使って Sn(IV) および他の不純物
を実質的に除去する。次いで Sn(II) および硫黄含有タ
ンパク質複合体に、放射性核種を還元するのに十分な量
の第二の Sn(II) 剤を添加する。放射能標識物を添加す
ることにより放射能標識を行い、それによって第二の S
n(II) 剤が放射性核種を還元し、そして還元された放射
性核種がタンパク質中で Sn(II) および硫黄含有複合体
を形成する。
有するタンパク質は、第一の Sn(II) 剤または上述した
ような他の還元剤とのインキュベーションにより放射性
核種、例えばテクネチウムまたはレニウムで放射能標識
することができる。インキュベーション期間は、 Sn(I
I) および硫黄含有複合体の形成を可能にするほど十分
でなければならない。複合体形成の結果として、 Sn(I
V) 反応副生成物、例えば塩化第二錫、および他の不純
物、例えばタンパク質断片または重合体が形成され得
る。次いで精製段階を使って Sn(IV) および他の不純物
を実質的に除去する。次いで Sn(II) および硫黄含有タ
ンパク質複合体に、放射性核種を還元するのに十分な量
の第二の Sn(II) 剤を添加する。放射能標識物を添加す
ることにより放射能標識を行い、それによって第二の S
n(II) 剤が放射性核種を還元し、そして還元された放射
性核種がタンパク質中で Sn(II) および硫黄含有複合体
を形成する。
【００３４】放射能標識は、第二の Sn(II) 剤の添加の
段階を省略することによっても行うことができる。この
場合、残りの第一の Sn(II) 剤が放射性核種を還元し、
そして還元された放射性核種がタンパク質中で Sn(II)
および硫黄含有複合体を形成する。これは、 Sn(II) お
よび硫黄含有タンパク質複合体を形成せしめた後に反応
混合物を希釈することによって行うこともできる。
段階を省略することによっても行うことができる。この
場合、残りの第一の Sn(II) 剤が放射性核種を還元し、
そして還元された放射性核種がタンパク質中で Sn(II)
および硫黄含有複合体を形成する。これは、 Sn(II) お
よび硫黄含有タンパク質複合体を形成せしめた後に反応
混合物を希釈することによって行うこともできる。
【００３５】それらの方法は、特に過テクネチウム酸ナ
トリウムの形のテクネチウム−99mに適用可能である。
第一の Sn(II) 剤も第二の Sn(II) 剤も、5.0 〜6.0 の
pHを有するアルカリ金属酒石酸塩を含む溶液中に最適に
存在する。第二の Sn(II) 剤は、グルコヘプトン酸第一
錫、グルコン酸第一錫、ホスホン酸第一錫、ジチオニッ
トといった物質、または放射性核種を還元することので
きる他の物質から成ることもできる。
トリウムの形のテクネチウム−99mに適用可能である。
第一の Sn(II) 剤も第二の Sn(II) 剤も、5.0 〜6.0 の
pHを有するアルカリ金属酒石酸塩を含む溶液中に最適に
存在する。第二の Sn(II) 剤は、グルコヘプトン酸第一
錫、グルコン酸第一錫、ホスホン酸第一錫、ジチオニッ
トといった物質、または放射性核種を還元することので
きる他の物質から成ることもできる。
【００３６】それらの方法は、特にモノクローナル抗
体、モノクローナル抗体断片およびポリクローナル抗体
に適用可能である。この方法を使って生成物を製造する
ことができ、過テクネチウム酸ナトリウムまたは過レニ
ウム酸ナトリウムの導入およびインキュベーション期間
によりテクネチウムまたはレニウムで放射能標識した時
の生成物が、85％またはそれ以上のタンパク質に強力に
結合したテクネチウムまたはレニウムを有することによ
り更に特徴づけられる。更に、モノクローナル抗体また
はモノクローナル抗体断片を使って生成物を作る時、該
生成物の免疫反応性は、第一の Sn(II) 剤とのインキュ
ベーション前の抗体の免疫反応性と実質的に同じであ
る。生成物は凍結乾燥することができ、そして患者への
生体内投与前に濾過または精製を必要としない。
体、モノクローナル抗体断片およびポリクローナル抗体
に適用可能である。この方法を使って生成物を製造する
ことができ、過テクネチウム酸ナトリウムまたは過レニ
ウム酸ナトリウムの導入およびインキュベーション期間
によりテクネチウムまたはレニウムで放射能標識した時
の生成物が、85％またはそれ以上のタンパク質に強力に
結合したテクネチウムまたはレニウムを有することによ
り更に特徴づけられる。更に、モノクローナル抗体また
はモノクローナル抗体断片を使って生成物を作る時、該
生成物の免疫反応性は、第一の Sn(II) 剤とのインキュ
ベーション前の抗体の免疫反応性と実質的に同じであ
る。生成物は凍結乾燥することができ、そして患者への
生体内投与前に濾過または精製を必要としない。
【００３７】モノスルフィドまたはジスルフィド結合を
有するタンパク質は、上記方法の変形を使ってテクネチ
ウムまたはレニウムのような放射性核種で放射能標識す
ることもできる。タンパク質を第一の Sn(II) 剤（これ
は上記と同様であってもよい）と共にインキュベートす
る。インキュベーション期間は Sn(II) および硫黄含有
複合体の形成を可能にするのに十分でなければならな
い。複合体形成の結果として、 Sn(IV) 反応副生成物お
よび他の不純物が形成され得る。次いで Sn(IV)反応副
生成物をポリアミノカルボン酸、例えばエチレンジアミ
ン四酢酸（EDTA）またはジエチレントリアミノペンタ酢
酸（DTPA）と錯生成させることができる。放射性核種を
添加することによって放射能標識が行われ、これによっ
て残余の第一の Sn(II) 剤が放射性核種を還元し、そし
て還元された放射性核種がタンパク質中で放射性核種お
よび硫黄含有複合体を形成する。
有するタンパク質は、上記方法の変形を使ってテクネチ
ウムまたはレニウムのような放射性核種で放射能標識す
ることもできる。タンパク質を第一の Sn(II) 剤（これ
は上記と同様であってもよい）と共にインキュベートす
る。インキュベーション期間は Sn(II) および硫黄含有
複合体の形成を可能にするのに十分でなければならな
い。複合体形成の結果として、 Sn(IV) 反応副生成物お
よび他の不純物が形成され得る。次いで Sn(IV)反応副
生成物をポリアミノカルボン酸、例えばエチレンジアミ
ン四酢酸（EDTA）またはジエチレントリアミノペンタ酢
酸（DTPA）と錯生成させることができる。放射性核種を
添加することによって放射能標識が行われ、これによっ
て残余の第一の Sn(II) 剤が放射性核種を還元し、そし
て還元された放射性核種がタンパク質中で放射性核種お
よび硫黄含有複合体を形成する。
【００３８】放射能標識は、最適には、ポリアミノカル
ボン酸のような錯生成剤の添加後、放射性核種の還元を
促進するために、第二の Sn(II) 剤の添加によって行う
ことができる。
ボン酸のような錯生成剤の添加後、放射性核種の還元を
促進するために、第二の Sn(II) 剤の添加によって行う
ことができる。
【００３９】ポリアミノカルボン酸を使った方法は、特
に過テクネチウム酸ナトリウムの形のテクネチウム−99
m に適用可能である。好ましくは、第一の Sn(II) 剤も
第二の Sn(II) 剤も両方とも、5.0 〜6.0 のpHを有する
アルカリ金属酒石酸塩を含む溶液中に存在する。第二の
Sn(II) 剤は、グルコヘプトン酸第一錫、グルコン酸第
一錫、ホスホン酸第一錫といった物質、または放射性核
種を還元することのできる他の物質から成ることもでき
る。
に過テクネチウム酸ナトリウムの形のテクネチウム−99
m に適用可能である。好ましくは、第一の Sn(II) 剤も
第二の Sn(II) 剤も両方とも、5.0 〜6.0 のpHを有する
アルカリ金属酒石酸塩を含む溶液中に存在する。第二の
Sn(II) 剤は、グルコヘプトン酸第一錫、グルコン酸第
一錫、ホスホン酸第一錫といった物質、または放射性核
種を還元することのできる他の物質から成ることもでき
る。
【００４０】ポリアミノカルボン酸を使った方法は、特
にモノクローナル抗体、モノクローナル抗体断片および
ポリクローナル抗体に適用可能である。この方法は、過
テクネチウム酸ナトリウムまたは過レニウム酸ナトリウ
ムの導入およびインキュベーション期間によりテクネチ
ウムまたはレニウムで放射能標識した時の生成物が85％
またはそれ以上のタンパク質に強力に結合したテクネチ
ウムまたはレニウムを有することにより更に特徴づけら
れる生成物を製造するのに用いることができる。更に、
モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体断片を使
って生成物を作る時、該生成物の免疫反応性は、第一の
Sn(II) 剤とのインキュベーション前の抗体の免疫反応
性と実質的に同じである。生成物は凍結乾燥することが
でき、そして患者への生体内投与前に濾過または精製を
必要としない。
にモノクローナル抗体、モノクローナル抗体断片および
ポリクローナル抗体に適用可能である。この方法は、過
テクネチウム酸ナトリウムまたは過レニウム酸ナトリウ
ムの導入およびインキュベーション期間によりテクネチ
ウムまたはレニウムで放射能標識した時の生成物が85％
またはそれ以上のタンパク質に強力に結合したテクネチ
ウムまたはレニウムを有することにより更に特徴づけら
れる生成物を製造するのに用いることができる。更に、
モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体断片を使
って生成物を作る時、該生成物の免疫反応性は、第一の
Sn(II) 剤とのインキュベーション前の抗体の免疫反応
性と実質的に同じである。生成物は凍結乾燥することが
でき、そして患者への生体内投与前に濾過または精製を
必要としない。
【００４１】上記方法は全て、 Sn(II) と錯生成した反
応性スルフィド基を含んで成る Sn(II) および硫黄含有
複合体が認められるタンパク様組成物をもたらし、該組
成物はテクネチウムおよびレニウムといった放射性核種
での放射能標識に適当である。この組成物は、放射性核
種を還元するのに十分な量の Sn(II) 還元剤も含んで成
ることができ、そして錯生成剤、好ましくはポリアミノ
カルボン酸、例えばEDTAまたはDTPAを更に含んでもよ
い。タンパク質はモノクローナル抗体、モノクローナル
抗体断片またはポリクローナル抗体であることができ、
そして生成物に変換することができる。生成物は凍結乾
燥することができる。過テクネチウム酸ナトリウムの導
入およびインキュベーション期間によりテクネチウムで
標識する場合、生成物がタンパク質に強力に結合した85
％またはそれ以上のテクネチウムを有することにより更
に特徴づけられる。それは15分間またはそれ未満のイン
キュベーション期間を必要とすることによっても更に特
徴づけられる。
応性スルフィド基を含んで成る Sn(II) および硫黄含有
複合体が認められるタンパク様組成物をもたらし、該組
成物はテクネチウムおよびレニウムといった放射性核種
での放射能標識に適当である。この組成物は、放射性核
種を還元するのに十分な量の Sn(II) 還元剤も含んで成
ることができ、そして錯生成剤、好ましくはポリアミノ
カルボン酸、例えばEDTAまたはDTPAを更に含んでもよ
い。タンパク質はモノクローナル抗体、モノクローナル
抗体断片またはポリクローナル抗体であることができ、
そして生成物に変換することができる。生成物は凍結乾
燥することができる。過テクネチウム酸ナトリウムの導
入およびインキュベーション期間によりテクネチウムで
標識する場合、生成物がタンパク質に強力に結合した85
％またはそれ以上のテクネチウムを有することにより更
に特徴づけられる。それは15分間またはそれ未満のイン
キュベーション期間を必要とすることによっても更に特
徴づけられる。
【００４２】従って、本発明の目的は、テクネチウムま
たはレニウムでのタンパク質の直接標識方法を提供する
ことであり、該方法は最終生成物から望ましくない断片
または分解されたタンパク質成分を排除するであろう。
たはレニウムでのタンパク質の直接標識方法を提供する
ことであり、該方法は最終生成物から望ましくない断片
または分解されたタンパク質成分を排除するであろう。
【００４３】本発明の他の目的は、放射性同位体として
テクネチウムまたはレニウムを使った放射能標識効率の
増加をもたらす方法を提供することである。本発明の更
なる目的は、放射能標識工程によって抗体または抗体断
片の親和力の低下を引き起こすことなく、抗体または抗
体断片を放射能標識する方法を提供することである。
テクネチウムまたはレニウムを使った放射能標識効率の
増加をもたらす方法を提供することである。本発明の更
なる目的は、放射能標識工程によって抗体または抗体断
片の親和力の低下を引き起こすことなく、抗体または抗
体断片を放射能標識する方法を提供することである。
【００４４】本発明の更なる目的は、潜在的に毒性のま
たは危険な化学物質を方法に使用しない、テクネチウム
またはレニウムでタンパク質を標識する方法を提供する
ことである。
たは危険な化学物質を方法に使用しない、テクネチウム
またはレニウムでタンパク質を標識する方法を提供する
ことである。
【００４５】本発明の他の目的は、還元された抗体と第
一錫イオンの両方を含有し、そして酸化損失に対して保
護する一方で少量の第一錫イオンを維持するための手段
を更に含有する単一バイアルを使って、最終使用者によ
り放射能標識を行うことを可能にする方法およびキット
を提供することである。該方法は放射能標識を行うのに
一段階のみを必要とし、即ち過テクネチウム酸ナトリウ
ムの導入の段階のみを必要とする。
一錫イオンの両方を含有し、そして酸化損失に対して保
護する一方で少量の第一錫イオンを維持するための手段
を更に含有する単一バイアルを使って、最終使用者によ
り放射能標識を行うことを可能にする方法およびキット
を提供することである。該方法は放射能標識を行うのに
一段階のみを必要とし、即ち過テクネチウム酸ナトリウ
ムの導入の段階のみを必要とする。
【００４６】本発明の他の目的、利点および新規特徴並
びに更なる適用可能性の範囲は、一部分は下記の詳細な
記載においてそして一部分は下記を吟味する時に当業者
に明らかとなるであろうし、または本発明の実施により
わかるであろう。本発明の目的および利点は、添付の請
求の範囲において特に指摘される手段および組合せを使
って実現および達成することができる。
びに更なる適用可能性の範囲は、一部分は下記の詳細な
記載においてそして一部分は下記を吟味する時に当業者
に明らかとなるであろうし、または本発明の実施により
わかるであろう。本発明の目的および利点は、添付の請
求の範囲において特に指摘される手段および組合せを使
って実現および達成することができる。
【００４７】
【発明の実施の形態】還元され得る１もしくは複数のモ
ノスルフィドもしくはジスルフィド結合を含む任意のタ
ンパク質、キレート剤または他の基質を、本発明に従っ
て放射能標識することができる。代表的な適当な基質と
しては、いずれかの源の、ヒト血清アルブミン、フィブ
リノーゲン、ウロキナーゼ、γ−グロブリン、糖タンパ
ク質、他のタンパク質および抗体、または抗体断片が挙
げられ、そして任意の手段により作製されたポリクロー
ナル抗体およびモノクローナル抗体、並びにキメラ抗体
および遺伝子操作された抗体、並びに上記の全ての抗体
断片が挙げられる。これにはヒトを含む任意の種起源の
任意のクラスの免疫グロブリン、例えばIgＧ，IgＭ，Ig
Ａ，IgＤまたはIgＭ、二または複数の抗原もしくはエピ
トープ特異性を有するキメラ抗体またはハイブリット抗
体、および上記の全ての断片、例えばF(ab')2, F(ab)2,
Fab', Fab、および他の断片、例えばハイブリッド断片
が挙げられ、そして更に任意の免疫グロブリンまたは、
特異的抗原と結合して複合体を形成することにより機能
的に抗体のように振る舞う任意の天然の、合成のもしく
は遺伝子操作されたタンパク質が挙げられる。本明細書
および請求の範囲を通して使用される「抗体」なる用語
および「モノクローナル抗体成分」なる用語は、そのよ
うな抗体および抗体断片を全て含むものを意味する。
ノスルフィドもしくはジスルフィド結合を含む任意のタ
ンパク質、キレート剤または他の基質を、本発明に従っ
て放射能標識することができる。代表的な適当な基質と
しては、いずれかの源の、ヒト血清アルブミン、フィブ
リノーゲン、ウロキナーゼ、γ−グロブリン、糖タンパ
ク質、他のタンパク質および抗体、または抗体断片が挙
げられ、そして任意の手段により作製されたポリクロー
ナル抗体およびモノクローナル抗体、並びにキメラ抗体
および遺伝子操作された抗体、並びに上記の全ての抗体
断片が挙げられる。これにはヒトを含む任意の種起源の
任意のクラスの免疫グロブリン、例えばIgＧ，IgＭ，Ig
Ａ，IgＤまたはIgＭ、二または複数の抗原もしくはエピ
トープ特異性を有するキメラ抗体またはハイブリット抗
体、および上記の全ての断片、例えばF(ab')2, F(ab)2,
Fab', Fab、および他の断片、例えばハイブリッド断片
が挙げられ、そして更に任意の免疫グロブリンまたは、
特異的抗原と結合して複合体を形成することにより機能
的に抗体のように振る舞う任意の天然の、合成のもしく
は遺伝子操作されたタンパク質が挙げられる。本明細書
および請求の範囲を通して使用される「抗体」なる用語
および「モノクローナル抗体成分」なる用語は、そのよ
うな抗体および抗体断片を全て含むものを意味する。
【００４８】精製段階および付随の過剰な還元剤の除去
の包括から、本発明は多数の有意な利点を有する。放射
能標識しようとするタンパク質以外のあらゆる種の還元
されたタンパク質（大きいまたは小さい分子量種を含
む）の除去により、還元されたTc-99mを目当てにした競
合が排除される。これは有意に高い放射能標識収率をも
たらす。過テクネチウム酸塩または過レニウム酸塩還元
溶液中の第一錫イオンおよび第二錫イオンの総量をでき
るだけ低く維持することにより、追加の還元されたタン
パク質種の形成が最小限にされる。通常、タンパク質中
のジスルフィド結合を還元するのに要するよりもずっと
少量の第一錫イオンが過テクネチウム酸塩または過レニ
ウム酸塩を還元するのに必要であり、従って放射能標識
しようとするタンパク質中のジスルフィドの追加の還元
なしに過テクネチウム酸塩または過レニウム酸塩の還元
を可能にする。この追加の還元は放射能標識しようとす
るタンパク質以外のタンパク質種を生成し得る。
の包括から、本発明は多数の有意な利点を有する。放射
能標識しようとするタンパク質以外のあらゆる種の還元
されたタンパク質（大きいまたは小さい分子量種を含
む）の除去により、還元されたTc-99mを目当てにした競
合が排除される。これは有意に高い放射能標識収率をも
たらす。過テクネチウム酸塩または過レニウム酸塩還元
溶液中の第一錫イオンおよび第二錫イオンの総量をでき
るだけ低く維持することにより、追加の還元されたタン
パク質種の形成が最小限にされる。通常、タンパク質中
のジスルフィド結合を還元するのに要するよりもずっと
少量の第一錫イオンが過テクネチウム酸塩または過レニ
ウム酸塩を還元するのに必要であり、従って放射能標識
しようとするタンパク質中のジスルフィドの追加の還元
なしに過テクネチウム酸塩または過レニウム酸塩の還元
を可能にする。この追加の還元は放射能標識しようとす
るタンパク質以外のタンパク質種を生成し得る。
【００４９】本発明は、最終使用者が放射能標識を行う
のに一段階のみ、即ち過テクネチウム酸ナトリウムまた
は過レニウム酸ナトリウムの添加および付随のインキュ
ベーションの段階のみを必要とするので、有意な利点を
有する。この有意な単純化は、第一錫イオンと還元され
た抗体の両方が担体タンパク質および他の不活性希釈剤
と一緒に同一バイアル中で凍結され、所望により凍結乾
燥されるので、可能である。錫ペレットまたは別の源の
精製された酸化されていない金属錫の添加は、低濃度の
第一錫イオンを保存しそして貯蔵または再構成中の酸化
による放射能標識の損失を防ぐのに役立つ。本発明を次
の非限定例により更に説明する。
のに一段階のみ、即ち過テクネチウム酸ナトリウムまた
は過レニウム酸ナトリウムの添加および付随のインキュ
ベーションの段階のみを必要とするので、有意な利点を
有する。この有意な単純化は、第一錫イオンと還元され
た抗体の両方が担体タンパク質および他の不活性希釈剤
と一緒に同一バイアル中で凍結され、所望により凍結乾
燥されるので、可能である。錫ペレットまたは別の源の
精製された酸化されていない金属錫の添加は、低濃度の
第一錫イオンを保存しそして貯蔵または再構成中の酸化
による放射能標識の損失を防ぐのに役立つ。本発明を次
の非限定例により更に説明する。
【００５０】
【実施例】実施例１ 酒石酸塩−フタル酸塩溶液中の塩化第一錫から成る Sn
(II) 還元溶液を作製した。塩化第一錫は、濃塩酸中に
塩化第一錫結晶を0.5 M になるように溶解し、１mlあた
り約94.8mgの塩化第一錫の溶液を得た。使用するまでこ
の溶液を密閉され窒素でパージされたバイアル中で保存
した。塩化第一錫の他の源を使うこともでき、例えば濃
塩酸と接触させた酸化されていない固体の錫ペレットを
使用することができる。
(II) 還元溶液を作製した。塩化第一錫は、濃塩酸中に
塩化第一錫結晶を0.5 M になるように溶解し、１mlあた
り約94.8mgの塩化第一錫の溶液を得た。使用するまでこ
の溶液を密閉され窒素でパージされたバイアル中で保存
した。塩化第一錫の他の源を使うこともでき、例えば濃
塩酸と接触させた酸化されていない固体の錫ペレットを
使用することができる。
【００５１】酒石酸カリウムナトリウムとフタル酸水素
カリウムの混合物の酒石酸塩−フタル酸塩溶液を調製し
た。0.282 g の酒石酸カリウムナトリウムを100 mlの蒸
留水に溶解し、これに0.817 g のフタル酸水素カリウム
を添加した。10Ｎ水酸化ナトリウムを使ってpHを約5.0
に調整し、次いで１Ｎ水酸化ナトリウムを使ってpHを5.
6 ±0.05に調整した。得られた溶液を攪拌し、そして不
活性ガス、例えば窒素、ヘリウム等をバブリングするこ
とによりこの物質から酸素をパージした。
カリウムの混合物の酒石酸塩−フタル酸塩溶液を調製し
た。0.282 g の酒石酸カリウムナトリウムを100 mlの蒸
留水に溶解し、これに0.817 g のフタル酸水素カリウム
を添加した。10Ｎ水酸化ナトリウムを使ってpHを約5.0
に調整し、次いで１Ｎ水酸化ナトリウムを使ってpHを5.
6 ±0.05に調整した。得られた溶液を攪拌し、そして不
活性ガス、例えば窒素、ヘリウム等をバブリングするこ
とによりこの物質から酸素をパージした。
【００５２】パージされた酒石酸塩−フタル酸塩溶液の
一部をフラスコ中に測り取り、それに一定量の塩化第一
錫をゆっくり添加することにより、 Sn(II) 還元溶液を
作製した。塩化第一錫を該溶液に添加する時に攪拌棒ま
たは類似の機械を使って攪拌して塩化第一錫の混合を確
実にすることが好ましい。100 容の緩衝液に対して約１
容の塩化第一錫を使った。pHを連続してモニタリング
し、塩化第一錫が添加されたら、10Ｎ水酸化ナトリウム
を使ってpHを約5.0 に調整し、次いで１Ｎ水酸化ナトリ
ウムを使ってpHを5.6 ±0.05に調整した。
一部をフラスコ中に測り取り、それに一定量の塩化第一
錫をゆっくり添加することにより、 Sn(II) 還元溶液を
作製した。塩化第一錫を該溶液に添加する時に攪拌棒ま
たは類似の機械を使って攪拌して塩化第一錫の混合を確
実にすることが好ましい。100 容の緩衝液に対して約１
容の塩化第一錫を使った。pHを連続してモニタリング
し、塩化第一錫が添加されたら、10Ｎ水酸化ナトリウム
を使ってpHを約5.0 に調整し、次いで１Ｎ水酸化ナトリ
ウムを使ってpHを5.6 ±0.05に調整した。
【００５３】全ての段階は無酸素環境下で行われ、溶液
に不活性ガスをバブリングしながら行ってもよい。得ら
れた溶液に不活性ガス、例えば窒素、ヘリウム等をバブ
リングすることによりこの物質から酸素をパージする。
に不活性ガスをバブリングしながら行ってもよい。得ら
れた溶液に不活性ガス、例えば窒素、ヘリウム等をバブ
リングすることによりこの物質から酸素をパージする。
【００５４】あるいは、別のジスルフィド還元剤、例え
ば２−メルカプトエタノール、１，４−ジチオトレイト
ール、２，３−ジヒドロキシブタン−１，４−ジチオー
ル、２−アミノエタンチオール HCl、２−メルカプトエ
チルアミン、チオグリコレート、シアニド、システイン
または他のジスルフィド開裂試薬を使って抗体還元用溶
液を作製することができる。
ば２−メルカプトエタノール、１，４−ジチオトレイト
ール、２，３−ジヒドロキシブタン−１，４−ジチオー
ル、２−アミノエタンチオール HCl、２−メルカプトエ
チルアミン、チオグリコレート、シアニド、システイン
または他のジスルフィド開裂試薬を使って抗体還元用溶
液を作製することができる。
【００５５】還元しようとするタンパク質を窒素でパー
ジされた密閉バイアル中に入れる。モノクローナル抗体
またはその断片を標識しようとする場合、最少で0.1 m
g、好ましくは少なくとも2 mgのモノクローナル抗体ま
たはその断片を、１mg／mlまたはそれ以上、好ましくは
1.7 mg／mlの濃度で使用する。モノクローナル抗体、断
片または他のタンパク質は通常の塩類溶液中に希釈する
ことができ、または必要であるなら限外濾過により濃縮
することができる。３容のタンパク質対２容の Sn(II)
還元溶液のおよその比において、タンパク質に Sn(II)
還元溶液を添加する。次いでタンパク質と Sn(II) 還元
溶液とを含むバイアルを、好ましくは無酸素環境中で、
例えば窒素または他の不活性ガスが充填された容器中
で、インキュベートする。タンパク質中のジスルフィド
結合の還元を可能にするのに十分な時間室温でバイアル
をインキュベートする。通常、室温で１〜24時間のイン
キュベーションが適当であり、大部分の完全免疫グロブ
リンについては室温で21時間のインキュベーションが好
ましい。温度を高くすればインキュベーション時間が減
少し、逆に、低温でのインキュベーションはそれに応じ
て長いインキュベーション時間を必要とする。タンパク
質と Sn(II) 還元溶液の混合物を凍結させるか、希釈す
るか、またはすぐに精製に入ることによってインキュベ
ーションを終了させる。
ジされた密閉バイアル中に入れる。モノクローナル抗体
またはその断片を標識しようとする場合、最少で0.1 m
g、好ましくは少なくとも2 mgのモノクローナル抗体ま
たはその断片を、１mg／mlまたはそれ以上、好ましくは
1.7 mg／mlの濃度で使用する。モノクローナル抗体、断
片または他のタンパク質は通常の塩類溶液中に希釈する
ことができ、または必要であるなら限外濾過により濃縮
することができる。３容のタンパク質対２容の Sn(II)
還元溶液のおよその比において、タンパク質に Sn(II)
還元溶液を添加する。次いでタンパク質と Sn(II) 還元
溶液とを含むバイアルを、好ましくは無酸素環境中で、
例えば窒素または他の不活性ガスが充填された容器中
で、インキュベートする。タンパク質中のジスルフィド
結合の還元を可能にするのに十分な時間室温でバイアル
をインキュベートする。通常、室温で１〜24時間のイン
キュベーションが適当であり、大部分の完全免疫グロブ
リンについては室温で21時間のインキュベーションが好
ましい。温度を高くすればインキュベーション時間が減
少し、逆に、低温でのインキュベーションはそれに応じ
て長いインキュベーション時間を必要とする。タンパク
質と Sn(II) 還元溶液の混合物を凍結させるか、希釈す
るか、またはすぐに精製に入ることによってインキュベ
ーションを終了させる。
【００５６】別の還元剤、例えば２−メルカプトエタノ
ール、１，４−ジチオトレイトール、２，３−ジヒドロ
キシブタン−１，４−ジチオール、２−アミノエタンチ
オール HCl、２−メルカプトエチルアミン、チオグリコ
レート、シアニド、システインまたは他のジスルフィド
開裂試薬を使用する時、インキュベーション時間は使用
する特定の還元剤に合わせて調整しなければならない。
一般により短いインキュベーション時間が要求される。
還元溶液を除去した後、 Sn(II) 塩を添加してSn(II)
および硫黄含有複合体を形成せしめ、それによって還元
されたジスルフィド基を次の精製段階の間保存する。そ
れらの還元剤を使って行った精製段階は実質的に全ての
還元剤を除去しなければならない。
ール、１，４−ジチオトレイトール、２，３−ジヒドロ
キシブタン−１，４−ジチオール、２−アミノエタンチ
オール HCl、２−メルカプトエチルアミン、チオグリコ
レート、シアニド、システインまたは他のジスルフィド
開裂試薬を使用する時、インキュベーション時間は使用
する特定の還元剤に合わせて調整しなければならない。
一般により短いインキュベーション時間が要求される。
還元溶液を除去した後、 Sn(II) 塩を添加してSn(II)
および硫黄含有複合体を形成せしめ、それによって還元
されたジスルフィド基を次の精製段階の間保存する。そ
れらの還元剤を使って行った精製段階は実質的に全ての
還元剤を除去しなければならない。
【００５７】タンパク質と Sn(II) 還元溶液または他の
還元溶液との混合物は、好ましくはサイズ排除クロマト
グラフィーによって精製される。カラムには適当なゲ
ル、例えば低分子量モノクローナル抗体F(ab')2 断片の
使用には、例えばSephacryl-200 ゲル(Pharmacia, Pisc
ataway, NJ) が充填される。カラムを適当な溶出緩衝
液、例えばゲンチジン酸塩緩衝化塩溶液で平衡化する。
タンパク質と還元溶液の混合物をカラムに適用し、溶出
緩衝液を使って分画する。紫外検出器または同様な装置
を使って分画プロフィールを得、そして放射能標識しよ
うとするタンパク質を含む分画を収集し、プールする。
得られた還元されたタンパク質を、必要であれば、好ま
しくは1.7 mg／mlの濃度に濃縮する。濃縮は限外濾過に
よって行うことができる。得られた濃縮物を通常の塩類
溶液に対して透析して残余の Sn(IV)塩または他の残余
の還元剤を除去することも可能である。
還元溶液との混合物は、好ましくはサイズ排除クロマト
グラフィーによって精製される。カラムには適当なゲ
ル、例えば低分子量モノクローナル抗体F(ab')2 断片の
使用には、例えばSephacryl-200 ゲル(Pharmacia, Pisc
ataway, NJ) が充填される。カラムを適当な溶出緩衝
液、例えばゲンチジン酸塩緩衝化塩溶液で平衡化する。
タンパク質と還元溶液の混合物をカラムに適用し、溶出
緩衝液を使って分画する。紫外検出器または同様な装置
を使って分画プロフィールを得、そして放射能標識しよ
うとするタンパク質を含む分画を収集し、プールする。
得られた還元されたタンパク質を、必要であれば、好ま
しくは1.7 mg／mlの濃度に濃縮する。濃縮は限外濾過に
よって行うことができる。得られた濃縮物を通常の塩類
溶液に対して透析して残余の Sn(IV)塩または他の残余
の還元剤を除去することも可能である。
【００５８】あるいは、 Sn(II) および硫黄含有タンパ
ク質複合体と Sn(II) 還元溶液または他の還元溶液との
混合物は、脱塩カラムに該混合物を通し、還元されたタ
ンパク質を収集し、そして Sn(IV) 塩および過剰の還元
剤を除去することにより精製することができる。必要な
ら得られた溶出液を濃縮しそして透析することができ
る。この方法は、過剰の Sn(II) 溶液、 Sn(IV) 反応副
生成物および他の還元試薬を除去するであろうが、必ず
しも他の不純物、例えばタンパク質中のジスルフィド結
合の過剰還元から生じるタンパク質の小断片、または還
元されたタンパク質の凝集物を除去するわけではない。
それらの小断片または大凝集物は、モノクローナル抗体
の場合、免疫反応性でないことがあり、または所望のタ
ンパク質のものとは異なった生体分布を有することがあ
り、最終生成物から除去する必要がある。
ク質複合体と Sn(II) 還元溶液または他の還元溶液との
混合物は、脱塩カラムに該混合物を通し、還元されたタ
ンパク質を収集し、そして Sn(IV) 塩および過剰の還元
剤を除去することにより精製することができる。必要な
ら得られた溶出液を濃縮しそして透析することができ
る。この方法は、過剰の Sn(II) 溶液、 Sn(IV) 反応副
生成物および他の還元試薬を除去するであろうが、必ず
しも他の不純物、例えばタンパク質中のジスルフィド結
合の過剰還元から生じるタンパク質の小断片、または還
元されたタンパク質の凝集物を除去するわけではない。
それらの小断片または大凝集物は、モノクローナル抗体
の場合、免疫反応性でないことがあり、または所望のタ
ンパク質のものとは異なった生体分布を有することがあ
り、最終生成物から除去する必要がある。
【００５９】あるいは、還元されたタンパク質と Sn(I
I) 還元溶液または他の還元溶液との混合物は、外の手
段により、例えば透析、限外濾過、沈澱、分取用高性能
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、他の形態のクロマトグラフィー、分取用等電点電気
泳動、および当業界で常用される他の精製手段により、
精製してもよい。
I) 還元溶液または他の還元溶液との混合物は、外の手
段により、例えば透析、限外濾過、沈澱、分取用高性能
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、他の形態のクロマトグラフィー、分取用等電点電気
泳動、および当業界で常用される他の精製手段により、
精製してもよい。
【００６０】還元され Sn(II) と複合体形成され精製さ
れたタンパク質を、好ましくは窒素のような不活性ガス
を溶液にバブリングすることにより酸素をパージし、そ
して無酸素バイアル中で凍結させることができる。凍結
されたタンパク質溶液を含む各バイアルに、過テクネチ
ウム酸塩還元溶液を添加し、そして凍結されたタンパク
質溶液と過テクネチウム酸塩還元溶液との間で反応が起
こらないように内容物を即座に凍結または凍結乾燥せし
める。酸化されていない錫ペレットをこのバイアルに添
加してもよい。この錫ペレットは極微量の Sn(II) に取
って代わり、そして過テクネチウム酸塩還元溶液中の低
濃度の第一錫イオンを安定化するのに役立ち、更に放射
能標識生成物の貯蔵中の再酸化による放射能標識の損失
を防ぐのに役立つだろう。過テクネチウム酸塩還元溶液
は、約１容の0.5 M 塩化第一錫を約5,000 容の酒石酸塩
−フタル酸塩溶液に添加し、約0.1 ミリモルの過テクネ
チウム酸塩還元溶液を得ること以外は、 Sn(II) 還元溶
液と同様にして作製した。約１容の過テクネチウム酸塩
還元溶液を２容の還元された Sn(II) と複合体形成され
精製されたタンパク質溶液に添加する。最適には、タン
パク質溶液が約1.7mg／mlであり、そして還元され Sn(I
I) と複合体形成され精製されたタンパク質溶液各1.32m
lに、約0.68mlの過テクネチウム酸塩還元溶液を添加す
る。
れたタンパク質を、好ましくは窒素のような不活性ガス
を溶液にバブリングすることにより酸素をパージし、そ
して無酸素バイアル中で凍結させることができる。凍結
されたタンパク質溶液を含む各バイアルに、過テクネチ
ウム酸塩還元溶液を添加し、そして凍結されたタンパク
質溶液と過テクネチウム酸塩還元溶液との間で反応が起
こらないように内容物を即座に凍結または凍結乾燥せし
める。酸化されていない錫ペレットをこのバイアルに添
加してもよい。この錫ペレットは極微量の Sn(II) に取
って代わり、そして過テクネチウム酸塩還元溶液中の低
濃度の第一錫イオンを安定化するのに役立ち、更に放射
能標識生成物の貯蔵中の再酸化による放射能標識の損失
を防ぐのに役立つだろう。過テクネチウム酸塩還元溶液
は、約１容の0.5 M 塩化第一錫を約5,000 容の酒石酸塩
−フタル酸塩溶液に添加し、約0.1 ミリモルの過テクネ
チウム酸塩還元溶液を得ること以外は、 Sn(II) 還元溶
液と同様にして作製した。約１容の過テクネチウム酸塩
還元溶液を２容の還元された Sn(II) と複合体形成され
精製されたタンパク質溶液に添加する。最適には、タン
パク質溶液が約1.7mg／mlであり、そして還元され Sn(I
I) と複合体形成され精製されたタンパク質溶液各1.32m
lに、約0.68mlの過テクネチウム酸塩還元溶液を添加す
る。
【００６１】あるいは、グルコヘプトン酸 Sn(II) 、酒
石酸 Sn(II) 、ホスホン酸 Sn(II)、ジチオニットおよ
び他の常用されるTc-99m放射性医薬キットを使って、過
テクネチウム酸塩還元溶液を作製することができる。
石酸 Sn(II) 、ホスホン酸 Sn(II)、ジチオニットおよ
び他の常用されるTc-99m放射性医薬キットを使って、過
テクネチウム酸塩還元溶液を作製することができる。
【００６２】過テクネチウム酸塩還元溶液は過レニウム
酸塩を還元するのにも使用することができる。本明細書
を通した過テクネチウム酸塩および過レニウム酸塩化合
物の記載は、過レニウム酸塩および過テクネチウム酸塩
にも適用することができる。同様に、本明細書を通した
テクネチウムおよびそれの化合物の記載は、レニウムお
よびそれの化合物に適用することができる。
酸塩を還元するのにも使用することができる。本明細書
を通した過テクネチウム酸塩および過レニウム酸塩化合
物の記載は、過レニウム酸塩および過テクネチウム酸塩
にも適用することができる。同様に、本明細書を通した
テクネチウムおよびそれの化合物の記載は、レニウムお
よびそれの化合物に適用することができる。
【００６３】放射能標識するためには、所望の活性の過
テクネチウム酸ナトリウム−Tc-99mを添加し、混合し、
そして混合物をある期間、通常は約15分間、インキュベ
ートする。この段階は、大気中の酸素の導入を避けなが
らまたは最小にしながら行われる。所望であれば、通常
の塩類溶液中の１％ヒト血清アルブミンまたは他の適当
な保護タンパク質の添加により、得られた放射能標識タ
ンパク質を安定化することができる。
テクネチウム酸ナトリウム−Tc-99mを添加し、混合し、
そして混合物をある期間、通常は約15分間、インキュベ
ートする。この段階は、大気中の酸素の導入を避けなが
らまたは最小にしながら行われる。所望であれば、通常
の塩類溶液中の１％ヒト血清アルブミンまたは他の適当
な保護タンパク質の添加により、得られた放射能標識タ
ンパク質を安定化することができる。
【００６４】テクネチウム−Tc-99mの源は、従来99Mo/9
9mTc発生器から過テクネチウム酸ナトリウム−Tc-99mと
して得られる。本発明では任意の源の医薬上許容される
テクネチウム−Tc-99m源を使用することができる。
9mTc発生器から過テクネチウム酸ナトリウム−Tc-99mと
して得られる。本発明では任意の源の医薬上許容される
テクネチウム−Tc-99m源を使用することができる。
【００６５】あるいはテクネチウムの他の放射性同位体
およびレニウムの同位体、例えばRe-186およびRe-188を
使用してもよい。過テクネチウム酸塩よりもむしろ過レ
ニウム酸塩を還元する時、通常は反応を完了させるため
により高温およびより長い放射能標識時間を必要とす
る。
およびレニウムの同位体、例えばRe-186およびRe-188を
使用してもよい。過テクネチウム酸塩よりもむしろ過レ
ニウム酸塩を還元する時、通常は反応を完了させるため
により高温およびより長い放射能標識時間を必要とす
る。
【００６６】実施例２ この実施例は、免疫グロブリンＧ（IgＧ）を標識するた
めの本発明の方法を例示する。IgＧは、ヒツジ、ヤギ、
マウスまたはヒトといった動物から得られる。過テクネ
チウム酸ナトリウム−Tc-99m U.S.P. は任意の商業的入
手源から得られる。
めの本発明の方法を例示する。IgＧは、ヒツジ、ヤギ、
マウスまたはヒトといった動物から得られる。過テクネ
チウム酸ナトリウム−Tc-99m U.S.P. は任意の商業的入
手源から得られる。
【００６７】濃HCl (12M) 中の 0.5M 塩化第一錫0.2 ml
を40mMフタル酸水素カリウムおよび10mM酒石酸ナトリウ
ムの溶液(pH 5.6) 20ml に添加することにより、 Sn(I
I) ジスルフィド結合還元剤を調製した。曇った色の酸
化第一錫を含まない表面を有する酸化されていないSnCl
2 ペレットに濃塩酸を添加することにより、塩化第一錫
溶液を調製した。次いで得られた還元溶液のpHを10M Na
OHの添加により5.5 に調整し、そして1 M NaOHの添加に
より最終のpH 5.6±0.05に調整した。
を40mMフタル酸水素カリウムおよび10mM酒石酸ナトリウ
ムの溶液(pH 5.6) 20ml に添加することにより、 Sn(I
I) ジスルフィド結合還元剤を調製した。曇った色の酸
化第一錫を含まない表面を有する酸化されていないSnCl
2 ペレットに濃塩酸を添加することにより、塩化第一錫
溶液を調製した。次いで得られた還元溶液のpHを10M Na
OHの添加により5.5 に調整し、そして1 M NaOHの添加に
より最終のpH 5.6±0.05に調整した。
【００６８】0.25mlの免疫グロブリン（ヒト）U.S.P.(C
utter Biological; タンパク質含量15-18 ％, 0.21-0.3
2 M のグリシンで安定化されている) を7.25mlの注射用
蒸留水U.S.P.で希釈し、そして0.22ミクロンのフィルタ
ーに通して濾過することにより、IgＧ製剤を調製した。
5 mlの Sn(II) 還元溶液を7.5 mlのIgＧ製剤と混合し
た。混合溶液を含むバイアルを封管し、酸素を除去する
ためにN2ガスでフラッシュした。この混合溶液を遮光下
で室温にて21時間保存してジスルフィド結合の部分還元
を許容し、以後還元されたタンパク質と呼称されるもの
を形成せしめた。21時間インキュベーション後、バイア
ルの内容物をPD-10 脱塩カラム(PharmaciaLKB Biotechn
ology, Piscataway, NJ) に通し、タンパク質含有分画
を収集し、そして Sn(II), Sn(IV) および他の塩を含む
残りの溶出液を捨てた。還元され Sn(II) と 複合体形
成されたタンパク質分画を限外濾過により1.7 mg／mlの
濃度に濃縮した。還元され Sn(II) 複合体形成されたタ
ンパク質の0.5 mgアリコートを、N2ガス充填され封管さ
れた血清バイアル中にいれ、凍結させた。pH 5.6の40mM
フタル酸水素カリウム／10mM酒石酸ナトリウム中の0.1m
M SnCl2 0.5 mlから Sn(II) 過テクネチウム酸塩還元溶
液を作製した。還元された抗体を解凍させることなく、
Sn(II) 過テクネチウム酸塩還元溶液を添加し、この溶
液を再度凍結させた。無菌の直径3 mmの金属錫を添加
し、バイアルをN2でフラッシュし、そして放射能標識に
必要になるまで−20℃で保存した。
utter Biological; タンパク質含量15-18 ％, 0.21-0.3
2 M のグリシンで安定化されている) を7.25mlの注射用
蒸留水U.S.P.で希釈し、そして0.22ミクロンのフィルタ
ーに通して濾過することにより、IgＧ製剤を調製した。
5 mlの Sn(II) 還元溶液を7.5 mlのIgＧ製剤と混合し
た。混合溶液を含むバイアルを封管し、酸素を除去する
ためにN2ガスでフラッシュした。この混合溶液を遮光下
で室温にて21時間保存してジスルフィド結合の部分還元
を許容し、以後還元されたタンパク質と呼称されるもの
を形成せしめた。21時間インキュベーション後、バイア
ルの内容物をPD-10 脱塩カラム(PharmaciaLKB Biotechn
ology, Piscataway, NJ) に通し、タンパク質含有分画
を収集し、そして Sn(II), Sn(IV) および他の塩を含む
残りの溶出液を捨てた。還元され Sn(II) と 複合体形
成されたタンパク質分画を限外濾過により1.7 mg／mlの
濃度に濃縮した。還元され Sn(II) 複合体形成されたタ
ンパク質の0.5 mgアリコートを、N2ガス充填され封管さ
れた血清バイアル中にいれ、凍結させた。pH 5.6の40mM
フタル酸水素カリウム／10mM酒石酸ナトリウム中の0.1m
M SnCl2 0.5 mlから Sn(II) 過テクネチウム酸塩還元溶
液を作製した。還元された抗体を解凍させることなく、
Sn(II) 過テクネチウム酸塩還元溶液を添加し、この溶
液を再度凍結させた。無菌の直径3 mmの金属錫を添加
し、バイアルをN2でフラッシュし、そして放射能標識に
必要になるまで−20℃で保存した。
【００６９】ガンマグロブリン製剤をTc-99mで放射能標
識するために、2.5 mCi の放射能を含む過テクネチウム
酸ナトリウム−Tc-99mU.S.P. 1.0mlをバイアルに添加
し、そしてバイアルと内容物を室温に戻し、混合し、15
分間放置しておいた。生成物の薄層クロマトグラフィー
分析は、放射能の99.6％がタンパク質に結合しているこ
とを示した。UVとラジオアイソトープ検出器の両方を使
った高性能液体クロマトグラフィーは、Tc-99m溶出がタ
ンパク質溶出プロフィールと平行であることを示した。
識するために、2.5 mCi の放射能を含む過テクネチウム
酸ナトリウム−Tc-99mU.S.P. 1.0mlをバイアルに添加
し、そしてバイアルと内容物を室温に戻し、混合し、15
分間放置しておいた。生成物の薄層クロマトグラフィー
分析は、放射能の99.6％がタンパク質に結合しているこ
とを示した。UVとラジオアイソトープ検出器の両方を使
った高性能液体クロマトグラフィーは、Tc-99m溶出がタ
ンパク質溶出プロフィールと平行であることを示した。
【００７０】実施例３ この実施例は、IgＧおよびIgＭクラスのモノクローナル
抗体を標識するための本発明の方法を例示する。該抗体
をマウス腹水またはバイオリアクター液から得、95％以
上に精製し、そして0.9% NaCl 溶液中１mg／mlより高い
濃度に調製した。
抗体を標識するための本発明の方法を例示する。該抗体
をマウス腹水またはバイオリアクター液から得、95％以
上に精製し、そして0.9% NaCl 溶液中１mg／mlより高い
濃度に調製した。
【００７１】実施例２と同様にして Sn(II) 還元溶液を
調製した。２種類の完全抗体調製物、即ちIgＧマウス抗
体 B72.3およびIgＭマウス抗体抗SSEA-1を試験した。各
抗体調製物は1.7 mg／mlのタンパク質濃度であった。精
製タンパク質溶液各１mlに0.66mlの Sn(II) 還元溶液を
添加した。実施例２と同様に混合溶液をインキュベート
し、PD-10 カラムに通した。還元されたタンパク質分画
を限外濾過により2mg／mlの濃度に濃縮した。0.5 〜2.0
mgのタンパク質を含む還元タンパク質のアリコート
を、N2ガス充填され封管された血清バイアルに入れ、凍
結させた。
調製した。２種類の完全抗体調製物、即ちIgＧマウス抗
体 B72.3およびIgＭマウス抗体抗SSEA-1を試験した。各
抗体調製物は1.7 mg／mlのタンパク質濃度であった。精
製タンパク質溶液各１mlに0.66mlの Sn(II) 還元溶液を
添加した。実施例２と同様に混合溶液をインキュベート
し、PD-10 カラムに通した。還元されたタンパク質分画
を限外濾過により2mg／mlの濃度に濃縮した。0.5 〜2.0
mgのタンパク質を含む還元タンパク質のアリコート
を、N2ガス充填され封管された血清バイアルに入れ、凍
結させた。
【００７２】50mgのゲンチジン酸、 0.375μg のSuCl2
および 975μg の酒石酸カリウムナトリウムを、N2ガス
を２〜３分間バブリングさせることにより予め脱酸素さ
れている蒸留水50mlに溶解することにより、過テクネチ
ウム酸塩還元溶液を調製した。非常に希薄な(0.05 M) N
aOH の添加によりpHを7.0 に調製した。同容量のこの溶
液を、還元され Sn(II) 複合体形成され凍結されたタン
パク質溶液の上に重層し、この溶液を凍結させた。無菌
の直径３mmの錫金属ショットを添加し、バイアルにN2ガ
スをフラッシュし、そして放射能標識に必要になるまで
−20℃で保存した。
および 975μg の酒石酸カリウムナトリウムを、N2ガス
を２〜３分間バブリングさせることにより予め脱酸素さ
れている蒸留水50mlに溶解することにより、過テクネチ
ウム酸塩還元溶液を調製した。非常に希薄な(0.05 M) N
aOH の添加によりpHを7.0 に調製した。同容量のこの溶
液を、還元され Sn(II) 複合体形成され凍結されたタン
パク質溶液の上に重層し、この溶液を凍結させた。無菌
の直径３mmの錫金属ショットを添加し、バイアルにN2ガ
スをフラッシュし、そして放射能標識に必要になるまで
−20℃で保存した。
【００７３】IgＧまたはIgＭ製剤をTc-99mで放射能標識
するために、2.5 mCi の放射能を含む過テクネチウム酸
ナトリウム−Tc- 99m, U.S.P. 1.0 mlを各バイアルに添
加し、そしてバイアルと内容物を室温に戻し、混合し、
15分間放置しておいた。生成物の薄層クロマトグラフィ
ー分析は、放射能の90.0％〜96.5％がタンパク質に結合
していることを示した。UVとラジオアイソトープ検出器
の両方を使った高性能液体クロマトグラフィーは、Tc-9
9m溶出がタンパク質溶出プロフィールと平行であること
を示した。HPLC分析によりタンパク質に結合していない
放射能は検出されなかった。
するために、2.5 mCi の放射能を含む過テクネチウム酸
ナトリウム−Tc- 99m, U.S.P. 1.0 mlを各バイアルに添
加し、そしてバイアルと内容物を室温に戻し、混合し、
15分間放置しておいた。生成物の薄層クロマトグラフィ
ー分析は、放射能の90.0％〜96.5％がタンパク質に結合
していることを示した。UVとラジオアイソトープ検出器
の両方を使った高性能液体クロマトグラフィーは、Tc-9
9m溶出がタンパク質溶出プロフィールと平行であること
を示した。HPLC分析によりタンパク質に結合していない
放射能は検出されなかった。
【００７４】実施例４ この実施例はモノクローナル抗体のF(ab')2 断片を標識
するための本発明の方法を例示する。この実施例は、放
射能標識生成物の組成が、使用する方法とジスルフィド
結合還元試薬の種類によって異なることも示す。この実
施例は、本方法が、この特定のモノクローナル抗体断片
については、"METHOD FOR RADIOLABELING PROTEINS WIT
H TECHNETIUM-99M" という名称のCrockford およびRhod
esの米国特許第4,424,200 号明細書に記載の初期の直接
標識法よりも優れていることも示す。F(ab')2 断片は、
マウスモノクローナル抗体のペプシン消化後、ペプシン
消化物中に認められる他の物質からF(ab')2 断片を分離
するクロマトグラフィー精製により、95％より高い純度
で得られた。
するための本発明の方法を例示する。この実施例は、放
射能標識生成物の組成が、使用する方法とジスルフィド
結合還元試薬の種類によって異なることも示す。この実
施例は、本方法が、この特定のモノクローナル抗体断片
については、"METHOD FOR RADIOLABELING PROTEINS WIT
H TECHNETIUM-99M" という名称のCrockford およびRhod
esの米国特許第4,424,200 号明細書に記載の初期の直接
標識法よりも優れていることも示す。F(ab')2 断片は、
マウスモノクローナル抗体のペプシン消化後、ペプシン
消化物中に認められる他の物質からF(ab')2 断片を分離
するクロマトグラフィー精製により、95％より高い純度
で得られた。
【００７５】この実施例で使用するモノクローナル抗体
は Sorin Bio-technica, Italyから入手した。それは予
備実験によって予備はんだ法を使った非常に乏しいTc-9
9m放射能標識が示されているマウス抗−CEA F(ab')2 で
あった。
は Sorin Bio-technica, Italyから入手した。それは予
備実験によって予備はんだ法を使った非常に乏しいTc-9
9m放射能標識が示されているマウス抗−CEA F(ab')2 で
あった。
【００７６】４つの異なる放射能標識方法を使った。１
つは米国特許第4,424,200 号明細書に記載された初期の
予備はんだ法であり、その他の３つは本発明において教
示される方法を使った。それらの４つの方法は下記のよ
うに要約することができる。
つは米国特許第4,424,200 号明細書に記載された初期の
予備はんだ法であり、その他の３つは本発明において教
示される方法を使った。それらの４つの方法は下記のよ
うに要約することができる。
【００７７】１．米国特許第4,424,200 号明細書に記載
された初期の予備はんだ法であり、実施例２に記載のよ
うにSn(II)還元溶液を調製したが、精製段階を使用せ
ず、そして過テクネチウム酸塩還元溶液を添加しなかっ
た。
された初期の予備はんだ法であり、実施例２に記載のよ
うにSn(II)還元溶液を調製したが、精製段階を使用せ
ず、そして過テクネチウム酸塩還元溶液を添加しなかっ
た。
【００７８】２．実施例２に記載のように抗体断片中の
ジスルフィド結合を還元するのにSn(II)還元溶液を使
い、第一錫塩と錫ペレットから成る過テクネチウム酸塩
還元溶液を使用し、PD-10 脱塩カラムを使った精製段階
を含む本発明の方法。
ジスルフィド結合を還元するのにSn(II)還元溶液を使
い、第一錫塩と錫ペレットから成る過テクネチウム酸塩
還元溶液を使用し、PD-10 脱塩カラムを使った精製段階
を含む本発明の方法。
【００７９】３．抗体断片中のジスルフィド結合を還元
するのに２−メルカプトエタノールを使った本発明の方
法。２−メルカプトエタノールの５％溶液をpH 8.0の0.
1 Mリン酸緩衝液中に調製した。この溶液１mlを凍結乾
燥された抗体断片タンパク質１mgに添加し、混合して溶
解させた。室温で１時間インキュベーション後、1.6ml
の塩溶液を添加し、そしてPD-10 脱塩カラムに通すこと
により溶液中の他の成分から部分還元タンパク質を分離
した。このタンパク質を限外濾過により1.7 mg／mlに濃
縮した。次いで実施例２に記載のような第一錫塩と錫ペ
レットとから成る過テクネチウム酸塩還元溶液を適用し
た。
するのに２−メルカプトエタノールを使った本発明の方
法。２−メルカプトエタノールの５％溶液をpH 8.0の0.
1 Mリン酸緩衝液中に調製した。この溶液１mlを凍結乾
燥された抗体断片タンパク質１mgに添加し、混合して溶
解させた。室温で１時間インキュベーション後、1.6ml
の塩溶液を添加し、そしてPD-10 脱塩カラムに通すこと
により溶液中の他の成分から部分還元タンパク質を分離
した。このタンパク質を限外濾過により1.7 mg／mlに濃
縮した。次いで実施例２に記載のような第一錫塩と錫ペ
レットとから成る過テクネチウム酸塩還元溶液を適用し
た。
【００８０】４．抗体断片中のジスルフィド結合を還元
するのにジチオトレイトールを使った本発明の方法。1
5.4mgのdl−ジチオトレイトール(DTT) を50mM Tris お
よび1mM EDTA, pH 8.0の溶液10mlに溶解した。還元しよ
うとするタンパク質１mgにつき、0.33mlの還元溶液を添
加し、混合してタンパク質を溶解させた。還元混合物を
37℃で１時間反応させた。部分還元されたタンパク質を
サイズ排除クロマトグラフィーにより精製し、そしても
とのF(ab')2 抗体断片の分子量に相当するタンパク質分
画を収集した。クロマトグラフィー精製断片を限外濾過
により0.9 ％食塩溶液中1.7 mg／mlに濃縮した。次いで
実施例２に記載の第一錫塩と錫ペレットとから成る過テ
クネチウム酸塩還元溶液を適用した。
するのにジチオトレイトールを使った本発明の方法。1
5.4mgのdl−ジチオトレイトール(DTT) を50mM Tris お
よび1mM EDTA, pH 8.0の溶液10mlに溶解した。還元しよ
うとするタンパク質１mgにつき、0.33mlの還元溶液を添
加し、混合してタンパク質を溶解させた。還元混合物を
37℃で１時間反応させた。部分還元されたタンパク質を
サイズ排除クロマトグラフィーにより精製し、そしても
とのF(ab')2 抗体断片の分子量に相当するタンパク質分
画を収集した。クロマトグラフィー精製断片を限外濾過
により0.9 ％食塩溶液中1.7 mg／mlに濃縮した。次いで
実施例２に記載の第一錫塩と錫ペレットとから成る過テ
クネチウム酸塩還元溶液を適用した。
【００８１】この４つの調製物それぞれについて、凍結
されバイアルに入れられた抗体断片を放射能標識し、実
施例２に記載のようにして試験した。同一の抗体断片を
使った４つの異なる方法の結果を表１に要約する。
されバイアルに入れられた抗体断片を放射能標識し、実
施例２に記載のようにして試験した。同一の抗体断片を
使った４つの異なる方法の結果を表１に要約する。
【００８２】表１は、精製段階を含まず、限定された量
の過テクネチウム酸塩還元溶液の添加も含まない米国特
許第4,424,200 号明細書に開示された最初の予備はんだ
法を使った時、この特定のF(ab')2 マウスモノクローナ
ル抗体断片を効率的に放射能標識することができなかっ
たが、本発明の方法を使った時、特にジスルフィド結合
を還元するのに Sn(II) 以外の剤を使った時、該抗体断
片が効率的に放射能標識されたことを示す。同じ過テク
ネチウム酸塩還元剤、ここでは Sn(II) 、を各方法に使
用した。85％より高い結合を得るように操作条件を最適
化しなかった。比較の目的は、本発明の方法を使うこと
により結合がどれくらい大幅に改善されるかを示すこと
であった。
の過テクネチウム酸塩還元溶液の添加も含まない米国特
許第4,424,200 号明細書に開示された最初の予備はんだ
法を使った時、この特定のF(ab')2 マウスモノクローナ
ル抗体断片を効率的に放射能標識することができなかっ
たが、本発明の方法を使った時、特にジスルフィド結合
を還元するのに Sn(II) 以外の剤を使った時、該抗体断
片が効率的に放射能標識されたことを示す。同じ過テク
ネチウム酸塩還元剤、ここでは Sn(II) 、を各方法に使
用した。85％より高い結合を得るように操作条件を最適
化しなかった。比較の目的は、本発明の方法を使うこと
により結合がどれくらい大幅に改善されるかを示すこと
であった。
【００８３】
【表１】
【００８４】実施例５ この実施例は、従来の直接もしくは予備はんだ法により
または他の同等な直接標識法により上手く標識すること
ができないモノクローナル抗体を標識するための本発明
の方法を例示する。或る種のモノクローナル抗体を用い
た以前の直接標識法の失敗の原因は、抗体の還元中に抗
体の断片化または凝集が起こり、これが異なった分子量
のタンパク質種を生成するためであった。この例は、So
rin Biomedia, Italy により提供される抗−CEA マウス
モノクローナルIgＧである。この抗体を Sn(II) 塩で還
元すると、還元されたTc-99mで優先的に標識される少量
の断片が形成される。この抗体をジチオトレイトールま
たは２−メルカプトエタノールで還元すると、還元され
たIgＧの二量体またはポリマーが形成され、これもTc-9
9mで標識される。本発明の方法では、ジスルフィド結合
還元段階の後、サイズ排除クロマトグラフィーカラムへ
の通過により抗体が精製される。もとの抗体の分子量に
のみ相当するカラム溶出液は、より小さいまたは大きい
タンパク質種から分離されている。過テクネチウム酸ナ
トリウムを還元するのには十分であるが抗体中のジスル
フィド結合を更に還元しないような量の過テクネチウム
酸塩還元溶液を添加し、抗体を放射能標識した。得られ
たTc-99m標識タンパク質は正しい分子量のものであり、
それより小さいまたは大きい分子量の汚染物を含まなか
った。
または他の同等な直接標識法により上手く標識すること
ができないモノクローナル抗体を標識するための本発明
の方法を例示する。或る種のモノクローナル抗体を用い
た以前の直接標識法の失敗の原因は、抗体の還元中に抗
体の断片化または凝集が起こり、これが異なった分子量
のタンパク質種を生成するためであった。この例は、So
rin Biomedia, Italy により提供される抗−CEA マウス
モノクローナルIgＧである。この抗体を Sn(II) 塩で還
元すると、還元されたTc-99mで優先的に標識される少量
の断片が形成される。この抗体をジチオトレイトールま
たは２−メルカプトエタノールで還元すると、還元され
たIgＧの二量体またはポリマーが形成され、これもTc-9
9mで標識される。本発明の方法では、ジスルフィド結合
還元段階の後、サイズ排除クロマトグラフィーカラムへ
の通過により抗体が精製される。もとの抗体の分子量に
のみ相当するカラム溶出液は、より小さいまたは大きい
タンパク質種から分離されている。過テクネチウム酸ナ
トリウムを還元するのには十分であるが抗体中のジスル
フィド結合を更に還元しないような量の過テクネチウム
酸塩還元溶液を添加し、抗体を放射能標識した。得られ
たTc-99m標識タンパク質は正しい分子量のものであり、
それより小さいまたは大きい分子量の汚染物を含まなか
った。
【００８５】実施例６ この実施例は高いHPLC収率を得るための精製およびEDTA
の使用を例示する。キメラIgＧモノクローナル抗体の４
つのアリコートを実施例２と同様にして Sn(II) 還元剤
で還元した。２つのアリコートをPD-10 カラムへの通過
により精製した後、 Sn(II) 過テクネチウム酸塩還元溶
液を添加した。残りの２つのアリコートは精製せず、追
加の Sn(II) 過テクネチウム酸塩還元溶液を添加しなか
った。この２組のアリコートの各々の一方に、エチレン
ジアミン四酢酸（EDTA）を放射能標識前に添加した。
の使用を例示する。キメラIgＧモノクローナル抗体の４
つのアリコートを実施例２と同様にして Sn(II) 還元剤
で還元した。２つのアリコートをPD-10 カラムへの通過
により精製した後、 Sn(II) 過テクネチウム酸塩還元溶
液を添加した。残りの２つのアリコートは精製せず、追
加の Sn(II) 過テクネチウム酸塩還元溶液を添加しなか
った。この２組のアリコートの各々の一方に、エチレン
ジアミン四酢酸（EDTA）を放射能標識前に添加した。
【００８６】HPLC収率により定量的放射化学純度を決定
した。この方法では、強力に結合したTc-99mの存在は、
注入された全Tc-99m中のHPLCサイズ排除クロマトグラフ
ィーにおいて回収されるTc-99mの比率に、IgＭタンパク
質ピークの元でのTc-99mの比率をかけたものとして測定
される。弱く結合したTc-99mはほとんど完全にHPLCカラ
ムに転移してカラムに結合し、そして未還元のTc-99mは
タンパク質ピークとは別個に溶出する。従ってこの方法
は強力に結合したTc-99mの測定を提供する。
した。この方法では、強力に結合したTc-99mの存在は、
注入された全Tc-99m中のHPLCサイズ排除クロマトグラフ
ィーにおいて回収されるTc-99mの比率に、IgＭタンパク
質ピークの元でのTc-99mの比率をかけたものとして測定
される。弱く結合したTc-99mはほとんど完全にHPLCカラ
ムに転移してカラムに結合し、そして未還元のTc-99mは
タンパク質ピークとは別個に溶出する。従ってこの方法
は強力に結合したTc-99mの測定を提供する。
【００８７】
【表２】
【００８８】実施例７ この実施例は、 Sn(II) によるおよびジチオトレイトー
ル(DTT) によるジスルフィド結合の還元の際の反応性ス
ルフィド基の形成を例示する。ヨードビーズ法を使って
マウスモノクローナルIgＭ抗体をI-125 で標識した。ア
リコートを実施例２のように調製した Sn(II) 還元溶液
と共にインキュベートし、21時間までの様々な時間間隔
でアリコートを取り出し、そしてPD-10 カラムに通して
還元反応を停止させた。アリコートをDTT ともインキュ
ベートした。塩化ナトリウムを対照として使った。反応
性スルフィド基の再酸化を防ぐために、窒素でパージし
た塩溶液でPD-10 カラムを溶出させた。各アリコートの
一部を遊離の反応性スルフィド基の測定に使用し、他の
一部をTc-99m標識および強力に結合したTc-99mの比率の
測定に使用した。
ル(DTT) によるジスルフィド結合の還元の際の反応性ス
ルフィド基の形成を例示する。ヨードビーズ法を使って
マウスモノクローナルIgＭ抗体をI-125 で標識した。ア
リコートを実施例２のように調製した Sn(II) 還元溶液
と共にインキュベートし、21時間までの様々な時間間隔
でアリコートを取り出し、そしてPD-10 カラムに通して
還元反応を停止させた。アリコートをDTT ともインキュ
ベートした。塩化ナトリウムを対照として使った。反応
性スルフィド基の再酸化を防ぐために、窒素でパージし
た塩溶液でPD-10 カラムを溶出させた。各アリコートの
一部を遊離の反応性スルフィド基の測定に使用し、他の
一部をTc-99m標識および強力に結合したTc-99mの比率の
測定に使用した。
【００８９】反応性スルフィド基形成は、Thio Avidgel
F (Bioprobe, Justin, CA) へのI-125 標識抗体の相対
的結合によって決定した。Thio Avidgel Fは、遊離スル
フヒドリル基または反応性スルフィド基を有するタンパ
ク質を結合する。そのような基が還元剤とのインキュベ
ーション中に形成されるならば、抗体結合率は反応性ス
ルフィド基に比例するだろう。Tc-99m標識は、実施例２
のように調製しこれにヒト血清アルブミンとイノシトー
ルを添加した Sn(II) 過テクネチウム塩還元溶液を使っ
て行った。強力に結合したTc-99mの比率は、実施例６に
記載のHPLC収率によって測定した。
F (Bioprobe, Justin, CA) へのI-125 標識抗体の相対
的結合によって決定した。Thio Avidgel Fは、遊離スル
フヒドリル基または反応性スルフィド基を有するタンパ
ク質を結合する。そのような基が還元剤とのインキュベ
ーション中に形成されるならば、抗体結合率は反応性ス
ルフィド基に比例するだろう。Tc-99m標識は、実施例２
のように調製しこれにヒト血清アルブミンとイノシトー
ルを添加した Sn(II) 過テクネチウム塩還元溶液を使っ
て行った。強力に結合したTc-99mの比率は、実施例６に
記載のHPLC収率によって測定した。
【００９０】
【表３】
【００９１】実施例８ この実施例は、実施例２の Sn(II) 還元剤を使った後で
PD-10 カラムへ通過させる本発明の方法が、モノクロー
ナル抗体の免疫反応性に影響を及ぼさないことを例証す
る。ミオシンに特異的なF(ab')2 抗体をI-125 標識ポリ
クローナル免疫グロブリンで短期標識した。一部を記載
のように還元し、PD-10 カラムに通した。還元されたF
(ab')2 と未還元のF(ab')2 の両者のアリコートを、標
準としてI-125 標識ポリクローナル免疫グロブリンを使
って同じ濃度になるように調整した。減少する濃度のF
(ab')2 抗体を使って両アリコートにおいて精製重鎖ミ
オシン抗原に対するELISA を行った。1/2 プラトー最大
吸光度においてアフィニティー定数を算出すると、同等
であることがわかった。
PD-10 カラムへ通過させる本発明の方法が、モノクロー
ナル抗体の免疫反応性に影響を及ぼさないことを例証す
る。ミオシンに特異的なF(ab')2 抗体をI-125 標識ポリ
クローナル免疫グロブリンで短期標識した。一部を記載
のように還元し、PD-10 カラムに通した。還元されたF
(ab')2 と未還元のF(ab')2 の両者のアリコートを、標
準としてI-125 標識ポリクローナル免疫グロブリンを使
って同じ濃度になるように調整した。減少する濃度のF
(ab')2 抗体を使って両アリコートにおいて精製重鎖ミ
オシン抗原に対するELISA を行った。1/2 プラトー最大
吸光度においてアフィニティー定数を算出すると、同等
であることがわかった。
【００９２】一般的にもしくは特定的に記載した本発明
の反応体および／または操作条件を上記実施例で使用し
たものに置き換えることにより、同様な成功を伴って上
記実施例を繰り返すことができる。特に、別のタンパク
質、キレート剤、または還元することのできるモノスル
フィドもしくはジスルフィド結合を含む基質をIgＧ，Ig
ＭおよびF(ab')2 モノクローナル抗体の代わりに使用す
ることができ；放射能標識しようとする物質中のジスル
フィド結合を還元するのに別の還元剤を使用することが
でき；還元剤を除去するのに別の精製方法を使用するこ
とができ；過テクネチウム酸ナトリウムを還元するのに
別の過テクネチウム酸塩還元剤を使うことができ；そし
てテクネチウムの同位体の他にレニウムの同位体を使用
することができる。上記は単に例示であり、他の同等な
態様も可能であり、考慮に入れられる。
の反応体および／または操作条件を上記実施例で使用し
たものに置き換えることにより、同様な成功を伴って上
記実施例を繰り返すことができる。特に、別のタンパク
質、キレート剤、または還元することのできるモノスル
フィドもしくはジスルフィド結合を含む基質をIgＧ，Ig
ＭおよびF(ab')2 モノクローナル抗体の代わりに使用す
ることができ；放射能標識しようとする物質中のジスル
フィド結合を還元するのに別の還元剤を使用することが
でき；還元剤を除去するのに別の精製方法を使用するこ
とができ；過テクネチウム酸ナトリウムを還元するのに
別の過テクネチウム酸塩還元剤を使うことができ；そし
てテクネチウムの同位体の他にレニウムの同位体を使用
することができる。上記は単に例示であり、他の同等な
態様も可能であり、考慮に入れられる。
【００９３】本発明を好ましい態様に関して記載してき
たが、他の態様も同じ結果を達成することができ、本発
明の変形や改良は当業者にとって明白であり、そしてそ
のような変形および同等物は全て、上述の特許請求の範
囲に包含されるだろう。
たが、他の態様も同じ結果を達成することができ、本発
明の変形や改良は当業者にとって明白であり、そしてそ
のような変形および同等物は全て、上述の特許請求の範
囲に包含されるだろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 43/00 49/02 Ｃ
Claims (3)
- 【請求項１】 放射性核種で放射能標識するのに適当な
タンパク様剤を調製する際の使用に適当な組成物であっ
て、 Sn(II)と錯生成する１または複数の反応性基を含有する
還元されたタンパク質；および添加される放射性核種の
量の完全な還元を可能にするのに十分な濃度であって且
つそれが前記タンパク質のそれ以上の還元を促進しない
ような濃度のSn(II)還元剤を含んで成る組成物。 - 【請求項２】 前記還元されたタンパク質が、還元され
たモノクローナル抗体、還元されたモノクローナル抗体
断片または還元されたポリクローナル抗体を含んで成
る、請求項１に記載の組成物。 - 【請求項３】 前記組成物が担体、不活性の糖または還
元されないタンパク質を更に含んで成る、請求項１また
は２に記載の組成物。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/391,474 US5078985A (en) | 1989-08-09 | 1989-08-09 | Radiolabeling antibodies and other proteins with technetium or rhenium by regulated reduction |
| US391474 | 1989-08-09 | ||
| US07/565,275 US5102990A (en) | 1989-08-09 | 1990-08-08 | Direct radiolabeling of antibodies and other proteins with technetium or rhenium |
| PCT/US1990/004461 WO1991001754A1 (en) | 1989-08-09 | 1990-08-08 | Direct radiolabeling of antibodies and other proteins with technetium or rhenium |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2514313A Division JP3070763B2 (ja) | 1989-08-09 | 1990-08-08 | テクネチウムまたはレニウムでの抗体または他のタンパク質の直接放射能標識 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000053590A true JP2000053590A (ja) | 2000-02-22 |
Family
ID=27013516
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2514313A Expired - Fee Related JP3070763B2 (ja) | 1989-08-09 | 1990-08-08 | テクネチウムまたはレニウムでの抗体または他のタンパク質の直接放射能標識 |
| JP11227755A Pending JP2000053590A (ja) | 1989-08-09 | 1999-08-11 | テクネチウムまたはレニウムでの抗体または他のタンパク質の直接放射能標識 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2514313A Expired - Fee Related JP3070763B2 (ja) | 1989-08-09 | 1990-08-08 | テクネチウムまたはレニウムでの抗体または他のタンパク質の直接放射能標識 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5102990A (ja) |
| EP (1) | EP0486622B1 (ja) |
| JP (2) | JP3070763B2 (ja) |
| AT (1) | ATE172879T1 (ja) |
| AU (1) | AU650629B2 (ja) |
| CA (1) | CA2065299C (ja) |
| DE (1) | DE69032742T2 (ja) |
| DK (1) | DK0486622T3 (ja) |
| ES (1) | ES2125854T3 (ja) |
| WO (1) | WO1991001754A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016129444A1 (ja) * | 2015-02-12 | 2016-08-18 | コニカミノルタ株式会社 | 抗体結合蛍光体集積ナノ粒子、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の製造方法および免疫染色キット |
| JPWO2017056844A1 (ja) * | 2015-09-28 | 2018-07-12 | コニカミノルタ株式会社 | 前立腺癌の病理組織診断結果（グリーソンスコア）の推定方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US5460785A (en) * | 1989-08-09 | 1995-10-24 | Rhomed Incorporated | Direct labeling of antibodies and other protein with metal ions |
| US5102990A (en) * | 1989-08-09 | 1992-04-07 | Rhomed Incorporated | Direct radiolabeling of antibodies and other proteins with technetium or rhenium |
| US5346687A (en) * | 1989-08-09 | 1994-09-13 | Rhomed Incorporated | Direct radiolabeling of antibody against stage specific embryonic antigen for diagnostic imaging |
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| US5443816A (en) * | 1990-08-08 | 1995-08-22 | Rhomed Incorporated | Peptide-metal ion pharmaceutical preparation and method |
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