DE10045803A1

DE10045803A1 - Rezeptor der EDb Fibronektin-Domäne

Info

Publication number: DE10045803A1
Application number: DE10045803A
Authority: DE
Inventors: Andreas Menrad; Alexander REDLITZ; Markus Koppitz; Ursula Egner
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2000-09-07
Filing date: 2000-09-07
Publication date: 2002-04-11
Also published as: CN1865284A; ZA200302629B

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Protein, DOLLAR A a) das die Fähigkeit aufweist, spezifisch an die ED¶b¶-Fibronektin-Dömäne zu binden, wobei die Bindungsregion durch mindestens eine Sequenz charakterisiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO : 1-3 umfaßt; DOLLAR A b) das spezifisch in Endothelzellen exprimiert oder aktiviert ist; DOLLAR A c) das spezifisch in stromalen Zellen eines Tumors exprimiert oder aktiviert ist; DOLLAR A d) das spezifisch in Tumorzellen exprimiert oder aktiviert ist; DOLLAR A e) dessen Bindung an die ED¶b¶-Fibronektin-Domäne durch ein Polypeptid inhibiert wird, das eine Sequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO : 1-3 umfaßt; und DOLLAR A f) das ein apparentes Molekulargewicht von 120-130 kDa, ermittelt durch SDS-Polyacrylamid-Gelenktrophorese, aufweist, DOLLAR A sowie Verfahren zum Screenen auf Verbindungen, die an einen Rezeptor der ED¶b¶-Fibronektin-Domäne oder die ED¶b¶-Fibronektin-Domäne oder die ED¶b¶ oder die ED¶b¶-Fibronektin-Domäne binden, sowie Verwendungen des Proteins.

Description

Die Erfindung betrifft einen Rezeptor der ED_b-Fibronektin-Domäne.

Fibronektine sind eine wichtige Klasse von Matrix-Glykoproteinen. Ihre Hauptrolle besteht darin, das Anhaften von Zellen an eine Vielzahl verschiedener extrazellu lärer Matrizes zu ermöglichen. Das Vorhandensein von Fibronektinen auf der O berfläche von nicht-transformierten Zellen in Kultur sowie deren Abwesenheit bei transformierten Zellen führte zur Identifizierung von Fibronektinen als wichtigen Adhäsionsproteinen. Sie wechselwirken mit zahlreichen verschiedenen, anderen Molekülen, z. B. Collagen, Heparansulfat-Proteoglykanen und Fibrin, und regulie ren damit die Zellform und den Aufbau des Zytoskeletts. Weiterhin sind sie ver antwortlich für Zellmigration und Zelldifferenzierung während der Embryogenese. Sie sind außerdem wichtig für die Wundheilung, bei der sie die Wanderung von Makrophagen und anderen Immunzellen in das betroffene Gebiet ermöglichen, und bei der Bildung von Blutgerinnseln, indem sie das Anheften von Blutplättchen an beschädigte Regionen der Blutgefäße ermöglichen.

Fibronektine sind Dimere zweier ähnlicher Peptide, wobei jede Kette ungefähr 60-70 nm lang ist. Wenigstens 20 verschiedene Fibronektin-Ketten sind identifiziert worden, von denen alle durch alternatives Spleißen des RNA-Transkripts eines einzelnen Fibronektin-Gens erzeugt werden. Eine Analyse von proteolytischen Verdauen von Fibronektin zeigt, daß die Polypeptide aus sechs stark gefalteten Domänen bestehen, von denen jede Domäne wiederum sog. Wiederholungsse quenzen ("repeats") enthält, deren Ähnlichkeiten hinsichtlich ihrer Aminosäurese quenz eine Klassifikation in drei Typen erlauben (Typ I, II, III). Die zentrale Region beider Ketten aus dem Dimer besteht aus einem Abschnitt von sog. Typ-III- Wiederholungen, die durchschnittlich 90 Aminosäuren lang sind (Kornblihtt AR, Vibe-Pedersen K und Baralle FE, 1983. "Isolation and characterization of cDNA- clones for human and bovine fibronectins". Proc Natl Acad Sci USA, 80, 3218-22). Strukturelle Studien haben ergeben, daß jede Typ-III-Wiederholung aus sieben beta-Strängen besteht, die in zwei antiparallele Faltblätter gefaltet sind, wobei kur ze Loop-Regionen als potentielle Protein-Protein-Wechselwirkungsstellen expo niert sind (Leahy DJ, Hendrickson WA, Aukhil I und Erickson HP, 1992. Structure of fibronectin type III domain from tenascin phased by MAD analysis of the selenomethionyl protein. Science, 258, 987-91). Diese Wiederholungen vom Typ III ermöglichen es, daß Fibronektine als Adhäsionsmoleküle fungieren. Insbesondere vermittelt die Sequenz RGDS, die sich in der zehnten Wiederholung vom Typ III befindet (III 10), die Wechselwirkung von Fibronektin mit wenigstens acht Integri nen, die hauptverantwortlich für Adhäsionsvorgänge an der Zelloberfläche sind (Ruoslahti E. 1991, Integrins. J Clin Invest. 87, 1-5). Die Gruppe der Wiederho lungssequenzen vom Typ III umfaßt neben den III7-, III8-, III9- und III10- Sequenzen auch die Repeats EIIIB und EIIIA (ED_b und ED_a). Die Funktionen die ser beiden Wiederholungssequenzen sind bislang nicht oder nur zu einem gerin gen Maße verstanden. Eine Studie von Jarnagin W. et al. (Jarnagin W. Rockey D. Koteliansky V. Wang S. und Bissell D. 1994, "Expression of variant fibronectins in wound healing: cellular source and biological activitiy of the EIIIA segment in rat hepatic fibrogenesis". J. Cell. Biol., 127, 2037-48) legt nahe, daß die ED_a-Domäne bei einer frühen Antwort der Leber auf eine Verletzung beteiligt ist, und weiterhin scheint die ED_a-Domäne beim Vermitteln von Zelladhäsionsvorgängen beteiligt zu sein. Eine Fibronektin-Isoform, die die ED_b-Sequenz (ED_b-FN oder ED-B oder EDB) enthält, ist in normalem Erwachsenengewebe nicht nachweisbar, zeigt je doch eine starke Expression in fötalem Gewebe sowie Tumorgewebe, ebenso wie auch während der Wundheilung.

Während der Entwicklung eines Tumors wird die extrazelluläre Matrix des Gewe bes, in dem der Tumor wächst, durch proteolytischen Abbau bereits existierender Matrix-Bestandteile umgebaut. Hierbei entsteht eine tumorinduzierte, extrazelluläre Matrix, die sich von der von normalen Geweben unterscheidet, eine geeignetere Umgebung für das Tumorwachstum bietet und die Angiogenese fördert. Angioge nese ist einer der wichtigsten Vorgänge beim Tumorwachstum und bezeichnet den Prozeß, bei dem neue Gefäße aus existierenden Endothel-beschichteten Gefäßen hervorgehen. Angiogenese ist ein invasiver Prozeß, der eine Proteolyse der extrazellulären Matrix, Proliferation, gerichtete Wanderung und Differenzierung von Endothelzellen in neue Kapillaren erfordert, die das Wachstum eines Tumors über eine bestimmte Größe hinaus unterstützen.

ED_b-Fibronektin ist mit dem Tumorwachstum in Verbindung gebracht worden. Weiterhin ist ED_b-FN um neue Blutgefäße während angiogener Vorgänge ange reichert und stellt somit einen Marker für die Angiogenese bereit (Castellani P., Viale G., Dorcaratto A., Nicolo G., Kaczmarek J., Querze G., Zardi L. (1994) Int. J. Cancer 59: 612-618).

Die ED_b-Domäne ist eine Wiederholungssequenz vom Typ III, umfassend 91 Ami nosäuren, und weist eine extrem hohe Sequenzhomologie zwischen dem Ratten- und Hühner-Fibronektin auf, die zwischen 96% und 100% liegt. Ihre genaue Funktion ist bis dato unbekannt. Drei Studien sind veröffentlicht worden, die Spe kulationen über eine allgemeine fördernde Funktion hinsichtlich Adhäsi on/Zellausbreitung für verschiedene Zellen anstellen.

Chen und Culp (1996), Exp. Cells Res. 223, 9-19, haben gezeigt, daß zelluläre Fibronektine die ED_b-Domäne und benachbarte Wiederholungssequenzen vom Typ III als u. U. adhäsionsfördernde Sequenzen enthalten, die von den Zellen durch alternatives Spleißen des primären Transkripts von Fibronektin reguliert werden können.

In einer späteren Studie (Chen und Culp, 1998, Clin. Exp. Metast., 16, 1, 30-42) konnte gezeigt werden, daß ED_b Zell-Signal-Ereignisse induziert, die zu einer Ty rosin-Phosphorylierung von fokalen Adhäsionsproteinen führt, und zwar mit einem Mechanismus, der sich von demjenigen unterscheidet, der durch die Wiederho lungssequenzen III8-9-10 vermittelt wird, welche Integrine erkennen. Es wird zu nehmend anerkannt, daß die Zelladhäsion an extrazelluläre Matrizes bzw. an an dere Zellen eine wichtige Quelle für Zell-Signale ist, die für die Regulation vieler Phänomene verantwortlich ist, wie z. B. Zellwachstum, -differenzierung und -transformation. Ein Adhäsions-induziertes Signalgeben beinhaltet die Aktivierung von Protein-Tyrosin-Kinasen und eine Kaskade der Tyrosin-Phosphorylierung ver schiedener Signal-Moleküle. Die Autoren der eben genannten Studie weisen dar auf hin, daß für diesen Signalprozeß die 125 kDa fokale Adhäsionskinase (FAK) von zentraler Bedeutung ist, die die Zell-Wechselwirkung mit Matrix-Proteinen an die Aktivierung von intrazellulären Signalmolekülen verknüpft, wie etwa Src (Xing Z, Chen HC, Nowlen JK, Taylor SJ, Shalloway D. und Guan JL, 1994, Direct inter action of v-Src with the focal adhesion kinase mediated by the Src SH2 domain. Mol Blot Cell. 5, 413-21), Grb2 (Schlaepfer DD, Hanks SK, Hunter T und von der Geer P, 1994, Integrin-mediated signal transduction linked to Ras pathway by GRB2 binding to focal adhesion kinase. Nature, 372, 786-91) und PI-3-Kinase (Chen HC und Guan JL, 1994, "Association of focal adhesion kinase with its poten tial substrate phosphatidylinositol 3-kinase". Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91, 10148- 52). Von einem anderen fokalen Adhäsionsprotein p130cas wird ebenso ange nommen, daß es bei Adhäsions-vermittelten Signalereignissen und bei spezifi schen Onkogen-Aktivitäten beteiligt ist, obwohl seine genaue Funktion bisher nicht aufgeklärt ist (Sakai R., Iwamatsu A., Hirano N. et al. 1994, "A novel signaling mole cule, p130, forms stable complexes in vivo with v-Crk and c-Src in a tyrosine phosphorylation-dependent manner". EMBO J. 13, 3748-56; Petch LA, Bockholt SM, Bouton A, Parsons JT und Burridge K, 1995, "Adhesion-induced tyrosine phosphorylation of the p130 SRC substrate". J. Cell. Sci., 108, 1371-9; Polte TR und Hanks SK, 1995, "Interaction between focal adhesion kinase and Crk-associated tyrosine kinase substrate p130^Cas". Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92, 10678-82).

Die Studie von Chen und Culp (1998, a. a. O.) zeigt, daß das Mono-Wiederholungs- Protein ED_b stärker fördernd war für die Ausbreitung von Balb/c 3T3-Zellen sowie für das Induzieren von FAK-Tyrosin-Phosphorylierung als die benachbarten Re peats III8 etc. Es wird die Vermutung angestellt, daß bei physiologischen Kon zentrationen der zellulären Fibronektine die Bindung des Tetrapeptids RGDS aus III10 an die Integrine möglicherweise ein nicht hinreichend starkes Signal für die Zelladhäsion erzeugt, so daß es bei dem durch die Wechselwirkung zwischen III10 und Integrin-vermittelten Mechanismen zu keiner Tyrosin-Phosphorylierungs- Antwort kommt. Es wird weiter vermutet, daß der Unterschied hinsichtlich der Antwort auf die unterschiedlichen vermittelten Zelladhäsionen durch eine unter schiedliche Aktivierung verschiedener kleiner GTP-bindender Proteine verursacht wird. Drei dieser Proteine, cde42, rac und rho, die alle Mitglieder der ras- Superfamilie sind, spielen wichtige Rollen bei zell-morphologischen Veränderun gen. cdc42 agiert sequenziell stromaufwärts von rac und induziert direkt das Er scheinen von Filopodien (Nobes CD und Hall A, 1995, Rho, rac, und cdc42 GTPa ses regulate the assembly of multimolecular focal complexes associated with actin stress fibers, lamellipodia, and filopodia, Cell. 81, 53-62). Die Aktivierung von rac ist dann verantwortlich für die Bildung von Lamellipodien und das Netzwerk von Aktin-Filamenten zwischen den Filopodien. Weiter stromabwärts rho kann durch rac aktiviert werden und induziert fokale Adhäsionen und Aktin-Zugfasern. Alle diese Ereignisse sind abhängig von der Aktivierung von Tyrosin-Kinase, und von FAK wird angenommen, daß sie bei diesen Vorgängen beteiligt ist. Chen und Culp stellen die Vermutung an, daß die morphologischen Unterschiede zwischen Zel len, die über 7-ED_b-8 adhärent sind, sowie Zellen, die über 8-9-10 adhärent sind, auf der unterschiedlichen Aktivierung der kleinen GTP-bindenden Proteine beruht. Daraus wird gefolgert, daß eine Adhäsion über 8-9-10 über den Integrin vermittelten Signalweg schließlich zu einer Aktivierung von rho führt, um fokale Adhäsionen und Aktin-Zugfasern zu erzeugen, während die Adhäsion von Balb/c- 3T3-Zellen über 7-ED_b-8 nur zu einer Aktivierung von cdc42- und rac-Proteinen führt, nicht jedoch rho aktiviert. Für die eben genannten Mutmaßungen werden jedoch in keiner der beiden Studien Daten präsentiert.

Eine andere Studie (Hashimoto-Uoshima et al., 1997, J. Cell. Sci. 110, 2271-2280) zeigt, daß die Zell-Adhäsion von kultivierten Fibroblasten durch die Anwesenheit von Fibronektin-Fragmenten, die die ED_b-Fibronektin-Domäne einschließen, ver stärkt wird. Daraus wird gefolgert, daß die gespleißte ED_b-Domäne eine wichtige biologische Funktion hinsichtlich der Verstärkung der Zell-Adhäsion und - ausbreitung haben kann. Demgegenüber verhindert der Einschluß von ED_a in Fragmenten in Abwesenheit von ED_b die Ausbildung von guten fokalen Adhäsio nen in Zellen. Darauf basierend, spekulieren die Autoren dieser Studie, daß der Einschluß beider Domänen im Fibronektin-Molekül einen Mechanismus darstellen kann, mit dem eine Zell-Adhäsion in dem Ausmaße erreicht wird, daß Fortbewe gungsvorgänge erleichtert werden, bei denen sowohl Adhäsion als auch Verluste der Adhäsion für das Fortbewegen von Zellen benötigt wird.

Keine der genannten Studien ergibt eine klare Antwort hinsichtlich der Funktion der ED_b-Domäne, noch werden Aussagen getroffen über die Identität eines mögli chen (möglicher) Rezeptors (Rezeptoren) für die ED_b-Domäne.

Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Funktion der ED_b- Domäne weiter aufzuklären. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfin dung, einen möglichen spezifischen Rezeptor für die ED_b-Domäne zu identifizie ren. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, den ED_b-spezifischen Adhäsions-Mechanismus und die Wechselwirkung mit Rezeptormolekülen aufzu klären, die beim Prozeß der Angiogenese beteiligt sein könnten. Weiterhin ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die für die spezifische Bindung verant wortliche ED_b-Region zu identifizieren.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Protein,

a) das die Fähigkeit aufweist, spezifisch an die ED_b-Fibronektin-Domäne zu bin den, wobei die Bindungsregion durch mindestens eine Sequenz charakterisiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-3 umfaßt;
b) das spezifisch in Endothelzellen exprimiert oder aktiviert ist;
c) das spezifisch in stromalen Zellen eines Tumors exprimiert oder aktiviert ist;
d) das spezifisch in Tumorzellen exprimiert oder aktiviert ist;
e) dessen Bindung an die ED_b-Fibronektin-Domäne durch ein Polypeptid inhibiert wird, das eine Sequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-3 umfaßt; und
f) das ein apparentes Molekulargewicht von 120-130 kDa, ermittelt durch SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese, aufweist.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Endothelzellen proliferierende En dothelzellen.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die stromalen Zellen Tumor-Stroma- Zellen.

Die Aufgabe wird außerdem gelöst durch ein Protein, dessen spezifische Bindung an die ED_b-Fibronektin-Domäne die Adhäsion von Endothelzellen, Tumor-Stroma- Zellen und Tumorzellen vermittelt, wobei die Bindungsregion durch mindestens eine Sequenz charakterisiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-3 umfaßt.

Die Aufgabe wird auch durch ein Protein gelöst, dessen spezifische Bindung an die ED_b-Fibronektin-Domäne die Proliferation von Endothelzellen induziert, wobei die Bindungsregion durch mindestens eine Sequenz charakterisiert ist, die ausge wählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-3 umfaßt.

Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch ein Protein, dessen spezifische Bindung an die ED_b-Fibronektin-Domäne die Proliferation, Migration und Differenzierung von Endothelzellen in eine Collagenmatrix induziert, wobei die Bindungsregion durch mindestens eine Sequenz charakterisiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-3 umfaßt.

Die Aufgabe wird weiterhin gelöst durch ein Protein, das an die ED_b-Fibronektin- Domäne bindet und spezifische Signaltransduktionswege induziert, wobei min destens ein Gen induziert wird, das für ein Protein codiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die
Fokale Adhäsionskinase,
CD6-Ligand (ALCAM),
die α-Kette des Vitronektin-Rezeptors und
einen/den Vorläufer für Follistatin-verwandtes Protein
umfaßt, und wobei die Bindungsregion durch mindestens eine Sequenz charakte risiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-3 umfaßt.

Es wird bevorzugt, daß bei der Induktion spezifischer Signaltransduktionswege mindestens eines der genannten Gene mindestens einfach induziert wird. Bevor zugter wird dabei mindestens eines der genannten Gene zweifach induziert.

Die Aufgabe wird auch gelöst durch einen Antikörper, der in der Lage ist, an ein Protein gemäß der vorliegenden Erfindung zu binden.

Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch einen Antikörper, der in der Lage ist, an ein Protein zu binden, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 umfaßt.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper in der Lage, Effekte zu inhibieren, die für die ED_b-Domäne spezifisch sind.

Es wird bevorzugt, daß die Bindung und Inhibierung in vitro und/oder in vivo er folgt.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper monoklonal oder rekom binant.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper ein scFv-Fragment.

Die Aufgabe wird auch gelöst durch eine Zelle, die ein Protein gemäß der vorlie genden Erfindung exprimiert.

Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch eine Zelle, die einen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert.

Außerdem wird die Aufgabe durch einen Phagen gelöst, der einen Antikörper ge mäß der vorliegenden Erfindung exprimiert.

Die Aufgabe wird auch gelöst durch ein Verfahren zum Screenen auf Verbindun gen, die an einen Rezeptor der ED_b-Fibronektin-Domäne binden, wobei das Ver fahren umfaßt:
Vergleich einer Antwort von Zellen in Anwesenheit von einer oder mehrerer dieser Verbindungen mit der Kontrollantwort besagter Zellen in Abwesenheit dieser Ver bindungen, wobei die Zellen
ein Protein gemäß der vorliegenden Erfindung exprimieren oder
eine Nukleinsäure, die für dieses Protein codiert, umfassen, und
wobei die Antwort bzw. die Kontrollantwort durch einen Rezeptor der ED_b- Fibronektin-Domäne vermittelt wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Antwort bzw. die Kontrollantwort das Anhaften der Zellen an Oberflächen, die mit der ED_b-Fibronektin-Domäne oder Teilen davon beschichtet sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens umfaßt eine Bindungsregi on der ED_b-Fibronektin-Domäne die Sequenzen SEQ ID NO: 1-4 oder Teile da von.

Es wird bevorzugt, daß die Antwort bzw. die Kontrollantwort die Proliferation der Zellen an Oberflächen umfaßt, die mit der ED_b-Fibronektin-Domäne oder Teilen davon beschichtet sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Antwort bzw. die Kontrollantwort die Proliferation, Migration und Differenzierung von Endothelzellen in einer Colla genmatrix, die mit der ED_b-Fibronektin-Domäne oder Teilen davon versetzt wird.

Es ist bevorzugt, daß die Verbindungen ausgewählt sind aus der Gruppe, die Anti körper, Antikörperfragmente, Peptide, niedermolekulare Verbindungen und Apta mere umfaßt.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Antikörper rekombinante Antikör per.

Es wird bevorzugt, daß die Antikörper ausgewählt sind aus der Gruppe, die scFv und Fragmente davon umfaßt.

Die Aufgabe wird ebenso gelöst durch ein Verfahren zum Screenen auf Verbin dungen, die an die ED_b-Fibronektin-Domäne binden, wobei das Verfahren umfaßt:

a) In-Kontakt-Bringen von Zellen mit einer festgelegten Konzentration eines Pro teins, das die ED_b-Fibronektin-Domäne oder ein Protein mit einer der in SEQ ID NO: 1-4 dargestellten Sequenzen umfaßt, in der Anwesenheit verschiedener Konzentrationen von einer oder mehrerer der Verbindungen, und
b) Nachweisen von Unterschieden in der Antwort der Zellen auf das Protein, das die ED_b-Fibronektin-Domäne oder ein Protein mit einer der in SEQ ID NO: 1-4 dargestellten Sequenzen umfaßt, in der Anwesenheit der Verbindungen im Ver gleich mit der Kontrollantwort der Zellen auf das Protein, das die ED_b-Fibronektin- Domäne oder ein Protein mit einer der in SEQ ID NO: 1-4 dargestellten Sequen zen umfaßt, in der Abwesenheit dieser Verbindungen, wobei
die Zellen ein Protein gemäß der vorliegenden Erfindung exprimieren oder
eine Nukleinsäure, die für dieses Protein codiert, umfassen, und
wobei die Antwort bzw. die Kontrollantwort durch einen Rezeptor der ED_b- Fibronektin-Domäne vermittelt wird.

Dabei ist bevorzugt, daß die Antwort bzw. die Kontrollantwort das Anhaften der Zellen an Oberflächen umfaßt, die mit der ED_b-Fibronektin-Domäne oder Teilen davon beschichtet sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Antwort bzw. die Kontrollantwort die Proliferation der Zellen an Oberflächen, die mit der ED_b-Fibronektin-Domäne oder Teilen davon beschichtet sind.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Antwort bzw. die Kon trollantwort die Proliferation, Migration und Differenzierung von Endothelzellen in einer Collagenmatrix, die mit der ED_b-Fibronektin-Domäne oder Teilen davon ver setzt wird.

Es ist bevorzugt, daß die Verbindungen ausgewählt sind aus der Gruppe, die Anti körper, Peptide, niedermolekulare Substanzen und Aptamere umfaßt.

Die Aufgabe wird weiterhin gelöst durch die Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein Protein codiert, das eine Sequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-4 umfaßt, zum Screenen auf Verbindungen, die an einen Rezeptor der ED_b-Fibronektin-Domäne oder die ED_b-Fibronektin-Domäne binden.

Die Aufgabe wird auch gelöst durch die Verwendung eines Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung bzw. eines Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung zum Screenen auf Verbindungen, die an einen Rezeptor der ED_b-Fibronektin- Domäne oder die ED_b-Fibronektin-Domäne binden.

Ebenso gelöst wird die Aufgabe durch die Verwendung einer Zelle gemäß der vorliegenden Erfindung, zum Screenen auf Verbindungen, die an einen Rezeptor der ED_b-Fibronektin-Domäne oder die ED_b-Fibronektin-Domäne binden.

Die Aufgabe wird ebenso gelöst durch die Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein Protein codiert, das eine Sequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-4 umfaßt, zum Entwickeln von Antikörpern oder scFv- Fusionsproteinen für diagnostische oder therapeutische Zwecke.

Die Aufgabe wird ebenso gelöst durch die Verwendung eines Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung zum Entwickeln von Antikörpern oder scFv-Fusionsprotei nen für diagnostische oder therapeutische Zwecke. Unter therapeutischem Zweck ist u. a. die anti-angiogene Behandlung mit Verbindungen, die die spezifische In teraktion zwischen ED_b und dem Rezeptor inhibieren, gemeint. Die Antikörper sind hierbei sowohl gegen den Rezeptor als auch gegen ED_b gerichtet, wobei die Pep tide der Sequenz SEQ ID NO: 1-3 und stabilisierte Derivate davon sowie nieder molekulare Verbindungen zur Anwendung kommen.

Die Aufgabe wird ebenso gelöst durch die Verwendung einer Zelle gemäß der vor liegenden Erfindung zum Entwickeln von Antikörpern oder scFv-Fusionsproteinen für diagnostische oder therapeutische Zwecke.

Die Aufgabe wird ebenso gelöst durch die Verwendung eines Phagen gemäß der vorliegenden Erfindung zum Entwickeln von Antikörpern oder scFv- Fusionsproteinen für diagnostische oder therapeutische Zwecke.

Die Aufgabe wird ebenso gelöst durch die Verwendung eines Proteins, das eine Sequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-4 um faßt, für eine pro-angiogene Therapie.

Die Aufgabe wird ebenso gelöst durch die Verwendung eines Proteins, das eine Sequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-4 um faßt, für diagnostische Zwecke.

Die Aufgabe wird ebenso gelöst durch die Verwendung eines Proteins, das eine Sequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-4 um faßt, in der Gentherapie.

Die Aufgabe wird ebenso gelöst durch die Verwendung eines Proteins, das eine Sequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-4 um faßt, zum Beschichten von Oberflächen, an die Endothelzellen binden.

Dabei ist bevorzugt, daß das Beschichten in vitro oder in vivo erfolgt.

Die Aufgabe wird ebenso gelöst durch die Verwendung eines Proteins, das eine Sequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-4 um faßt, in Zellkulturen.

Die Aufgabe wird ebenso gelöst durch die Verwendung eines Proteins, das eine Sequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-4 um faßt, zusammen mit mindestens einem Transplantat.

Dabei ist bevorzugt, daß das Transplantat ausgewählt ist aus der Gruppe, die Gefäß(e), Haut, Cornea, Nieren, Leber, Knochenmark, Herz, Lunge, Knochen, Thymus, Dünndarm, Pankreas, andere innere Organe sowie Teile und Zellen da von umfaßt.

Die Aufgabe wird ebenso gelöst durch die Verwendung eines Proteins, das eine Sequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-4 um faßt, zusammen mit mindestens einem Implantat.

Dabei ist bevorzugt, daß das Implantat ausgewählt ist aus der Gruppe, die Lun genimplantate, künstliche Herzschrittmacher, künstliche Herzklappen, Gefäßimp lantate, Endprothesen, Schrauben, Schienen, Platten, Drähte, Nägel, Stäbe, künstliche Gelenke, Mammaimplantate, künstliche Schädelplatten, künstliche Zähne, Zahnfüllungen und Zahnbrücken umfaßt.

Unter "Effekten, die für die ED_b-Fibronektin-Domäne spezifisch sind" werden alle solche Effekte verstanden, die durch die ED_b-Fibronektin-Domäne, nicht aber durch EIII7, EIII8, etc. hervorgerufen werden. Ein solcher Effekt ist bspw. in Chen et al., 1998 (a.a.O) beschrieben, d. h. eine schnelle Tyrosin-Phosphorylierung meh rerer intrazellulärer Proteine, im Gegensatz zu der eher langsamen Phosphorylie rung nach einer durch die Domänen EIII8-9-10 vermittelten Adhäsion. Unter "nie dermolekularen Verbindungen" werden alle Verbindungen verstanden, deren rela tive Molekülmasse unter etwa 1000-1200 liegt. Unter "Aptameren" werden auf Nukleinsäuren aufgebaute Moleküle verstanden, die in der Lage sind, als hoch spezifische Liganden für eine große Anzahl von Biomolekülen zu fungieren. Unter einer "pro-angiogenen Therapie" wird jede Therapieform verstanden, bei der die Angiogenese gefördert werden soll. Unter einer "anti-angiogenen Behand lung/Therapie" wird jede Behandlungs-/Therapieform verstanden, die auf eine In hibierung der Angiogenese abzielt. Unter "Gentherapie" wird jede Form der The rapie verstanden, die auf die Ausschaltung einer genbedingten Fehlfunktion bzw. auf die Wiederherstellung einer normalen Genfunktion bei Erkrankungen abzielt, die durch die Eliminierung oder Bereitstellung eines Proteins zu beeinflussen sind. Sie kann das Einschleusen von Fremd-DNA in Körperzellen beinhalten, ist jedoch nicht als hierauf beschränkt anzusehen. Unter "Zellkulturen" sollen sowohl Zell kulturmedien als auch Zellkulturgefäße verstanden werden. Bevorzugt sind die Zellkulturgefäße ausgewählt aus der Gruppe, die Zellkulturflaschen, -schalen, - näpfe, -platten, Mikrotiterplatten, 96-Napf-Platten, Zellkulturkolben und Bioreakto ren umfaßt.

"Diagnostische Zwecke" sind alle Zwecke, die dem Erkennen eines Zustandes eines Organismus/Organs/einer Zelle bzw. dem Zuordnen eines aktuellen Zustan des eines Organismus/Organs/einer Zelle zu einer bestimmten Zustandskategorie (z. B. einer bestimmten Krankheit) dienen; beispielsweise kann dies der Einsatz eines Kits/chemischer Reagenzien/einer Meßeinrichtung sein, zum Bestimmen einer physikalischen Größe, wie Temperatur etc., oder einer chemischen Größe, wie Konzentration etc., soll jedoch nicht als hierauf beschränkt angesehen wer den.

"Therapeutische Zwecke" sind alle Zwecke, die der Verbesserung bzw. der Hei lung eines Krankheitszustandes eines Organismus/Organs/einer Zelle dienen. Unter dem Begriff "Verwendung eines Proteins zusammen mit einem Implantat" ist entweder eine zeitlich oder eine räumlich identische Verwendung gemeint. Bei spielsweise können Proteinmoleküle an das Implantat bei dessen "Einbau" in den Körper befestigt sein, oder aber sie können räumlich vom Implantat getrennt, aber zur gleichen Zeit wie dem "Einbau" des Implantats verabreicht werden (Injektionen etc.).

Die Erfindung wird nunmehr detailliert anhand der folgenden Beispiele und Figu ren beschrieben. Dabei zeigt:

Fig. 1 eine schematische Darstellung der in dieser Studie verwendeten Wiederholungssequenzen vom Typ III;

Fig. 2 die Resultate eines Proliferationsassays unter dem Einfluß der ED_b- Fibronektin-Domäne (ED-B) auf Endothelzellen bzw. menschliche Stromazellen auf verschiedenen Substraten;

Fig. 3 die Resultate eines Sprießtests (tube formation-test) von Endothel zellen unter dem Einfluß von ED-B;

Fig. 4 die Resultate eines Anheftungstests, bei dem das Anheften von En dothelzellen an mit ED-B beschichteten Oberflächen getestet wurde;

Fig. 5 die Resultate eines Tests, ähnlich zu dem in Fig. 4, mit der Ausnah me, daß die Zelle mit verschiedenen synthetischen Peptiden vorin kubiert wurden, deren Sequenzen Teilsequenzen der ED_b- Fibronektin-Domäne sind;

Fig. 6 die in Fig. 5 verwendeten Teilsequenzen der synthetischen Peptide aus der ED_b-Fibronektin-Domäne;

Fig. 7 die Resultate eines Anheftungstests von Endothelzellen an verschie dene synthetische ED-B-Peptide;

Fig. 8 die Lage der in Fig. 6-7 ermittelten synthetischen Peptide in einer Modellstruktur der Peptid-Hauptkette von ED-B;

Fig. 9 die Wirkung von der ED_b-Fibronektin-Domäne und eines aus Loop 5 stammenden Peptids (SEQ ID NO: 2) auf die Induktion von Kapillar ähnlichen Strukturen in einem Sprießtest (tube formation test);

Fig. 10 die Resultate zweier Affinitäts-Chromatographie-Läufe unter Ver wendung von Fn-7-8-9 bzw. Fn-7-B-8-9 von Zell-Lysaten von Ober flächen-markierten, menschlichen Hautendothelzellen;

Fig. 11 die Resultate zweier Affinitäts-Chromatographie-Läufe unter Ver wendung von Fn-7-8-9 bzw. Fn-7-B-8-9 von Zell-Lysaten von ober flächenmarkierten, menschlichen Haut-Stroma-Zellen.

Fig. 1 zeigt verschiedene, in dieser Studie verwendete, rekombinante Fibronektin- Fragmente, die unterschiedliche Domänen-Struktur mit unterschiedlichen Wieder holungssequenzen vom Typ III aufweisen. Dabei umfassen Fn-7-B-8-9 die Fibro nektin-Domänen 7, ED_b, 8 und 9, Fn-7-8-9 die Domänen 7, 8 und 9, ED-B die Domäne ED_b, Fn-10 die Domäne 10 und Fn-6 die Domäne 6. Diese Proteine wur den als mit einem His-Tag versehene Proteine in E. coli exprimiert und auf einer Nickel-Chelat-Sepharosesäule aufgereinigt. Die in dieser Studie verwendeten Nummernbezeichnungen entsprechen den in der Literatur verwendeten. Dabei bezeichnen die Abkürzungen FN-B, ED-B, EDB und ED_b alle jeweils die ED_b- Fibronektin-Domäne und sind als synonym anzusehen.

Fig. 2 zeigt die Resultate eines Proliferationsassays, bei dem die Wirkung der ED_b- Fibronektin-Domäne (ED-B) auf die Proliferation von Endothelzellen (EC) bzw. Stroma-Zellen (SC) untersucht wurde. 1000 Zellen pro Napf wurden in 96-Napf- Platten inkubiert. Lösliches ED-B (10 µg/l) wurde dem Medium während des Pro liferationsassays zugegeben. Nach drei Tagen wurde die Zellzahl mit dem MTS- Assay bestimmt. Die Proliferation der Zellen wurde durch basischen Fibronektin- Wachstumsfaktor (bFGF) induziert. Es zeigte sich, daß ED-B keine Wirkung in Abwesenheit von bFGF hatte, und ebenso konnte keine Wirkung für die Fibronek tin-Domäne 10 vom Typ III in Anwesenheit von bFGF auf die Zellen nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Eine Wirkung von ED-B auf menschliche Endothel zellen-Proliferation konnte bei Zellen festgestellt werden, die auf Gelatine ausplat tiert worden waren (EG/Gelatine), ebenso bei Zellen, die auf Collagen ausplattiert worden waren (EC/Collagen), wobei jedoch letzterer Effekt nicht so deutlich war, wie beim Ausplattieren auf Gelatine. Bei menschlichen Stroma-Zellen auf Gelatine (SC/Gelatine) fand eine Proliferation bereits in Abwesenheit von bFGF statt, die deutlich über der von menschlichen Endothelzellen lag. Sie konnte durch die Zu gabe von bFGF bzw. bFGF + ED-B nicht gesteigert werden. Als Maß für die Zell zahl wurde die Extinktion bei 490 nm bestimmt.

Für den Proliferationsassay wurde folgende experimentelle Methode befolgt:

Material

96-Napf-Platte (mit flachem Boden), Nunc.

Medium

MCDB 131, Pen/Strep, Amphotericin (0,25 µg/ml), Heparin (20 µg/ml), hitze-inaktiviertes FCS (5%).

Methode

Zellen, 500-1000 pro Napf (96-Napf-Platte) in 100 µl, werden für 3 Tage in Medi um mit bFGF (1-3 ng/ml) oder VEGF (30-50 ng/ml) kultiviert. Die genaue Menge sollte für jede Charge durch Titration bestimmt werden: optimal ist die minimale Konzentration, die maximale Proliferationsstimulation erreicht. Eine Synchronisati on der Zellen vor dem Experiment ist nicht notwendig, kann aber gemacht werden. Nach 3 Tagen wird die Zellzahl mit dem MTS-Kit (Promega) nach Herstelleranga ben bestimmt. Es empfiehlt sich, die Absorption bei mehreren Zeitpunkten zu messen, um eine maximale Absorption im linearen Bereich zu erhalten (0,5; 1; 2; 4 Stunden).

Kontrollen

Negative Kontrolle, kein Mitogen (keine Proliferation) (-bFGF/VEGF);
Positive Kontrolle, mit Mitogen (maximale Stimulation) (+bFGF/VEGF).

Fig. 3 zeigt die Wirkung von ED-B auf das Sprießen von Endothelzellen aus Sphä roiden. Hierzu wurden HUVEC-Sphäroide (Human Umbilical Vein Endothelial Cells = menschliche Nabelschnur-Endothelzellen) in Collagen eingebettet und durch die Zugabe von 10 µg/ml bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) zum Sprie ßen induziert in Ab- oder Anwesenheit von 6 µg/ml ED-B. Es zeigte sich, daß durch die Zugabe von bFGF alleine das Sprießen induziert und dann durch die Zugabe von ED-B weiter stimuliert werden konnte (+ bFGF + ED-B).

Für den Sprießtest (tube formation test) wurde folgende experimentelle Methode verwendet:

Material

Methylcellulose, höchste Viskosität (Sigma);
Trypsin/EDTA für Zellkultur (Gibco);
Rundboden 96-Napf-Platten (Greiner #650185);
rekombinantes bFGF (Gibco #13256-029);
rekombinantes VEGF (R & D System);
Anti-Ratte-CD31 (RDI #RDI-CD31TLD);
Heparin (Gibco #15077-027).

Lösungen PBS/Antibiotika

Zellkultur-PBS, 10 × Pen/Strep, 2,5 µg/ml Amphotericin 1% Gelatine (Difco, autoklavieren und nach Abkühlung mit Pen/Strep und Amphotericin (0,25 µg/ml) versetzen.

Medium

MCDB 131, Glutamin, Pen/Strep, Amphotericin (0,25 µg/ml), Heparin (20 µg/ml), Hitze-inaktiviertes FCS (10%).

Wachstumsmedium

Medium mit 2 ng/ml bFGF und 10 ng/ml VEGF.

Zellen

HUVEC;
Dermale MVEC (Passage < 4).

Methode

Endothelzellen werden mit Trypsin/EDTA abgelöst und auf 5000 Zellen/ml in Me dium mit 0,24% Methylcellulose verdünnt. Je 200 µl (1000 Zellen) werden in Näpfen einer Greiner-Platte gegeben und über Nacht inkubiert. Runde Zellhaufen (Sphäroide) werden mit einer 1-ml-Pipette mit abgeschnittener Spitze geerntet und abzentrifugiert. Sphäroide werden in 1,2% Methylcellulose/FCS resuspendiert und mit neutralisiertem Collagengel gemischt. ED_b und bFGF wurden co-polymerisiert.

Wie aus der Figur deutlich wird, erfolgt durch die Zugabe von ED-B eine deutliche Steigerung des Sprießens über das durch bFGF induzierte Maß hinaus.

Fig. 4 zeigt die Resultate eines Adhäsionstests von Endothelzellen an Mikrotiter napf-Platten, die mit ED-B beschichtet waren. Hierzu wurden Endothelzellen aus ihrem ursprünglichen Kulturgefäß durch Trypsinisierung (Trypsin/EDTA) von ihrem Substrat gelöst und dann in Mikrotiternapf-Platten, die mit verschiedenen Konzentrationen (0, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 40 µg/ml) ED-B beschichtet waren, inkubiert und für eine Stunde zum Anhaften belassen. Als eine Negativ-Kontrolle dienten Näpfe, die mit 1 mg/ml BSA (bovinem Serumalbumin) beschichtet waren; die Adhäsion an BSA (< 10%) wurde substrahiert.

Das Anheften wurde durch Färbung mit Kristallviolett quantifiziert, gefolgt von ei ner Lyse mit SDS. Die Quantifizierung erfolgte durch Messen der Extinktion bei 595 nm. Eine in der Figur waagerecht angebrachte Linie bei A₅₉₅ nm ≈ 1,06 zeigt die 100%ige Adhäsion an Plasma-Fibronektin an.

Das Ergebnis dieses Versuchs zeigt an, daß die Zellen an den mit ED-B be schichteten Oberflächen anhaften, was einen Rezeptor auf der Zelloberfläche für ED-B nahelegt.

Für den Anheftungs/Adhäsionstest wurde folgende experimentelle Methode ver wendet:

Lösungen

1% BSA (Sigma, Ethanol-präzipitiert);
2% Serum in PBS (oder eine Trypsin-Neutralisationslösung).

Medium

MCDB 131, Pen/Strep, Amphotericin (0,25 µg/ml), Heparin (20 µg/ml), 0,1% BSA (Sigma, Äthanol-präzipitiert);
0,1% Kristallviolett, 2% Glutaraldehyd in PBS, sterilfiltriert;
2% SDS.

Methode

Näpfe einer 96-Napf-Platte (Nunc) werden für 1 Stunde bei 37°C mit Protein belegt. Bei kleinen Proteinen (< 20 kDa) oder Peptiden empfiehlt es sich, diese auf der Platte trocknen zu lassen (über Nacht ohne Deckel unter der Sterilbank). Da nach werden die Näpfe mit 1% BSA für 1 h bei 37°C abgesättigt. Zellen werden mit 1 × Trypsin abgelöst, mit 2% Serum zur Inaktivierung des Trypsins gewa schen, und in Medium resuspendiert. Wenn Antikörper oder Peptide getestet wer den sollen, werden die Zellen in Suspension mit diesen für 30 min bei 37°C vorin kubiert. Pro Napf (96-Napf-Platte) werden 104 Zellen in einem Volumen von 50-100 µl für 1 h bei 37°C inkubiert. Der Überstand wird vorsichtig abgegossen; die Platte zum Abtropfen auf einem Papierhandtuch für 1 min umgedreht stehen gelas sen, und angeheftete Zellen werden mit Kristallviolett/Glutaraldehyd für 15 min gefärbt und fixiert. Die Näpfe werden 3mal mit PBS gewaschen und die Zellen an schließend durch Zugabe von 2% SDS lysiert (15 min. auf dem Schüttler). Die Ab sorption bei 595 nm wird gemessen. Nach dreimaligem Waschen mit Wasser kön nen die Zellen, falls erwünscht, erneut angefärbt werden.

Kontrollen

Negative Kontrolle: Leer-Näpfe (BSA-Kontrolle);
Positive Kontrolle: Plasma-Fibronektin (2,5 µg/ml);
% Adhäsion = A₅₉₅

(Probe): 100 × A₅₉₅

(Fibronektin).

Fig. 5 zeigt die Resultate eines Tests, ähnlich dem aus Fig. 4 mit der Ausnahme, daß vor dem Anheften an mit ED-B beschichteten Mikrotiternapf-Platten die En dothelzellen mit 250 µM verschiedener, synthetischer Peptide vorinkubiert wurden, deren Sequenz eine Teilsequenz der ED_b-Fibronektin-Domäne war. Die Anheftung wurde durch die Bestimmung der Extinktion bei 595 nm (A₅₉₅) bestimmt. Die in der Figur aufgetragenen Peptidbezeichnungen werden in Fig. 6 erläutert. Dabei ent spricht Peptidsequenz Nr. 043 der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz, Peptid sequenz Nr. 553 der SEQ ID NO: 2, Peptidsequenz Nr. 038 der SEQ ID NO: 3. Ein hoher A₅₉₅-Wert entspricht einer nicht-inhibierten Anhaftung, während ein niedriger A₅₉₅-Wert einer Inhibition der Anhaftung durch das entsprechende Peptid ent spricht.

Die für Fig. 4 beschriebene Methode wurde befolgt.

Fig. 6 zeigt die der Gesamtsequenz der ED_b-Fibronektin-Domäne entnommenen Teilsequenzen der synthetischen ED-B-Peptide mit den dazu gewählten Sequenzbezeichnungen. Es wird der Ein-Buchstaben-Code für Aminosäuren ver wendet.

Fig. 7 zeigt die Resultate eines Tests, ähnlich zu dem in Fig. 5, außer, daß hier die Mikrotiternapf-Platten nicht mit der ED_b-Fibronektin-Domäne beschichtet wa ren, sondern mit den sich im Test aus Fig. 5 als inhibitorisch erwiesenen Peptiden, bzw. nicht-inhibitorisch erwiesenen Peptide vorinkubiert wurden und somit mit diesen beschichtet wurden. Dabei zeigt es sich, daß die Zellen in diesen Tests nunmehr bei einer Beschichtung mit jeweils eines der inhibitorischen Peptide An heftung zeigen, gemessen am A₅₉₅-Wert, während ein aus Fig. 5 als nicht- inhibitorisches, erwiesenes Peptid zu keiner Anheftung führt.

Die für Fig. 4 beschriebene Methode wurde befolgt.

Fig. 8 zeigt eine Modellstruktur der ED_b-Fibronektin-Domäne (ED-B), aus dem die Lage der inhibitorischen Peptide Nr. 1 (= SEQ ID NO: 1), Nr. 2 (= SEQ ID NO: 2) und Nr. 3 (= SEQ ID NO: 3) hervorgeht. Es zeigt sich, daß sich diese inhibitori schen Peptide auf Loop 1 bzw. Loop 5 der ED-B-Struktur befinden und damit die Region der Domäne identifizieren, über die eine Bindung zur Zelle bzw. dem auf der Zelle befindlichen Rezeptor stattfindet. Die in Fig. 8 gezeigte Modellstruktur der ED-B-Domäne beruht auf einer bereits ermittelten Struktur der Fibronektin- Domäne 7 vom Typ III. N-T und C-T stehen für N- bzw. C-Terminus.

Fig. 9 zeigt die Resultate eines Tests, bei dem die Wirkung der Zugabe von ED-B und dem zuvor als inhibitorisch ermittelten Peptid Nr. 2 sowie die Zugabe der Fibronektin-Domäne 6 vom Typ III auf die Induktion von kapillarähnlichen Struk turen (tube formation) im Sprießtest untersucht wird. Es zeigt sich, daß über dem basalen, durch bFGF induzierten Eindringen in Collagen-Gele die größte Wirkung durch das Anheftungs-inhibitorische Peptid SEQ ID NO: 2 erzeugt wird. Dieses Peptid hat also eine stimulatorische Wirkung auf das Eindringen von Endothelzel len in Collagen-Gele. Dieses Peptid entspricht daher der Bindungsregion von ED_b und stimuliert, in Analogie zu ED_b selbst, das Eindringen von Endothelzellen in das Collagen.

Die für Fig. 3 beschriebene Methode wurde befolgt.

Fig. 10 zeigt die Resultate einer Affinitätschromatographie von Zell-Lysat aus Oberflächen-markierten, menschlichen Hautendothelzellen. Hierzu wurden prolife rierende, an der Zelloberfläche biotinylierte Endothelzellen mit einem Detergens lysiert und einer Affinitätschromatographie unterzogen, bei der kurze Fragmente Fibronektin mit oder ohne die eingefügte ED_b-Fibronektin-Domäne an Sepharose gekoppelt waren (mit der ED_b-Fibronektin-Domäne = Fn-7-B-8-9, ohne die ED_b- Fibronektin-Domäne = Fn-7-8-9). Es konnte gezeigt werden, daß ein biotinyliertes Protein mit einem apparenten Molekulargewicht von 120-130 kDa spezifisch an das ED-B-enthaltende Fragment bindet (siehe Pfeil). Die Elution erfolgt mittels EDTA. Es wurden mehrere, im folgenden beschriebene Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen wurden anschließend SDS-PAGE unterzogen und mit Western- Blot mit Streptavidin-Peroxidase- und Chemolumineszenz (ECL) untersucht. Die Spuren 1 und 5 zeigen Prä-Elutions-Fraktionen, während die Spuren 2, 3, 4 bzw. 6, 7, 8 die eluierten Fraktionen 1, 2 und 3 zeigen. Spuren 1-4 zeigen die Chro matographie mit Fn-7-8-9, während Spuren 5-8 die Chromatographie mit Fn-7-B- 8-9 zeigen. Das hier gezeigte Resultat ist ein starkes Indiz dafür, daß die promi nente Bande mit einem Molekulargewicht zwischen 120-130 kDa ein Protein ist, das spezifisch an ein ED_b-enthaltendes Fibronektin-Fragment bindet und somit ei nen Rezeptor für die ED_b-Fibronektin-Domäne darstellt.

Für die Biotinylierung und Lyse der Endothelzellen wurde folgende experimentelle Methode befolgt:

Material

Biotinamidohexansäure-3-sulfo-N-Hydroxysuccinimid-Ester; Sigma PBS w/o Mg/Ca (Dulbecco);
Hepes-Puffer: 20 mM Hepes pH 7,6, 1 mM CaCl₂

, 1 µM MgCl₂

, 0,1% NaN₃

;
1% CHAPS (V/V),
und Boehringer vollständiger Mini-Protease-Inhibitor, EDTA-frei, Cocktail-Tabletten.

Methode

Die Zellkulturflaschen werden vor und nach dem Biotinylieren jeweils 3mal mit PBS w/Ca + Mg gewaschen. Vor dem letzten Waschvorgang wird der Biotinpuffer (1 mg/15 ml PBS) angesetzt. In jede der Flaschen werden langsam 5 ml des Puffers (für 225 cm²) oder 12,5 ml (500 cm²-Platten) in die Mitte des Bo dens pipettiert, so daß sich das Volumen über den ganzen Flaschenboden unter Schwenken verteilen kann. Dann wird die erste Kulturflasche mit der Hälfte des Lysepuffervolumens behandelt. Der Puffer wird ebenfalls in die Mitte des Fla schenbodens pipettiert und über die gesamte Oberfläche verteilt. Dann werden die Zellen mit Hilfe eines Zellschabers abgeschabt. Anschließend wird das Gesamt volumen der 1. Kulturflasche in die 2. Flasche pipettiert, wo der Vorgang dann wiederholt wird. Nach der letzten Flasche wird das Volumen in ein 50 ml koni sches Zentrifugenröhrchen überführt. Mit der anderen Hälfte des Lysepuffers wird dieser Vorgang in allen Kulturflaschen wiederholt (ohne Zellschaber) und das Endvolumen ebenfalls in Zentrifugenröhrchen gegeben. Zentrifugiert wird in 50 ml konischen Zellkulturröhrchen bei 3000 U/min, 5 min bei RT (Heraeus- Tischzentrifuge). Das Lysat wird abpipettiert und sollte idealerweise sofort für die Affinitätschromatographie eingesetzt werden (kann notfalls aber auch bei -80°C eingefroren werden).

Für die kovalente Kopplung von Proteinen an Sepharose wurde folgendes Vorge hen gewählt:

Material

Aktivierte CH-Sepharose 4 B Pharmacia Biotech, Code-No. 17-0490-01;
1 mmol HCl, 2,2% NaHCO3.

Methode

Die HCl wird im Eisbad gekühlt; die Sepharose läßt man auf Raumtem peratur erwärmen.

Dann wird die Sepharose mit 1 mmol HCl gewaschen. Pro ml Sepharose benötigt man 10 ml HCl. Die Sepharose läßt man langsam in das vorgekühlte Röhrchen rieseln, wo sie dann für etwa 15 Minuten aufquillt. (1 g Sepharose entspricht 3 ml gequollener Sepharose). Anschließend wird das Röhrchen für 1 Min. bei 800 U zentrifugiert. Der Überstand wird abpipettiert und verworfen.

Dieser Vorgang wird 3mal wiederholt.

Nach dem 3. Waschen wird erneut HCl zugegeben; das Röhrchen wird ge schwenkt und 3-5 Min. bei 800 U zentrifugiert. Der Überstand wird abpipettiert, und das Pellet wird mit 20 ml Millipore-Wasser gelöst und in 2 neue Zentrifugen röhrchen überführt (je 1 Röhrchen für 7-EDB-8-9-Sepharose und für 7-8-9-Sepha rose, d. h. Sepharose, an die ein Polypeptid mit den Repeats III7, ED_b, III8 und III9 bzw. III7, III8 und III9 gekoppelt ist.). Die Röhrchen werden sofort wieder ab zentrifugiert; der Überstand wird abpipettiert, und die 1-5 mg Protein/ml Sepharose können gekoppelt werden.
(d. h.:
2 mg Protein/ml Sepharose 7-8-9;
2 mg Protein/ml Sepharose 7-EDB-8-9).

Die Röhrchen werden durch Umschwenken gemischt. Dann erfolgt zügig die Zu gabe von 2,2% NaHC3 (50 µl/ml Gel). Dadurch wird die restliche HCl neutrali siert. Die Röhrchen werden umgeschwenkt und bei höchster Stufe auf einem "Wipptisch" für 1-5 Std. durchgemischt.

Anschließend werden die Röhrchen wieder abzentrifugiert.

Zur Bestimmung der Proteinkonzentration, die bei der kovalenten Kopplung an Sepharose eingesetzt werden soll, wurde ein Bradford-Test durchgeführt:

Material

BSA-Stammlösung 2 mg/ml;
Bradford-Reagens.

Methode

Die BSA-Lösung wird wie folgt auf eine Nung-Immuno-Plate (Maxi Sorp) aufgetragen:
5 µg-4 µg-3 µg-2 µg-1 µg (80 µl Vol. + 20 µl Assay);
Vorverdünnung für BSA: 5 µg/50 µl = 0,1 mg/ml.

Die Stammlösung 2 mg/ml wird durch eine 1 : 20-Verdünnung auf eine Konzentration von 0,1 mg/ml verdünnt.

Zur Durchführung der Affinitätschromatographie bzw. zur Elution wurde folgendes Vorgehen gewählt:

a) Affinitätschromatographie Material

Aktivierte CH-Sepharose 4B Pharmacia Biotech, Code-No. 17-0490-01;
Puffer A (20 mM Hepes pH 7,6, 1 mM CaCl₂

, 1 mM MgCl₂

, 0,1% NaN3);
Puffer B (Puffer A + 150 mM NaCl + 0,1% Chaps);
Puffer C (Puffer A + 0,1% Chaps);
PH-4-Puffer (Millipore-Wasser + 0,1% Eisessig + 0,1% Chaps);
EDTA-Puffer (Puffer A + 200 mM EDTA pH 8,5 + 0,1% Chaps).

Methode

Das Lysat wird zunächst 3 × über die Säule geschickt.

Unter der Säule befindet sich ein Röhrchen zum Auffangen der Flüssigkeit. Die ersten 2 ml des Lysats werden vorsichtig mit einer Eppendorfpipette auf das Gel gegeben. Für das weitere Lysatvolumen verwendet man eine Meßpipette. Zu be achten ist, daß die Säule gerade ist. Wird die Säule zum ersten Mal benutzt, wird vor dem eigentlichen Durchlauf ein "Trockendurchlauf" mit allen proteinfreien Puf fern durchgeführt. Eine Säulenfüllung sollte maximal 5× benutzt werden.

Wenn das Lysat eingefroren (-80°C) vorliegt, wird es zunächst im Wasserbad er wärmt und dann zentrifugiert (5 min. bei 3000 U).

Frisches Lysat ist jedoch immer dem eingefrorenen vorzuziehen.

Von dem Lysat werden 500 µl in ein Eppendorfgefäß abpipettiert. Dies dient zur Untersuchung des Lysats vor und nach der Chromatographie..

Werden 2 Säulen verwendet (je eine für 7-8-9-Sepharose und für 7-B-8-9-Sepha rose), wird jeweils die Hälfte des Lysatvolumens über jede der Säulen geschickt. Beide Säulen sollten dieselbe Flußrate haben. Ist dies nicht der Fall, wird die "langsamere" Säule entsprechend lange geschlossen. Die ideale Flußrate beträgt 0,2-0,5 ml/min.

Ist das Lysat 3× durch die Säule gelaufen, wird von dem Durchlauf, nachdem er gemischt wurde, ebenfalls 500 µl in ein Eppendorfgefäß pipettiert, damit auch hier eine Untersuchung erfolgen kann.

Anschließend werden je 10 Säulenvolumina Puffer B und Puffer C über die Säule geschickt. Danach ist der Waschvorgang abgeschlossen.

b) Elution Präelution

Puffer C wird über die Säule geschickt, damit festgestellt werden kann, ob trotz der Waschprozedur noch Proteine verblieben sind. 500 µl werden in ei nem Eppendorf-Gefäß aufgefangen (bei 2 Säulen entsprechend 2 × 500 µl).

EDTA-Elution

EDTA komplexiert die Ca- und Mg-Ionen. Dadurch werden die En dothelzell-Proteine eluiert, die Ca und Mg zur Bindung benötigen. 2 × 4 ml EDTA- Puffer werden über die Säule (bzw. über beide Säulen) geschickt und in 2 Fraktio nen (E1 u. E2/BE1 u. BE2) in Falcon-Röhrchen aufgefangen. Dann wird der Röhrcheninhalt gemischt, und 5000 µl werden in 1 (bzw. 2) Eppendorfgefäß(e) abpipettiert.

pH-4-Elution

Der eigentliche pH-Wert des Puffers beträgt 3,7. Außerhalb des neutralen pH-Bereiches (pH 6-8) kann man die Bindung des Rezeptors an sein Protein hemmen. Auch hier werden wie bei der EDTA-Elution 2 × 4 ml pH-4-Puffer über die Säule geschickt, in 2 Fraktionen gesammelt und jeweils 500 µl abpipet tiert (4,1 u. 4,1/B 4,1 und B 4,2).

Anschließend werden 3 Säulenvolumen Puffer A über die Säule gegeben, damit die Säure herausgewaschen wird. Das letzte Säulenvolumen verbleibt in der Säule. Die Säule wird geschlossen und im Kühlschrank verwahrt.

Die 500-µl-Fraktionen in den Eppendorfgefäßen werden für mind. 15 Min. bei -80°C eingefroren und anschließend in einem "Speed vac" gefriergetrocknet.

Die so erhaltenen Fraktionen bzw. Prä-Elutions-Fraktionen wurden mit SDS-PAGE aufgetrennt und einem Western-Blot unter reduzierenden Bedingungen unterzo gen.

Fig. 11 zeigt dasselbe Experiment wie in Fig. 10, mit der Ausnahme, daß hier nicht lysierte Endothelzellen, sondern lysierte Stroma-Zellen verwendet werden. In dem in Fig. 11 gezeigten Western-Blot zeigen die Spuren 1-3 die Elution von ei ner Affinitätssäule mit Fn-7-8-9, während die Spuren 4-6 die Elution von einer Affinitätssäule von Fn-7-B-8-9 zeigen. Spuren 1 und 4 sind Prä-Elutionsfaktoren, während Spuren 2, 3 bzw. 5, 6 die Fraktionen 1 und 2 des jeweiligen Elutionslau fes zeigen. Eine prominente Bande mit einem apparenten Molekulargewicht von 120-130 kDa, wie sie in Fig. 10 zu sehen ist, kann bei diesem Zell-Lysat aus menschlichen Stroma-Zellen nicht festgestellt werden.

Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen sowie den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebigen Kombinationen für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Aus führungsformen wesentlich sein.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Protein,

a) das die Fähigkeit aufweist, spezifisch an die ED_b-Fibronektin- Domäne zu binden, wobei die Bindungsregion durch mindestens ei ne Sequenz charakterisiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-3 umfaßt;
b) das spezifisch in Endothelzellen exprimiert oder aktiviert ist;
c) das spezifisch in stromalen Zellen eines Tumors exprimiert oder akti viert ist;
d) das spezifisch in Tumorzellen exprimiert oder aktiviert ist;
e) dessen Bindung an die ED_b-Fibronektin-Domäne durch ein Polypep tid inhibiert wird, das eine Sequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-3 umfaßt, und
f) das ein apparentes Molekulargewicht von 120-130 kDa, ermittelt durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, aufweist.

2. Protein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Endothelzellen proliferierende Endothelzellen sind.

3. Protein, dessen spezifische Bindung an die ED_b-Fibronektin-Domäne die Adhäsion von Endothelzellen, Tumor-Stroma-Zellen und Tumorzellen ver mittelt, wobei die Bindungsregion durch mindestens eine Sequenz charak terisiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-3 umfaßt.

4. Protein, dessen spezifische Bindung an die ED_b-Fibronektin-Domäne die Proliferation von Endothelzellen induziert, wobei die Bindungsregion durch mindestens eine Sequenz charakterisiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-3 umfaßt.

5. Protein, dessen spezifische Bindung an die ED_b-Fibronektin-Domäne die Proliferation, Migration und Differenzierung von Endothelzellen in eine Col lagenmatrix induziert, wobei die Bindungsregion durch mindestens eine Se quenz charakterisiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-3 umfaßt;

6. Protein, das an die ED_b-Fibronektin-Domäne bindet und spezifische Signaltransduktionswege induziert, wobei mindestens ein Gen induziert wird, das für ein Protein codiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die:

- fokale Adhäsionskinase,
- CD6-Ligand (ALCAM),
- die α-Kette des Vitronektin-Rezeptors und einen/den Vorläufer für Follistatin-verwandtes Protein

umfaßt, und wobei die Bindungsregion durch mindestens eine Sequenz charakteri siert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-3 umfaßt.

7. Antikörper, der in der Lage ist, an ein Protein nach einem der Ansprüche 1-6 zu binden.

8. Antikörper, der in der Lage ist, an ein Protein zu binden, das eine Amino säuresequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die SEQ ID NO: 1-4 umfaßt.

9. Antikörper nach einem der Ansprüche 7-8, der in der Lage ist, Effekte zu inhibieren, die für die ED_b-Fibronektin-Domäne spezifisch sind.

10. Antikörper nach einem der Ansprüche 7-9, wobei die Bindung und Inhibie rung in vitro und/oder in vivo erfolgt.

11. Antikörper, nach einem der Ansprüche 7-10, dadurch gekennzeichnet, daß er monoklonal oder rekombinant ist.

12. Antikörper, nach einem der Ansprüche 7-10, dadurch gekennzeichnet, daß er ein scFv-Fragment ist.

13. Zelle, die ein Protein nach einem der Ansprüche 1-6 exprimiert.

14. Zelle, die einen Antikörper nach einem der Ansprüche 7-12 exprimiert.

15. Phage, der einen Antikörper nach einem der Ansprüche 7-12 exprimiert.

16. Verfahren zum Screenen auf Verbindungen, die an einen Rezeptor der ED_b-Fibronektin-Domäne binden, wobei das Verfahren umfaßt:
Vergleich einer Antwort von Zellen in Anwesenheit von einer oder mehrerer dieser Verbindungen mit der Kontrollantwort besagter Zellen in Abwesen heit dieser Verbindungen, wobei die Zellen
ein Protein nach einem der Ansprüche 1-6 exprimieren oder
eine Nukleinsäure, die für dieses Protein codiert, umfassen, und
wobei die Antwort bzw. die Kontrollantwort durch einen Rezeptor der ED_b- Fibronektin-Domäne vermittelt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Antwort bzw. die Kontrollantwort das Anhaften der Zellen an Oberflächen umfaßt, die mit der ED_b- Fibronektin-Domäne oder Teilen davon beschichtet sind.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 16-17, dadurch gekennzeichnet, daß eine Bindungsregion der ED_b-Fibronektin-Domäne die Sequenzen SEQ ID NO: 1-4 umfaßt oder Teile davon.

19. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Antwort bzw. die Kontrollantwort die Proliferation der Zellen an Oberflächen umfaßt, die mit der ED_b-Fibronektin-Domäne oder Teilen davon beschichtet sind.

20. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Antwort bzw. die Kontrollantwort die Proliferation, Migration und Differenzierung von Endothelzellen in einer Collagenmatrix umfaßt, die mit der ED_b-Fibronek tin-Domäne oder Teilen davon versetzt wird.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 16-20, wobei die Verbindungen ausgewählt sind aus der Gruppe, die Antikörper, Antikörperfragmente, Pep tide, niedermolekulare Verbindungen und Aptamere umfaßt.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper rekombinante Antikörper sind.

23. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper ausgewählt sind aus der Gruppe, die scFv und Fragmente davon umfaßt.

24. Verfahren zum Screenen auf Verbindungen, die an die ED_b-Fibronektin- Domäne binden, wobei das Verfahren umfaßt:

a) In Kontakt-Bringen von Zellen mit einer festgelegten Konzentration eines Proteins, das die ED_b-Fibronektin-Domäne oder ein Protein mit einer der in SEQ ID NO: 1-4 dargestellten Sequenzen umfaßt, in der Anwe senheit verschiedener Konzentrationen von einer oder mehrerer Verbin dungen, und
b) Nachweisen von Unterschieden in der Antwort der Zellen auf das Prote in, das die ED_b-Fibronektin-Domäne oder ein Protein mit einer der in SEQ ID NO: 1-4 dargestellten Sequenzen umfaßt, in der Anwesenheit der Verbindungen im Vergleich mit der Kontrollantwort der Zellen auf das Protein, das die ED_b-Fibronektin-Domäne oder ein Protein mit einer der in SEQ ID NO: 1-4 dargestellten Sequenzen umfaßt, in der Abwesenheit dieser Verbindungen, wobei
die Zellen ein Protein nach einem der Ansprüche 1-6 exprimieren oder
eine Nukleinsäure, die für dieses Protein codiert, umfassen,

und wobei die Antwort bzw. die Kontrollantwort durch einen Rezeptor der ED_b-Fibronektin-Domäne vermittelt wird.

25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Antwort bzw. die Kontrollantwort das Anhaften der Zellen an Oberflächen umfaßt, die mit der ED_b-Fibronek tin-Domäne oder Teilen davon beschichtet sind.

26. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Antwort bzw. die Kontrollantwort die Proliferation der Zellen an Oberflächen umfaßt, die mit der ED_b-Fibronektin-Domäne oder Teilen davon beschichtet sind.

27. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Antwort bzw. die Kontrollantwort die Proliferation, Migration und Differenzierung von Endothelzellen in einer Collagenmatrix umfaßt, die mit der ED_b-Fibronek tin-Domäne oder Teilen davon versetzt wird.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 24-27, wobei die Verbindungen ausgewählt sind aus der Gruppe, die Antikörper, Peptide, niedermolekulare Substanzen und Aptamere umfaßt.

29. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein Protein codiert, das eine Se quenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-4 umfaßt, zum Screenen auf Verbindungen, die an einen Rezeptor der ED_b- Fibronektin-Domäne oder die ED_b-Fibronektin-Domäne binden.

30. Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1-6 bzw. eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 7-12 zum Screenen auf Verbin dungen, die an einen Rezeptor der ED_b-Fibronektin-Domäne oder die ED_b- Fibronektin-Domäne binden.

31. Verwendung einer Zelle nach einem der Ansprüche 13-14, zum Screenen auf Verbindungen, die an einen Rezeptor der ED_b-Fibronektin-Domäne oder die ED_b-Fibronektin-Domäne binden.

32. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein Protein codiert, das eine Se quenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-4 umfaßt, zum Entwickeln von Antikörpern oder scFv-Fusionsproteinen für diagnostische oder therapeutische Zwecke.

33. Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1-6 zum Entwi ckeln von Antikörpern oder scFv-Fusionsproteinen für diagnostische oder therapeutische Zwecke.

34. Verwendung einer Zelle nach einem der Ansprüche 13-14 zum Entwickeln von Antikörpern oder scFv-Fusionsproteinen für diagnostische oder thera peutische Zwecke.

35. Verwendung eines Phagens nach Anspruch 15 zum Entwickeln von Antikör pern oder scFv-Fusionsproteinen für diagnostische oder therapeutische Zwecke.

36. Verwendung eines Proteins, das eine Sequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-4 umfaßt, für eine pro-angiogene The rapie.

37. Verwendung eines Proteins, das eine Sequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-4 umfaßt, für diagnostische Zwecke.

38. Verwendung eines Proteins, das eine Sequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-4 umfaßt, in der Gentherapie.

39. Verwendung eines Proteins, das eine Sequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-4 umfaßt, zum Beschichten von Ober flächen, an die Endothelzellen binden.

40. Verwendung nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß das Be schichten in vitro oder in vivo erfolgt.

41. Verwendung eines Proteins, das eine Sequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-4 umfaßt, in Zellkulturen.

42. Verwendung eines Proteins, das eine Sequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-4 umfaßt, zusammen mit mindestens einem Transplantat.

43. Verwendung nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß das Trans plantat ausgewählt ist aus der Gruppe, die Gefäß(e), Haut, Cornea, Nieren, Leber, Knochenmark, Herz, Lunge, Knochen, Thymus, Dünndarm, Pank reas, andere innere Organe sowie Teile und Zellen davon umfaßt.

44. Verwendung eines Proteins, das eine Sequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID NO: 1-4 umfaßt, zusammen mit mindestens einem Implantat.

45. Verwendung nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß das Imp lantat ausgewählt ist aus der Gruppe, die Lungenimplantate, künstliche Herzschrittmacher, künstliche Herzklappen, Gefäßimplantate, Endoprothe sen, Schrauben, Schienen, Platten, Drähte, Nägel, Stäbe, künstliche Ge lenke, Mammaimplantate, künstliche Schädelplatten, künstliche Zähne, Zahnfüllungen und Zahnbrücken umfaßt.