KR20030045056A - ＥＤｂ-피브로넥틴 도메인의 수용체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 EDb-피브로넥틴 도메인에 특이적으로 결합하는 단백질, EDb-피브로넥틴 도메인의 수용체 또는 EDb-피브로넥틴 도메인에 결합하는 화합물의 스크리닝 방법에 관한 것이며, 상기 단백질의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 EDb-피브로넥틴 도메인에 특이적으로 결합하는 단백질에 관한 것이다.
피브로넥틴은 중요한 클래스의 매트릭스-당단백질이다. 이의 주된 역할은 세포가 여러가지 수많은 세포외 매트릭스에 부착하는 것을 용이하게 하는 것이다. 피브로넥틴이 배양한 비-형질전환 세포의 표면에는 존재하고 형질전환된 세포의 표면에는 부재한다는 사실은 피브로넥틴이 중요한 부착 단백질임을 확인시켜 주었다. 피브로넥틴은 수많은 다양한 다른 분자, 예를 들어 콜라겐, 헤파란 술페이트-프로테오글리칸 및 피브린과 상호작용하기 때문에 세포의 형태와 세포골격의 생성을 조절한다. 추가로, 피브로넥틴은 배자(胚子)발생 동안의 세포 이동 및 세포 분화를 담당하기도 한다. 추가로, 피브로넥틴은 창상 치유에도 중요하여, 대식세포 및 다른 면역 세포가 해당 지역으로 이동할 수 있게 하고 혈소판이 혈관의 손상된 영역에 부착될 수 있도록 함으로써 혈병(血餠)의 형성을 가능케 한다.
피브로넥틴은 2종의 유사한 펩티드들로 구성된 이량체로서, 각 쇄는 대략 60내지 70 nm 길이이다. 20종 이상의 다양한 피브로넥틴 쇄가 확인되었는데, 이들 모두가 단일 피브로넥틴 유전자로부터의 RNA-전사체의 얼터네이티브 (alternative) 스플라이싱을 통해 생성된 것이다. 피브로넥틴의 단백질 가수분해 소화물에 관한 분석에서, 상기 폴리펩티드는 크게 6개로 폴딩된 도메인들로 구성되어 있고 각 도메인은 소위 반복 서열 ("반복부")을 함유하는 것으로 나타났으며, 이들의 아미노산 서열 유사성에 따라 3가지 (I형, II형 및 III형)로 분류된다. 상기 이량체의 2가지 쇄 모두의 중심 영역은 III형 반복부 (평균적으로 90개 아미노산 길이)라 불리는 구역으로 구성된다 [Kornblihtt, A. R., Viobe-Pedersen, K., and Baralle, F. E., 1983. Isolation and Characterization of cDNA Clones for Human and Bovine Fibronectins. Proc Natl Acad Sci USA, 80, 3218-22]. 구조적 연구에서는 각 III형 반복부가 7개의 베타-가닥으로 구성되어 있고 이들이 반대방향으로 평행한 2개의 쉬이트 (sheet)로 폴딩되어 짧은 루프 영역들이 잠재적인 단백질-단백질-상호작용 부위로서 노출된다는 것을 알아냈다 [Leahy, D. J.; Hendrickson, W. A.; Aukhil, I. and Erickson, H. P., 1992. Structure of Fibronectin Type III Domain from Tenascin Phased by MAD Analysis of the Selenomethionyl Protein. Science, 258, 987-91]. 피브로넥틴은 이러한 III형 반복부를 통해 "인테그린"이라 불리는 세포 표면 분자와 상호작용하는 부착 분자로서 작용할 수 있다. 용어 "인테그린"은 1987년의 조사 논문 (survey article) [Hynes, R. O., 1987, Cell 48, 549-550]에서 세포외 매트릭스와 세포내 세포골격 사이의 매개자로 작용하여 세포 부착 및 이동을 유도하는 이종이량체성 세포 표면 분자들의 관련 군을 설명하기 위하여 최초로 사용되었다. 이들 이종이량체성 수용체는 세포외 환경으로부터의 신호를 특정한 세포 기능과 "통합"하거나 매개한다. 지금까지, 20종 초과의 알파-서브유닛과 공유결합하지 않은 채로 특이적으로 상호작용할 수 있는 (특히, 20종의 다양한 족을 형성함) 17종의 베타-서브유닛이 공지되어 있다 [Plow, E. F. et al. 2000, J Biol Chem, 275, 21785-21788]. 특히, III형 피브로넥틴의 10번째 반복부 (III10)에서 발견되는 서열 RGDS는 피브로넥틴과 8종 이상의 다양한 인테그린 사이의 상호작용을 매개한다. 또한, 4종 이상의 인테그린은 RGDS에 의존하지 않는 방식으로 피브로넥틴과 특이적으로 상호작용할 수 있는 것으로 나타났다 [Plow, E. F. et al. 2000, J Biol Chem, 275, 21785-21788]. 추가로, III형의 반복 서열군 중 III7 서열, III8 서열, III9 서열 및 III10 서열은 반복부 EIIIB 및 EIIIA (EDb및 EDa)도 포함한다. 현재까지, 이들 2가지 반복 서열의 기능은 거의 규명되지 않았거나 전혀 규명되지 않았다. 자르나긴, 더블유. (Jarnagin, W.) 등은 연구 [Jarnagin, W.; Rockey, D.; Koteliansky, V.; Wang, S. and Bissell, D. 1994, Expression of Variant Fibronectins in Wound Healing: Cellular Source and Biological Activity of the EIIIA Segment in Rat Hepatic Fibrogenesis. J Cell Biol, 127, 2037-48]를 통해, EDa도메인이 간 손상의 초기 반응에 관여할 뿐 아니라 세포 부착 과정의 매개에도 관여하는 듯 하다고 제안했다. EDb서열 (EDb-FN 또는 ED-B 또는 EDB)을 함유하는 피브로넥틴 이소형 (isoform)은 정상적인 성인의 조직에서는 검출되지 않지만, 태아 조직 및 종양 조직에서는 창상 치유 동안 만큼 높게 발현되는 것으로 나타났다.
종양이 진행되는 동안, 종양이 생장하는 조직의 세포외 매트릭스는 기존의 매트릭스 성분이 단백질 가수분해됨으로써 변형된다. 이와 관련하여, 종양은 정상적인 조직의 경우와 구별되는 세포외 매트릭스를 유도하며, 이는 종양 생장에 더욱 적합한 환경을 제공하고 혈관형성을 촉진한다. 혈관형성은 종양 생장에 가장 중요한 과정 중 하나로서, 내피로 코팅되어 있는 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 뻗어 나오는 과정을 일컫는다. 혈관형성은 특정 크기를 초과하는 종양의 생장을 보조하기 위해 세포외 매트릭스의 단백질가수분해, 새로운 모세혈관에서 내피 세포의 증식, 분화 및 이동의 유도가 요구되는 강도 높은 침윤 과정이다.
EDb피브로넥틴은 종양 생장과 관련이 있다. 추가로, EDb-FN은 혈관형성 과정 동안 새로운 혈관 주위에 집중되므로 혈관형성에 대한 마커를 제공하는 구실을 한다 [Castellani, P.; Viale, G.; Dorcaratto, A.; Nicolo, G.; Kaczmarek, J.; Querze, G.; Zardi, L. (1994) Int. J. Cancer 59: 612-618].
EDb도메인은 III형의 반복 서열로서 91개의 아미노산을 포함하고, 래트 피브로넥틴과 닭 피브로넥틴 사이의 서열 상동성은 96％ 내지 100％ 사이로 매우 높다. 상기 도메인 내에는 인테그린과의 상호작용을 매개한다고 공지되어 있는 RGDS 서열 또는 다른 아미노산 서열이 없다. ED-B 도메인의 특이적 기능은 현재까지 알려져 있지 않다. 다양한 세포에서 부착/세포 증식과 관련한 일반적인 자극 기능에 대해 성찰하는 3개의 연구 문헌이 간행된 바 있다.
문헌 [Chen and Culp (1996), Exp. Cells Res. 223, 9-19]은 세포의 피브로넥틴이 가능한 부착-촉진 서열로서 EDb도메인 및 인접한 III형의 반복 서열을 함유하며, 이는 세포에 의한 피브로넥틴 1차 전사체의 얼터네이티브 스플라이싱을 통해 조절될 수 있다는 것을 밝혀냈다.
이후의 연구 [Chen and Culp, 1998, Clin. Exp. Metast., 16, 1, 30-42]에서는, EDb가 병소(病巢) (focal) 부착 단백질을 티로신 인산화시키는 세포-신호 사건을 유도하며, 이는 특히 반복 서열 III8-9-10에 의해 매개되는 인테그린 인식 메카니즘과는 구별되는 메카니즘을 통해 인테그린을 인식하여 유도되는 것임을 밝혀낼 수 있었다. 세포외 매트릭스 또는 다른 세포와의 세포 부착은 세포 생장, 세포 분화 및 세포 형질전환 등과 같은 많은 현상들의 조절을 담당하는 세포 신호의 중요한 공급원이라는 것이 점점 인지되고 있다. 부착으로 유도되는 신호로는 단백질-티로신-키나제의 활성화 및 다양한 신호-분자들의 티로신-인산화 캐스케이드 등이 있다. 상기에서 언급한 연구 문헌의 저자들은 이러한 신호 과정에서 있어서 125 kDa의 병소 부착 키나제 (FAK)가 세포 상호작용과 매트릭스 단백질을 연결시켜 세포내 신호 분자, 예를 들어 Src [Xing, Z.; Chen, H. C.; Nowlen, J. K.; Taylor, S. J.; Shalloway, D., and Guan, J. L., 1994, Direct Interaction of v-Src with the Focal Adhesion Kinase Mediated by the Src SH2 Domain. Mol Biol Cell. 5, 413-21], Grb2 [Schlaepfer, D. D.; Hanks, S. K., Hunter, T. and van der Geer, P., 1994, Integrin-Mediated Signal Transduction Linked to Ras Pathway by GRB2Binding to Focal Adhesion Kinase. Nature, 372, 768-91] 및 PI-3-키나제 [Chen, H. C. and Guan, J. L., 1994, Association of Focal Adhesion Kinase with its Potential Substrate Phosphatidylinositol 3-Kinase. Proc Natl Acad Sci USA, 91, 10148-52]를 활성화시키는데 매우 중요하다는 점을 지적하고 있다. 또한, 다른 병소 부착 단백질인 p130cas 역시 부착-매개 신호 사건 및 특이적 종양원성(腫瘍原性) 활성과 관련이 있을 것이라고 추정되고 있으나, 이의 특이적 기능에 관해서는 현재까지 설명되지 않고 있다 ([Sakai, R.; Iwamatsu, A.; Hirano, N., et al. 1994, A Novel Signaling Molecule, p130, Forms Stable Complexes in Vivo with v-Crk and c-Src in a Tyrosine Phosphorylation-Dependent Manner. EMBO J. 13, 3748-56], [Petch, L. A., Bockholt, S. M., Bouton, A., Parsons, J. T. and Burridge, K., 1995, Adhesion-Induced Tyrosine Phosphorylation of the p130 SRC Substrate. J Cell Sci, 108, 1371-9], [Polte, T. R. and Hanks, S. K., 1995, Interaction Between Focal Adhesion Kinase and Crk-Associated Tyrosine Kinase Substrate p130Cas, Proc Natl Acad Sci USA, 92, 10678-82]).
첸 (Chen) 및 컬프 (Culp)의 연구 [1998, aaO]에서는 단일-반복 단백질 EDb가 인접한 반복부 III8 등 보다 BALB/c 3T3 세포의 증식을 더 크게 촉진할 뿐 아니라 FAK-티로신 인산화 유도 역시 더 크게 촉진한다는 것을 밝혀냈다. 이러한 추정은 세포의 피브로넥틴의 생리적 농도에서 III10의 테트라펩티드 RGDS와 인테그린이 결합하여 생성하는 신호의 강도는 세포 부착에 부적절할 수 있어서, III10과 인테그린-매개 메카니즘 사이의 상호작용으로 인한 티로신-인산화 반응은 발생하지 않는다는 것으로 진전되었다. 추가로, 여러가지 작은 GTP-결합 단백질들의 활성화 정도에 따라 다양한 세포 부착 매개에 대한 반응에 차이가 있는 것으로 추정된다. 이들 단백질 중 3가지인 cdc42, rac 및 rho는 모두가 ras-거대족의 일원이며 세포의 형태 변화에서 중요한 역할을 한다. cdc42는 rac의 상류에서 순차적으로 작용하여 필로포디아 (filopodia)의 생성을 직접 유도한다 [Nobes, C. D. and Hall, A., 1995, Rho, rac and cdc42 GTPa-ses Regulate the Assembly of Multimolecular Focal Complexes Associated with Actin Stress Fibers, Lamellipodia and Filopodia, Cell. 81, 53-62]. 이후에 rac의 활성화는 라멜리포듐 (lamellipodia)의 형성 및 필로포디아들 사이에서 액틴 필라멘트의 네트워크 형성을 담당한다. rho는 더욱 하류에서 rac에 의해 활성화될 수 있고 병소 부착 및 액틴 스트레스 섬유 (stress fiber)를 유도한다. 이들 사건 모두가 티로신 키나제의 활성화에 의존하고, 이들은 FAK 이후의 과정에 관여한다고 추정된다. 첸 및 컬프는 7-EDb-8을 통해 부착하는 세포들 뿐 아니라 8-9-10을 통해 부착하는 세포들 사이의 형태 차이는 작은 GTP-결합 단백질들의 활성화 정도에 따른 것이라 추측했다. 이는, 8-9-10을 통한 부착은 인테그린-매개 신호 경로를 거쳐 최종적으로는 rho를 활성화시켜 병소 부착 및 액틴 스트레스 섬유를 생성시키고, 7-EDb-8를 통한 BALB/c-3T3 세포의 부착은 cdc42 단백질 및 rac 단백질만을 활성화시키고 rho는 활성화시키지 않는다는 것을 제안한다. 그러나, 상기에서 언급한 내용은 추측일 뿐이며 상기 2가지 연구 어느 것도 관련 데이타를 제시하지 못했다.
다른 연구 [Hashimoto-Uoshima et al., 1997, J. Cell Sci. 110, 2271-2280]는 배양된 섬유아세포의 세포 부착이 EDb-피브로넥틴 도메인을 포함하는 피브로넥틴 단편의 존재에 의해 증대된다는 것을 밝혔다. 이는 스플라이싱된 EDb도메인이 세포 부착 및 세포 증식의 증대와 관련한 중요한 생물학적 기능을 수행할 수 있음을 제안하는 것이다. 그러나, EDb가 없는 단편에서 EDa의 존재는 세포에서 양호한 병소 부착의 형성을 저해한다. 상기 연구 문헌의 저자는 피브로넥틴 분자 내 상기 2개의 도메인이 포함되어 있으면 세포의 강력한 진행성 이동 과정 (부착했다가 떨어지는 과정 모두가 요구됨)이 용이해지는 정도로 세포 부착이 달성되는 메카니즘을 제공할 수 있게 된다는 사실을 바탕으로 추측한 것이다.
닭 배아(胚芽) 및 성숙 마우스에 대한 연구에서는 EDb-매개 혈관형성이 내피 세포 인테그린 α3β1의 억제를 통해 차단될 수 있는 것으로 나타났다 [Renato et al., AACR 2001, LB-60].
그러나, 상기에서 언급한 연구 및 조사 중 어느 것도 EDb도메인의 기능과 관련한 명백한 해답을 알아내지는 못했으며, 이들 내용은 EDb도메인에 대한 가능한 수용체(들)을 확인했음을 언급하는 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 EDb도메인의 기능을 더욱 규명하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 EDb도메인에 대한 가능한 특이적 수용체를 확인하는 것이다.본 발명의 다른 목적은 혈관형성 과정에 관여할 수 있는 EDb-특이적 부착 메카니즘 및 수용체 분자들과의 상호작용을 규명하는 것이다. 추가로, 본 발명의 목적은 특이적 결합을 담당하는 EDb영역을 확인하는 것이다.
본 발명의 목적은
a) EDb-피브로넥틴 도메인과의 특이적 결합력이 있는 단백질;
b) 내피 세포에서 특이적으로 발현되거나 활성화되는 단백질;
c) 종양의 간질(間質) 세포에서 특이적으로 발현되거나 활성화되는 단백질;
d) 종양 세포에서 특이적으로 발현되거나 활성화되는 단백질;
e) EDb-피브로넥틴 도메인과의 결합이 폴리펩티드에 의해 억제되는 단백질; 및
f) SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정한 경쇄의 명백한 분자량이 120 내지 130 kDa이고, 중쇄의 명백한 분자량이 150 내지 160 kDa인 단백질
에 의해 달성된다.
특히 바람직한 단백질은
a) EDb-피브로넥틴 도메인과의 특이적 결합력이 있는 단백질로서, 이때의 결합 영역이 서열 1 내지 서열 3을 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 서열임을 특징으로 하는 단백질;
b) 내피 세포에서 특이적으로 발현되거나 활성화되는 단백질;
c) 종양의 간질 세포에서 특이적으로 발현되거나 활성화되는 단백질;
d) 종양 세포에서 특이적으로 발현되거나 활성화되는 단백질;
e) EDb-피브로넥틴 도메인과의 결합이 서열 1 내지 서열 3을 포함하는 군에서 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드에 의해 억제되는 단백질; 및
f) SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정한 경쇄의 명백한 분자량이 120 내지 130 kDa이고, 중쇄의 명백한 분자량이 150 내지 160 kDa인 단백질이다.
매우 특히 바람직한 단백질은
a) EDb-피브로넥틴 도메인과의 특이적 결합력이 있는 단백질로서, 인테그린의 α2β1 쇄를 포함하는 단백질;
b) 내피 세포에서 특이적으로 발현되거나 활성화되는 단백질;
c) 종양의 간질 세포에서 특이적으로 발현되거나 활성화되는 단백질;
d) 종양 세포에서 특이적으로 발현되거나 활성화되는 단백질;
e) EDb-피브로넥틴 도메인과의 결합이 폴리펩티드에 의해 억제되고 인테그린의 α쇄를 포함하는 단백질; 및
f) SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정한 경쇄의 명백한 분자량이 120 내지 130 kDa이고, 중쇄의 명백한 분자량이 150 내지 160 kDa인 단백질이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 내피 세포는 증식 중인 내피 세포이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 간질 세포는 종양의 간질 세포이다.
추가로, 상기 목적은 EDb-피브로넥틴 도메인과의 특이적 결합이 내피 세포,종양의 간질 세포 및 종양 세포의 부착을 매개하는 것인 단백질에 의해서 달성된다. 이때의 결합 영역은 서열 1 내지 서열 3을 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 서열임을 특징으로 할 수 있으며, 특히 인테그린의 α2β1 쇄를 포함한다.
또한, 상기 목적은 EDb-피브로넥틴 도메인과의 특이적 결합이 내피 세포의 증식을 유도하는 것인 단백질에 의해서 달성된다. 이때의 결합 영역은 서열 1 내지 서열 3을 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 서열임을 특징으로 할 수 있으며, 특히 인테그린의 α2β1 쇄를 포함한다.
추가로, 상기 목적은 EDb-피브로넥틴 도메인과의 특이적 결합이 콜라겐 매트릭스에서 내피 세포의 증식, 이동 및 분화를 유도하는 것인 단백질에 의해서 달성되며, 이때의 결합 영역은 1종 이상의 서열임을 특징으로 한다. 이때의 결합 영역은 서열 1 내지 서열 3을 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 서열임을 특징으로 할 수 있으며, 특히 인테그린의 α2β1 쇄를 포함한다.
추가로, 상기 목적은 EDb-피브로넥틴 도메인과 결합하고 특이적 신호 도입 경로를 유도함으로써
-병소 부착 키나제,
-CD6 리간드 (ALCAM),
-비트로넥틴 수용체의 α쇄,
-통합된 알파 8 서브유닛, 및
-폴리스타틴-관련 단백질의 전구체(들)
을 포함하는 군에서 선택된 단백질을 코딩하는 1종 이상의 유전자를 유도하는 단백질에 의해서 달성된다.
이때의 결합 영역은 서열 1 내지 서열 3을 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 서열임을 특징으로 할 수 있으며, 특히 인테그린의 α2β1 쇄를 포함한다.
특이적 신호 도입 경로의 유도시에, 상기에서 언급한 유전자 1종 이상이 1군데 이상에서 유도되는 것이 바람직하다. 여기서, 상기에서 언급한 유전자 1종 이상이 2군데에서 유도되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 목적은 본 발명에 따른 단백질에 결합할 수 있는 항체에 의해서 달성된다.
추가로, 상기 목적은 서열 1, 서열 2, 서열 3 및 서열 4를 포함하는 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 결합할 수 있는 항체에 의해서 달성된다.
바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 EDb도메인에 특이적인 효과를 억제할 수도 있다.
상기 결합 및 억제는 시험관내 및(또는) 생체내에서 수행되는 것이 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 모노클로날 또는 재조합 항체이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 scFv 단편이다.
또한, 상기 목적은 본 발명에 따른 단백질을 발현하는 세포에 의해서 달성된다.
추가로, 상기 목적은 본 발명에 따른 항체를 발현하는 세포에 의해서 달성된다.
추가로, 상기 목적은 본 발명에 따른 항체를 발현하는 파지에 의해서 달성된다.
또한, 상기 목적은 EDb-피브로넥틴 도메인의 수용체에 결합하는 화합물의 스크리닝 방법으로서, 1종 이상의 후보 화합물들의 존재하에서 본 발명에 따른 단백질을 발현하거나 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포의 반응과, 이들 화합물의 부재하에서 상기 세포에 의한 대조 반응을 비교하는 단계를 포함하고, 이때 상기 반응 또는 대조 반응이 EDb-피브로넥틴 도메인의 수용체에 의해 매개되는 것인 방법에 의해서 달성된다.
바람직한 실시양태에서, 상기 반응 또는 대조 반응은 EDb-피브로넥틴 도메인 또는 이의 일부로 코팅된 표면으로의 세포 부착을 포함한다.
상기 방법의 바람직한 실시양태에서, EDb-피브로넥틴 도메인의 결합 영역은 서열 1 내지 서열 4의 서열 또는 이의 일부를 포함한다.
상기 반응 또는 대조 반응은 EDb-피브로넥틴 도메인 또는 이의 일부로 코팅된 표면에서의 세포 증식을 포함하는 것이 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, 상기 반응 또는 대조 반응은 EDb-피브로넥틴 도메인또는 이의 일부가 사용된 콜라겐 매트릭스에서의 내피 세포 증식, 이동 및 분화를 포함한다.
상기 화합물은 항체, 항체 단편, 인공 항체, 펩티드, 저분자량 화합물, 아프타머 (aptamer) 및 스피겔머 (Spiegelmer)를 포함하는 군에서 선택하는 것이 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 재조합 항체이다.
상기 항체는 scFv 및 이의 단편을 포함하는 군에서 선택하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 목적은 EDb-피브로넥틴 도메인에 결합하는 화합물의 스크리닝 방법으로서,
a) 다양한 농도의 1종 이상의 후보 화합물들의 존재하에서 본 발명에 따른 단백질을 발현하거나 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 EDb-피브로넥틴 도메인을 포함하거나 서열 1 내지 서열 4로 나타낸 서열 중 하나를 갖는 고정된 농도의 단백질과 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 화합물의 존재하에서 EDb-피브로넥틴 도메인을 포함하거나 서열 1 내지 서열 4로 나타낸 서열 중 하나를 갖는 단백질에 대한 상기 세포의 반응과, 상기 화합물의 부재하에서 EDb-피브로넥틴 도메인을 포함하거나 서열 1 내지 서열 4로 나타낸 서열 중 하나를 갖는 단백질에 대한 상기 세포의 대조 반응을 비교하고 두가지 반응의 차이를 측정하는 단계
를 포함하며, 이때 상기 반응 또는 대조 반응이 EDb-피브로넥틴 도메인의 수용체에 의해 매개되는 것인 방법에 의해서 달성된다.
여기서, 상기 반응 또는 대조 반응은 EDb-피브로넥틴 도메인 또는 이의 일부로 코팅된 표면으로의 세포 부착을 포함하는 것이 바람직하다.
모노클로날 항체는 하이브리도마 기술의 표준 방법을 사용하여 제조했으며, 인간 종양의 냉동절편에 대한 면역조직분석 결과가 특징적이다 (도 13 참조).
예로는 AK AM-EDBr-2 (뮤린 (murine) IgG 1/카파)가 있다.
바람직한 실시양태에서, 상기 반응 또는 대조 반응은 EDb-피브로넥틴 도메인 또는 이의 일부로 코팅된 표면에서의 세포 증식을 포함한다.
다른 바람직한 실시양태에서, 상기 반응 또는 대조 반응은 EDb-피브로넥틴 도메인 또는 이의 일부가 혼합된 콜라겐 매트릭스에서의 내피 세포 증식, 이동 및 분화를 포함한다.
상기 화합물은 항체, 인공 항체, 항체 단편, 펩티드, 저분자량 물질, 아프타머 및 거울상 아프타머를 포함하는 군에서 선택하는 것이 바람직하다.
추가로, 상기 목적은 서열 1 내지 서열 4를 포함하는 군에서 선택된 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 핵산을 사용하여 EDb-피브로넥틴 도메인의 수용체 또는 EDb-피브로넥틴 도메인에 결합하는 화합물을 스크리닝함으로써 달성된다.
또한, 상기 목적은 본 발명에 따른 단백질 또는 본 발명에 따른 항체를 사용하여 EDb-피브로넥틴 도메인의 수용체 또는 EDb-피브로넥틴 도메인에 결합하는 화합물을 스크리닝함으로써 달성된다.
또한, 상기 목적은 본 발명에 따른 세포를 사용하여 EDb-피브로넥틴 도메인의 수용체 또는 EDb-피브로넥틴 도메인에 결합하는 화합물을 스크리닝함으로써 달성된다.
또한, 상기 목적은 서열 1 내지 서열 4를 포함하는 군에서 선택된 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 핵산을 사용하여 진단 목적 또는 치료 목적을 위한 항체 또는 scFv-융합 단백질을 생성함으로써 달성된다.
또한, 상기 목적은 본 발명에 따른 단백질을 사용하여 진단 목적 또는 치료 목적을 위한 항체 또는 scFv-융합 단백질을 생성함으로써 달성된다. 치료 목적은 EDb와 수용체 사이의 특이적 상호작용을 억제하는 화합물을 사용한, 혈관형성을 저해하는 치료법으로서 정의된다. 이와 관련하여, 상기 항체는 수용체 및 EDb모두에 대해 유도된 것으로서, 서열 1 내지 서열 3의 펩티드 및 이의 안정화된 유도체 뿐 아니라 저분자량 화합물도 사용된다.
또한, 상기 목적은 본 발명에 따른 세포를 사용하여 진단 목적 또는 치료 목적을 위한 항체 또는 scFv-융합 단백질을 생성함으로써 달성된다.
또한, 상기 목적은 본 발명에 따른 파지를 사용하여 진단 목적 또는 치료 목적을 위한 항체 또는 scFv-융합 단백질을 생성함으로써 달성된다.
또한, 상기 목적은 서열 1 내지 서열 4를 포함하는 군에서 선택된 서열을 포함하는 단백질을 사용하여 프로-혈관형성 (pro-angiogenic) 요법을 수행함으로써 달성된다.
또한, 상기 목적은 진단 목적을 위해서 서열 1 내지 서열 4를 포함하는 군에서 선택된 서열을 포함하는 단백질을 사용함으로써 달성된다.
또한, 상기 목적은 유전자 요법에서 서열 1 내지 서열 4를 포함하는 군에서 선택된 서열을 포함하는 단백질을 사용함으로써 달성된다.
또한, 상기 목적은 서열 1 내지 서열 4를 포함하는 군에서 선택된 서열을 포함하는 단백질을 사용하여 내피 세포가 결합할 표면을 코팅함으로써 달성된다.
여기서, 코팅은 시험관내 또는 생체내에서 수행하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 목적은 세포 배양시에 서열 1 내지 서열 4를 포함하는 군에서 선택된 서열을 포함하는 단백질을 사용함으로써 달성된다.
또한, 상기 목적은 서열 1 내지 서열 4를 포함하는 군에서 선택된 서열을 포함하는 단백질을 1종 이상의 이식물과 함께 사용함으로써 달성된다.
여기서, 이식물은 혈관(들), 피부, 각막, 신장, 간, 골수, 심장, 폐, 뼈, 흉선, 소장, 췌장, 다른 내부 기관 및 이의 일부 및 이의 세포를 포함하는 군에서 선택하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 목적은 서열 1 내지 서열 4를 포함하는 군에서 선택된 서열을 포함하는 단백질을 1종 이상의 삽입물과 함께 사용함으로써 달성된다.
여기서, 삽입물은 폐 삽입물, 인공 심박조율기, 인공 심장판, 혈관내 삽입물, 내부 인공 보철물 (endoprostheses), 스크류, 부목(副木), 판(板), 와이어, 핀, 간체(桿體) (rods), 인공 관절, 유방 삽입물, 인공 두개판, 의치(義齒), 충전물 및 가교물 (bridge)을 포함하는 군에서 선택하는 것이 바람직하다.
"EDb-피브로넥틴 도메인에 특이적인 효과"는 EDb-피브로넥틴 도메인에 의해서는 달성되나 EIII7, EIII8 등에 의해서는 달성되지 않는 모든 효과로서 정의된다. 이러한 효과는 문헌 [Chen et al., 1998 (aaO)] 등에 기재되어 있는 바와 같이 여러 세포내 단백질의 신속한 티로신-인산화이며 도메인 EIII8-9-10에 의해 매개되는 부착 후의 느린 인산화와는 반대이다. "저분자량 화합물"은 상대적인 분자량이 약 1000 내지 1200 미만인 모든 화합물로서 정의된다. "아프타머"는 축적될 경우에 수많은 생체분자에 대해 고도로 특이적인 리간드로서 작용할 수 있는 핵산을 형성하는 분자로서 정의된다. "프로-혈관형성 요법"은 혈관형성이 요구되는 임의의 형태의 요법으로서 정의된다. "혈관형성을 저해하는 치료법/요법"은 혈관형성을 억제하도록 고안된 임의의 형태의 치료법/요법으로서 정의된다. "유전자 요법"은 질환시에 정상적인 유전자 기능을 회복하거나 유전자-관련 기능이상 (malfunction)을 제거하도록 고안된 임의의 형태의 요법으로서 정의되며, 이는 단백질을 제거하거나 제조하게 함으로써 효과를 발휘할 수 있다. 이는 외래 DNA를 신체 세포로 도입하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "세포 배양물"은 세포 배양 배지 및 세포 배양 용기 모두로서 정의된다. 세포 배양 용기는 세포 배양병, 세포 배양 접시, 세포 배양 웰, 세포 배양 플레이트, 미량역가 플레이트, 96-웰 플레이트, 세포 배양 플라스크 및 생물반응기를 포함하는 군에서 선택하는 것이 바람직하다.
"진단 목적"은 유기체/기관/세포 상태의 검출 또는 유기체/기관/세포의 현재 상태가 특이적 상태의 범주 (예를 들어, 특정 질환)에 드는지의 여부를 확인하기 위한 모든 목적이며, 예를 들어 키트/화학적 시약/측정용 장치를 사용하여 온도 등과 같은 물리적 수치 또는 농도 등과 같은 화학적 수치를 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것으로 고려되지 않는다.
"치료 목적"은 유기체/기관/세포의 질환 상태를 개선 또는 치유하기 위한 모든 목적이다. 어구 "단백질 및 삽입물의 사용"은 동일 시간에 또는 동일 공간에서 사용하는 것을 의미한다. 예를 들어, 신체에 "혼입"시키는 삽입물에 단백질 분자를 부착시킬 수 있고, 또는 이들은 삽입물과 물리적으로 분리되어 있을 수 있으나 삽입물의 "혼입"과 동시에 투여한다 (주사 등).
하기에서는 실시예와 도면을 토대로 본 발명을 상세히 설명할 것이다.
도 1은 본 발명에서 사용한 III형의 반복 서열을 도표로서 제시하여 나타낸다.
도 2는 EDb-피브로넥틴 도메인 (ED-B)의 영향하에서 다양한 기판상의 내피 세포 또는 인간 간질 세포의 증식 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 ED-B의 영향하에서 내피 세포의 관 분열 시험 (splintering test, 관형성 시험) 결과를 나타낸다.
도 4는 ED-B로 코팅된 표면으로의 내피 세포 부착을 시험한 부착 시험 결과를 나타낸다.
도 5는 세포를 EDb-피브로넥틴 도메인의 부분 서열을 갖는 다양한 합성 펩티드와 예비인큐베이션시켰다는 점을 제외하고는 도 4와 유사한 시험의 결과를 나타낸다.
도 6은 도 5에서 사용한 EDb-피브로넥틴 도메인에 대한 합성 펩티드의 부분 서열을 나타낸다.
도 7은 다양한 합성 ED-B 펩티드에 대한 내피 세포의 부착 시험 결과를 나타낸다.
도 8은 ED-B의 펩티드 주쇄의 모델 구조에서 도 6 및 도 7에서 사용한 합성 펩티드들의 위치를 나타낸다.
도 9는 관 분열 시험 (관 형성 시험)에서 모세혈관-유사 구조의 유도시에 EDb-피브로넥틴 도메인 및 루프 5에서 유래된 펩티드 (서열 2)의 작용을 나타낸다.
도 10은 표면-표지된 인간 피부-내피 세포로부터 수득한 세포 용균물을 사용하여 Fn-7-8-9 또는 Fn-7-B-8-9가 있는 2가지 친화성-크로마토그래피를 수행한 결과를 나타낸다.
도 11은 표면-표지된 인간 피부-간질 세포로부터 수득한 세포 용균물을 사용하여 Fn-7-8-9 또는 Fn-7-B-8-9가 있는 2가지 친화성-크로마토그래피를 수행한 결과를 나타낸다.
도 12는 EDbB 수용체의 친화성-크로마토그래피 정제 결과를 나타낸다.
도 13은 면역조직 분석 결과가 특징적인, 인간 종양의 냉동절편을 나타낸다.
도 1은 본 연구에서 사용한 다양한 재조합 피브로넥틴 단편을 나타내는 것으로서, 이들의 도메인 구조는 III형의 다양한 반복 서열을 사용하여 변화시켰다. 여기서, Fn-7-B-8-9는 피브로넥틴 도메인 7, 도메인 EDb, 도메인 8 및 도메인 9를 포함하고, Fn-7-8-9는 도메인 7, 도메인 8 및 도메인 9를 포함하고, ED-B는 도메인 EDb를 포함하고, Fn-10은 도메인 10을 포함하며, Fn-6은 도메인 6을 포함한다. 이들 단백질을 대장균에서 His-태그가 부착된 단백질로서 발현시켜 니켈-킬레이트-세파로스 컬럼상에서 정제하였다. 본 연구에서 사용한 숫자는 문헌에 사용된 숫자에 상응한다. 여기서, 각각의 약어 Fn-B, ED-B, EDB 및 EDb는 모두가 EDb-피브로넥틴 도메인을 지칭하며 동의어일 수 있다.
도 2는 내피 세포 (EC) 또는 간질 세포 (SC)의 증식에 대한 EDb-피브로넥틴 도메인 (ED-B)의 작용을 조사한 증식 분석 결과를 나타낸다. 96-웰 플레이트에서 웰 당 1000개 세포를 인큐베이션시켰다. 증식 분석 동안 가용성 ED-B (10 ㎕/L)를 배지에 첨가했다. 3일 후에, MTS 분석법을 통해 세포의 개수를 측정했다. 세포 증식은 bFGF (basic fibronectin growth factor)로 유도하였다. 세포에서 bFGF의부재시에는 ED-B가 아무런 작용을 하지 않는 것으로 나타났으며, bFGF의 존재하에서 III형의 피브로넥틴 도메인 10의 작용은 검출되지 않았다 (데이타는 나타내지 않음). 인간 내피 세포 증식에 대한 ED-B의 작용은 젤라틴상에 편평하게 부착된 세포 (EC/젤라틴)에서도 측정할 수 있고 콜라겐상에 편평하게 부착된 세포 (EC/콜라겐)에서도 측정할 수 있으나, 콜라겐상에서의 효과는 젤라틴상에서의 효과 만큼 크지 않았다. 젤라틴상의 인간 간질 세포 (SC/젤라틴)의 경우에는 bFGF의 부재하일지라도 인간 내피 세포 보다 상당히 더 많이 증식했다. bFGF 또는 bFGF + ED-B를 첨가해도 더 이상은 증가되지 않았다. 세포 계수의 척도로서 490 nm에서의 흡광도를 측정했다.
증식 분석에 사용한 실험 방법은 다음과 같았다:
-재료:
96-웰 플레이트 (바닥이 편평한 플레이트), 넌크 (Nunc) 제품
-배지:
MCDB 131, 페니실린/스트렙토마이신, 암포테리신 (0.25 ㎍/mL), 헤파린 (20 ㎍/mL), 열-불활성화된 FCS (5％)
-방법:
웰 (96-웰 플레이트) 당 500 내지 1000개의 세포를 bFGF (1 내지 3 ng/mL) 또는 VEGF (30 내지 50 ng/mL)가 들어있는 배지 100 ㎕ 중에 3일 동안 배양했다. 적정을 통해 각 배치 (batch)에서 최대 증식 자극이 최적에 도달하는 최소 농도의 정확한 양을 계산해야 한다. 실험 전에 세포를 동기화 (synchronization)시킬 필요는 없지만, 동기화할 수도 있다. 3일 후에, MTS 키트 (프로메가 (Promega) 제품)를 제조업체의 정보에 따라 사용하여 세포의 개수를 측정했다. 최대 흡광도를 선형 범위로 얻기 위해서는 여러 시점에서 흡광도를 측정할 것이 권고된다 (0.5시간; 1시간; 2시간; 4시간).
-대조군:
음성 대조군 - 유사분열 촉진인자 없음 (증식 없음) (-bFGF/VEGF)
양성 대조군 - 유사분열 촉진인자 있음 (최대 자극) (+bFGF/VEGF)
도 3은 내피 세포가 구상체(球狀體) (spheroid)로부터 관이 분열되는 과정에 대한 ED-B의 작용을 나타낸다. 이를 위해서, HUVEC (HumanUmbilicalVeinEndothelialCells)-구상체를 콜라겐 중에 묻고 ED-B의 부재하 또는 ED-B 6 ㎍/mL의 존재하에 bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) 10 ㎍/mL를 첨가하여 관 분열을 유도했다. 관 분열은 bFGF만을 첨가했을 때도 유도되는 것으로 나타났고, 이후에 ED-B를 첨가 (+bFGF + ED-B)함으로써 추가로 자극시킬 수 있었다.
관 분열 시험 (관 형성 시험)에 사용한 실험 방법은 다음과 같았다:
-재료:
메틸 셀룰로스, 최고 점도 (시그마 (Sigma) 제품)
세포 배양물을 위한 트립신/EDTA (깁코 (Gibco) 제품)
둥근 바닥 96-웰 플레이트 (그라이너 (Greiner) #650185)
재조합 bFGF (깁코 제품, #13256-029)
재조합 VEGF (알 앤드 디 시스템 (R ＆ D System) 제품)
항-래트-CD31 (RDI 제품, #RDI-CD31TLD)
헤파린 (깁코 제품, #15077-027)
-용액:
PBS/항생제: 세포 배양용 PBS, 10 ×페니실린/스트렙토마이신, 2.5 ㎕/mL 암포테리신
1％ 젤라틴 (디프코 (Difco) 제품, 오토클레이브시켰다가 냉각시킨 후에 페니실린/스트렙토마이신 및 암포테리신 (0.25 ㎍/mL)과 혼합함)
-배지:
MCDB 131, 글루타민, 페니실린/스트렙토마이신, 암포테리신 (0.25 ㎍/mL), 헤파린 (20 ㎍/mL), 열-불활성화된 FCS (10％)
-생장 배지:
2 ng/mL bFGF 및 10 ng/mL VEGF를 함유하는 배지
-세포:
HUVEC
표피 MVEC (계대 >4)
-방법:
내피 세포를 트립신/EDTA로 떼어내고 0.24％ 메틸 셀룰로스를 사용하여 5000개 세포/mL로 희석했다. 그라이너 플레이트의 웰 각각에 200 ㎕ (1000개 세포)씩 첨가하고 밤새 인큐베이션했다. 비스듬히 자른 팁을 꽂은 1 mL 피펫을 사용하여 둥근 형태의 세포 군집체 (구상체)를 수거하고 원심분리했다. 구상체를 1.2％ 메틸 셀룰로스/FCS 중에 재현탁하고 중화시킨 콜라겐 겔과 혼합했다. EDb및 bFGF를 혼합하였다.
상기 도면으로부터 명백한 바와 같이, ED-B를 첨가한 경우의 관 분열은 bFGF로 유도한 경우에서 보다 상당히 더 증가되었다.
도 4는 ED-B로 코팅한 미량역가-웰 플레이트로의 내피 세포 부착 시험 결과를 나타낸다. 이를 위해서, 내피 세포의 기판에 트립신처리 (트립신/EDTA)함으로써 상기 내피 세포를 원래의 배양 용기로부터 떼어낸 후에 다양한 농도 (0, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 40 ㎍/mL)의 ED-B로 코팅한 미량역가-웰 플레이트에서 1시간 동안 인큐베이션하여 부착되도록 했다. 음성 대조군으로서, 1 mg/mL BSA (소 혈청 알부민)로 코팅한 웰을 사용했다; BSA로의 부착률 (< 10％)을 감하였다.
크리스탈 바이올렛으로 염색한 후에 SDS로 용균시킴으로써 부착 정도를 정량하였다. 이러한 정량은 595 nm에서의 흡광도를 측정하여 수행했다. 도면에서 약 1.06의 A595nm에서 수평으로 그린 선은 혈장-피브로넥틴으로의 100％ 부착을 지시하는 것이다.
이러한 시험 결과는 세포가 ED-B로 코팅한 표면에 부착한다는 것을 지시하며, 세포 표면상에 ED-B에 대한 수용체가 존재함을 암시하는 것이다.
부착 시험에 사용한 실험 방법은 다음과 같았다:
-용액:
1％ BSA (시그마 제품, 에탄올-침전시킴)
PBS 중 2％ 혈청 (또는 트립신 중화 용액)
-배지:
MCDB 131, 페니실린/스트렙토마이신, 암포테리신 (0.25 ㎍/mL), 헤파린 (20 ㎍/mL), 0.1％ BSA (시그마 제품, 에탄올-침전시킴)
-PBS 중 0.1％ 크리스탈 바이올렛, 2％ 글루타르알데히드 (여과하여 멸균함)
-2％ SDS
-방법:
1시간 동안 37℃에서 96-웰 플레이트 (넌크 제품)의 웰에 단백질을 첨가하고 뚜껑을 덮었다. 작은 단백질 (< 20 kDa) 또는 펩티드를 사용할 경우, 이를 플레이트상에서 건조시킬 것이 권고된다 (멸균실에서 뚜껑없이 밤새 건조시킴). 이어서, 상기 웰에 1％ BSA를 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 포화시켰다. 1 ×트립신을 사용하여 세포를 떼어내고 2％ 혈청으로 세척하여 트립신을 불활성화시키고 배지 중에 재현탁했다. 항체 또는 펩티드를 시험하는 경우, 세포를 이와의 현탁액 중에서 30분 동안 37℃로 예비인큐베이션시켰다. 웰 (96-웰 플레이트) 당 104개 세포를 50 내지 100 ㎕의 부피로 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 상청액을 조심스럽게 따라 버린 후에 플레이트를 종이 타월위에 뒤집어 놓고 1분 동안 방치하여 물기를 없애고, 부착된 세포를 크리스탈 바이올렛/글루타르알데히드로 15분 동안 염색하면서 부착시켰다. 상기 웰을 PBS로 3회 세척한 후에 2％ SDS (진탕기 중에서 15분)를 첨가하여 세포를 용균시켰다. 595 nm에서의 흡광도를 측정했다. 물로 3회세척한 후에, 필요하다면 상기 세포를 다시 염색할 수 있다.
-대조군:
음성 대조군: 빈 웰 (BSA 대조군)
양성 대조군: 혈장-피브로넥틴 (2.5 ㎍/mL)
-부착률(％) = A595(샘플) : 100 ×A595(피브로넥틴)
도 5는 내피 세포를 EDb-피브로넥틴 도메인의 부분 서열을 갖는 250 μM의 다양한 합성 펩티드와 예비인큐베이션시킨 후에 ED-B로 코팅된 미량역가-웰 플레이트에 부착시켰다는 점을 제외하고는 도 4와 유사한 시험의 결과를 나타낸다. 595 nm에서의 흡광도 (A595)를 측정하여 부착률을 측정했다. 도면에 나타낸 펩티드 고안물은 도 6에 설명되어 있다. 여기서, 펩티드 서열 번호 043은 서열 1로 나타낸 서열에 상응하고, 펩티드 서열 번호 553은 서열 2로 나타낸 서열에 상응하며, 펩티드 서열 번호 038은 서열 3으로 나타낸 서열에 상응한다. A595값이 높을 수록 해당하는 펩티드에 의한 부착 억제가 그만큼 적음을 나타내고, A595값이 낮을 수록 해당하는 펩티드에 의한 부착 억제가 그만큼 높음을 나타낸다.
도 4와 관련하여 기재한 방법에 따라 수행했다.
도 6은 EDb-피브로넥틴 도메인의 전체 서열로부터 일부를 선택하여 고안한 서열을 갖는 합성 ED-B 펩티드의 부분 서열을 나타낸다. 아미노산에 대한 1-문자코드를 사용했다.
도 7은 미량역가-웰 플레이트를 EDb-피브로넥틴 도메인으로 코팅하지 않고 도 5의 시험에서 억제 활성이 입증된 펩티드와 예비인큐베이션시켜 이것으로 플레이트를 코팅하거나, 또는 미량역가-웰 플레이트를 도 5에서 억제 활성이 없는 것으로 입증된 펩티드와 예비인큐베이션시켜 이것으로 플레이트를 코팅했다는 점을 제외하고는 도 5와 유사한 시험의 결과를 나타낸다. 여기서, A595수치를 측정했을 때, 이들 시험에서의 세포는 각각의 억제성 펩티드로 코팅한 플레이트에는 부착되는 것으로 나타났으나, 도 5에서 억제 활성이 없는 것으로 입증된 펩티드로 코팅한 플레이트에는 전혀 부착되지 않았다.
도 4와 관련하여 기재한 방법에 따라 수행했다.
도 8은 EDb-피브로넥틴 도메인 (ED-B)의 모델 구조로서, 억제성 펩티드-1 (= 서열 1), 억제성 펩티드-2 (= 서열 2) 및 억제성 펩티드-3 (= 서열 3)의 위치를 나타냈다. 이들 억제성 펩티드는 ED-B 구조의 루프 1 또는 루프 5상에 위치하는 것으로 나타났으며, 이로써 세포 또는 세포상에 존재하는 수용체와 결합하는 도메인 영역이 확인되었다. 도 8에 나타낸 ED-B 도메인의 모델 구조는 이미 결정된 III형 피브로넥틴 도메인 7의 구조를 바탕으로 한다. N-T 및 C-T는 N-말단 또는 C-말단을 의미한다.
도 9는 관 분열 시험에서 모세혈관-유사 구조 (관 형성)의 유도시에 ED-B 및 펩티드-2 (앞에서 억제성 펩티드인 것으로 결정되었음)의 첨가 효과 및 III형 피브로넥틴 도메인 6의 첨가 효과에 관해 연구한 결과를 나타낸다. 기준량의 bFGF로 유도된, 콜라겐 겔로의 침투에 대한 최대 효과는 부착을 억제했던 서열 2의 펩티드에 의해 달성되는 것으로 나타났다. 따라서, 상기 펩티드는 콜라겐 겔에서 내피 세포의 침투에 대한 자극 효과가 있다. 따라서, 상기 펩티드는 EDb의 결합 영역에 상응하며, EDb자체와 유사하게 내피 세포에 의한 콜라겐의 침투를 자극한다.
도 3과 관련하여 기재한 방법에 따라 수행했다.
도 10은 표면-표지된, 인간 피부 내피 세포로부터 수득한 세포 용균물로 친화성 크로마토그래피를 수행한 결과를 나타낸다. 이와 관련하여, 세포 표면을 바이오티닐화시킨, 증식 중인 내피 세포를 세정제로 용균시켜 친화성 크로마토그래피를 수행하였으며, 이때 EDb-피브로넥틴 도메인이 삽입되어 있거나 상기 도메인이 없는 짧은 단편의 피브로넥틴들을 커플링시킨 세파로스를 사용했다 (EDb-피브로넥틴 도메인이 있는 경우, Fn-7-B-8-9; EDb-피브로넥틴 도메인이 없는 경우, Fn-7-8-9). 명백한 분자량이 120 내지 130 kDa인 바이오티닐화 단백질은 ED-B-함유 단편에 특이적으로 결합한다는 것을 알 수 있었다 (화살표 참조). EDTA로 용출시켰다. 하기에 기재한 여러개의 분획물을 수집했다. 이어서, 상기 분획물로 SDS-PAGE를 수행하고, 스트렙타비딘-퍼옥시다제 및 화학발광 (ECL)을 사용한 웨스턴 블롯팅을 수행하여 연구했다. 레인 1 및 5는 초기 용출 분획물을 나타내고, 레인 2, 3, 4 또는 6, 7, 8은 용출된 분획물 1, 2 및 3을 나타낸다. 레인 1 내지 4는 Fn-7-8-9를사용한 크로마토그래피를 나타내고, 레인 5 내지 8은 Fn-7-B-8-9를 사용한 크로마토그래피를 나타낸다. 여기서 나타난 결과는 분자량 120 내지 130 kDa 사이의 뚜렷한 밴드가 EDb-함유 피브로넥틴 단편에 특이적으로 결합하므로, 이것이 EDb-피브로넥틴 도메인의 수용체임을 강하게 지시하는 것이다.
바이오티닐화 및 내피 세포의 용균시에 사용한 실험 방법은 다음과 같았다:
-재료:
바이오틴아미도헥산산-3-술포-N-히드록시숙신이미드-에스테르; 시그마 제품
PBS w/o Mg/Ca (둘베코 (Dulbecco))
HEPES-완충액: 20 mmol HEPES, pH 7.6, 1 mmol CaCl2, 1 μM MgCl2, 0.1％ NaN3,
1％ CHAPS (V/V) 및
베링거 (Boehringer) 완전 미니프로스테아제 억제제, EDTA-없는 칵테일 정제
-방법:
바이오티닐화 전후에 세포 배양병을 각각 3회씩 PBS w/Ca + Mg로 세척했다. 마지막으로 세척하기 전에, 바이오틴 완충액 (1 mg/15 mL PBS)을 제조했다. 각각의 병에 완충액 5 mL (225 cm2플레이트의 경우) 또는 12.5 mL (500 cm2플레이트의 경우)을 병의 바닥 중앙부에 피펫을 사용하여 넣고 병을 흔들어서, 상기 부피량이 병의 바닥 전체에 깔릴 수 있도록 했다. 이어서, 상기 제1 배양병에 용균 완충액 부피량의 절반을 넣었다. 완충액 역시 피펫을 사용하여 병의 바닥 중앙부에 넣고전체 표면에 깔리도록 했다. 이어서, 세포를 세포 스크래퍼로 긁어냈다. 제1 배양병의 전체 부피량을 제2 병에 피펫을 사용하여 넣은 후에 이 과정을 반복했다. 마지막 병에 넣은 후에, 상기 부피량을 50 mL 원뿔형 원심분리 튜브로 옮겼다. 용균 완충액의 나머지 절반을 사용하여, 이 과정을 모든 배양병에 대해 반복했고 (세포 스크래퍼는 사용하지 않음), 이러한 최종 부피량도 상기 원심분리 튜브에 옮겼다. 이를 50 mL 원뿔형 세포 배양 튜브에서 3000 rpm으로 5분 동안 실온에서 원심분리했다 (헤래우스 테이블 (Heraeus table) 원심분리기). 용균물을 피펫으로 수거한 직후에 친화성 크로마토그래피를 수행하는 것이 이상적이다 (필요한 경우에는 -80℃에 냉동시켜 둘 수도 있음).
단백질을 세파로스에 공유결합으로 커플링시키기 위해 선택한 방법은 다음과 같았다:
-재료:
활성화된 CH 세파로스 4B 파르마샤 바이오테크 (Pharmacia Biotech), 코드 번호 17-0490-01
1 mmol HCl, 2.2％ NaHCO3
-방법:
HCl을 빙욕조 중에서 냉각시키고, 세파로스를 실온으로 가온했다. 이어서, 세파로스를 1 mmol HCl로 세척했다. 세파로스 1 mL 당 HCl 10 mL이 필요했다. 세파로스를 미리 냉각시킨 튜브로 서서히 떨어뜨린 후에, 약 15분 동안 팽윤시켰다.(세파로스 1 g은 팽윤된 세파로스 3 mL에 상응함). 이어서, 상기 튜브를 1분 동안 800 U로 원심분리했다. 상청액을 피펫으로 수거하고 버렸다.
상기 과정을 3회 반복했다..
3번째 세척 후에, 튜브를 흔들면서 HCl을 다시 첨가하고 3 내지 5분 동안 800 U로 원심분리했다. 상청액은 피펫으로 수거하고 펠렛은 밀리포어 (millipore) 물 20 mL 중에 현탁하여 새로운 원심분리 튜브 2개 (7-EDB-8-9 세파로스 및 7-8-9 세파로스, 즉, 반복부 III7, EDb, III8 및 III9 또는 III7, III8 및 III9의 폴리펩티드가 커플링된 세파로스에 각각 튜브 1개씩)로 옮겼다. 곧이어, 상기 튜브를 다시 원심분리하고 상청액을 피펫으로 제거함으로써, 세파로스 1 mL 당 단백질 1 내지 5 mg을 커플링시킬 수 있었다 (즉, 세파로스 7-8-9 1 mL 당 단백질 2 mg; 세파로스 7-EDB-8-9 1 mL 당 단백질 2 mg).
이어서, 상기 튜브를 흔들어서 혼합했다. 이어서, 2.2％ NaHC3(겔 1 mL 당 50 ㎕)을 신속하게 첨가했다. 이 결과, 잔류 HCl이 중화되었다. 상기 튜브를 흔들고, "로커 테이블 (rocker table)"상에서 최대 강도로 1 내지 5시간 동안 철저하게 혼합했다.
이어서, 상기 튜브를 다시 원심분리했다.
세파로스에 공유결합으로 커플링시킨 단백질 농도를 측정하기 위해서, 브래드포드 (Bradford) 시험을 수행했다:
-재료:
BSA 스톡 용액, 2 mg/mL
브래드포드 시약
-방법:
BSA 용액을 다음과 같이 넌크-이뮤노-플레이트 (맥시 소르프 (Maxi Sorp))에 넣었다: 5 ㎍ - 4 ㎍ - 3 ㎍ - 2 ㎍ - 1 ㎍ (부피 80 ㎕ + 분석물 20 ㎕)
BSA의 예비 희석: 5 ㎍/50 ㎕ = 0.1 mg/mL
상기 스톡 용액 (2 mg/mL)을 1 : 20으로 희석시켜 0.1 mg/mL의 농도로 만들었다.
친화성 크로마토그래피를 수행하거나 용출하기 위해서, 다음의 방법을 선택하였다:
a) 친화성 크로마토그래피
-재료:
활성화된 CH 세파로스 4B 파르마샤 바이오테크, 코드 번호 17-0490-01
완충액 A (20 mmol HEPES, pH 7.6, 1 mmol CaCl2, 1 mmol MgCl2, 0.1％ NaN3)
완충액 B (완충액 A + 150 mmol of NaCl + 0.1％ Chaps)
완충액 C (완충액 A + 0.1％ Chaps)
PH 4-완충액 (밀리포어 물 + 0.1％ 빙초산 + 0.1％ Chaps)
EDTA-완충액 (완충액 A + 200 mmol EDTA, pH 8.5 + 0.1％ Chaps)
-방법:
먼저, 상기 용균물을 컬럼상에 3회 첨가했다.
액체 수집용 튜브는 컬럼 아래쪽에 장착했다. 우선, 용균물 중 2 mL을 에펜도르프 (Eppendorf) 피펫을 사용하여 조심스럽게 겔에 첨가했다. 나머지 용균물 부피량은 측정용 피펫을 사용했다. 상기 컬럼은 곧은형임을 알아야 한다. 컬럼을 처음 사용할 경우에는 실제로 사용하기 전에 어떤 단백질도 없는 완충액으로 "건조 운행"시켜야 한다. 컬럼 충전은 5회 이하로 사용해야 한다.
용균물을 냉동 (-80℃)시킨 경우, 이는 먼저 수조 중에서 가열한 후에 원심분리했다 (3000 U로 5분).
그러나, 냉동된 용균물 보다는 신선한 용균물인 것이 언제나 더욱 바람직하다.
상기 용균물 500 ㎕를 피펫으로 수거하여 에펜도르프 용기에 옮겼다.
크로마토그래피 전후의 용균물 연구에 이를 사용했다.
2개의 컬럼을 사용하는 경우 (7-8-9 세파로스 및 7-B-8-9 세파로스에 각각 1개씩), 각각에 상기 용균물 부피량의 절반을 첨가했다. 2개의 컬럼의 유속은 동일해야 한다. 유속이 동일하지 않을 경우, 유속이 "더 느린" 컬럼은 상응하는 시간 동안 막아 둔다. 이상적인 유속은 0.2 내지 0.5 mL/분이다.
용균물을 3회에 나누어 컬럼에 사용하는 경우에도 마찬가지로, 운행 시작시에 500 ㎕을 피펫으로 에펜도르프 용기에 넣어 혼합한 후에, 이에 대한 연구도 수행할 수 있다.
이어서, 컬럼 부피의 10배에 해당하는 완충액 B 및 완충액 C 각각을 컬럼에첨가했다. 이어서, 세척 단계가 완결되었다.
b) 용출
예비-용출: 완충액 C를 컬럼에 첨가함으로써 세척 단계 이후에도 단백질이 여전히 남아있는지를 알 수 있다. 에펜도르프 용기 중에 500 ㎕을 수집했다 (2개의 컬럼으로 2 ×500 ㎕에 상응함).
EDTA-용출: EDTA는 Ca 이온 및 Mg 이온과 복합체를 형성한다. 그 결과, 결합에 Ca 및 Mg가 요구되는 내피-세포 단백질이 용출된다. EDTA-완충액 2 ×4 mL을 컬럼 (또는 2개의 컬럼 모두)에 첨가하고 팔콘 (Falcon) 튜브에서 2개의 분획물 (E1 및 E2/BE1 및 BE2)로 수집했다. 이어서, 상기 튜브의 내용물들을 혼합하고 5000 ㎕씩을 피펫으로 수거하여 1개 (또는 2개)의 에펜도르프 용기(들)에 옮겼다.
pH 4-용출: 완충액의 실제 pH는 3.7이었다. 중성 pH 범위 (pH 6 내지 8)에서 벗어난 경우, 수용체와 이의 단백질 사이의 결합이 억제될 수 있다. 또한, EDTA-용출에서와 마찬가지로, pH 4-완충액 2 ×4 mL을 컬럼에 첨가하고 2개의 분획물로 수집하여 각각 500 ㎕씩을 피펫으로 수거했다 (4.1 및 4.1/B4.1 및 B4.2).
이어서, 컬럼 부피의 3배에 해당하는 완충액 A를 컬럼에 첨가하여 산을 세척해냈다. 마지막 산 컬럼은 컬럼 내에 남겨두었다. 컬럼을 밀폐시켜 냉장 보관했다.
에펜도르프 용기 중의 500 ㎕ 분획물을 15분 이상 동안 -80℃에서 냉동시킨 후에 "스피드 백 (Speed Vac)"에서 동결건조시켰다.
이로써 수득된 상기 분획물 또는 예비-용출 분획물을 SDS-PAGE로 분리하고환원 조건하에 웨스턴 블롯팅을 수행했다.
도 11은 용균시킨 내피 세포가 아니라 용균시킨 간질 세포를 사용했다는 점을 제외하고는 도 10과 동일한 실험을 나타낸다. 도 11에 나타낸 웨스턴 블롯에서, 레인 1 내지 3은 Fn-7-8-9를 사용한 친화성 컬럼의 용출물을 나타내고, 레인 4 내지 6은 Fn-7-B-8-9를 사용한 친화성 컬럼의 용출물을 나타낸다. 레인 1 및 4는 예비-용출물이며, 레인 2, 3 또는 5, 6은 각각의 용출 운행에서 얻은 분획물 1 및 2를 나타낸다. 도 10에서 볼 수 있는 명백한 분자량 120 내지 130 kDa의 뚜렷한 밴드는 인간 간질 세포로부터 수득한 세포 용균물에서는 관찰되지 않았다.
상기 기재 내용에 개시한 본 발명의 특징, 청구의 범위 및 도면 각각 및 이들의 임의의 조합은 본 발명을 다양한 실시양태로 수행하는데 있어서 필수적일 수 있다.
도 12는 ED-B 결합 단백질을 나타내며, 이는 기재한 바와 같이 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하고 SDS-구배 겔 전기영동 (4 내지 12％)으로 분리한 것이다. 특히 집중된 2개의 밴드 (화살표)를 잘라 질량 분광계로 분석하였다.
서열 분석을 통해, 상기 단리된 단백질이 알파2-베타1-인테그린임이 명백히 확인되었으며, 베타1 서브유닛의 우세한 밴드는 두꺼우며, 알파2 서브유닛의 밴드는 얇게 나타났다.
이러한 발견은 EDB와의 결합이 주로 인테그린의 베타1 서브유닛에 의해 매개된다는 것을 암시하는 것이다. 시험한 세포 유형에 상응하는 다른 알파 서브유닛 (예를 들어, 알파2)과 베타1의 조합 역시 EDB-FN과의 결합을 매개할 수 있다.
도 13은 면역조직 분석 결과가 특징적인, 인간 종양의 냉동절편을 나타내며, 여기서 A는 신장 세포 암종(癌腫)의 사진으로서, 화살표는 AK AM-EDBr-2에 의한 특이적 염색 부위를 나타내고; B는 상기 A의 사진을 클로즈업한 것이고; C는 간세포 암종을 나타내며; D는 흑색종의 사진이다 (특이적 염색 부위는 관찰되지 않음).
EDB-수용체의 분석
상기 밴드들을 1D-겔에서 잘라 NH4HCO3용액 및 아세토니트릴로 세척하고 건조시켜 트립신 용액과 혼합하여 겔 중의 단백질을 가수분해시켰다. 겔에서 소화 용액 중으로 용출된 펩티드를 μC18컬럼상에서 농축하고 탈염하여 MALDI-질량 분광계로 측정했다 (이를 통해, 소화된 단백질의 펩티드 질량 목록을 얻음).
임의의 겔 밴드로부터 얻은 펩티드 질량을 사용하여 데이타베이스 검색을 수행했다. 검색 결과가 모호한 경우에는 개개의 펩티드에 대한 MALDI-PSD-스펙트럼 (단편 스펙트럼)을 다시 측정했다. 상기 스펙트럼을 직접 사용하여 제안된 펩티드 서열을 확인하거나 (스펙트럼의 해석) 또는 이들 스펙트럼으로 데이타베이스 검색을 수행했다.
연구한 밴드는 다음과 같았다:
밴드 A= 제제 6의 밴드 1
제제 5의 밴드 4
산성 용출물의 밴드 6
결과: 인테그린 α2
-밴드 4의 데이타베이스 검색 결과 참조
-밴드 1 및 밴드 6의 스펙트럼은 동일한 최대 농도의 펩티드들을 나타냄
-밴드 1의 펩티드에 대한 PSD-스펙트럼을 통해 인테그린 α2의 부분 서열임을 확인함
밴드 B= 제제 6의 밴드 2
제제 5의 밴드 5
산성 용출물의 밴드 7
결과: 인테그린 β1
-밴드 5 및 7의 데이타베이스 검색 결과 참조
-밴드 2의 스펙트럼은 동일한 최대 농도의 펩티드들을 나타냄
-밴드 2의 PSD-스펙트럼을 사용한 데이타베이스 검색을 통해 인테그린 β1임을 확인함
BSA:
-모든 3개의 밴드에 함유되어 있음
-PSD-스펙트럼을 사용한 데이타베이스 검색을 통해 및 수많은 펩티드 질량을 확인함
Claims (55)
- a) EDb-피브로넥틴 도메인과의 특이적 결합력이 있는 단백질;b) 내피 세포에서 특이적으로 발현되거나 활성화되는 단백질;c) 종양의 간질(間質) 세포에서 특이적으로 발현되거나 활성화되는 단백질;d) 종양 세포에서 특이적으로 발현되거나 활성화되는 단백질;e) EDb-피브로넥틴 도메인과의 결합이 폴리펩티드에 의해 억제되는 단백질; 및f) SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정한 경쇄의 명백한 분자량이 120 내지 130 kDa이고, 중쇄의 명백한 분자량이 150 내지 160 kDa인 단백질.
- 제1항에 있어서,a) EDb-피브로넥틴 도메인과의 특이적 결합력이 있는 단백질로서, 이때의 결합 영역이 서열 1 내지 서열 3을 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 서열임을 특징으로 하는 단백질;b) 내피 세포에서 특이적으로 발현되거나 활성화되는 단백질;c) 종양의 간질 세포에서 특이적으로 발현되거나 활성화되는 단백질;d) 종양 세포에서 특이적으로 발현되거나 활성화되는 단백질;e) EDb-피브로넥틴 도메인과의 결합이 서열 1 내지 서열 3을 포함하는 군에서 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드에 의해 억제되는 단백질; 및f) SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정한 경쇄의 명백한 분자량이 120 내지 130 kDa이고, 중쇄의 명백한 분자량이 150 내지 160 kDa인 단백질.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,a) EDb-피브로넥틴 도메인과의 특이적 결합력이 있는 단백질로서, 인테그린의 α2β1 쇄를 포함하는 단백질;b) 내피 세포에서 특이적으로 발현되거나 활성화되는 단백질;c) 종양의 간질 세포에서 특이적으로 발현되거나 활성화되는 단백질;d) 종양 세포에서 특이적으로 발현되거나 활성화되는 단백질;e) EDb-피브로넥틴 도메인과의 결합이 폴리펩티드에 의해 억제되고 인테그린의 α쇄를 포함하는 단백질; 및f) SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정한 경쇄의 명백한 분자량이 120 내지 130 kDa이고, 중쇄의 명백한 분자량이 150 내지 160 kDa인 단백질.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내피 세포가 증식 중인 내피 세포인 것을 특징으로 하는 것인 단백질.
- EDb-피브로넥틴 도메인과의 특이적 결합이 내피 세포, 종양의 간질 세포 및종양 세포의 부착을 매개하는 것인 단백질.
- EDb-피브로넥틴 도메인과의 특이적 결합이 내피 세포, 종양의 간질 세포 및 종양 세포의 부착을 매개하며, 이때의 결합 영역이 서열 1 내지 서열 3을 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 서열임을 특징으로 하는 것인 단백질.
- 제6항에 있어서, 상기 결합 영역이 인테그린의 α2β1 쇄를 포함하는 것인 단백질.
- EDb-피브로넥틴 도메인과의 특이적 결합이 내피 세포의 증식을 유도하는 것인 단백질.
- EDb-피브로넥틴 도메인과의 특이적 결합이 내피 세포의 증식을 유도하며, 이때의 결합 영역이 서열 1 내지 서열 3을 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 서열임을 특징으로 하는 것인 단백질.
- 제9항에 있어서, 상기 결합 영역이 인테그린의 α2β1 쇄를 포함하는 것인 단백질.
- EDb-피브로넥틴 도메인과의 특이적 결합이 콜라겐 매트릭스에서 내피 세포의 증식, 이동 및 분화를 유도하는 것인 단백질.
- EDb-피브로넥틴 도메인과의 특이적 결합이 콜라겐 매트릭스에서 내피 세포의 증식, 이동 및 분화를 유도하며, 이때의 결합 영역이 서열 1 내지 서열 3을 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 서열임을 특징으로 하는 것인 단백질.
- 제12항에 있어서, 상기 결합 영역이 인테그린의 α2β1 쇄를 포함하는 것인 단백질.
- EDb-피브로넥틴 도메인과 결합하고 특이적 신호 도입 경로를 유도함으로써-병소(病巢) (focal) 부착 키나제,-CD6 리간드 (ALCAM),-비트로넥틴 수용체의 α쇄,-통합된 알파 8 서브유닛, 및-폴리스타틴-관련 단백질의 전구체(들)을 포함하는 군에서 선택된 단백질을 코딩하는 1종 이상의 유전자를 유도하는 단백질.
- EDb-피브로넥틴 도메인과 결합하고 특이적 신호 도입 경로를 유도함으로써-병소 부착 키나제,-CD6 리간드 (ALCAM),-비트로넥틴 수용체의 α쇄,-통합된 알파 8 서브유닛, 및-폴리스타틴-관련 단백질의 전구체(들)을 포함하는 군에서 선택된 단백질을 코딩하는 1종 이상의 유전자를 유도하며, 이때의 결합 영역이 서열 1 내지 서열 3을 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 서열임을 특징으로 하는 것인 단백질.
- 제15항에 있어서, 상기 결합 영역이 인테그린의 α2β1 쇄를 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 단백질에 결합할 수 있는 항체.
- 서열 1 내지 서열 4를 포함하는 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 결합할 수 있는 항체.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, EDb도메인에 특이적인 효과를 억제할 수 있는 항체.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 결합 및 억제가 시험관내 및(또는) 생체내에서 수행되는 것인 항체.
- 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 또는 재조합 항체인 항체.
- 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, scFv 단편인 항체.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 발현하는 세포.
- 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체를 발현하는 세포.
- 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체를 발현하는 파지.
- EDb-피브로넥틴 도메인의 수용체에 결합하는 화합물의 스크리닝 방법으로서, 1종 이상의 후보 화합물들의 존재하에서 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 발현하거나 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포의 반응과, 이들 화합물의 부재하에서 상기 세포에 의한 대조 반응을 비교하는 단계를 포함하고, 이때 상기 반응 또는 대조 반응이 EDb-피브로넥틴 도메인의 수용체에 의해 매개되는 것인 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 반응 또는 대조 반응이 EDb-피브로넥틴 도메인 또는 이의 일부로 코팅된 표면으로의 세포 부착을 포함하는 것인 방법.
- 제26항 또는 제27항에 있어서, EDb-피브로넥틴 도메인의 결합 영역이 서열 1 내지 서열 4의 서열 또는 이의 일부를 포함하는 것인 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 반응 또는 대조 반응이 EDb-피브로넥틴 도메인 또는 이의 일부로 코팅된 표면에서의 세포 증식을 포함하는 것인 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 반응 또는 대조 반응이 EDb-피브로넥틴 도메인 또는 이의 일부가 혼합된 콜라겐 매트릭스에서의 내피 세포 증식, 이동 및 분화를 포함하는 것인 방법.
- 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 항체, 인공 항체, 항체 단편, 펩티드, 저분자량 화합물, 아프타머 (aptamer) 및 스피겔머 (Spiegelmer)를 포함하는 군에서 선택된 것인 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 항체가 재조합 항체인 것인 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 항체가 scFv 및 이의 단편을 포함하는 군에서 선택된 것인 방법.
- EDb-피브로넥틴 도메인에 결합하는 화합물의 스크리닝 방법으로서,a) 다양한 농도의 1종 이상의 후보 화합물들의 존재하에서 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 발현하거나 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 EDb-피브로넥틴 도메인을 포함하거나 서열 1 내지 서열 4로 나타낸 서열 중 하나를 갖는 고정된 농도의 단백질과 접촉시키는 단계; 및b) 상기 화합물의 존재하에서 EDb-피브로넥틴 도메인을 포함하거나 서열 1 내지 서열 4로 나타낸 서열 중 하나를 갖는 단백질에 대한 상기 세포의 반응과, 상기 화합물의 부재하에서 EDb-피브로넥틴 도메인을 포함하거나 서열 1 내지 서열 4로 나타낸 서열 중 하나를 갖는 단백질에 대한 상기 세포의 대조 반응을 비교하고 두가지 반응의 차이를 측정하는 단계를 포함하며, 이때 상기 반응 또는 대조 반응이 EDb-피브로넥틴 도메인의 수용체에 의해 매개되는 것인 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 반응 또는 대조 반응이 EDb-피브로넥틴 도메인 또는 이의 일부로 코팅된 표면으로의 세포 부착을 포함하는 것인 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 반응 또는 대조 반응이 EDb-피브로넥틴 도메인 또는 이의 일부로 코팅된 표면에서의 세포 증식을 포함하는 것인 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 반응 또는 대조 반응이 EDb-피브로넥틴 도메인 또는 이의 일부가 혼합된 콜라겐 매트릭스에서의 내피 세포 증식, 이동 및 분화를 포함하는 것인 방법.
- 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 항체, 인공 항체, 항체 단편, 펩티드, 저분자량 물질, 아프타머 및 스피겔머를 포함하는 군에서 선택된 것인 방법.
- EDb-피브로넥틴 도메인의 수용체 또는 EDb-피브로넥틴 도메인에 결합하는 화합물을 스크리닝하기 위한, 서열 1 내지 서열 4를 포함하는 군에서 선택된 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 핵산의 용도.
- EDb-피브로넥틴 도메인의 수용체 또는 EDb-피브로넥틴 도메인에 결합하는 화합물을 스크리닝하기 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 단백질 또는 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
- EDb-피브로넥틴 도메인의 수용체 또는 EDb-피브로넥틴 도메인에 결합하는 화합물을 스크리닝하기 위한, 제23항 또는 제24항에 따른 세포의 용도.
- 진단 목적 또는 치료 목적을 위한 항체 또는 scFv-융합 단백질을 생성하기 위한, 서열 1 내지 서열 4를 포함하는 군에서 선택된 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 핵산의 용도.
- 진단 목적 또는 치료 목적을 위한 항체 또는 scFv-융합 단백질을 생성하기 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 단백질의 용도.
- 진단 목적 또는 치료 목적을 위한 항체 또는 scFv-융합 단백질을 생성하기 위한, 제23항 또는 제24항에 따른 세포의 용도.
- 진단 목적 또는 치료 목적을 위한 항체 또는 scFv-융합 단백질을 생성하기 위한, 제25항에 따른 파지의 용도.
- 프로-혈관형성 (pro-angiogenic) 요법을 위한, 서열 1 내지 서열 4를 포함하는 군에서 선택된 서열을 포함하는 단백질의 용도.
- 진단 목적을 위한, 서열 1 내지 서열 4를 포함하는 군에서 선택된 서열을 포함하는 단백질의 용도.
- 유전자 요법에서 서열 1 내지 서열 4를 포함하는 군에서 선택된 서열을 포함하는 단백질의 용도.
- 내피 세포가 결합할 표면을 코팅하기 위한, 서열 1 내지 서열 4를 포함하는 군에서 선택된 서열을 포함하는 단백질의 용도.
- 제49항에 있어서, 상기 코팅이 시험관내 또는 생체내에서 수행되는 것인 용도.
- 세포 배양시에 서열 1 내지 서열 4를 포함하는 군에서 선택된 서열을 포함하는 단백질의 용도.
- 1종 이상의 이식물과 함께 사용하는, 서열 1 내지 서열 4를 포함하는 군에서 선택된 서열을 포함하는 단백질의 용도.
- 제52항에 있어서, 상기 이식물이 혈관(들), 피부, 각막, 신장, 간, 골수, 심장, 폐, 뼈, 흉선, 소장, 췌장, 다른 내부 기관 및 이의 일부 및 이의 세포를 포함하는 군에서 선택된 것인 용도.
- 1종 이상의 삽입물과 함께 사용하는, 서열 1 내지 서열 4를 포함하는 군에서 선택된 서열을 포함하는 단백질의 용도.
- 제54항에 있어서, 상기 삽입물이 폐 삽입물, 인공 심박조율기, 인공 심장판, 혈관내 삽입물, 내부 인공 보철물 (endoprostheses), 스크류, 부목(副木), 판(板), 와이어, 핀, 간체(桿體) (rods), 인공 관절, 유방 삽입물, 인공 두개판, 의치(義齒), 충전물 및 가교물 (bridge)을 포함하는 군에서 선택된 것인 용도.
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