SK2882003A3 - Receptor in the EDb fibronectin domain - Google Patents
Receptor in the EDb fibronectin domain Download PDFInfo
- Publication number
- SK2882003A3 SK2882003A3 SK288-2003A SK2882003A SK2882003A3 SK 2882003 A3 SK2882003 A3 SK 2882003A3 SK 2882003 A SK2882003 A SK 2882003A SK 2882003 A3 SK2882003 A3 SK 2882003A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- protein
- fibronectin
- domain
- cells
- seq
- Prior art date
Links
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 title claims description 97
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 title description 68
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 135
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 128
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 39
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 27
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 95
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 55
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 51
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 39
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 39
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 32
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 32
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 29
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 claims description 26
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 claims description 26
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 15
- 239000007943 implant Substances 0.000 claims description 14
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 13
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 13
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 13
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 12
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 11
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 11
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims description 10
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 claims description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 7
- 108010075348 Activated-Leukocyte Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 claims description 6
- 102000016621 Focal Adhesion Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 claims description 6
- 108010067715 Focal Adhesion Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 claims description 6
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 claims description 6
- 229950008418 talipexole Drugs 0.000 claims description 6
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 claims description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 5
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims description 5
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 5
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 4
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 4
- 102100024210 CD166 antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 102100029379 Follistatin-related protein 3 Human genes 0.000 claims description 3
- 101001062529 Homo sapiens Follistatin-related protein 3 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100022337 Integrin alpha-V Human genes 0.000 claims description 3
- 108010048673 Vitronectin Receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000001023 pro-angiogenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 108010017642 Integrin alpha2beta1 Proteins 0.000 claims description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003709 heart valve Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims description 2
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 claims description 2
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 claims 28
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 claims 1
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 claims 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 20
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 10
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 10
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 10
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 10
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 9
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 9
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 9
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 5
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102100027609 Rho-related GTP-binding protein RhoD Human genes 0.000 description 5
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 5
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 5
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 5
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 5
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 5
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 5
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 5
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 5
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- NNRFRJQMBSBXGO-CIUDSAMLSA-N (3s)-3-[[2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]acetyl]amino]-4-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical group NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NNRFRJQMBSBXGO-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 description 4
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 description 4
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 4
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 102000013515 cdc42 GTP-Binding Protein Human genes 0.000 description 4
- 108010051348 cdc42 GTP-Binding Protein Proteins 0.000 description 4
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 210000001650 focal adhesion Anatomy 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100039160 Amiloride-sensitive amine oxidase [copper-containing] Human genes 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 101000829980 Homo sapiens Ral guanine nucleotide dissociation stimulator Proteins 0.000 description 3
- 108010022222 Integrin beta1 Proteins 0.000 description 3
- 102000012355 Integrin beta1 Human genes 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 3
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 3
- 102100023320 Ral guanine nucleotide dissociation stimulator Human genes 0.000 description 3
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 3
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- MGSVBZIBCCKGCY-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MGSVBZIBCCKGCY-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- USENATHVGFXRNO-SRVKXCTJSA-N Asp-Tyr-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 USENATHVGFXRNO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 108010048623 Collagen Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108010016831 Elongation Factor 2 Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102100021808 Eukaryotic elongation factor 2 kinase Human genes 0.000 description 2
- 239000001828 Gelatine Substances 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NGBGZCUWFVVJKC-IRXDYDNUSA-N Gly-Tyr-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 NGBGZCUWFVVJKC-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 2
- 101000684275 Homo sapiens ADP-ribosylation factor 3 Proteins 0.000 description 2
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 2
- 101001130437 Homo sapiens Ras-related protein Rap-2b Proteins 0.000 description 2
- 102000000507 Integrin alpha2 Human genes 0.000 description 2
- 108010008212 Integrin alpha4beta1 Proteins 0.000 description 2
- 108010042918 Integrin alpha5beta1 Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 2
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 101001027130 Mus musculus Fibronectin Proteins 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 2
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000003993 Phosphatidylinositol 3-kinases Human genes 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 241000168036 Populus alba Species 0.000 description 2
- 102100025391 Pre-mRNA-splicing factor SYF1 Human genes 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 102100031421 Ras-related protein Rap-2b Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QQWNRERCGGZOKG-WEDXCCLWSA-N Thr-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QQWNRERCGGZOKG-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 2
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 2
- 108700041286 delta Proteins 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 2
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 102000005912 ran GTP Binding Protein Human genes 0.000 description 2
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 2,5-dioxo-1-oxoniopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound ON1C(=O)CC(S(O)(=O)=O)C1=O GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N Ala-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108010028700 Amine Oxidase (Copper-Containing) Proteins 0.000 description 1
- SPWXXPFDTMYTRI-IUKAMOBKSA-N Asp-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SPWXXPFDTMYTRI-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N Asp-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- BIZULEWPNGZPNN-WBGPXRNDSA-N C(CCCC[C@@H]1SC[C@@H]2NC(=O)N[C@H]12)(=O)NC(C(=O)O)CCCC Chemical compound C(CCCC[C@@H]1SC[C@@H]2NC(=O)N[C@H]12)(=O)NC(C(=O)O)CCCC BIZULEWPNGZPNN-WBGPXRNDSA-N 0.000 description 1
- 101100008044 Caenorhabditis elegans cut-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100029318 Chondroitin sulfate synthase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100033361 Cilium assembly protein DZIP1 Human genes 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102100028908 Cullin-3 Human genes 0.000 description 1
- 101710094482 Cullin-3 Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 101100015729 Drosophila melanogaster drk gene Proteins 0.000 description 1
- 102100038631 E3 ubiquitin-protein ligase SMURF1 Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000002090 Fibronectin type III Human genes 0.000 description 1
- 108050009401 Fibronectin type III Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 101001027551 Gallus gallus Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- CUXJIASLBRJOFV-LAEOZQHASA-N Glu-Gly-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O CUXJIASLBRJOFV-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- CQAHWYDHKUWYIX-YUMQZZPRSA-N Glu-Pro-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O CQAHWYDHKUWYIX-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- BPLNJYHNAJVLRT-ACZMJKKPSA-N Glu-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BPLNJYHNAJVLRT-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- UTYGDAHJBBDPBA-BYULHYEWSA-N Gly-Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)CN UTYGDAHJBBDPBA-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- NSTUFLGQJCOCDL-UWVGGRQHSA-N Gly-Leu-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NSTUFLGQJCOCDL-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- ULZCYBYDTUMHNF-IUCAKERBSA-N Gly-Leu-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ULZCYBYDTUMHNF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 102100033067 Growth factor receptor-bound protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000008055 Heparan Sulfate Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 101800001941 Hippocampal cholinergic neurostimulating peptide Proteins 0.000 description 1
- 101000989500 Homo sapiens Chondroitin sulfate synthase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000926718 Homo sapiens Cilium assembly protein DZIP1 Proteins 0.000 description 1
- 101000664993 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase SMURF1 Proteins 0.000 description 1
- 101000871017 Homo sapiens Growth factor receptor-bound protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000968663 Homo sapiens MutS protein homolog 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000702559 Homo sapiens Probable global transcription activator SNF2L2 Proteins 0.000 description 1
- 101000739146 Homo sapiens Protein SFI1 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000591312 Homo sapiens Putative MORF4 family-associated protein 1-like protein UPP Proteins 0.000 description 1
- 101000702545 Homo sapiens Transcription activator BRG1 Proteins 0.000 description 1
- 101100311908 Homo sapiens XAB2 gene Proteins 0.000 description 1
- YNMQUIVKEFRCPH-QSFUFRPTSA-N Ile-Ile-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)O)N YNMQUIVKEFRCPH-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- SAVXZJYTTQQQDD-QEWYBTABSA-N Ile-Phe-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N SAVXZJYTTQQQDD-QEWYBTABSA-N 0.000 description 1
- KBDIBHQICWDGDL-PPCPHDFISA-N Ile-Thr-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N KBDIBHQICWDGDL-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- XYUBOFCTGPZFSA-WDSOQIARSA-N Leu-Arg-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 XYUBOFCTGPZFSA-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- IWMJFLJQHIDZQW-KKUMJFAQSA-N Leu-Ser-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IWMJFLJQHIDZQW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ICYRCNICGBJLGM-HJGDQZAQSA-N Leu-Thr-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O ICYRCNICGBJLGM-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- 238000000719 MTS assay Methods 0.000 description 1
- 231100000070 MTS assay Toxicity 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 102100021794 Microtubule-associated protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710093519 Microtubule-associated protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102100021156 MutS protein homolog 5 Human genes 0.000 description 1
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 1
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 1
- 108010028277 Myosin Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000016798 Myosin Type I Human genes 0.000 description 1
- 101710149694 Myosin-I heavy chain Proteins 0.000 description 1
- 102100039306 Nucleotide pyrophosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010058765 Oncogene Protein pp60(v-src) Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- 102000007074 Phospholipase C beta Human genes 0.000 description 1
- 108010047834 Phospholipase C beta Proteins 0.000 description 1
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 1
- GZNYIXWOIUFLGO-ZJDVBMNYSA-N Pro-Thr-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GZNYIXWOIUFLGO-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- 102100037271 Protein SFI1 homolog Human genes 0.000 description 1
- 102100034096 Putative MORF4 family-associated protein 1-like protein UPP Human genes 0.000 description 1
- 108010009413 Pyrophosphatases Proteins 0.000 description 1
- 102000009609 Pyrophosphatases Human genes 0.000 description 1
- 101000889557 Rattus norvegicus Amiloride-sensitive amine oxidase [copper-containing] Proteins 0.000 description 1
- 101000890996 Rattus norvegicus Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- 108700038365 Reelin Proteins 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000014400 SH2 domains Human genes 0.000 description 1
- 108050003452 SH2 domains Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- IFPBAGJBHSNYPR-ZKWXMUAHSA-N Ser-Ile-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O IFPBAGJBHSNYPR-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- PYTKULIABVRXSC-BWBBJGPYSA-N Ser-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PYTKULIABVRXSC-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 108090000054 Syndecan-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000007000 Tenascin Human genes 0.000 description 1
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 description 1
- KZTLZZQTJMCGIP-ZJDVBMNYSA-N Thr-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KZTLZZQTJMCGIP-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 description 1
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 description 1
- 102100031027 Transcription activator BRG1 Human genes 0.000 description 1
- ZZDFLJFVSNQINX-HWHUXHBOSA-N Trp-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N)O ZZDFLJFVSNQINX-HWHUXHBOSA-N 0.000 description 1
- KDGFPPHLXCEQRN-STECZYCISA-N Tyr-Arg-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KDGFPPHLXCEQRN-STECZYCISA-N 0.000 description 1
- NLMXVDDEQFKQQU-CFMVVWHZSA-N Tyr-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 NLMXVDDEQFKQQU-CFMVVWHZSA-N 0.000 description 1
- 102100026773 Unconventional myosin-Ia Human genes 0.000 description 1
- 101710135389 Unconventional myosin-Ia Proteins 0.000 description 1
- OVLIFGQSBSNGHY-KKHAAJSZSA-N Val-Asp-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O OVLIFGQSBSNGHY-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 102100040810 Zinc finger protein 175 Human genes 0.000 description 1
- 101710145407 Zinc finger protein 175 Proteins 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003527 anti-angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 108091006004 biotinylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012152 bradford reagent Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000003352 cell adhesion assay Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000003235 crystal violet staining Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 108010067341 ectonucleotide pyrophosphatase phosphodiesterase 1 Proteins 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 101150098203 grb2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000003632 microfilament Anatomy 0.000 description 1
- 239000013580 millipore water Substances 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 108010067588 nucleotide pyrophosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 102000016731 rac GTP-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010092883 rac GTP-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 239000004577 thatch Substances 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
Description
Oblasť techniky
Vynález sa týka proteínu, ktorý sa špecificky viaže na EDb-doménu fibronektínu.
Doterajší stav techniky
Eibronektíny sú dôležitou triedou glykoproteínov v matrixe. Ich hlavná úloha spočíva v tom, že umožňujú prilnutie bunky na mnoho rôznych extracelulárnych povrchov a štruktúr. Prítomnosť fibronektínu na povrchu netransformovaných buniek v kultúre ako aj ich neprítomnosť u transformovaných buniek viedli k identifikácii fibronektínov ako dôležitých adhéznych proteínov. Interagujú s mnohými rôznymi ďalšími molekulami, napr. kolagénom, heparansulfát-proteoglykánmi a fibrínom, a regulujú tak tvar bunky a výstavbu cytoskeletu. Ďalej sú zodpovedné za bunkovú migráciu a diferenciáciu buniek v priebehu embryogenézy. Okrem toho sú dôležité pre hojenie rán, umožňujú migráciu makrofágov a ďalších buniek imunitného systému do postihnutej oblasti, a tiež umožňujú tvorbu krvnej zrazeniny, kde umožňujú prilnutie krvných doštičiek na poškodené oblasti krvných ciev.
Eibronektíny sú diméry pozostávajúce z dvoch podobných peptidov, kde je každý z reťazcov s približnou veľkosťou 50 až 70 nm. Identifikovalo sa najmenej 20 rôznych reťazcov fibronektínu, ktoré sú všetky vytvárané alternatívnym zostrihom RNA transkriptov jediného fibronektínového génu. Analýza proteolytického štiepenia fibronektínu ukázala, že polypeptid pozostáva zo šiestich silne zvrásnených domén, pričom každá z domén obsahuje opakované sekvencie („repeats), opakovania, ktorých podobnosť, pokiaľ ide o aminokyselinové sekvencie, dovoľuje ich klasifikovať do troch typov (Typ I, II, III). Centrálny úsek obidvoch reťazcov pozostáva z diméru, úseku tzv. opakovania typu-III, ktoré je zložené v priemere z 90 aminokyselín (Kornblutt AR, Vibe-Pedersen K and Baralle PE, 1983. Isolation and characterization of cDNA dones for human and bovine fibronectins. Proc Natl Acad Sci USA, 80, 3218-22). Štruktúrne štúdie ukázali, že každý typ opakovania Typu-III je zložený zo siedmich beta-reťazcov, ktoré sú antiparalelne poskladané do štruktúry listu, pričom krátke úseky slučiek sú exponované ako potenciálne miesta proteín-proteínových interakcií (Leahy DJ, Hendrickson VA, Aukhil I and Erickson HP. 1992. Structure of fibronectin type III domain from tenascin phased by MAD analysis cf the selenomethionyl proteín. Science, 258, 987-91). Tieto opakovania typu III umožňujú to, že fibronektíny pôsobia ako adhézne molekuly, ktoré interagujú s molekulami na bunkovom povrchu, tzv. integríny. Koncept integrínov bol prvý krát použitý v roku 1987 v prehľadnom článku (Hynes R.O., 1987, Celí 48, 549550), aby opísal príbuznú skupinu heterodimérnych molekúl bunkového povrchu, ktoré pôsobia ako sprostredkovateľ medzi extracelulárnym matrixom a intracelulárnym cytoskeletom a tak indukujú bunkovú adhéziu a migráciu. Tieto heterodimérne receptory integrujú alebo sprostredkovávajú tiež signály z extracelulámeho prostredia so špecifickými bunkovými funkciami. V súčasnosti je známych 17 beta-podjednotiek, ktoré môžu s viac ako 20 alfa-podjednotkami špecificky a nekovalentne interagovať, a tak vytvárať viac ako 20 rôznych rodín (Plow E. P. et al. 2000, J Biol Chem, 275, 21785-21788). Najmä sekvencia RGDS, ktorá sa nachádza v desiatom opakovaní typu III fibronektínu (III-10), sprostredkováva vzájomné pôsobenie medzi fibronektínom a najmenej 8 rôznymi integrinmi. Okrem toho sa ukázalo, že najmenej štyri integríny môžu reagovať s fibronektínom špecifickým a od RGDS nezávislým spôsobom (Plow E. E. et al. 2000, J Biol Chem, 275, 2178521788). Skupina opakovaní typu III obsahuje okrem sekvencii III7-, III8-, III9- a III10- tiež opakovania EIIIB a EIIIA (EDb a EDa). Funkcia týchto dvoch opakovaní nie je doteraz vôbec známa, alebo je známa iba v malej miere. Štúdia Jarnagina W. et al.
(Jarnagin W. Rockey D. Koteliansky V. Wang S. and Azsell D. 1994, Expression of variant fibronectins in wound healing: cellular source and biological activity of the EIIIA segment in rat hepatic fibrogenesis. J Celí Biol, 127, 2037-48) naznačila, že EDa-doména sa podieľa na ranej odpovedi pečene na poranenie, a ďalej sa zdá, že sa EDa-doména podieľa na sprostredkovaní priebehu bunkovej adhézie. Izoforma fibronektínu, ktorá obsahuje EDb-sekvenciu (EDb-EN alebo ED-B alebo EDB) , nie je v normálnom dospelom tkanive zistiteľná, avšak vykazuje silnú expresiu vo fetálnom tkanive a v nádorovom tkanive, a tiež pri hojení rán.
V priebehu vývoja nádoru extracelulárny matrix tkaniva, v ktorom nádor rastie, je prestavovaný prostredníctvom proteolytického rozpadu už existujúcich stavebných zložiek matrixu. Pritom vzniká nádor indukujúci extracelulárny matrix, ktorý sa od normálneho tkaniva odlišuje tým, že poskytuje prostredie vhodné pre rast nádoru a podporuje angiogenézu. Angiogenéza je jedným z najdôležitejších predpokladov pre rast nádoru a znamená proces, pri ktorom sa vytvárajú nové cievy z existujúcich ciev potiahnutých endotelom. Angiogenéza je invazívny proces, ktorý vyžaduje proteolýzu extracelulámeho matrixu, proliferáciu, smerovú migráciu buniek a diferenciáciu endotelových buniek na nové kapiláry, ktoré sú nutné na podporu rastu nádoru nad určitú veľkosť.
EDb-fibronektín sa uvádza v súvislosti s rastom nádorov. Navyše sa EDb-FN akumuluje okolo nových krvných ciev pri angiogenéze a predstavuje preto vhodný marker angiogenézy (Castellani P, Viale G, Dorcaratto A, Nicolo G, Kaczmarek J, Querze G, Zardi L (1994) Int. J. Cancer 59:612-618).
EDb-doména je opakovanie typu III, obsahujúce 91 aminokyselín, ktorá vykazuje mimoriadne vysokú sekvenčnú homológiu medzi fibronektinom laboratórneho potkana a kuraťa, ktorá dosahuje 96% až 100%. Vo vnútri domény sa nevyskytujú RGDS - alebo iné aminokyselinové sekvencie, o ktorých by bolo známe, že sprostredková4 vajú interakciu s integrínmi. Presná funkcia ED-B domény doteraz neznáma. Boli zverejnené tri štúdie, ktoré po špekulácie o všeobecnej podpornej funkcii pokial ide ziu/expanziu rôznych buniek.
Chen a Culp (1996), Exp. Cells Res. 223, 9-19, ukáž bunkové fibronektíny, ktoré ako adhéziu podporujúce se) obsahujú EDb-doménu a susedné opakovania typu III, môžu by lované bunkou prostredníctvom alternatívneho zostrihu pri: transkriptov fibronektínu.
V neskoršej štúdii (Chen and Culp, 1998, Clin. Exp. M 16, 1, 30-42) sa ukázalo, že EDb indukuje udalosť bunkovej lizácie, ktorá spôsobuj e fosforyláciu tyrozínu fokáIných nych proteínov, a to mechanizmom, ktorý sa odlišuje od pc; tým, že je sprostredkovaný opakovaniami III8-9-10, ktoré znávajú integríny. Stále viac sa uznáva, že bunková adhé extracelulámy matrix, napr. na iné bunky, je významným : bunkových signálov, ktoré sú zodpovedné za reguláciu : javov, ako je napr. rast buniek, diferenciácia buniek, transformácia buniek. Signál indukovaný adhéziou zahrnuje váciu proteínovej tyrozínkinázy a kaskádu tyrozín-fosfc; rôznych signálnych molekúl. Autori horeuvedenej štúdie pc; na to, že pre tento signálny proces má ústredný význam ; adhézna kináza (FAK) s velkosťou 125 kDa, ktorá spája v: pôsobenie bunky a matrixových proteínov na aktiváciu int; lárnych signálnych molekúl, ako je napr. Src (Xing Z, Cr. Nowlen JK, Taylor SJ, Shalloway D and Guán JL, 1994, interaction of v-Src with the focal adhesion kinase medie the Src SH2 domain. Mol Biol CelL 5, 413-21), Grb2 (Sch
DD, Hanks SK, Hunter T and van der Geer P, 1994, Integ diated signál transduction linked to Ras pathway by GRB2 to focal adhesion kinase. Náture, 372, 786-91) a PI-2 (Chen HC and Guán JL, 1994, Association of focal adhesion with its potential substráte phosphatidylinositol 3-kinas; Natl Acad. Sci USA, 91, 10148-52). O ďalšom fokálnom a je však s kytuj ú ? adhéiii, že <.vencie t regulárnych stast., signaadhéziobných rozpolia na zdrojom 'nohých = tiež : aktizylácií zkazuj ú fekálna :áj cmné zacelu;en HC, Direct ;ced by laepŕer zin-mezinding -kináza kinase
i. Proc ihéznom proteíne pl30cas sa predpokladá, že sa tiež podieľa na adhéziou sprostredkovanej signalizácii a na špecifickej onkogénnej aktivite, aj keď jeho presná funkcia nie je doteraz známa (Sakai R. Iwamatsu A. Hirano N, et aC 1994, A novel signaling molecule, pl30, forms stable complexes in vivo with v-Crk and c-Src in a tyrosine phosphorylation-dependent manner. EMBO J. 13, 3748-56; Petch LA, Bockholt SM, Bouton A, Parsons JT and Burridge K, 1995, Adhesion-induced tyrosine phosphorylation of the pl30 SRC substráte. J Celí Sci, 108, 1371-9; Polte TR and Hanks SK, 1995, Interaction between focal adhesion kinase and Crk-associated tyrosine kinase substráte pl30~as. Proc Natl Acad Sci USA, 92, 10678-82).
Štúdia Chena and Culpa (1998, aaO) ukazuje, že mono-repetičný proteín EDb silnejšie podporoval expanziu buniek Balb/c 3T3 a indukoval EAK-tyrozín-fosforyláciu ako susedné opakovania III8 atď. Je teda predložená hypotéza, že pri fyziologických koncentráciách bunkových fibronektínov väzba tetrapeptidu RGDS z III10 na integrín možno spôsobuje nedostatočne silný signál pre bunkovú adhéziu, takže pri ňom nedochádza k tyrozín-fosforylačnej odozve sprostredkovanej mechanizmom vzájomnej interakcie III10 a integrínu. Ďalej sa navrhlo, že rozdielna odozva na rôzne sprostredkované bunkové adhézie je spôsobená rozdielnou aktiváciou rôznych malých GTP-väzbových proteínov. Tri tieto proteíny, cdc42, rac a rho, ktoré všetky patria do proteínovej nadrodiny ras, hrajú dôležitú úlohu v zmenách bunkovej morfológie. cdc42 pôsobí v kaskáde „upstream (proti smeru prenosu) od rac a indukuje priamo objavovanie filopódií (Nobes CD and Halí A, 1995, Rho, rac, and cdc42 GTPases regulate the assembly of multimolecular focal complexes associated with actin stress fibers, lamellipodia, and filopodia, Celí. 81, 53-62). Aktivácia rac je teda zodpovedná za vytváranie lamellipódií a siete aktínových filamentov (vláken) medzi filopódiami. Ďalej downstream v kaskáde sa rho môže prostredníctvom rac aktivovať a indukovať fokálnu adhéziu a aktínové ťažné vlákna. Všetky tieto udalosti sú závislé od aktivácie tyrozínkinázy, a predpokladá sa, že sa na tejto udalosti podieľa FAK. Chen a Culp predložili hypotézu, že morfologické rozdiely medzi bunkami, ktoré vzájomne adherujú prostredníctvom 7-EDb~8, a tiež bunkami, ktoré vzájomne adherujú prostredníctvom 8-9-10, spočívajú v rozdielnej aktivácii malých GTP-väzbových proteínov. Z toho vyplýva, že adhézia prostredníctvom 8-9-10 pomocou signalizácie sprostredkovanej integrínom nakoniec spôsobí aktiváciu rho, fokálnu adhéziu a vytvorenie aktínových vláken, zatiaľ čo adhézia buniek Balb/c 3T3 prostredníctvom 7-EDb-8 spôsobuje iba aktiváciu cdc42- a rac-proteínov, avšak neaktivuje rho. Avšak pre uvedené hypotézy nie sú ani v jednej zo štúdií uvedené žiadne údaje.
Iná štúdia (Hashimoto-Uoshima et al., 1997, J. Celí Sci. 110, 2271-2280) ukazuje, že bunková adhézia kultivovaných fibroblastov je zosilnená prítomnosťou fragmentov fibronektínu, k.toré obsahujú EDb-doménu fibronektínu. Z toho vyplýva, že zostrihnutá EDb-doména má dôležitú biologickú funkciu vzhľadom na zosilnenie bunkovej adhézie a šírenie buniek.
Na rozdiel od toho účasť EDa vo fragmentoch bez prítomnosti EDb znižuje vytváranie dobrých fokálnych adhézií v bunkách. Na základe toho autori štúdie uvažujú, že zapojenie obidvoch domén vo fíbronektínovej molekule predstavuje mechanizmus, ktorým sa dosahuje bunková adhézia v takej miere, že je uľahčená migrácia, pretože tak adhézia ako aj strata adhézie sú významné pre migráciu buniek.
Výskumy na kuracích embryách a dospelých myšiach ukázali, že EDb-sprostredkovaná angiogenéza sa môže blokovať inhibíciou integrínov α3β1 endotelových buniek (Renato et al., AACR 2001, LB-6O).
Žiadne zo skôr citovaných štúdií a výskumov však nedali jasnú odpoveď pokiaľ ide o funkciu EDb-domény, ani sa nevyslovilo nič o identite možného receptora (receptorov) EDbdomény.
Cieľom predkladaného vynálezu je teda objasniť funkciu EDbdomény. Ďalším cielom je identifikovať možné špecifické receptory EDb-domény. A ešte ďalším cielom predkladaného vynálezu je objasniť mechanizmus EDb-špecifickej adhézie a interakciu s molekulou receptora, ktoré by sa mohli podieľať na procese angiogenézy. Ďalšou úlohou predkladaného vynálezu je identifikovať úseky EDb zodpovedné za špecifickú väzbu.
Podstata vynálezu
Riešením podľa vynálezu je proteín,
a) ktorý je schopný sa špecificky viazať na EDb-doménu fibronektínu;
b) ktorý je špecificky exprimovaný alebo aktivovaný v endotelových bunkách;
c) ktorý je špecificky exprimovaný alebo aktivovaný v stromových bunkách nádoru;
d) ktorý je špecificky exprimovaný alebo aktivovaný v nádorových bunkách;
e) ktorého väzba na EDb-doménu fibronektínu je inhibcvar.á pclypeptidom; a
f) ktorý má zjavnú molekulovú hmotnosť ľahkého reťazca 120 až 130 kDa a ťažkého reťazca 150 až 160 kDa podľa stanovenia v SDS-polyakrylamidovej gélovej elektroforéze.
Osobitne výhodný je proteín,
a) ktorý je schopný sa špecificky viazať na EDb-doménu fibronektínu, pričom väzbový úsek je charakterizovaný najmenej jednou sekvenciou, ktorá je vybraná zo skupiny, ktorá obsahuje sekvencie SEQ ID MO: 1 až 3;
b) ktorý je špecificky exprimovaný alebo aktivovaný v endotelových bunkách;
c) ktorý je špecificky exprimovaný alebo aktivovaný v stromových bunkách nádoru;
d) ktorý je špecificky exprimovaný alebo aktivovaný v nádorových bunkách;
e) ktorého väzba na EDb-doménu fibronektínu je inhibovaná polypeptidom, ktorý obsahuje sekvenciu, ktorá je vybraná zo skupiny, ktorá obsahuje sekvencie SEQ ID NO; 1 až 3; a
f) ktorý má zjavnú molekulovú hmotnosť ľahkého reťazca 120 až 130 kDa a ťažkého reťazca 150 až 160 kDa podľa stanovenia v SDS-polyakrylamidovej gélovej elektroforéze.
Osobitne výhodný je najmä protein,
a) ktorý je schopný sa špecificky viazať na EDb-doménu fibronektínu, a ktorý obsahuje a2βΐ-reťazec integrínu;
b) ktorý je špecificky exprimovaný alebo aktivovaný v endotelových bunkách;
c) ktorý je špecificky exprimovaný alebo aktivovaný v stromových bunkách nádoru;
d) ktorý je špecificky exprimovaný alebo aktivovaný v nádorových bunkách;
e) ktorého väzba na EDb-doménu fibronektínu je inhibovaná polypeptidom, a ktorý obsahuje α-reťazec integrínu; a
f) ktorý má zjavnú molekulovú hmotnosť ľahkého reťazca 120 až 130 kDa a ťažkého reťazca 150 až 160 kDa podľa stanovenia v SDS-polyakrylamidovej gélovej elektroforéze.
Vo výhodnom uskutočnení vynálezu endotelové bunky sú proliferujúce endotelové bunky.
Vo výhodnom uskutočnení vynálezu stromové bunky sú nádorové stromové bunky.
Okrem toho je riešením podľa vynálezu proteín, ktorého špecifická väzba na EDb-doménu fibronektínu sprostredkováva adhéziu endotelových, nádorových stromových buniek a nádorových buniek. Väzbový úsek môže byť charakterizovaný najmenej jednou sekvenciou, ktorá je vybraná zo skupiny, ktorá obsahuje sekvencie SEQ ID NO: 1 až 3 a osobitne obsahuje aľpi-reťazec integrínu.
Ďalej je riešením podľa vynálezu proteín, ktorého špecifická väzba na EDb-doménu fibronektínu indukuje proliferáciu endotelových buniek. Väzbový úsek môže byť charakterizovaný najmenej jednou sekvenciou, ktorá je vybraná zo skupiny, ktorá obsahuje sekvencie SEQ ID NO: 1 až 3 a osobitne obsahuje a2Bl-reťazec integrínu.
Ďalej je riešením podľa vynálezu proteín, ktorého špecifická väzba na EDb-doménu fibronektínu indukuje proliferáciu, migráciu a diferenciáciu endotelových buniek v kolagénovom matrixe, pričom väzbový úsek je charakterizovaný najmenej jednou sekvenciou. Väzbový úsek tu môže byť charakterizovaný najmenej jednou sekvenciou, ktoré je vybraná zo skupiny, ktorá obsahuje sekvencie SEQ ID NO: 1 až 3 a osobitne obsahuje a2pi-reťazec integrínu.
A ďalej je riešením podľa vynálezu proteín, ktorý sa špecificky viaže na EDb-doménu fibronektínu a indukuje špecifickú dráhu signálnej transdukcie, pričom je indukovaný najmenej jeden gén, ktorý kóduje proteín, ktorý je vybraný zo skupiny, ktorá obsahuj e fokálnu adhéznu kinázu,
CD6-Ligand (ALCAM), α-reťazec vitronektínového receptora, integrovanú podjednorku alfa 8 a prekurzor proteínu príbuzného follistatinu.
Väzbový úsek tu môže byť charakterizovaný najmenej jednou sekvenciou, ktorá je vybraná zo skupiny, ktorá obsahuje sekven10 cie SEQ ID NO: 1 až 3 a osobitne obsahuje c<2pi-reťazec integrínu .
Je výhodné, keď indukciou špecifickej dráhy signálnej transdukcie je aspoň jeden z vymenovaných génov prinajmenšom jednoducho indukovaný. Výhodne je pritom prinajmenšom jeden z vymenovaných génov dvojito indukovaný.
Riešením podľa vynálezu je tiež protilátka, ktorá je sehopná sa viazať na proteín podľa predkladaného vynálezu.
Ďalej je riešením podľa vynálezu tiež protilátka, ktorá je schopná sa viazať na proteín, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je vybraná zo skupiny, ktorá obsahuje sekvenciu SEQ ID NO: 1, sekvenciu SEQ ID NO: 2, sekvenciu SEQ ID NC: 3 a sekvenciu SEQ ID NO: 4.
Vo výhodnom uskutočnení predkladaného vynálezu je protilátka schopná inhibovať účinky, ktoré sú špecifické pre EDb-domér.u.
Výhodné je, keď sa väzba a inhibícia môžu uskutočniť in vitro a/alebo in vivo.
Vo výhodnom uskutočnení predkladaného vynálezu je protilátka monoklonálna alebo rekombinantná protilátka.
Vo výhodnom uskutočnení predkladaného vynálezu je protilátka scFv-fragment.
Ďalej je riešením podľa vynálezu bunka, ktorá exprimuje proteín podľa predkladaného vynálezu.
Ďalej je riešením podlá vynálezu bunka, ktorá exprimuje protilátku podľa predkladaného vynálezu.
Okrem toho je riešením podľa vynálezu fág, ktorý exprimuje protilátku podľa predkladaného vynálezu.
Ďalej je riešením podľa vynálezu spôsob skríningu zlúčenín, ktoré sa viažu na receptor EDb-domény fibronektínu, pričom spôsob zahŕňa:
Porovnanie odpovede buniek v prítomnosti jednej alebo viacerých zlúčenín s kontrolnou odpoveďou buniek v neprítomnosti zlúčenín, pričom bunky exprimujú protein podlá predkladaného vynálezu alebo obsahujú nukleovú kyselinu, ktorá kóduje tento protein, a pričom odpoveď prípadne kontrolná odpoveď je sprostredkovaná receptorom EDb-domény fibronektínu.
Vo výhodnom uskutočnení predkladaného vynálezu zahrňuje odpoveď, prípadne kontrolná odpoveď, priľnutie buniek na povrch, ktorý je potiahnutý EDb-doménami fibronektínu alebo ich časťami.
Vo výhodnom uskutočnení spôsobu podlá predkladaného vynálezu väzbový úsek EDb-domény fibronektínu obsahuje sekvencie SEQ ID NO: 1 až 4 alebo ich časti.
Je výhodné, keď odpoveď, prípadne kontrolná odpoveď, zahrňuje proliferáciu buniek na povrchu, ktorý je potiahnutý EDb-doménami fibronektínu alebo ich časťami.
Vo výhodnom uskutočnení predkladaného vynálezu zahrňuje odpoveď, prípadne kontrolnú odpoveď, proliferáciu, migráciu a diferenciáciu endotelových buniek v kolagénovom matrixe, ktorý obsahuje EDb-domény fibronektínu alebo ich časti.
Výhodne je zlúčenina vybraná zo skupiny, ktorá obsahuje protilátky, fragmenty protilátok, umelé protilátky, peptidy, nízkomolekulové zlúčeniny, aptaméry a ich izoméry.
Vo výhodnom uskutočnení predkladaného vynálezu sú protilátky rekombinantné protilátky.
Je výhodné, keď je protilátka vybraná zo skupiny, ktorá obsahuje scFv a jeho fragmenty.
Ďalej je riešením podľa predkladaného vynálezu spôsob skríningu zlúčenín, ktoré sa viažu na EDb-doménu fibronektínu, pričom spôsob zahŕňa:
a) privedenie buniek do kontaktu so stanovenou koncentráciou proteínu, ktorý obsahuje EDb-doménu fibronektínu alebo proteínu, ktorý obsahuje jednu zo sekvencií uvedených v zozname sekvencií ako sekvencie SEQ ID NO: 1 až 4, v prítomnosti rôznych koncentrácií jednej alebo viac zlúčenín,
b) dokázanie rozdielu v odpovedi buniek na proteín, ktorý obsahuje EDb-doménu fibronektínu alebo proteínu, ktorý obsahuje jednu zo sekvencií uvedených v zozname sekvencií ako sekvencie SEQ ID NO: 1 až 4, v prítomnosti zlúčenín v porovnaní s kontrolnou odpoveďou buniek na proteín, ktorý obsahuje jednu zo sekvencií uvedených v zozname sekvencií ako SEQ ID NO: 1 až 4, v neprítomnosti týchto zlúčenín, pričom bunky exprimujú proteín pódia predkladaného vynálezu alebo obsahujú nukleovú kyselinu, ktorá kóduje tento proteín, a pričom odpoveď, prípadne kontrolná odpoveď, je sprostredkovaná receptorom Ed-o-domény fibronektínu.
Pritom je výhodné, keď odpoveď, prípadne kontrolná odpoveď, zahrňuje prilnutie buniek na povrchy, ktoré sú potiahnuté ED-0doménami fibronektínu alebo ich časťami.
Monoklonálne protilátky sú pripravované štandardnými postupmi hybridómovej technológie a potom sú imunohistologicky charakterizované na kryorezoch z ľudských nádorov (pozri obr. 13). Ako príklad sa môže uviesť AKAM-ED3r-2 (myšací IgGl/kappa).
Vo výhodnom uskutočnení predkladaného vynálezu zahŕňa odpoveď, prípadne kontrolná odpoveď, proliferáciu buniek na povrchu, ktorý je potiahnutý EDb-doménou fibronektínu alebo jej časťami.
V ďalšom výhodnom uskutočnení predkladaného vynálezu zahŕňa odpoveď, prípadne kontrolná odpoveď, proliferáciu, migráciu a diferenciáciu endotelových buniek v kolagénovom matrixe, ktorý obsahuje EDb-domény fibronektínu alebo ich časti.
Výhodne je zlúčenina vybraná zo skupiny, ktorá obsahuje protilátky, umelé protilátky, fragmenty protilátok, peptidy, nizkomolekulové látky, aptaméry a zrkadlové aptaméry.
Riešením podlá predkladaného vynálezu je ďalej použitie nukleovej kyseliny, ktorá kóduje proteín, ktorý obsahuje sekvenciu, ktorá je vybraná zo skupiny obsahujúcej sekvencie SEQ ID NO: 1 až 4, na skríning zlúčenín, ktoré sa viažu na receptor EDbdomény fibronektínu alebo na EDb-doménu fibronektínu.
Riešením podlá predkladaného vynálezu je ďalej použitie proteínu podľa vynálezu, prípadne protilátky podľa vynálezu, na skríning zlúčenín, ktoré sa viažu na receptor EDb-domény fibronektínu alebo na EDb-doménu fibronektínu.
Riešením podlá predkladaného vynálezu je tiež použitie bunky podľa vynálezu, na skríning zlúčenín, ktoré sa viažu na receptor EDb-domény fibronektínu alebo na EDb-doménu fibronektínu.
Riešením podľa predkladaného vynálezu je tiež použitie nukleovej kyseliny, ktorá kóduje proteín, ktorý obsahuje sekvenciu, ktorá je vybraná zo skupiny obsahujúcej sekvencie SEQ ID NO: 1 až 4, na vývoj protilátok alebo scFv fúznych proteínov pre diagnostické alebo terapeutické účely.
Riešením podľa predkladaného vynálezu je tiež použitie proteínu podľa predkladaného vynálezu na vývoj protilátok alebo scFv fúznych proteínov pre diagnostické alebo terapeutické účely. Termínom terapeutický účel sa myslí okrem iného antiangiogenetické ošetrenie zlúčeninou, ktorá inhibuje špecifickú interakciu medzi EDb a receptorom. Protilátky sú pritom namierené tak proti receptoru ako aj proti EDb, pričom sa môžu použiť pep14 tidy so sekvenciou uvedenou ako sekvencia SEQ ID NO: 1 až 3 a ich stabilizované deriváty, a tiež nízkomolekulové zlúčeniny.
Riešením podlá predkladaného vynálezu je tiež použitie buniek podlá vynálezu na vývoj protilátok alebo scFv fúznych proteínov pre diagnostické alebo terapeutické účely.
Riešením podľa predkladaného vynálezu je tiež ďalej použitie fága podľa vynálezu pre vývoj protilátok alebo scFv fúznych proteínov pre diagnostické alebo terapeutické účely.
Riešením podľa predkladaného vynálezu je tiež ďalej použitie proteínu, ktorý obsahuje sekvenciu, ktorá je vybraná zo skupiny obsahujúcej sekvencie SEQ ID NO: 1 až 4, pri pro-angiogenetickej terapii.
Riešením podľa predkladaného vynálezu je ďalej použitie proteínu, ktorý obsahuje sekvenciu, ktorá je vybraná zo skupiny obsahujúcej sekvencie SEQ ID NO: 1 až 4, pre diagnostické účely.
Riešením podľa predkladaného vynálezu je ďalej použitie proteínu, ktorý obsahuje sekvenciu, ktorá je vybraná zo skupiny obsahujúcej sekvencie SEQ ID NO: 1 až 4, na génovú terapiu.
Riešením podľa predkladaného vynálezu je ďalej použitie proteínu, ktorý obsahuje sekvenciu, ktorá je vybraná zo skupiny obsahujúcej sekvencie SEQ ID NO: 1 až 4, na potiahnutie povrchu, na ktorý sa viažu endotelové bunky.
Pritom je výhodné, keď poťahovanie prebieha in vitro alebo in vivo.
Riešením podľa predkladaného vynálezu je ďalej použitie proteínu, ktorý obsahuje sekvenciu, ktorá je vybraná zo skupiny obsahujúcej sekvencie SEQ ID NO: 1 až 4, v bunkových kultúrach.
Riešením podľa predkladaného vynálezu je ďalej použitie proteínu, ktorý obsahuje sekvenciu, ktorá je vybraná zo skupiny obsahujúcej sekvencie SEQ ID NO: 1 až 4, spoločne aspoň s jedným transplantátom.
Pritom je výhodné, keď transplantát je vybraný zo skupiny, ktorá obsahuje cievy, kožu, rohovku, obličky, pečeň, kostnú dreň, srdce, pľúca, kosti, týmus, tenké črevo, pankreas, a ďalšie vnútorné orgány vrátane ich častí alebo ich buniek.
Riešením podľa predkladaného vynálezu je ďalej použitie proteínu, ktorý obsahuje sekvenciu, ktorá je vybraná zo skupiny obsahujúcej sekvencie SEQ ID NO: 1 až 4, spoločne aspoň s jedným implantátom.
Pritom je výhodné, keď implantát je vybraný zo skupiny, ktorá obsahuje pľúcny implantát, kardiostimulátor, umelú srdcovú chlopňu, cievne implantáty, endoprotézy, skrutky, došzičky, drôty, klince, tyče, umelé kĺby, prsné implantáty, umelé lebečné kosti, umelé zuby, zubné výplne a zubné mostíky.
Termín „účinky, ktoré sú špecifické pre EDb-doménu fibronektínu označuje všetky takéto účinky, ktoré sú vyvolané ED~-doménou fibronektínu, avšak nie doménou EIII7, EIII8, a ďalšími. Jeden takýto účinok je napr. opísaný v publikácii Chen et al., 1998 (aaO), kde ide o rýchlu tyrozín-fosforyláciu viacerých intracelulárnych proteínov, na rozdiel od skôr pomalej fcsforylácie po adhézii sprostredkovanej doménami EIII8-9-10. Termínom „nizkomolekulové zlúčeniny alebo látky sa chápu všetky zlúčeniny, ktorých relatívna molekulová hmotnosť je nižšia ako 1000 až 1200. Termín „aptaméry označuje molekuly na báze nukleovej kyseliny, ktoré sú schopné účinkovať ako vysoko špecifické ligandy pre velký počet biomolekúl. Termínom „pro-angiogenetická terapia sa myslí forma terapie, pri ktorej sa má podporiť angiogenéza. Termínom „antia-ngiogenetická terapia sa myslí akákoľvek forma ošetrenia alebo terapie, ktorej cieľom je inhibícia angiogenézy. Termínom „génová terapia sa mieni akákoľvek forma terapie, ktorá je zacielená na vyradenie génovo podmienenej poruchy, prípadne obnovenie normálnej funkcie génu pri ochorení, ktoré je spôsobené elimináciou alebo naopak tvorbou proteínu. Génová terapia môže zahŕňať vnesenie cudzorodej DNA do telových buniek, avšak nie je na ne obmedzená. Termínom „bunkové kultúry sa mienia tak média pre bunkové kultúry ako aj nádoby pre bunkové kultúry. Výhodné sú nádoby pre bunkové kultúry vybrané zo skupiny, ktorá obsahuje fľaše, doštičky, misky, mikrotitračné doštičky, 96-jamkové doštičky, kultivačné valce, bioreaktory a ďalšie.
Termínom „diagnostické účely sú mienené všetky účely, ktoré slúžia na rozpoznanie stavu organizmu/orgánu/bunky, prípadne priradenie aktuálneho stavu organizmu/orgánu/bunky k určitej kategórii stavov (napr. konkrétnemu ochoreniu), čo môže byť napr. použitie kitu/chemických reagencií/meracieho zariadenia na stanovenie fyzikálnej veličiny, ako je napr. teplota a pod., alebo chemickej veličiny, ako je napr. koncentrácia a pod., avšak bez akéhokoľvek obmedzenia.
Termínom „terapeutické účely sú mienené všetky účely, ktoré slúžia na zlepšenie, prípadne liečenie choroby organizmu/orgánu/bunky. Termínom „použitie proteínu spoločne s implantátom sa mieni buď časovo alebo priestorovo identické použitie. Tak napríklad môžu byť proteínové molekuly zachytené na implantát pri jeho vkladaní do tela, alebo môžu byť síce priestorovo od implantátu oddelené, ale podané (napr. injekciou) v rovnakom okamžiku, keď je vkladaný implantát.
Vynález je ďalej podrobnejšie opísaný a vysvetlený pomocou príkladov a obrázkov.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1: Schematické znázornenie opakovania typu III, ktorým sa. zaoberala štúdia;
Obr. 2: Výsledky proliferačného testu pod vplyvom EDb domény (ED-B) fibronektínu na endotelové bunky, prípadne ľudské bunky stromy, na rôznych substrátoch;
Obr. 3: Výsledky testu „pučania (test vytvárania trubice, „tube formation test) z endotelových buniek pod vplyvom ED-B;
Obr. 4: Výsledky testu priľnavosti (adhézie), keď sa testovala adhézia endotelových buniek na povrchy potiahnuté ED-B;
Obr. 5: Výsledky testu, podobného testu na obr. 4, s výnimkou toho, že bunky sa preinkubovali s rôznymi syntetickými peptidmi, ktorých sekvencie sú čiastočnými sekvenciami EDb-domény fibronektínu;
Obr. 6: čiastočné sekvencie syntetických peptidov z EDb-domény fibronektínu z Obr. 5;
Obr. 7: Výsledky testu adhézie endotelových buniek na rôzne syntetické ED-B-peptidy;
Obr. 8: Poloha syntetických peptidov z obr. 6 a 7 v modelovej štruktúre hlavného peptidového reťazca ED-B;
Obr. 9: Účinok EDb-domény fibronektínu a peptidu pochádzajúceho zo slučky 5 (sekvencia SEQ ID NO: 2) na indukciu tvorby štruktúr podobných kapiláram v teste „pučania (teste vytvárania trubíc);
Obr. 10: Výsledky dvojitej afinitnej chromatografie s použitím Fn-7-8-9, prípadne Fn-7-B-8-9 z bunkových lyzátov povrchovo označených ľudských kožných endotelových buniek;
Obr. 11: Výsledky dvojitej afinitnej chromatografie s použitím Fn-7-8-9, prípadne Fn-7-B-8-9 z bunkových lyzátov povrchovo označených ľudských kožných stromových buniek.
Obr. 12: Čistenie EDbB-receptorov pomocou afinitnej chromatografie .
Obr. 13 Imunohistologicky charakterizované ľudské kryorezy z nádorov.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Obr. 1 ukazuje rôzne, v tejto štúdii použité rekombinantné fibronektínové fragmenty, ktoré sa vyznačujú rozdielnou štruktúrou domén s rozdielnymi opakovaniami typu III. Pritom Fn-7-Β8-9 obsahuje fibronektínovú doménu 7, EDb, 8 a 9, Fn-7-8-9 obsahuje domény 7, 8 a 9, ED-B doménu EDb, Fn-10 doménu 10 a Fn-6 doménu 6. Tieto proteíny boli exprimované v E. coli ako proteíny s His-značkou (His-Tag) a prečistili sa na kolóne sefarózy chelatujúcej nikel. Číselné označenia použité v tejto štúdii zodpovedajú označeniu bežne používanému v odbornej literatúre. Pritom všetky označenia FN-B, ED-B, EDB a EDb sú použité ako synonymá na označenie EDb-domény fibronektínu.
Obr. 2 ukazuje výsledky proliferačného testu, keď sa skúmal účinok EDb-domény fibronektínu (ED-B) na proliferáciu endotelových buniek (EC), prípadne buniek stromy (SC) . 1000 buniek na jamku sa inkubovalo na 96-jamkovej doštičke. Rozpustná ED-B (10 pg/l) sa pridala do média v priebehu proliferačného restu. Po troch dňoch sa počet buniek stanovil MTS testom. Proliferácia buniek sa indukovala bázickým fibronektínovým rastovým faktorom (bFGF). Ukázalo sa, že ED-B bola v neprítomnosti bFGF bez účinku na bunky, a práve sa nedal dokázať žiadny účinok fibronektínovej domény 10 typu III (Dáta nie sú uvedené). Účinok EC-B na proliferáciu ľudských endotelových buniek sa stanovil, keď sa bunky vysiali na želatínu (EC/Gelatine), a tiež u buniek, ktoré sa vysiali na kolagén (EC/Collagen), avšak druhý z uvedených účinkov nebol taký výrazný, ako pri vysiatí na želatínu. U ľudských buniek stromy na želatíne (SC/Gelatine) došlo už v neprítomnosti bFGF k proliferácii, ktorá však ležala zreteľne za proliferáciou ľudských endotelových buniek. Prídavkom bFGF, prípadne bFGF + ED-B, sa už nemohla zvýšiť. Ako mierka pre počet buniek sa použila extinkcia pri vlnovej dĺžke 490 nm.
Pre proliferačný test sa použili nasledujúce experimentálne materiály a postupy.
Materiál: 96-jamkové doštičky (s plochým dnom), Nunc
Médium: MCDB 131, Pen/Strep, Amphotericin (0,25 pg/ml), Heparin (20 pg/ml), tepelne inaktivované FCS (5%)
Postup: Bunky, 500 až 1000 na jamku (96-jamková doštička) v 100 pl sa 3 dni kultivovali v médiu s bFGF (1 až 3 ng/ml) alebo VEGF (30 až 50 ng/ml). Presné množstvo bolo potrebné stanoviť pre každú náplň pomocou titrácie: ako optimálna bola stanovené minimálna koncentrácia, pri ktorej sa dosahuje maximálna stimulácia proliferácie. Synchronizácia buniek v experimente nebola potrebná, ale uskutočnila sa. Po 3 dňoch sa stanovil počet buniek pomocou súpravy MTS (Promega) podlá inštrukcií výrobcu. Odporúča sa merať absorpciu vo viacerých časových bodoch, aby sa maximálna absorpcia dosiahla v lineárnom rozsahu (0,5; 1; 2; 4 hodiny).
Kontroly:
Negatívna kontrola, bez mitogénu (bez proliferácie) (-bFGF/VEGF)
Pozitívna kontrola, s mitogénom (maximálna stimulácia) (+bFGF/VEGF).
Obr. 3 ukazuje účinok ED-B na pučanie endotelových buniek zo sféroidov. Na tento účel sa sféroidy HUVEC (bunky endotelu ľudskej pupočnej cievy, Human Umbilical Vein Endothelial Cells) vysadili do kolagénu a pridaním 10 pg/ml bFGF (základného fibroblastového rastového faktora) sa indukovalo „pučanie za absencie alebo prítomnosti 6 pg/ml ED-B. Ukázalo sa, že samotným bFGF sa môže „pučanie indukovať a pridaním ED-B sa môže ďalej stimulovať (+ bFGF + ED-B).
Na test „pučania sa použili nasledujúce materiály a experimentálne postupy:
Materiál: Metylcelulóza s najvyššou viskozitou (Sigma), Trypsín/EDTA pre bunkové kultúry (Gibco), 96-jamkové doštičky s guľatým dnom (Greiner #650185), rekombinantný bFGF (Gibco #13256-029), rekombinantný VEGF (R&D System), anti-potkaniaCD31 (RDI #RDI-CD31TLD), heparín (Gibco #15077-027).
Roztoky: PBS/antibiotiká, PBS pre bunkové kultúry, 10 x Pen/Strep, 2,5 pg/ml amfotericin, 1% želatína (Difco, autoklávovaná a po vychladnutí doplnená Pen/Strep a amfotericinom (0,25 pg/ml).
Médium: MCDB 131, glutamín, Pen/Strep, amfotericin (0,25 pg/ml), heparín (20 pg/ml), tepelne inaktivované FCS (10%)
Rastové médium: Médium s 2 ng/ml bFGF a 10 ng/ml VEGF
Bunky: HUVEC, dermálne MVEC (počet pasáží >4).
Postup: Endotelové bunky sa oddelili pomocou trypsín/EDTA a nariedili na koncentráciu 5000 buniek/ml v médiu obsahujúcom 0,24% metylcelulózy. Po 200 pl (1000 buniek) na jamku sa nanieslo na' Greiner-doštičku a inkubovalo cez noc. Guľaté zhluky buniek (sféroidy) sa odobrali 1 ml pipetou s odrezanou špičkou a stočili centrifúgou. Sféroidy sa potom resuspendovali v 1,2% metylcelulóza/FCS a zmiešali s neutralizovaným kolagénom. EDb a bFGF sa kopolymerovali.
Ako je zreteľne zjavné na obrázku, dôsledkom pridania ED-Bbolo výrazné zvýšenie „pučania v porovnaní s bFGF indukovaným množstvom.
Obr. 4 ukazuje výsledky testu adhézie endotelových bur.iek na jamky mikrotitračnej doštičky, ktoré sa potiahli ED-B. Na tenuo účel sa endotelové bunky v ich pôvodných kultivačných nádobách zo’ substrátu uvoľnili trypsinizáciou (Trypsín/EDTA) a potom sa inkubovali na mikrotitračných doštičkách, potiahnutých ED-B v rôznych koncentráciách (0, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 40 ug/ml) a ponechali sa 1 hodinu na priľnutie. Ako negatívna kontrola slúžila jamka, ktorá sa potiahla 1 mg/ml BSA (hovädzí sérový albumín); adhézia na BSA (< 10%) sa odrátala.
Adhézia buniek sa kvantifikovala zafarbením kryštálovou violeťou a následnou lýzou s použitím SDS. Kvantifikácia sa potom uskutočnila meraním extinkcie pri vlnovej dĺžke 595 nm. Na obrázku znázornená vodorovná línia zodpovedajúca A595 nm 1,06 ukazuje 100% adhéziu na plazmatický fibronektín.
Výsledok tohto experimentu ukázal, že bunky prilnuli na povrchy potiahnuté ED-B, čo naznačuje prítomnosť receptora ED-B na povrchu buniek.
Pre test prilnutia/adhézie sa použili nasledujúce experimentálne materiály a postupy:
Roztoky: 1% BSA (Sigma, precipitovaný etanolom), 2% sérum v PBS (alebo trypsín-neutralizačný roztok),
Médium: MCDB 131, Pen/Strep, amfotericin (0,25 pg/ml), heparín (20 pg/ml), 0,1% BSA (Sigma, precipitovaný etanolom),
0,1% kryštálová violeť, 2% glutaraldehyd v PBS, 2% SDS sterilizovaný filtráciou.
Postup: Jamky 96-jamkovej doštičky (Nunc) sa potiahli proteínom 1 hodinu pri 37°C. Pre malé proteíny (<20 kDa) alebo peptidy sa odporúča nechať ich zaschnúť na doštičkách (napr. cez noc bez vrchnáku v sterilnom boxe). Potom sa jamky nasýtili 1% BSA 1 hodinu pri 37°C. Bunky sa uvoľnili 1 X trypsínom, spláchli 2% sérom kvôli inaktivácii trypsínu, a potom resuspendovali v médiu. Keď sa mali testovať protilátky alebo peptidy, bunky v suspenzii sa s nimi preinkubovali 30 minút pri 37°C. Do každej jamky (96-jamkovej doštičky) sa nanieslo 104 buniek s objemom 50 až 100 μΐ a inkubovalo 1 hodinu pri 37°C. Médium nad bunkami sa potom opatrne odsalo a doštička sa ponechala odkvapkať 1 minútu obrátená na papierovej vreckovke, a potom sa prichytené bunky zafarbili a fixovali kryštálovou violeťou/glutaraldehydom 15 minút. Jamky sa potom 3 x vypláchli s PBS a bunky sa nakoniec lyžovali s 2% SDS (15 minút na trepačke). Merala sa absorpcia pri vlnovej dĺžke 595 nm. Po troch prepláchnutiach vodou sa mohli bunky, pokiaľ bolo treba, znova zafarbiť.
Kontroly: Negatívna kontrola: prázdna jamka (BSA-kontrola), Pozitívna kontrola: Plazmatický fibronektín (2,5 pg/ml)
Adhézia = A595 (sonda) : 100 x A595 (fibronektín)
Obr. 5 ukazuje výsledky testu, podobného obr. 4 s výnimkou toho, že pred adhéziou buniek na jamky mikrotitračnej doštičky potiahnuté ED-B sa endotelové bunky preinkubovali v koncentrácii 250 μΜ s rôznymi syntetickými peptidmi, ktorých sekvencia bola čiastočnou sekvenciou EDb-domény fibronektínu. Adhézia sa stanovila meraním extinkcie pri vlnovej dĺžke 595 nm (A595) . Označenia peptidov použité na obrázku sú vysvetlené na nasledujúcom obr.
6. Peptidová sekvencia č. 043 zodpovedá peptidovej sekvencií uvedenej ako sekvencia SEQ ID NO: 1, peptidová sekvencia č. 553 zodpovedá sekvencií SEQ ID NO: 2, peptidová sekvencia č. 038 zodpovedá sekvencií SEQ ID NO: 3. Vyššia hodnota A595 znamená neinhibovanú adhéziu, zatial čo nižšia hodnota A595 znamená inhibíciu adhézie zodpovedajúcim peptidom.
Použili sa rovnaké postupy ako v experimente opísanom na obr. 4.
Obr. 6 ukazuje celkovú sekvenciu EDb-domény fibronektínu a z nej vybrané čiastočné sekvencie syntetických ED-B-peptidov spoločne so zvoleným označením sekvencií. Použili sa jednopísmenové symboly aminokyselín.
Obr. Ί ukazuje výsledky testu podobného experimentu opísaného na obr. 5, okrem toho, že mikrotitračné doštičky sa nepotiahli EDb-doménou fibronektínu, ale sa preinkubovali, a teda tiež potiahli, s peptidmi, ktoré sa v teste zobrazenom na obr. 5 prejavili ako inhibičné, prípadne neinhibičné. Pritom sa ukázalo, že bunky v týchto testoch už pri potiahnutí ktorýmkoľvek z inhibičných peptidov vykazovali adhéziu meranú ako hodnotu
A595 , zatiaľ čo peptidy podľa obr. 5 ako neinhibičné nespôsobovali adhéziu.
Použili sa rovnaké postupy ako v experimente opísanom na obr. 4.
Obr. 8 ukazuje modelovú štruktúru EDb-domény fibronektínu (ED—B) , 2. ktorej vyplýva poloha inhibičného peptidu č. 1 (= sekvencia SEQ ID NO: 1), č. 2 (= sekvencia SEQ ID NO: 2) a č. 3 (= sekvencia SEQ ID NO: 3) . Ukázalo sa, že tieto inhibičné peptidy sa nachádzajú na slučke 1 prípadne slučke 5 štruktúry ED-B a tým identifikujú úsek domény, prostredníctvom ktorého dochádza k väzbe na bunku, prípadne na receptor nachádzajúci sa na povrchu bunky. Modelová šrruktúra uvedená na obr. 8 je založená na už stanovenej štruktúre fibronektínovej domény 7 typu III. N-T a C-T označujú N- a C-koniec proteínu.
Obr. 9 ukazuje výsledky testu, ktorým sa skúmal účinok prídavku ED-B a peptidu č. 2 predtým určeného ako inhibičný peptid, a tiež prídavku fibronektínovej domény 6 typu III, na indukciu tvorby štruktúr podobných kapiláram (tube formation) v teste „pučania. Ukazuje sa, že najväčší účinok na bazálne, bFGE indukované prenikanie do kolagénového gélu sa dosiahne pomocou adhéziu inhibujúceho peptidu sekvencie SEQ ID NO: 2. Tento peptid má tiež stimulačný účinok na prenikanie endotelových buniek do kolagénového gélu. Tento peptid zodpovedá väzbovému úseku EDb a stimuluje, analogicky k samotnému EDb, prenikanie endotelových buniek do kolagénu.
Použili sa postupy použité v experimente opísanom na cbr. 3.
Obr. 10 ukazuje výsledky afinitnej chromatografie bunkového lyzátu z povrchovo označených ľudských dermálnych endotelových buniek. Na tento účel sa proliferujúce, na bunkovom povrchu biotinylované endotelové bunky lyžovali pomocou detergentu a potom sa naniesli na afinitnú chromatografickú kolónu, kde sa naviazali na sefarózu fragmenty fibronektínu s EDb-doménou fibronektínu alebo bez nej (s EDb-doménou fibronektínu = Fn-7-Β8-9, bez EDb-domény fibronektínu = Fn-7-8-9). Dalo sa ukázať, že biotinylovaný proteín so zjavnou molekulovou hmotnosťou Ϊ20 až 130 kDa. sa špecificky viaže na fragment obsahujúci ED-B (pozri šípka). Elúcia sa potom uskutočnila s použitím EDTA. Pocom sa odobrali frakcie opísané ďalej. Frakcie sa nakoniec analyzovali pomocou SDS-PAGE a tiež Western-blotom so značením pomocou streptavidín-peroxidázy a chemoluminescenciou (ECL). Dráhy 1 a 5 ukazujú predelučné frakcie, zatiaľ čo dráhy 2, 3, 4, a 6, 7, 8 ukazujú eluované frakcie 1, 2 a 3. Dráhy 1 až s Fn-7-8-9, zatiaľ čo dráhy 5 až s Fn-7-B8-9. Tu uvedené výsledky sú silným dôkazom pre to, že prevládajúci pás s molekulovou hmotnosťou 120 až 130 kDa je proteín, ktorý sa špecificky viaže na fragmenty fibronektínu obsahujúci EDb, takže predstavuje receptor pre EDbdoménu fibronektínu.
ukazujú 8 ukazujú chromatografiu chromatografiu
Pre biotinyláciu a lýzu endotelových buniek sa použili nasledujúce materiály a experimentálne postupy:
Materiál: 3-sulfo-N-hydroxysukcínimidester kyseliny biotín-amidohexánovej; Sigma, PBS w/o Mg/Ca (Dulbecco), Hepes tlmivý roztok: 20 mM Hepes pH 7,6, 1 mM CaCl2, 1 μΜ MgCl2, 0,1 NaN3, 1% CHAPS (objem/objem), a tablety pre roztok („koktail) inhibítora proteáz, bez EDTA (Mini Protease-Inhibitor, Cocktail-Tabletten) , Boehringer.
Postup: Nádoby pre bunkové kultúry pred a po biotinylácii sa 3 x premyli s PBS w/Ca + Mg. Pred posledným premytím sa pridal biotínový tlmivý roztok (1 mg/15 ml PBS) . Do každej nádoby sa pomaly pipetovalo 5 ml tlmivého roztoku (pre 225 cm2 misky) alebo
12,5 ml (pre 500 cm2 misky) do stredu dna, takže sa celý objem pri nakláňaní nádoby rozlial po celom dne. Potom sa prvá kultivačná nádoba ošetrila polovicou objemu lyzovacieho tlmivého roz25 toku. Tlmivý roztok sa rovnako pipetoval do stredu dna nádoby, a rozprestrel po celom povrchu dna. Potom sa bunky zoškrabali pomocou škrabky na bunky. Nakoniec sa celý objem 1. kultivačnej nádoby pipetoval do 2. kultivačnej nádoby, kde sa potom celý priebeh opakoval. Po poslednej nádobe sa objem preniesol do 50 ml kónickej centrifugačnej kyvety. S druhou polovicou lyzovacieho tlmivého roztoku sa tento priebeh opakoval vo všetkých kultivačných nádobách (bez použitia škrabky na bunky) a výsledný objem sa tiež preniesol do centrifugačných kyviet. Centrifugácia sa uskutočnila v 50 ml kónických kyvetách pre bunkové kultúry pri 3000 ot./min, 5 minút pri teplote miestnosti (stolná centrifúga Heraeus). Lyzát sa pipetou odobral a v ideálnom prípade ihneď naniesol na afinitnú chromatografiu (v núdzovom prípade sa môže zamraziť pri -80°C pre neskoršie použitie).
Pre kovalentné naviazanie proteínov na sefarózu sa použili nasledujúce materiály a postupy:
Materiál: aktivovaná CH Sepharose 4 B, Pharmacia Biotech, katalóg. č. 17-0490-01, 1 mmol HCI, 2,2% NaHCO3
Postup: HCI sa vychladila v ľadovom kúpeli, sefaróza sa zahriala na teplotu miestnosti. Potom sa sefaróza premyla 1 mmol HCI. Na 1 ml sefarózy sa použilo 10 ml HCI. Sefaróza sa nechala pomaly vznášať v predchladenej skúmavke, kde asi za 15 minút napučala (1 g sefarózy zodpovedá 3 ml napučanej sefarózy). Nakoniec sa skúmavka centrifugovala 1 minútu pri 800 ot./min. Supernatant sa odobral pipetou a odstránil. Tento postup sa opakoval trikrát.
Po treťom premytí sa pridala nová HCI, skúmavka sa pretrepala, potom centrif ugovala 3 až 5 minút pri 800 ot./min. Supematant sa pipetou odobral a pelet sa rozpustil v 20 ml vody čistenej Milliporom a preniesol do dvoch nových centrifugačných skúmaviek (1 skúmavka pre 7-EDB-8-9 sefarózu a druhá pre 7-8-9 sefarózu, t.j. sefarózu, na ktorú je naviazaný polypeptid s opakovaniami III7, EDb, III8 a III9 prípadne III7, III8 a III9, v uvedenom poradí). Skúmavky sa ihneď opäť centrifugovali, supernatant sa odstránil pipetou a tak sa naviazalo 1 až 5 mg proteínu na 1 ml sefarózy (tj. 2 mg proteínu/ml sefarózy 7-8-9, mg proteínu/ml sefarózy 7-EDB-8-9).
Skúmavky sa premiešali trepaním. Potom nasledovalo plynulé pridávanie 2,2% NaHCO3 (50 μΙ/ml gélu). Tým sa zvyšná HCI neutralizovala. Skúmavky sa potom pretrepali a na výkyvnom stolíku nastavenom na najvyššiu rýchlosť sa miešali 1 až 5 hodín. Nakoniec sa skúmavky opäť centrifugovali.
Na stanovenie koncentrácie proteínu, ktorý sa kovalentne naviazal na sefarózu, sa uskutočnil Bradfordov test:
Materiál: zásobný roztok BSA 2 mg/ml, Bradfordove činidlo
Postup: Roztok BSA sa naniesol nasledovne na imunodoštičky NuncImmuno-Plate (Maxi Sorp): 5 pg - 4 pg - 3 pg -2 pg - 1 pg (80 pl objem + 20 pl test)
Predriedenie BSA: 5 pg/50 pl = 0,1 mg/ml
Zásobný roztok 2 mg/ml sa nariedil 1:20 na koncentráciu 0,1 mg/ml.
Afinitná chromatografia a elúcia sa uskutočnili nasledujúcim postupom:
a) Afinitná chromatografia
Materiál: aktivovaná CH Sepharose 4 B, Pharmacia Biotech, katalóg. č. 17-0490-01,
Tlmivý roztok A (20 mM Hepes pH 7,6, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 0,1% NaN3) Tlmivý roztok B (Tlmivý roztok A + 150 mM NaCl + 0,1% Chaps)
Tlmivý roztok C (Pufor A + 0,1% Chaps) pH 4-Tlmivý roztok (voda Millipore + 0,1% ladová kyselina octová + 0,1% Chaps),
EDTA-Tlmivý roztok (Pufor A + 200 mM EDTA pH 8,5 + 0,1% Chaps)
Postup: lyzát sa naniesol na kolónu trikrát.
Pod kolónu sa umiestnila skúmavka na zachytávanie kvapaliny. Prvé 2 ml lyzátu sa naniesli na gél Eppendorf pipetou. Pre ďalšie objemy lyzátu sa použili odmerné pipety. Bolc treba sledovať, či je kolóna priama. Keď sa kolóna použila prvýkrát, pred vlastným behom sa uskutočnili behy „na sucho so všetkými tlmivými roztokmi bez proteínov. Jedna náplň kolóny by sa mala použiť najviac päťkrát. Keď sa lyzát zamrazený uložil (-80°C), bol najskôr zahriaty vo vodnom kúpeli a potom sa centrifugoval (5 minút pri 3000 ot./min.).
Prednostne sa však vždy spracovávali čerstvé lyzáty.
Z lyzátu sa odobralo 500 μΐ do skúmavky Eppendorf. Tie sa použili na skúmanie lyzátu pred a po chromatografii.
Keď sa použili dve kolóny (jedna so 7-8-9 sefarózou a druhá so 7-B-8-9 sefarózou), potom sa na každú kolónu naniesla polovica objemu lyzátu. Obidve kolóny by mali mať rovnakú prierokovú rýchlosť. Pokial to tak nebolo, „pomalšia kolóna sa primerane neskôr ukončila. Ideálny prietok bol 0,2 až 0,5 ml/min.
Keď lyzát prešiel 3 x kolónou, z výsledného pretečeného tlmivého roztoku sa po premiešaní odobralo tiež 500 μΐ do skúmavky Eppendorf, aby sa potom mohlo uskutočniť skúmanie.
Nakoniec sa na kolónu nanieslo 10 objemov tlmivého roztoku B a tlmivého roztoku C. Potom sa premývanie ukončilo.
b) Elúcia
Preelúcia: Tlmivý roztok C sa naniesol na kolónu, aby sa zistilo, či aj počas premývania ešte nezostali zachytené proteíny. 500 μΐ sa potom odobralo do skúmavky Eppendorf (v prípade dvoch kolón teda 2 x 500 μΐ).
EDTA-elúcia: EDTA vytvára komplexy s Ca- a Mg-iónmi. Takže sa takto eluovali proteíny endotelových buniek, ktoré potrebujú na väzbu Ca a Mg. 2 x 4 ml EDTA tlmivého roztoku sa prepustilo kolónou (prípadne obidvoma kolónami) a 2 frakcie (El a E2 / BE1 a BE2) sa zachytili do skúmaviek Falcon. Potom sa obsah skúmaviek premiešal a 500 μΐ (prípadne dvakrát) sa pipetou odobralo do skúmavky Eppendorf.
pH 4-elúcie: Skutočná hodnota pH tlmivého roztoku bola 3,7. Mimo rozsah neutrálneho pH (pH 6 až 8) sa môže väzba proteínu na jeho receptor inhibovať. Tiež tu sa 2 x 4 ml pH 4-pufru prepustilo kolónou a 2 frakcie (4,1 a 4,2 / B4,l a B4,2) sa zachytili a 500 μΐ sa pipetou odobralo do Eppendorf-skúmavky.
Potom sa kolónou pustili 3 objemy tlmivého roztoku A, čím sa vymyla kyselina. Posledný objem sa v kolóne ponechal. Kolóna· sa uzavrela a uložila do chladničky.
Odobraté 500 μΐ frakcie sa v Eppendorf skúmavkách najmenej 15 minút zmrazili pri -80°C a nakoniec sa lyofilizovali v zariadení „Speed Vac.
Takto získané frakcie, prípadne predelučné frakcie, sa analyzovali pomocou SDS-PAGE v neredukujúcich podmienkach a Wesrern blotom.
Obr. 11 ukazuje rovnaký experiment ako obr. 10, s výnimkou toho, že sa nepoužili lyzované endotelové bunky, ale lyzované bunky stromy. Vo Western-biote ukázanom na obr. 11 sú dráhy 1 až 3 eluáty z afinitnej kolóny s Fn-7-8-9, zatial čo dráhy 4 až 6 sú eluáty z afinitnej kolóny s En-7-B-8-9. Dráhy 1 a 4 sú predelučné frakcie, dráhy 2, 3 a 5, 6 sú frakcie 1 a 2 príslušných elúcií. Prevládajúci pás so zjavnou molekulovou hmotnosťou 120 až 130 kDa, aký je vidieť tiež na obr. 10, sa v týchto bunkových lyzátoch z ľudských buniek stromy nezistil.
Obr. 12 ukazuje ED-B-väzbový proteín, ktorý sa purifikoval prostredníctvom afinitnej chromatografie, ako bola opísaná, a potom analyzoval s použitím SDS-gradientovej gélovej elektroforézy (4 až 12%). Špecificky obohatené dvojité pásy (šípka) sa vyrezali a ďalej analyzovali s použitím hmotnostnej spekzroskopie.
Sekvenčnou analýzou sa zistilo, že izolovaný proteín je jednoznačne alfa2betal-integrín, pričom prevládajúci ťažký pás zodpovedá betal-podjednotke a lahký pás zodpovedá alpha2-podjednotke.
Toto zistenie zodpovedá tomu, že väzba na EDB je hlavne sprostredkovaná betal-podjednotkou integrínu. V závislcszi od skúmaného bunkového typu môžu byť tiež iné alfa-podjednotky (napr. alfa 2) v kombinácii s betal a sprostredkovávať väzbu na EDB-FN.
Obr. 13 ukazuje imunohistologicky charakterizované kryorezy z ľudských nádorov:
A: karcinóm obličiek, šípka ukazuje špecifické farbenie s použitím AK AM-EDBr2
B: Väčšie zväčšenie rovnakého preparátu.
C: Hepatocelulárny karcinóm
D: Melanóm (tu sa nezistilo žiadne špecifické farbenie)
Predchádzajúci opis, patentové nároky a tiež výkresy uvedené v predkladanej prihláške môžu byť tak jednotlivo ako aj v ľubovoľných kombináciách významné pre rôzne uskutočnenia predkladaného vynálezu.
Analýza EDB-receptora
Pásy sa vyrezali z ID-gélu a roztokom NH4HCO3 a acetonitrilom vymyli, osušili, a potom použili na proteolýzu trypsínovým roztokom v géli. Peptidy eluované z gélu do štiepneho roztoku sa potom koncentrovali na kolóne pCia a potom merali MALDI hmotnostnou spektroskopiou (= zoznam hmotností naštiepených proteinov).
S každou nájdenou hmotnosťou peptidu z každého pásu z gélu sa prehľadala databáza. Pri nejednoznačnom výsledku vyhľadávania sa navyše merali spektrá MALDI-PSD (fragmentové spektrá) celých peptidov. Spektrá sa použili buď priamo na potvrdenie predpokladanej peptidovej sekvencie (interpretácia spektra) alebo sa s týmto spektrom uskutočnilo prehľadávanie databázy.
Skúmané pásy:
| Pás A = pás | 1 | z preparátu 6 |
| pás | 4 | z preparátu 5 |
| pás | 6 | z kyslej elúcie |
Výsledok: Integrín oí2 pozri výsledky prehľadávania databázy pre pás 4 spektrá z pásu 1 a β ukazujú zhodné intenzity peptidu spektrum PSD peptidu z pásu 1 potvrdilo čiastočnú sekvenciu integrínu oí2
Pás B = pás 2 z preparátu 6 pás 5 z preparátu 5 pás 7 z kyslej elúcie
Výsledok: Integrín βΐ pozri výsledky prehľadávania databázy pre pásy 5 a 7 spektrum z pásu 2 ukazuje rovnako intenzívne peptidy spektrum PSD peptidu z pásu 2 potvrdilo čiastočnú sekvenciu integrínu βΐ
BSA - sa nachádza vo všetkých troch pásoch bol potvrdený prehľadaním databázy pre PSD-spektrum a na základe peptidovej hmotnosti
Ďalej sú pre ilustráciu vyššie opísaných skutočností uvedené originálne dáta MALDI spektroskopie a protokoly prehľadávania proteínových databáz:
Version 4.10.6
ProFound - Search Result Summary © 1997-2000 ProteoMetrics
A:hover (COLOR: red) unction togglelt(El) {whichlm = event.srcElement;if (E1 .style.display == none){El .style.display 7prow!/minus.gif;)else{whichlm.src = ''/prowl/plus.gif;E1 .style.display = none;)) A:hover (COLOR: red)
Protein Candidates for search 20010208092948-0121-149234049162 [121056 sequences searched]
Ran Prcbabíl Esťd = ;whichim.src
Protein Information and Seguence Analvse Tools (T) ity J
1.0e+00
qil4504743lreflNP 002194.11 integrín alpha 2 precursor +2 2.3e-010 - qil628012loirllA53933 myosin I myr 4 - rat qil6981242lreflNP 037115.11 unconventional myosin from rat 4 (or myosin I heavy chain
8.33-011 - qil7513QiQlDirHT00322 hypothetical protein KIAA0542 - human
0Í14210973lgblAAD12053.11 (AF105016) vacuolar proton
1.7e-012 - translocating ATPase 116-kDa subunit a2 isoform; V-ATPase
116-kDa isoform a2 isoform [Bos taurus] qil543747lsolP36633IABP RAT AMILORIDE-SENSITIVE AMINE OXIDASE [COPPER-CONTAINING] PRECURSOR
5.4e-013 (DIAMINE OXIDASE) (DAO) (AMILORIDE-BINDING PROTEÍN) (ABP) (HISTAMI NAŠE)
4.2e-013 - qil7656867lreflNP 055059.11 a disintegrin-iike and
| % | Bi | kDa |
| 19 | 5.2 | 129 |
| .28 | ||
| 15 | 9.6 | 116 |
| .17 | ||
| 15 | 9.6 | 116 |
| .12 | ||
| 11. | 117 | |
| 15 | 5 | .58 |
| u | 5.9 | 97. |
| 99 | ||
| 16 | 6.6 | 85. |
| 00 |
6.8 134
8.6e-014 +8 6.5e-014
5.0e-014
4.7e-014 metalloprotease (reprolysin type) with thrombospondin type 1 motif, 2 qil3688530lemblCAA09465.1l (AJ011035) phospholipase C beta 2 [Rattus norvegicus] ail45Q4085lrefINP 000399.11 glycerol-3-phosphate dehydrogenase 2 (mitochondrial) qil7446012lpirllG02093 g!ycerol-3-phosphate dehydrogenase human qi!75l3725lpirllT29098 microtubule-associated protein 4, muscle-specific - mouse (fragment) qil6005970lreflNP 009078.1l zinc finger protein 175
| .71 | ||
| n | 5.8 | 134 |
| ,87 | ||
| 21 | 7.0 | 80. |
| 80 | ||
| 21 | 7.3 | 80. |
| 14 | 8.1 | 82 114 |
| .87 | ||
| 22 | 9.6 | 81. |
| 59 |
NOTE:
1. To search aqain usinq unmatched masses, click the symbol ®.
2. Highly similar protein sequences were given the samé rank (IE user: click +“ to expand/contract). Input Summary
Dáte & Time Thu Feb 08 08:29:55 2001 UTC (Search Time: 6.30 sec.)
Sample ID EDB Fibronektin, Bande 4 Database NCBInr [,.\databases\nr]
Taxonomy Mammalia (mammals)
Category
Protein Mass Ra 80 - 135 kDa nge
Protein pl Range 0.0-14.0
Search (or Single protein only
Digest Chemistry Trypsin Max Missed Cut 2
Modifications +C3H5ON©C(Partial); +O@M(Partial);
Chargé State MH+
Peptide Masses (Da,Average)
Tolerance(AVG) 1.00 ppm
935.536 1007.504 1179.535 1222.729 1277.731 1307.689 1473.816 1479.833 1510.835 1553.895 1567.758 1586.801 1638.888 1707.772
Peptide Masses
1819.830 1851.993 1915.959 1931.980 1947.990 1973.966 1993.998 (Da.Monoisotopic
2044.968 2051.077 2068.095 2095.065 2150.093 2224.097 2283.137 ) 2344.115 2501.214 2705.123 2775.304 2372.336 2902.333 2932.502
3052.424 3280.542 Tolerance(MON) 50.00 ppm
Number of 37 Peptides
ProteoMetrics’ ProFound is based on ProFound at The Rockefeller University [search + transmission time: >=3.33 sec] function expandlt(whichEI) (whichEl.styie.disp'.ay = (whíchEl.style.display ==nonej? “:notie;}
Version 4.10.6
ProFound - Search Result Summary © 1997-2000 ProteoMetrics
A:hover {COLOR: red) function togglelt(EI) (whichlm = event.srcElement;if (E1 .style.display == none'‘)(El.style.display “tvrhichlm.src
7prcwl/minus.gif'’;}else(whichlm.src = 7prowl/plus.gil‘;E1.style.display = none;)) Amover {COLOR; red } Protein Candidates for search 20010207110038-0035-149234049162 [121056 sequences searched]
Ran Probabil Esťd
Protein Information and Sequence Analyss Tools (T) % g/ kDa k ity _Z qil124963ISDlP05556IITB1 HUMAN FIBRONECTIN
1.0e+00 + 1 1.15 RECEPTOR BETA SUBUNIT PRECURSOR (INTEGRIN BETA- 17 —
1) (CD29) (INTEGRIN VLA-4 BETA SUBUNIT) qil762977lemb1CAA33272.1i (X15202) Fn receptor beta prechain [Mus musculus] qil72070lpirlllJMSF3 fibronectin receptor beta chain precursor mouse qil8393636lreflNP 058718.11 integrin, beta 1 1_[
88.
5.8
88.
5.8
88.
5.8 qil124964lsplP09055IITB1 MOUSE FIBRONECTIN
RECEPTOR BETA SUBUNIT PRECURSOR (INTEGRIN BETA- 11 5.7 '
Ú 21 qi|10336839lqblAAGl6767.1!AFl°2528 1 (AF192528) integrin 88.
5.3 beta-1 subunit [Sus scrofaj — 25 qil1706573lsplP53712HTBl BOVIN FIBRONECTIN 9 5.3 85.
1.9e-004 +3 7.7Θ-005
l.8e-005
1.1e-005
6.1e-006
2.4e-006
1.1e-006
RECEPTOR BETA SUBUNIT (INTEGRIN BETA-1) (CD29) (INTEGRIN VLA.-4 BETA SUBUNIT) qíl1708574lsplP53713IITB1 FELCA FIBRONECTIN RECEPTOR BETA SUBUNIT PRECURSOR (INTEGRIN BETA1) (CD29) (INTEGRIN VLA-4 BETA SUBUNIT) qi 1545391 OlrefINP 006216.11 phcspholipase C, delta 1 gil 1589134lprf112210313A phosphatidylinositol 3kinase:SUBUNIT=55kD regulátory [Rattus norvegicus] qil6981358lreflNP 037137.11 phosphoinositide 3-kinase p85 (other splicing variants: p55 and p50) qil1 l63174lqblAAA85505.1l (U32575) similar tg yeast Sec6p, Swiss-Prot Accession Number P32844; similar to mammalian B94, Swiss-Prot Accession Number Q03169; Method: conceptual translation supplied by author [Rattus norvegicus] qi!2l 37061 Ipir11PC4183 i -phosphatidylinositol phosphodiesterase (EC 3.1.4.10) delta 1 - Chinese hamster (fragment) qil9910238lreflNP 064388.11 generál control of amino acid synthesis, yeast homolog-like 2 qil10047327fdbiíBABl3451.1 f (AB046845) KIAA1625 proteín [Homo sapiens]
PÍI5032191 ireflNP 005793.11 tumor protein p53-blndíng protein
| 9 | 5.2 | 88 08 |
| 85 | ||
| 8 | 6.2 | |
| 75 | ||
| 83 | ||
| 1θ | 5.9 | |
| 46 | ||
| 83 | ||
| 8 | 5.9 | 51 |
| 86 | ||
| 8 | 5.8 | |
| 48 | ||
| 84 | ||
| 12 | 5.9 | |
| 62 | ||
| 93. | ||
| 12 | 9.6 | 37 |
| 97. | ||
| 6 | 9.0 | |
| 20 | ||
| 12 | 9.7 | 93. |
+9 9.9e-007 + 10 9.6Θ-007
NOTE:
qil9910260lreflNP 064581.11 HCNP protein qil6330235ldbilBAA86491.11 (AB033003) KIAA1177 protein [Homo sapiens] qil9453796lemblCAB99365.11 (AL117378) dJ131Fl5.2 (phosphodiesterase l/nucleotide pyrcphosphatase 1 (homologous to mouse Ly-41 antigén) (PC1, NPPS)) [Homo sapiens] gil129678lsplP22413IPC1 HUMAN PLASMA-CELL MEMBRÁNE GLYCOPROTEIN PC-1 [INCLUDES: ALKALINE PHOSPHODIESTERASE I; NUCLEOTIDE
PYROPHOSPHATASE (NPPASE)]
98.
8.7
87.
5.6
96.
6.8
6.8
99.
1. To search aqain using unmatched masses. click the svmbol ®.
2. Highly similar protein sequences were given the samé rank (IE user: click + to expanďcontract).
Input Summary
Dáte & Time Wed Feb 07 10:00:44 2001 UTC (Search Time: 5.91 sec.)
Sample ID EDB Fibronektin, #0824, Bande 5 Database NCBInr [..\databases\nr]
Taxonomy Mammalia (rmammals)
Category
Protein Mass Ra 80 - 100 kDa nge
Proteín pl Range 0.0 -14.0
Search for Single protein only
Digest Chemistry Trypsin Max Missed Cut 2
Modifications +C3H5ON@C(Partial); +0©M(Partial); Chargé State MH+
Peptide Masses (Da.Average)
Tolerance(AVG) 1.00 ppm
Peptide Masses (Da.Monoisotopic )
881.288 927.495 983.498 1007.525 1222.666 1376.820 1422.642 1439.854 1475.797 1479.791 1553.852 1557.742 1638.888 1781.886. 1915.892 1961.078 2019.135 2044.949 2225.083 2283.131 2470.203 3143.411 3299.415 3323.912 3337.675
Tolerance(MON) 50.00 ppm Number of 25
Peptides
ProteoMetrics’ ProFound is based on ProFound atThe Rockefeller University fsearch + transmisslon tíme: >=5.94 sec] function expandlt(whichEI) (whichEl.style.display = (whichEI.style.display == nonej? T'none'':)
ProFound - Search Result Summary
Verslon 4.10.6 1997-2000 ProteoMetrlcs
A:hover { COLOR: red ) function toggielt(EI) (whichlm = event.srcElement;if (E1 .style.display = ποπθ)(Ε1.style.display = ,';whichlm.src 7prowl/minus.giľ;)else{whíchlm.src = 7prowl/plus.glf;E1 .style.display = none“;}) Aihover {COLOR: red}
Protein Candldates tor search 20010207110746-0006-149234049162 [121056 sequences searched]
F a
n Probability k
Esťd
Z
Protein Informalion and Sequence Analyse Tools (T) % pl kDa
11.0e+000 ail124963lsplP05556HTB1 HUMAN FIBRONECTIN
1.61 RECEPTOR BETA SUBUNIT PRECURSOR (INTEGRIN BETA- 18 5.3 ~ 45
1) (CO29) (INTEGRIN VLA-4 BETA SUBUNIT) qil10336839lqblAAGl6787.1IAF192528 1 (AF192528) integrin 38.
5.3 beta-1 subunit (Sus scroía] 25 qil762977lemblCAA33272.11 (X15202) Fn receptor beta 88.
5.8 prechain [Mus musculus] ~~ 18
23.1e-006
37.7e-007
6.7e-007
1.8e-007 ail72070lDirlllJMSr3 fibronectin receptor beta Chain precursor · mouse
5.8
QÍI124964lsplP09055IIT31 MOUSE FIBRONECTIN
RECEPTOR BETA SUBUNIT PRECURSOR (INTEGRIN BETA- 12 5.7
83.
qil8393536lreflNP 058718.11 integrin, beta 1 12 5.8 — 48 qil1708573lsplP537l2IIT31 8OV1N FIBRONECTIN
RECEPTOR BETA SUBUNIT (INTEGRIN BETA-1) (CD29) 10 5,3 85 (INTEGRIN VLA-4 BETA SUBUNIT) qtl 1708574 Isp IP53713I1TB1 FELCA FIBRONECTIN
RECEPTOR BETA SUBUNIT PRECURSOR (INTEGRIN BETA- 11 5.2 1) (CD29) (INTEGRIN VLA-4 BETA SUBUNIT) °8 oil479805lpirl'S35458 SNF2 protein homolog - human 88.
„ , 7.0 (fragment) 59 oil5725250lemblCAB52406.1l (AJ245661) G7 protein (Homo 94 . , 8 5.9 sapiens] 65 qil31Q822OlqblAAC62533.11 (AF048986) MutS homolog 5 [Homo sapiens] qil4505253lreflNP 002432.11 mutS (E. coli) homolog 5 qil7512247loirlll65253 disintegrin-like testicular metalíoproteinase (EC 3.4.24.-) IVb - crab-eating macaque (fragment) oil 1043845—IdbjlBAB15248.11 (AK025824) unnamed protein product [Homo sapiens]
| 8 | 6.0 | 92. 87 |
| 8 | 6.0 | 92. 86 |
| lá | 6.6 | 80. 82 |
| 19 | 6.4 | 80. 60 |
65.4e-008 - oil1586344lprfll22034l 1A reeler gene fMus musculus! 10 5.7
99.
3.0Θ-008 - qil4503165lreflNP 003581.11 cullin 3
9.0
88.
81,4e-008 qil66812751reflNP 031934,11 eukaryotic elongation factor-2 kinase
5.2
81.
gil5978795lrefiNP 037079.11 eukaryotic elongation factor 2 kinase
5.1
81.
91.2e-008 - qil7662434lreflNP 055733.11 KIAA0990 proteín
9.5
91.
15,2e-009 - qií7662436lreflNP 055749.11 KIAA0996 proteín
96.
5.8 ~ 68
NOTE:
1, To search aaain using unmatched masses, click the symbol ®.
2. Highly similar proteín sequences were given the samé rank (IE user; click “+ to expand/contract). Input Summary
Dáte & Time Wed Feb 07 10:07:52 2001 UTC (Search Time: 5.88 sec.)
Sample ID EDB Fibronektín, #0824, Bande 7 Database NCBInr [,,\databases\nr|
Taxonomy Mammaiia (mammals)
Category
Protein Mass Ra 80 - 100 kDa nge
Protein pl Range 0.0 -14,0
Search for Single protein only
Digest Chemistry Trypsin Max Mfssed Cut 2
Modificatlons +C3H5ON@C(Partial); +O@M(Partíal);
Chargé State MH+
Peptide Masses (Da.Average)
Tolerance(AVG) 1.00 ppm
881.213 983.479 1222.615 1266.561 1376.698 1422.672 1473.821 Peptide Masses 1479.786 1553.850 1567.725 1639.856 1781.886 1819.830 1915.945 (Da.Monoísotopic 1931.961 1961.051 2019.150 2068.101 2224.061 2283.101 2344.093 ) 2470.201 2501.215 2705.264 2776.358 2840.545 2872.558 3052.493
3143.494 3159.559 3280.571 3298.572
Tolerance(MON) 50.00 ppm
Number of 32 Peptides
ProteoMetrics' ProFound is based on ProFound at The Rockefeller University [search + transmission tíme; >=5.91 ssc]
ZOZNAM SEKVENCII <160> 4 <170> ?=íentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Väzbová sekvencie č. I pre predpokladaný EDB-receptor na molekule EDB <400> 1
Val Asp íle Thr Asp Ser Ser íle Gly Leu Arg Trp Thr Pro Leu 15 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Väzbová sekvencia č. II pre predpokladaný EDB-receptor na molekula EDB <400> 2
Gly Tyr Tyr Thr Val Thr Gly Leu Glu Pro Gly íle Asp Tyr Asp 15 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Väzbová sekvencia č. II pre predpokladaný EDB-receptor na molekule EDE <400> 3
Thr Gly Leu Glu Pro Gly íle Asp Tyr Asp íle Ser Val íle Thr 15 10 15
| <210> 4 | |
| <211> | 91 |
| <212> | PRT |
| <213> | Homo sapiens |
| <400> 4 | |||||||||||||||
| Glu | Val | Pro | Gin | Leu | Thr | Asp | Leu | Ser | Phe | Val | Asp | íle | Thr | Asp | Ser |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Ser | íle | Gly | Leu | Arg | Trp | Thr | Pro | Leu | Asn | Ser | Ser | Thr | íle | íle | Gly |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Tyr | Arg | íle | Thr | Val | Val | Ala | Ala | Gly | Glu | Gly | íle | Pro | íle | Phe | Glu |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Asp | Phe | Val | Asp | Ser | Ser | Val | Gly | Tyr | Tyr | Thr | Val | Thr | Gly | Leu | Glu |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Pro | Gly | íle | Asp | Tyr | Asp | íle | Ser | Va 1 | íle | Thr | Leu | íle | Asn | Gly | Gly |
| 65 | 70 | 75 | 80 |
Glu Ser Ala Pro Thr Thr Leu Thr Gin Gin Thr 85 90 ? f 2.^-2/)0^
Claims (55)
1. Protein,
a) ktorý má schopnosť sa špecificky viazať na EDb-doménu fibronektínu;
b) ktorý je exprimovaný alebo aktivovaný špecificky v endotelových bunkách;
c) ktorý je exprimovaný alebo aktivovaný špecificky v stromových bunkách nádoru;
d) ktorý je exprimovaný alebo aktivovaný špecificky v nádorových bunkách;
e) ktorého väzba na EDb-doménu fibronektínu je inhibovaná polypeptidom; a
f) ktorý má zjavnú molekulovú hmotnosť ľahkého reťazca 120 až 130 kDa a ťažkého reťazca 150 až 160 kDa podľa stanovenia v SDSpolyakrylamidovej gélovej elektroforéze .
2. Protein podľa nároku 1,
a) ktorý má schopnosť sa špecificky viazať na EDb-doménu fibronektínu, pričom väzbový úsek je charakterizovaný najmenej jednou sekvenciou, ktorá je vybraná zo skupiny, ktorá obsahuje sekvencie SEQ ID NO: 1 až 3;
b) ktorý je exprimovaný alebo aktivovaný špecificky v endotelových bunkách;
c) ktorý je exprimovaný alebo aktivovaný špecificky v stromových bunkách nádoru;
d) ktorý je exprimovaný alebo aktivovaný špecificky v nádorových bunkách;
e) ktorého väzba na EDb-doménu fibronektínu je inhibovaná polypeptidom, ktorý obsahuje sekvenciu, ktorá je vybraná zo skupiny obsahujúcej sekvencie SEQ ID NO: 1 až 3; a
f) ktorý má zjavnú molekulovú hmotnosť ľahkého reťazca 120 až 130 kDa a ťažkého reťazca 150 až 160 kDa podľa stanovenia v SDSpolyakrylamidovej gélovej elektroforéze.
3. Proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 2,
a) ktorý má schopnosť sa špecificky viazať na ED^-doménu fibronektínu a ktorý obsahuje a2pi-retazec integrínu;
b) ktorý je exprimovaný alebo aktivovaný špecificky v endotelových bunkách;
c) ktorý je exprimovaný alebo aktivovaný špecificky v stromových bunkách nádoru;
d) ktorý je exprimovaný alebo aktivovaný špecificky·v nádorových bunkách;
e) ktorého väzba na EDb-doménu fibronektínu je inhibovaná polypeptidom, a ktorý obsahuje α-reťazec integrínu; a
f) ktorý má zjavnú molekulovú hmotnosť ľahkého reťazca 120 až 130 kDa a ťažkého reťazca 150 až 160 kDa podľa stanovenia v SDSpolyakrylamidovej gélovej elektroforéze.
4. Proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa rým, že endotelové bunky sú proliferujúce endoteiové bunky.
5. Proteín, ktorého špecifická väzba na EDb-doménu fibronektínu sprostredkováva adhéziu endotelových buniek, buniek stromy nádoru a nádorových buniek.
6. Proteín, ktorého špecifická väzba na EDb-doménu fibronektínu sprostredkováva adhéziu endotelových buniek, buniek stromy nádoru a nádorových buniek, pričom väzbový úsek je charakterizovaný najmenej jednou sekvenciou, ktorá je vybraná zo skupiny obsahu43 júcej sekvencie SEQ ID NO: 1 až 3.
7. Proteín podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že väzbový úsek obsahuje a2hl-reťazec integrinu.
8. Proteín, ktorého špecifická väzba na EDb-doménu fibronektínu indukuje proliferáciu endotelových buniek.
9. Proteín, ktorého špecifická väzba na EDb-doménu fibronektínu indukuje proliferáciu endotelových buniek, pričom väzbový úsek je charakterizovaný najmenej jednou sekvenciou, ktorá je vybraná zo skupiny obsahujúcej sekvencie SEQ ID NO: 1 až 3.
10. Proteín podía nároku 9, vyznačujúci sa tým, že väzbový úsek obsahuje a2Bl-reťazec integrinu.
11. Proteín, ktorého špecifická väzba na EDb-doménu fibronektínu indukuje proliferáciu, migráciu a diferenciáciu endotelových buniek v kolagénovom matrixe.
12. Proteín, ktorého špecifická väzba na EDb-doménu fibronektínu indukuje proliferáciu, migráciu a diferenciáciu endotelových buniek v kolagénovom matrixe, pričom väzbový úsek je charakterizovaný najmenej jednou sekvenciou, ktorá je vybraná zo skupiny obsahujúcej sekvencie SEQ ID NO: 1 až 3.
13. Proteín podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že väzbový úsek obsahuje a2hl-reťazec integrinu.
14. Proteín, ktorý sa viaže na EDb-doménu fibronektínu a indukuje špecifickú dráhu signálnej transdukcie, pričom je indukovaný najmenej jeden gén, ktorý kóduje proteín vybraný zo skupiny obsahuj úcej:
fokálnu adhéznu kinázu,
CD6-ligand (ALCAM), α-reťazec vitronektínového receptora, integrovanú podjednotku alfa 8, a prekurzor/prekurzory proteínu príbuzného follistatinu.
15. Proteín, ktorý sa viaže na EDb-doménu fibronektínu a indukuje špecifickú dráhu signálnej transdukcie, pričom je indukovaný najmenej jeden gén, ktorý kóduje proteín vybraný zo skupiny obsahuj úcej:
fokálnu adhéznu kinázu,
CD6-ligand (ALCAM) , α-reťazec vitronektínového receptora, integrovanú podjednotku alfa 8, a prekurzor/prekurzory proteínu príbuzného follistatinu, pričom väzbový úsek je charakterizovaný najmenej jednou sekvenciou, ktorá je vybraná zo skupiny obsahujúcej sekvencie SEQ ID NO: 1 až 3.
16. Proteín podía nároku 15, vyznačujúci sa tým, že väzbový úsek obsahuje α2β1 reťazec integrínu.
17. Protilátka, ktorá je schopná sa viazať na proteín podía ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10.
18. Protilátka, ktorá je schopná sa viazať na proteín, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je vybraná zo skupiny obsahujúcej sekvencie SEQ ID NO: 1-4.
19. Protilátka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 17 až 18, ktorá je schopná inhibovať účinky, ktoré sú špecifické pre EDb-doménu fibronektínu.
20. Protilátka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 17 až 18, pričom väzba a inhibícia sa uskutočňujú in vitro a/alebo in vivo.
21. Protilátka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 17 až 20, v yznačujúca sa tým, že je monoklonálna alebo rekombinantná protilátka.
22. Protilátka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 17 až 21, v yznačujúca sa tým, že protilátka je scEv-fragment.
23. Bunka, 1 až 10.
ktorá exprimuje proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov
24. Bunka, ktorá exprimuje protilátku ktoréhokoľvek z nárokov 17 až 22 .
25. Fág, ktorý nárokov 17 až 22 exprimuje protilátku podlá ktoréhokoľvek z
26. Spôsob skríningu zlúčenín, ktoré sa viažu na receptor EDb-domény fibronektínu, pričom tento spôsob zahŕňa:
porovnanie odpovede buniek v prítomnosti jednej alebo viacerých týchto zlúčenín s kontrolnou odpoveďou uvedených buniek v neprítomnosti týchto zlúčenín, pričom bunky exprimujú proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10 alebo obsahujú nukleovú kyselinu, ktorá tento proteín kóduje, a pričom odpoveď, prípadne kontrolná odpoveď je sprostredkovaná receptorom EDb-domény fibronektínu.
27. Spôsob podľa nároku 26, vyznačujúci sa tým, že odpoveď, prípadne kontrolná odpoveď obsahuje prilnutie buniek na povrch, ktorý je potiahnutý EDb-doménou fibronektínu alebo jej časťou.
28. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 26 až 27, vyznačujúci sa tým, že väzbový úsek EDb-domény fibronektínu obsahuje sekvencie SEQ ID NO: 1-4 alebo ich časti.
29. Spôsob podľa nároku 26, vyznačujúci sa tým, že odpoveď, prípadne kontrolná odpoveď zahŕňa proliferáciu buniek na povrchu, ktorý je potiahnutý EDb-doménou fibronektínu alebo jej časťami.
30. Spôsob podľa nároku 26, vyznačujúci sa tým, že odpoveď, prípadne kontrolná odpoveď zahŕňa proliferáciu, migráciu a diferenciáciu endotelových buniek v kolagénovom matrixe, ktorý obsahuje EDb-doménu fibronektínu alebo jej časti.
31. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 26 až 30, vyznačujúci sa tým, že zlúčeniny sú vybrané zo skupiny obsahujúcej protilátky, umelé protilátky, fragmenty protilátok, peptidy, nízkomolekulové zlúčeniny, aptaméry a zrkadlové aptaméry.
32. Spôsob podľa nároku 31, vyznačujúci sa tým, že protilátky sú rekombinantné protilátky.
33. Spôsob podlá nároku 31, vyznačujúci sa tým, že protilátky sú vybrané zo skupiny obsahujúcej scFv a je.no fragmenty.
34. Spôsob skríningu zlúčenín, ktoré sa viažu na EDb-doménu fibronektínu, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje:
a) privedenie buniek do kontaktu so stanovenou koncentráciou proteínu, ktorý obsahuje EDb-doménu fibronektínu alebo proteín so sekvenciou uvedenou ako jedna zo sekvencii SEQ ID NO: 1 až 4, v prítomnosti rôznych koncentrácií jednej alebo viacerých zlúčenín; a
b) zistenie rozdielu v odpovedi buniek na proteín, ktorý obsahuje EDb-doménu fibronektínu alebo proteín so sekvenciou uvedenou ako jedna zo sekvencii SEQ ID NO: 1 až 4, v prítomnosti zlúčenín, v porovnaní s kontrolnou odpoveďou buniek na proteín, ktorý obsahuje EDb-doménu fibronektínu alebo proteín so sekvenciou uvedenou ako jedna zo sekvencii SEQ ID NO: 1 až 4, v neprítomnosti týchto zlúčenín, pričom bunky exprimujú proteín podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10 alebo obsahujú nukleovú kyselinu, ktorá kóduje tento proteín, a pričom odpoveď, prípadne kontrolná odpoveď je sprostredkovaná receptorom EDb-domény fibronektínu.
35. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že odpoveď, prípadne kontrolná odpoveď zahŕňa priir.utie buniek na povrch, ktorý je potiahnutý EDb-doménou fibronektínu alebo jej časťami.
36. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že odpoveď, prípadne kontrolná odpoveď zahŕňa proliferáciu buniek na povrchu, ktorý je potiahnutý EDb-doménou fibronektínu alebo jej časťami.
37. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že odpoveď, prípadne kontrolná odpoveď zahŕňa proliferáciu, migráciu a diferenciáciu endotelových buniek v kolagénovcm matrixe, ktorý obsahuje EDb-doménu fibronektínu alebo jej časti.
38. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 34 až 37, vyznačujúci sa tým, že zlúčeniny sú vybrané zo skupiny obsahujúcej protilátky, umelé protilátky, fragmenty protilátok, peptidy, nizkomolekulové zlúčeniny, aptaméry a zrkadlové aptaméry.
39. Použitie nukleovej kyseliny, ktorá kóduje proteín obsahujúci sekvenciu vybranú zo skupiny, ktorá obsahuje sekvenciu SEQ ID NO: 1 až 4, na skríning zlúčenín, ktoré sa viažu na receptor EDbdomény fibronektínu alebo EDb-doménu fibronektínu.
40. Použitie proteínu podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10 alebo protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 17 až 22 na skríning zlúčenín, ktoré sa viažu na receptor EDb-domény fibronektínu alebo EDb-doménu fibronektínu.
41. Použitie bunky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 23 až 24 na skríning zlúčenín, ktoré sa viažu na receptor EDb-doménv fibronektínu alebo EDb-doménu fibronektínu.
42. Použitie nukleovej kyseliny, ktorá kóduje proteín obsahujúci sekvenciu vybranú zo skupiny, ktorá obsahuje sekvencie SEQ ID NO: 1 až 4, na vývoj protilátok alebo scEv-ŕúznych proteínov na diagnostické alebo terapeutické účely.
43. Použitie proteínu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10 na vývoj protilátok alebo scFv-fúznych proteínov na diagnostické alebo terapeutické účely.
44. Použitie bunky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 23 až 24 na vývoj protilátok alebo scEv-f úznyc'n proteínov na diagnostické alebo terapeutické účely.
45. Použitie fága podľa nároku 25 na vývoj protilátok alebo scEv-fúznych proteinov na diagnostické alebo terapeutické účely.
46. Použitie proteinu, ktorý obsahuje sekvenciu vybranú zo skupiny obsahujúcej sekvencie SEQ ID NO: 1 až 4, na pro-angiogenetickú terapiu.
47. Použitie proteinu, ktorý obsahuje sekvenciu vybranú zo skupiny obsahujúcej sekvencie SEQ ID NO: 1 až 4, na diagnostické účely.
48. Použitie proteinu, ktorý obsahuje sekvenciu vybranú zo skupiny obsahujúcej sekvencie SEQ ID NO: 1 až 4, na génovú terapiu.
49. Použitie proteinu, ktorý obsahuje sekvenciu vybranú zo skupiny obsahujúcej sekvencie SEQ ID NO: 1 až 4, na poťahovanie povrchov, na ktoré sa viažu endotelové bunky.
50. Použitie podía nároku 49, kde poťahovanie prebieha in vitro alebo in vivo.
51. Použitie proteinu, ktorý obsahuje sekvenciu skupiny obsahujúcej sekvencie SEQ ID NO: 1 až 4, kultúry.
vybranú zo na bunkové
52. Použitie proteinu, ktorý skupiny obsahujúcej sekvencie s aspoň jedným transplantátom.
obsahuje sekvenciu SEQ ID NO: 1 až vybranú zo 4, spoločne
53. Použitie podía nároku 52, keď transplantát je vybraný zo skupiny, ktorá obsahuje cievy, kožu, rohovku, obličky, pečeň, kostnú dreň, srdce, plúca, kosti, týmus, tenké črevo, pankreas, a ďalšie vnútorné orgány vrátane ich častí alebo ich buniek.
54. Použitie proteínu, ktorý obsahuje sekvenciu vybranú zo skupiny obsahujúcej sekvencie SEQ ID NO: 1 až 4, spoločne s aspoň jedným implantátom.
55. Použitie podľa nároku 54, keď implantát je vybraný zo skupiny, ktorá obsahuje pľúcne implantáty, kardiostimulátor, umelú srdcovú chlopňu, cievne implantáty, endoprotézy, skrutky, dlahy, doštičky, drôty, klince, tyče, umelé kĺby, prsné implantáty, umelé lebečné kosti, umelé zuby, zubné výplne a zubné mostíky.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10045803A DE10045803A1 (de) | 2000-09-07 | 2000-09-07 | Rezeptor der EDb Fibronektin-Domäne |
| DE2001123133 DE10123133A1 (de) | 2001-05-02 | 2001-05-02 | Rezeptor der ED¶b¶-Fibronektin-Domäne (II) |
| PCT/EP2001/010016 WO2002020563A2 (de) | 2000-09-07 | 2001-08-30 | REZEPTOR DER EDb-FIBRONEKTIN-DOMÄNE (II) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK2882003A3 true SK2882003A3 (en) | 2003-08-05 |
Family
ID=26007070
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK288-2003A SK2882003A3 (en) | 2000-09-07 | 2001-08-30 | Receptor in the EDb fibronectin domain |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US20020197700A1 (sk) |
| EP (1) | EP1381629B1 (sk) |
| JP (1) | JP2004529848A (sk) |
| KR (1) | KR20030045056A (sk) |
| CN (1) | CN1246333C (sk) |
| AT (1) | ATE407951T1 (sk) |
| AU (1) | AU1218202A (sk) |
| BG (1) | BG107614A (sk) |
| BR (1) | BR0113737A (sk) |
| CA (1) | CA2421783A1 (sk) |
| DE (1) | DE50114321D1 (sk) |
| EE (1) | EE200300092A (sk) |
| ES (1) | ES2312478T3 (sk) |
| HK (1) | HK1064683A1 (sk) |
| HR (1) | HRP20030263A2 (sk) |
| HU (1) | HUP0300935A3 (sk) |
| IL (1) | IL154778A0 (sk) |
| NO (1) | NO20031033L (sk) |
| NZ (1) | NZ524342A (sk) |
| PL (1) | PL364358A1 (sk) |
| RU (1) | RU2280254C2 (sk) |
| SK (1) | SK2882003A3 (sk) |
| WO (1) | WO2002020563A2 (sk) |
| YU (1) | YU17503A (sk) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2400622A1 (en) | 2000-02-24 | 2001-08-30 | Eidgenossische Technische Hochschule Zurich | Antibody specific for the ed-b domain of fibronectin, conjugates comprising said antibody, and their use for the detection and treatment of angiogenesis |
| US7785591B2 (en) * | 2004-10-14 | 2010-08-31 | Morphosys Ag | Identification and characterization of function-blocking anti-ED-B-fibronectin antibodies |
| DE502005009389D1 (de) | 2005-11-09 | 2010-05-20 | Morphosys Ag | Identifizierung und charakterisierung von funktionsblockierenden anti-ed-b-fibronektin antikörpern |
| EP1892248A1 (en) * | 2006-08-21 | 2008-02-27 | Eidgenössische Technische Hochschule Zürich | Specific and high affinity binding proteins comprising modified SH3 domains of FYN kinase |
| ES2609813T3 (es) | 2007-04-02 | 2017-04-24 | Philogen S.P.A. | Antígeno nuevo asociado con la neovasculatura de metástasis tumorales |
| US10202442B2 (en) | 2007-07-25 | 2019-02-12 | Philogen S.P.A. | Antigen associated with lung cancers and lymphomas |
| AU2008317941B2 (en) * | 2007-10-30 | 2015-01-22 | Philogen S.P.A. | An antigen associated with rheumatoid arthritis |
| ES2382058T3 (es) * | 2008-01-17 | 2012-06-04 | Philogen S.P.A. | Combinación de una proteína de fusión de un anticuerpo dirigido contra el EDB de la fibronectina-IL-2, y una molécula de unión a los linfocitos B, progenitores de los linfocitos B y/o sus homólogos cancerosos |
| EP2947096B1 (en) | 2009-08-05 | 2018-11-28 | Philogen S.p.A. | Targeting of bone marrow neovasculature |
| MX364535B (es) | 2012-10-03 | 2019-04-29 | Philogen Spa | Antígenos asociados con enfermedad inflamatoria del intestino. |
| EP3689903A4 (en) * | 2017-09-30 | 2022-01-12 | Hefei Lifeon Pharmaceutical Co. Ltd. | FIBRONECTIN B DOMAIN BINDING PROTEIN |
Family Cites Families (53)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4341223A (en) * | 1981-02-04 | 1982-07-27 | Lutz Lauralee A | Fluoresceable composition and method of determining fluid flow |
| US4741900A (en) * | 1982-11-16 | 1988-05-03 | Cytogen Corporation | Antibody-metal ion complexes |
| US5576195A (en) * | 1985-11-01 | 1996-11-19 | Xoma Corporation | Vectors with pectate lyase signal sequence |
| US5243029A (en) * | 1986-04-09 | 1993-09-07 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Oncofetal structure of fibronectin |
| US4894326A (en) * | 1986-04-09 | 1990-01-16 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Monoclonal antibody defining oncofetal structure of fibronectin |
| EP0330506A3 (en) * | 1988-02-26 | 1990-06-20 | Dana Farber Cancer Institute | Vla proteins |
| US5177015A (en) * | 1988-08-12 | 1993-01-05 | Fred Hutchinson Cancer Research Centre | Onco-developmentally regulated α-N-acetylgalactosaminyltransferase |
| US5270030A (en) * | 1988-12-29 | 1993-12-14 | Bio-Technology General Corp. | Fibrin binding domain polypeptide and method of producing |
| WO1991001754A1 (en) * | 1989-08-09 | 1991-02-21 | Rhodes Buck A | Direct radiolabeling of antibodies and other proteins with technetium or rhenium |
| US5460785A (en) * | 1989-08-09 | 1995-10-24 | Rhomed Incorporated | Direct labeling of antibodies and other protein with metal ions |
| US5120830A (en) * | 1990-10-25 | 1992-06-09 | Washington University | Inhibitory peptides against α-2, β-1 mediated mg++ dependent adhesion of platelets to collagen |
| US5629291A (en) * | 1992-01-31 | 1997-05-13 | La Jolla Cancer Research Foundation | Methods of modulating fibronectin extracellular matrix assembly |
| DE69334255D1 (de) * | 1992-02-06 | 2009-02-12 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Marker für Krebs und biosynthetisches Bindeprotein dafür |
| US6093399A (en) * | 1992-03-05 | 2000-07-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for the specific coagulation of vasculature |
| US6004555A (en) * | 1992-03-05 | 1999-12-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for the specific coagulation of vasculature |
| US5965132A (en) * | 1992-03-05 | 1999-10-12 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors |
| US6036955A (en) * | 1992-03-05 | 2000-03-14 | The Scripps Research Institute | Kits and methods for the specific coagulation of vasculature |
| US6749853B1 (en) * | 1992-03-05 | 2004-06-15 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Combined methods and compositions for coagulation and tumor treatment |
| US5877289A (en) * | 1992-03-05 | 1999-03-02 | The Scripps Research Institute | Tissue factor compositions and ligands for the specific coagulation of vasculature |
| US5976535A (en) * | 1992-06-09 | 1999-11-02 | Neorx Corporation | Pretargeting protocols for the enhanced localization of cytotoxins to target sites and cytotoxic combinations useful therefore |
| CA2123699C (en) * | 1992-09-25 | 1999-12-07 | Takashi Komai | An adsorbent for cellular fibronectin, a method for fractional purification of fibronectin and a method of hemocatharisis |
| JP3339724B2 (ja) * | 1992-09-29 | 2002-10-28 | 株式会社リコー | インクジェット記録方法及びその装置 |
| US5491130A (en) * | 1992-11-10 | 1996-02-13 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Peptide inhibitors of fibronectin and related collagen-binding proteins |
| GB9324807D0 (en) * | 1993-12-03 | 1994-01-19 | Cancer Res Campaign Tech | Tumour antibody |
| US6015897A (en) * | 1993-12-07 | 2000-01-18 | Neorx Corporation | Biotinamido-n-methylglycyl-seryl-o-succinamido-benzyl dota |
| US5523229A (en) * | 1994-03-22 | 1996-06-04 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Antibodies specific for oncofetal fibronectin |
| DE4417865A1 (de) * | 1994-05-20 | 1995-11-23 | Behringwerke Ag | Kombination von Tumornekrose-induzierenden Substanzen mit Substanzen, die durch Nekrosen aktiviert werden, zur selektiven Tumortherapie |
| US5648485A (en) * | 1994-10-26 | 1997-07-15 | University Of British Columbia | β, β-dihydroxy meso-substituted chlorins, isobacteriochlorins, and bacteriochlorins |
| DE4445065A1 (de) * | 1994-12-07 | 1996-06-13 | Diagnostikforschung Inst | Verfahren zur In-vivo-Diagnostik mittels NIR-Strahlung |
| WO1997002479A2 (en) * | 1995-06-30 | 1997-01-23 | Yale University | Human monoclonal anti-tumor antibodies |
| US5808146A (en) * | 1995-11-09 | 1998-09-15 | Emory University | Amino acid analogs for tumor imaging |
| GB9610967D0 (en) * | 1996-05-24 | 1996-07-31 | Cambridge Antibody Tech | Specific binding members,materials and methods |
| US5913884A (en) * | 1996-09-19 | 1999-06-22 | The General Hospital Corporation | Inhibition of fibrosis by photodynamic therapy |
| US5842156A (en) * | 1996-11-12 | 1998-11-24 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force | Multirate multiresolution target tracking |
| GB9722131D0 (en) * | 1997-10-20 | 1997-12-17 | Medical Res Council | Method |
| US6394952B1 (en) * | 1998-02-03 | 2002-05-28 | Adeza Biomedical Corporation | Point of care diagnostic systems |
| US6267722B1 (en) * | 1998-02-03 | 2001-07-31 | Adeza Biomedical Corporation | Point of care diagnostic systems |
| US6296831B1 (en) * | 1998-04-10 | 2001-10-02 | Battelle Memorial Institute | Stimulus sensitive gel with radioisotope and methods of making |
| US5997842A (en) * | 1998-04-13 | 1999-12-07 | Light Sciences Limited Partnership | Radionuclide excited phosphorescent material for administering PDT |
| US6852318B1 (en) * | 1998-05-08 | 2005-02-08 | The Regents Of The University Of California | Methods for detecting and inhibiting angiogenesis |
| US20030176663A1 (en) * | 1998-05-11 | 2003-09-18 | Eidgenossische Technische Hochscule | Specific binding molecules for scintigraphy |
| TWI259837B (en) * | 1998-05-11 | 2006-08-11 | Eidgenossische Tech Hochscule | Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis |
| US20030045681A1 (en) * | 1998-05-11 | 2003-03-06 | Anthony J. Zelano | Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis |
| US6630570B1 (en) * | 1999-04-09 | 2003-10-07 | Insitut für Diagnostikforschung GmbH | Short-chain peptide-dye conjugates as contrast media for optical diagnosis |
| US6171578B1 (en) * | 1999-04-14 | 2001-01-09 | Diatide, Inc. | Benzodiazepine derivatives for imaging thrombi |
| ATE269357T1 (de) * | 1999-04-28 | 2004-07-15 | Univ Texas | Zusammensetzungen und verfahren zur krebsbehandlung durch die selektive hemmung von vegf |
| AU2001227837A1 (en) * | 2000-01-12 | 2001-07-24 | Light Sciences Corporation | Novel treatment for eye disease |
| EP1719528B1 (en) * | 2000-02-24 | 2011-09-28 | Philogen S.p.A. | Compositions and methods for treatment of angiogenesis in pathological lesions |
| US6342326B1 (en) * | 2000-05-10 | 2002-01-29 | Beckman Coulter, Inc. | Synthesis and use of acyl fluorides of cyanine dyes |
| JP2005505242A (ja) * | 2001-03-07 | 2005-02-24 | マンカインド コーポレイション | 癌用抗新生血管系調製物 |
| WO2003008537A2 (en) * | 2001-04-06 | 2003-01-30 | Mannkind Corporation | Epitope sequences |
| EP1461360B1 (en) * | 2002-01-03 | 2010-08-18 | Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft | Conjugates comprising an antibody specific for the ed-b domain of fibronectin and their use for the detection and treatment of tumours |
| AR040956A1 (es) * | 2002-07-31 | 2005-04-27 | Schering Ag | Nuevos conjugados de efectores, procedimientos para su preparacion y su uso farmaceutico |
-
2001
- 2001-08-30 EE EEP200300092A patent/EE200300092A/xx unknown
- 2001-08-30 SK SK288-2003A patent/SK2882003A3/sk unknown
- 2001-08-30 IL IL15477801A patent/IL154778A0/xx unknown
- 2001-08-30 YU YU17503A patent/YU17503A/sh unknown
- 2001-08-30 CA CA002421783A patent/CA2421783A1/en not_active Abandoned
- 2001-08-30 RU RU2003109431/13A patent/RU2280254C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-08-30 KR KR10-2003-7003340A patent/KR20030045056A/ko active IP Right Grant
- 2001-08-30 NZ NZ524342A patent/NZ524342A/en unknown
- 2001-08-30 WO PCT/EP2001/010016 patent/WO2002020563A2/de active IP Right Grant
- 2001-08-30 DE DE50114321T patent/DE50114321D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-30 EP EP01980305A patent/EP1381629B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-30 PL PL01364358A patent/PL364358A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2001-08-30 AT AT01980305T patent/ATE407951T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-08-30 US US09/942,117 patent/US20020197700A1/en not_active Abandoned
- 2001-08-30 BR BR0113737-9A patent/BR0113737A/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-08-30 ES ES01980305T patent/ES2312478T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-30 AU AU1218202A patent/AU1218202A/xx active Pending
- 2001-08-30 CN CNB018153461A patent/CN1246333C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-08-30 HU HU0300935A patent/HUP0300935A3/hu unknown
- 2001-08-30 JP JP2002525182A patent/JP2004529848A/ja active Pending
-
2003
- 2003-03-06 BG BG107614A patent/BG107614A/bg unknown
- 2003-03-06 NO NO20031033A patent/NO20031033L/no not_active Application Discontinuation
- 2003-04-07 HR HR20030263A patent/HRP20030263A2/hr not_active Application Discontinuation
- 2003-10-02 US US10/676,049 patent/US20050089941A1/en not_active Abandoned
-
2004
- 2004-09-28 HK HK04107490A patent/HK1064683A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-04-14 US US11/105,475 patent/US20050221434A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20020197700A1 (en) | 2002-12-26 |
| CN1246333C (zh) | 2006-03-22 |
| NZ524342A (en) | 2005-09-30 |
| BG107614A (bg) | 2003-12-31 |
| HK1064683A1 (en) | 2005-02-04 |
| ATE407951T1 (de) | 2008-09-15 |
| JP2004529848A (ja) | 2004-09-30 |
| NO20031033L (no) | 2003-05-07 |
| YU17503A (sh) | 2006-05-25 |
| DE50114321D1 (de) | 2008-10-23 |
| ES2312478T3 (es) | 2009-03-01 |
| RU2003109431A (ru) | 2005-01-20 |
| WO2002020563A2 (de) | 2002-03-14 |
| EP1381629B1 (de) | 2008-09-10 |
| RU2280254C2 (ru) | 2006-07-20 |
| US20050221434A1 (en) | 2005-10-06 |
| PL364358A1 (en) | 2004-12-13 |
| NO20031033D0 (no) | 2003-03-06 |
| EP1381629A2 (de) | 2004-01-21 |
| AU1218202A (en) | 2002-03-22 |
| HRP20030263A2 (en) | 2005-10-31 |
| US20050089941A1 (en) | 2005-04-28 |
| HUP0300935A3 (en) | 2005-09-28 |
| HUP0300935A2 (hu) | 2003-12-29 |
| EE200300092A (et) | 2005-06-15 |
| KR20030045056A (ko) | 2003-06-09 |
| BR0113737A (pt) | 2004-02-25 |
| CN1487953A (zh) | 2004-04-07 |
| WO2002020563A3 (de) | 2003-10-09 |
| IL154778A0 (en) | 2003-10-31 |
| CA2421783A1 (en) | 2002-03-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5641869A (en) | Method for purifying heregulin | |
| US20050221434A1 (en) | Receptor of the EDb-fibronectin domains | |
| US5367060A (en) | Structure, production and use of heregulin | |
| US5859206A (en) | Antibodies specific for heregulin 2-α | |
| US5607918A (en) | Vascular endothelial growth factor-B and DNA coding therefor | |
| Roach et al. | Preparation of a monoclonal antibody specific for the class I isotype of β‐tubulin: The β isotypes of tubulin differ in their cellular distributions within human tissues | |
| Baciu et al. | Syndesmos, a protein that interacts with the cytoplasmic domain of syndecan-4, mediates cell spreading and actin cytoskeletal organization | |
| JPH09507750A (ja) | Ｗｎｔ−ｘ増殖因子をコードするＤＮＡ | |
| JP2002517182A (ja) | インテグリンヘテロ二量体およびそのサブユニット | |
| WO2001049743A9 (en) | Methods of modulation of the immune system | |
| EP1636251A2 (en) | Ccn1 compositions and methods | |
| US20060240002A1 (en) | Methods of inhibiting angiogenesis-dependent conditions mediated by cryptic epitopes of extracellular matrix components | |
| ZA200302629B (en) | Receptor in the EDb fibronectin domain. | |
| EP1490400A2 (en) | Tenascin-w compositions and uses thereof | |
| US20060216236A1 (en) | Methods of inhibiting alphavBeta3-mediated angiogenesis and tumor development | |
| WO1998037195A9 (en) | Morphogenic proteins | |
| Kemp | Focal adhesion kinase signalling in endothelial cells | |
| McFall | Molecular interactions of the extracellular protein domain of syndecan-4 | |
| Stoletov | Role of Nck and Crk adapter proteins in the VEGF promoted endothelial cell migration | |
| WO2006098987A2 (en) | Methods of inhibiting angiogenesis and tumor development |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FB9A | Suspension of patent application procedure |