KR0151105B1 - 단백질의 직접적 방사선 라벨링 방법 - Google Patents

단백질의 직접적 방사선 라벨링 방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]
단백질의 직접적 방사선라벨링 방법
[발명의 배경]
본 발명은 내인성 리간드로서 하나 이상의 펜던트(pendant) 설프하이드릴 그룹을 사용하고, 임의로, 방사선 금속 이온에 단단히 결합하여 킬레이트를 더욱 안정화시키는 외인성 리간드를 사용하여, 설프하이드릴 그룹과 단단하게 결합하는 방사선핵종의 방사선금속 이온으로 단백질을 직접 방사선라벨링하는 방법 및 키트에 관한 것이다.
환원된 과테크네튬산염으로부터의 Tc-99m, Re-186 및 Re-188 이온, Cu-67 이온, Hg-197 이온 및 Bi-212 이온을 포함한 특정의 방사선금속이 황 리간드에 단단하게 결합한다는 것이 공지되었다. 이들 방사선금속의 몇몇은 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA)와 같은 공역 킬레이트 그룹 또는 비스-티오세미카바존 등과 같은 여러가지 황/질소(S2N2) 킬레이터를 사용하여 단백질, 특히 항체 또는 항체 단편에 결합된다.
단백질을 예비주석화(pre-tinning)시키고 생성된 물질을 과테크네튬산염과 접촉시킴으로써 Tc-99m 이온을 항체에 직접적으로 결합시키는 방법이 기술되었다.
이러한 방법은 수행하기가 용이하지 않고 몇몇의 방사선금속은 혈액 및 다른 체액 또는 조직의 존재하에 비교적 불안정한 부위에 결합된다. 예비 주석화 방법의 기작은 널리 인지되지 않았고 불안정한 라벨링 부위가 형성되는 이유는 규명되지 않고 있다.
디설파이드 결합 함유 단백질을 환원시켜 펜던트 설프하이드릴 그룹을 수득할 수 있다는 것 또한 공지되어 있다. 디설파이드 결합이 그들 자체가 결합되지 않은 폴리펩타이드 쇄, 예를 들어 항체 경쇄/중쇄를 연결하는 경우, 이의 환원적 분해는 단백질을 더 작은 단편으로 분리시킬 수 있다. 이러한 예는 시스테인, 디티오트레이톨, 머캅토에탄올 등과 같은 디설파이드 환원제를 사용하여 항체 F(ab')2단편을 환원적으로 분해하여 Fab' 단편을 형성하는 것이다.
단백질의 직접적인 라벨링은 킬레이트 결합체가 형성되지 않는 장점을 갖는다. 그러나, 이러한 방사선라벨링된 단백질을 항체-표적화된 종양 영상화 및 치료와 같이 생체내에서 사용하기 위한 시도는, 다른 기관으로 라벨이 손실되어 이러한 기관내에 라벨이 보유됨으로써 특정 형태의 영상화에 있어 높은 배경값 및 간, 비장 및 신장과 같은 기관으로부터 라벨의 지연적 제거를 유발하는 문제점을 드러낸다. 후자의 문제는 고도의 방사의 영향을 받은 기관의 심각한 손상에 기인하여 치료환자에게 간발증 및/또는 신발증을 차례로 유발시킬 수 있다.
혈액 및 다른 체액 및 조직의 존재하에서 라벨을 보유하는 고수율의 안정한 방사선라벨링된 생성물을 수득하기 위한 단백질의 직접적인 방사선라벨링 방법의 필요성이 지속적으로 있어왔다.
[본 발명의 목적]
따라서, 본 발명의 한가지 목적은, 단백질에 방사선핵종의 이온에 대한 킬레이터를 결합할 필요가 없이 방사선금속으로 단백질을 직접 방사선라벨링시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 단백질상에서 설프하이드릴-결합된 방사선금속 이온을 좀더 안정화시키기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 부산물에 의해 최소한으로 오염된 라벨링된 생성물을 고수율로 생성시키는, 단백질의 방사선 라벨링 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 Tc-99m을 항체 또는 항체 단편에 도입시키는데 사용하기 위한 편리하고 효과적인 방사선 라벨링 방법 및 키트를 제공하는 것이다.
명세서 및 청구범위의 추가의 조사에 의해, 본 발명의 다른 목적 및 장점이 본 분야의 숙련가에게 명백해질 것이다.
[발명의 요약]
상기 목적은, 하나 이상의 펜던트 설프하이드릴 그룹을 함유하는 단백질 용액을 설프하이드릴 그룹에 단단하게 결합되는 방사선핵종의 방사선금속 이온의 용액과 접촉시키고, 생성된 방사선라벨링된 단백질의 용액을 회수하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 단백질을 방사선라벨링시키는 방법을 제공함으로써 수행된다.
바람직한 태양은 본 발명의 방법을 적용시켜 방사선 라벨링된 항체 또는 항체 단편, 특히 Fab 및 Fab' 단편을 제조하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 핵의학 의사가 적용할 수 있는 단순한 방법으로 Tc-99m을 사용하여 단백질, 특히 항체 단편을 라벨링하는 적용에 유리하다.
본 발명은 또한 방사선라벨링된 단백질 및 본 발명의 라벨링 방법을 수행하기 위한 키트, 특히 Tc-99m-라벨링된 항체 및 항체 단편 및 이의 제조를 위한 키트를 제공한다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명자들은, 유리 펜던트 설프하이드릴 그룹을 갖는 단백질, 예를 들면 항체 또는 항체 단편이 선택적으로 방사선 금속이온과 결합하여, 혈액 및 다른 체액 및 조직에서 매우 안정한 설프하이드릴 그룹에 대한 단단한 결합을 형성할 수 있다는 것을 밝혀내었다. Tc-99m 라벨링을 수행하는데 있어서 F(ab')2항체 단편으로 예비-주석화 방법을 반복적으로 시도하였지만 성공하지 못하였다. 또한, Tc-99m 라벨 혼입의 실패는 예비주석화된 물질내에 유리 설프하이드릴 그룹을 함유하는 1가 단편의 부재와 관련되어 있음이 밝혀졌다. F(ab)2단편을 시스테인으로 환원시키고, 짧은 사이징 겔 컬럼상에서 과량의 환원제를 분리한후, 수득된 Fab'-SH 단편을 환원된 과테크네튬산염에 가하면, 환원된 과테크네튬산염 모두가 Fab'-SH에 결합되었다.
하나 이상의 유리 설프하이드릴 그룹을 함유하는 분해된 F(ab')2단편은 본원에서 Fab'-SH란 용어로 나타낸다. 분해된 F(ab')2는 Fab-SH란 용어로 나타내고, 하나 이상의 유리 설프하이드릴 그룹을 함유하는 분해된 전체 면역글로불린은 Fabc'-SH란 용어로 나타내며, 이는 설프하이드릴 그룹을 형성하고 Y-형 분자의 반쪽 2개를 2개의 경쇄/중쇄 단편으로 분리시키면서, 항체의 중쇄를 연결하는 디설파이드 결합이 완전히 분해됨을 의미한다. 중쇄를 연결하는 디설파이드 결합의 수보다 적은 유리 설프하이드릴 그룹이 형성되는 전체 면역글로불린 또는 단편의 불완전한 환원 또는 단백질내로 설프하이드릴 그룹의 도입은, 부분적으로 분해되거나 유도된 종에 대한 약어에 SH를 붙여 표현한다. 따라서, 온전한 IgG 보다 유리 설프하이드릴 그룹의 수가 더 적은 부분적으로 환원된 IgG를 IgG-SH로 나타낼 것이다. 하나 이상의 펜던트 설프하이드릴 그룹을 갖는 가장 일반적인 단백질의 경우의 단백질은 Prot-SH로 나타낼 것이다.
본 발명의 라벨링 방법 및 키트는 방사선금속을 특징 단백질에 결합시키는데 사용할 수 있다. 설프하이드릴 그룹을 함유하는 이들 단백질은 직접적으로 라벨링될 수 있다. 시스테인 잔기를 통하여 통상적으로 결합된, 디설파이드 그룹을 함유하는 단백질은 환원제로 처리되어 설프하이드릴 그룹을 형성할 수 있다. 디설파이드 결합이 연속적이지 않은 폴리펩타이드 쇄를 연결하는 경우, 단백질의 분해를 초래할 수 있거나, 디설파이드 결합이 단일 폴리펩타이드 쇄의 먼 절편를 연결하는 경우 가능하게는 단백질의 구조 변화를 수반하는, 쇄 분리를 초래할 수 있다. 설프하이드릴 그룹은 통상의 방법, 예를 들어, 이미노티올란과 같은 트라우트(Traut) 시약을 사용하거나, 문헌[참고문헌: Blattler et al., Biochem., 24 : 1517-1524, 1985]에 기술된 바와 같은 통상의 방법을 사용하여 폴리펩타이드 쇄내로 도입할 수 있다.
알부민, 효소, 호르몬, 면역 조절제 등과 같은 단백질 또한 라벨링시킬 수 있지만 본 발명의 방법은 항체 및 항체 단편을 라벨링시키는데 있어 특히 적합하다. 항체는 중쇄를 연결하는 디설파이드 결합 하나 이상 및 경쇄와 중쇄를 함께 연결시키는 디설파이드 결합을 함유한다. 후자의 디설파이드 결합은 정상적으로 디설파이드 환원제에 대해 덜 허용적이고 중쇄를 연결하는 결합은 통상적으로 선택적으로 분해될 수 있다. 생성된 단편은 항원에 대한 이의 면역특이성 및 결합력을 갖는다. 면역글로불린의 중쇄를 연결하는 디설파이드 결합의 환원은 환원조건이 너무 강렬하거나 환원제를 너무 장기간 동안 단편과 접촉한 상태로 방치하는 경우, 경쇄 및 중쇄를 연결하는 통상적으로 덜 반응성인 디설파이드 결합이 실질적으로 환원될 것이기 때문에 조심스럽게 수행되어야 한다.
방사선라벨링되는 항체 또는 항체 단편은, 이로써 제한되지는 않으나 종양, 감염성 병변, 심근경색, 아테롬성 동맥경화 반점 또는 정상적인 기관 또는 조직에 의해 생성되거나 이와 관련된 항원을 포함하는 항원과 결합하는 항체일 수 있다.
본 발명의 방법은 설프하이드릴-함유 1가 항체 단편, 즉, Fab-SH 또는 Fab'-SH를 방사선 라벨링하는데 특히 적합한데, 이는 이들이 2가 F(ab)2또는 F(ab')2단편을 예를 들어 시스테인, 디티오트레이톨, 2-머캅토에탄올, 디티오나이트 등과 같은 적절한 통상의 디설파이드 환원제로 환원적으로 분해시켜 수득할 수 있기 때문이다. 환원은 바람직하게는 불활성 가스 대기하에 pH 5.5 내지 9.5, 바람직하게는 6.0 내지 6.8, 더욱 바람직하게는 6.1 내지 6.4에서 시트레이트, 아세테이트 또는 포스페이트 완충액 중에서 수행된다. 더 높은 pH에서 환원반응이 급속하게 진행되나, 재산화반응 또한 급속하고, 최적 pH는 환원반응이 적합하게 신속히 진행되나 티올 환원제와 혼합된 디설파이드의 형성을 포함하여 재산화반응이 무시할 수 있는 정도로 발생하는 pH이다. 면역글로불린 단백질의 중쇄/중쇄 디설파이드 결합과 경쟁하여 경쇄/중쇄 디설파이드 결합을 환원시키는 지나치게 강력한 환원제를 사용하지 않도록 주의해야만 한다. 시스테인은 이러한 디설파이드 환원에 대해 바람직하고 시스테인과 유사한 산화능력을 갖는 다른 티올 또한 유리하게 사용될 것이다. 디설파이드 환원제 대 단백질의 비율은 쇄간 디설파이드 결합 안정성의 함수이고 각각의 경우에 대해 최적화되어야 한다. F(ab')2항체 단편의 분해는 10 내지 20mM의 시스테인 및 약 10㎎/ml의 단백질로 유리하게 수행된다.
Fab-SH 또는 Fab'-SH 단편은 동일계내에서 생성될 수 있으며 생성 용액, 바람직하게는 단편은 직접적으로 저분자량 종을 포획하는 짧은 사이징 겔 컬럼을 통과시키는 것이 바람직하다. 이러한 적합한 사이징 겔 컬럼은 예를 들어 세파덱스 G-25, G-50(Pharmacia)과 같은 덱스트란, 프락토겔 (Fractogel) TSK HW55(EM Science), P-4, P-6(BioRad)와 같은 폴리아크릴아미드를 포함한다.
분해를, 예를 들어 크기 배제 HPLC로 모니터링하여 일반적으로 디설파이드 분해에 대해 영향을 덜 받게 되는 경쇄/중쇄 분해를 최소화하며 Fab 또는 Fab' 단편이 최적 정도로 제조되도록 조건을 조절할 수 있다. 그런 다음 사이징 겔 컬럼으로부터 용출물을 라벨링에 사용하기 위한 방사선 금속이온의 용액내로 통과시킨다. 또다른 방도로서, Fab-SH 또는 Fab'-SH를 저온에서, 예를 들어 냉장고에서 유리하게는 불활성 가스 대기, 즉, 질소 또는 아르곤하에, 바람직하게는 pH 3.5 내지 5.5, 더욱 바람직하게는 pH 4.5 내지 5.0에서 수일 내지 수주 동안 보관할 수 있다.
용이하게 보관 및 안정화시키기 위해 Fab-SH 또는 Fab'-SH를 동결건조시키는 것이 편리하다. 이는 유리하게는 응집을 예방하기 위한 안정화제, 예를 들어 트레할로우즈 또는 슈크로우즈와 같은 당의 존재하에 휘발성 완충액, 즉, 암모늄 아세테이트의 용액으로부터 약 pH 5.5에서 수행한다. 이러한 동결건조 조건은 통상적이고 통상의 숙련가에게 널리 공지되어 있다. 항체 단편의 용액은 또한 동결될 수 있고 사용하기 전에 해동시키나, 이는 단백질의 재산화 및 응집의 큰 위험을 수반한다.
2가 단편의 이의 1가 성분으로 분해에 의한 설프하이드릴 그룹의 동일계 형성, 및 생성된 티올-함유 단백질의 분리를 또한 스핀 컬럼을 사용하여 수행할 수 있다. 스핀 컬럼은 짧은 겔-충진된 컬럼으로서, 이는 주사기 형태로서, 다음 단계를 위해 컬럼 용출물이 니들을 통하여 용기로 진행되도록 하는데 사용할 수 있는 니들 어뎁터가 장착되는 것이 바람직하다. 스핀 컬럼을 원심분리하면 공극 용적을 나타낼 수 있다.
스핀 컬럼 기술에서 사용될 수 있는 사이징 겔 컬럼은, 예를 들어 세파덱스(Sephadex) G-25, G-50(Pharmacia)와 같은 덱스트란, 프락토겔(Fractogel) TSK HW55(EM Science), P-4, P-6(BioRad)와 같은 폴리아크릴아미드 등을 포함할 수 있다.
스핀 컬럼의 겔은 유리하게는 아스코르베이트와 같은 티올 그룹에 대한 안정화제를 또한 함유하는, 라벨링 반응에서 사용되는 동일한 완충액으로 예비-평형화 시킨다. 바람직한 양태에서는 F(ab')2를 시스테인과 반응시킴으로써 동일반응계에서 제조된 설프하이드릴-함유 단백질, 예를 들어 Fab'-SH를 컬럼상에 적재한다. 그후 출구, 예를 들어 주사기 니들(예를 들면 환원된 과테크네튬산염, 과레늄산염, 구리이온, 수은이온, 납/비스무트 이온 등과 같은 방사선금속 이온의 용액을 함유하는 바이알로 연장된다)을 갖는 컬럼을 원심분리시킨다. 공간 용적이 나타나면, Fab'-SH를 바이알내로 통과시키고 방사선 금속이온을 흡수하면서, 컬럼내에 저분자량의 티올 환원제를 잔류시킨다.
본 발명의 방법을 사용하여 단백질에 결합될 수 있는 방사선금속은 설프하이드릴 그룹에 단단하게 결합되는 방사선금속이다. 일반적으로, 이들은 통상의 정성분석에서 비교적 불용성인 설파이드를 형성하는 금속이온일 것이다. 이들은 이로써 제한되지는 않으나 Tc-99m, Re-186, Re-188, Cu-67, Hg-197, Pb-203, Pb/Bi-212 등을 포함한다. 약 50 내지 500KeV의 범위에서 γ방사 에너지를 갖는 방사선 금속은 신티그래피에 유용하다. 양전자 방사체 또한 영상화 적용에 사용할 수 있다. β 및 α 방사체는 치료에 유용하다. 테크네튬-99m은 이의 구입 용이성 및 시판되는 과테크네튬산염 발생체로부터의 제조의 용이성 때문에 신티그래피에 있어 바람직한 방사선라벨이다.
주기율표에서 테크네튬 아래에 존재하는 레늄은 동일한 최외각 전자배치를 가지므로 매우 유사한 화학적 특성, 특히 동족 화합물의 특성을 갖는다. 사실상, 레늄 화합물은 환원반응 및 킬레이트화에 관한한 테크네튬 화합물과 유사하게 반응하나 산화에 대한 이의 감수성이 더 크기 때문에 취급시 더 많은 주의가 필요하다.
방사선 동위원소 Re-186은 영상화 및 치료 둘다에 적합하다. 이는 약 3.7일의 반감기, 고 LET β 방사(1.07MeV) 및 편리한 γ방사 에너지(0.137MeV)를 갖는다. 테크네튬과 같이, 레늄은 과레늄산염으로부터 제조되고, 환원된 레늄 이온은 비특이적으로 단백질에 결합될 수 있다. 따라서, 환원된 과레늄산염이 항체와 같은 단백질 분자의 설프하이드릴 그룹에 결합되는 단백질의 Re-186 라벨링 방법이 유리하다. Re-188은 약 17시간의 반감기를 갖는 발생체로부터형성된 β 및 γ방사체이고 영상화 및 치료용으로 유용할 수 있다.
구리이온도 또한 황 킬레이터에 의해 단단하게 킬레이트된다. Cu-67은 또한 영상화 및 치료에 있어 또다른 바람직한 방사선핵종이다. 약 2.6일의 반감기, β방사 (0.570MeV) 및 γ방사(0.185MeV)를 갖지만, β 에너지는 상대적으로 낮다. 이러한 조건은 필요에 따라 변화될 수 있으나 Cu-67은 비교적 고가이고 현재 용이하게 입수할 수 없다. 이는 티올과 단단한 킬레이트를 형성하고, 라벨링이 단순하고 급속하며 방사선금속을 위한 환원제가 필요하지 않다는 장점을 갖는다.
구리와 유사한 킬레이트화 반응을 다른 방사선핵종, 예를 들어 수은 및 납 또한 본 발명의 방법에 따라 티올-함유 화합물에 결합될 수 있다. Hg-197은 약 1.5일의 반감기를 갖고 78 내지 268KeV의 에너지 범위에서 γ방사선을 방출하며, Pb-203은 약 51시간의 반감기를 갖는, 약 275KeV에서 강한 γ-방사체로 γ 신티그래피에 적합하다. Bi-212는 약 1시간의 반감기 및 6.09MeV의 에너지를 갖는 α-방사체로서, 생체 치료에 유용하다. 이는, 약 10.6시간의 반감기를 가지며 239KeV의 γ방사선을 방출하는 Pb-212 전구체로부터 동일계로부터 제조된다. 따라서, Bi-212 치료를 위한 항체 결합체는 Pb-212-라벨링된 결합체이고, 본원중 납/비스무트 또는 Pb/Bi로 약칭하여 이를 나타낸다. 본 발명은 예시된 방사선금속 이온으로써 제한되지는 않으며, 일반적으로 설프하이드릴 그룹에 단단하게 결합하는 이온에 적용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
환원된 과테크네튬산염 또는 환원된 과레늄산염은 과테크네튬산염 또는 과레늄산염의 화학적 환원에 의해 형성되고 티올 그룹(들)에 의해 킬레이트되는 테크네튬 또는 레늄 이온 종을 의미한다. 환원된 과테크네튬산염은 이러한 킬레이트에서 Tc(Ⅲ) 및 /또는 Tc(Ⅳ) 및 /또는 Tc(Ⅴ)의 형태이고, 환원된 과레늄산염은 Re(Ⅲ) 및 /또는 Re(Ⅳ) 및 /또는 Re(Ⅴ)의 형태로 고려되나, 더 높거나 더 낮은 산화 상태 및/또는 다단계 산화 상태도 제외될 수 없으며 본 발명의 범주내이다.
Cu(Ⅰ) 및 /또는 Cu(Ⅲ)가 제외되지는 않으나, 구리는 통상적으로 Cu(Ⅱ)의 형태이다. 수은은 통상 Hg(Ⅰ) 및 /또는 Hg(Ⅱ)의 형태일 것이다. 납/비스무트는 통상 Pb(Ⅱ) 또는 Pb(Ⅳ)의 형태일 것이다.
설프하이드릴-함유 단백질의 테크네튬 라벨링은 일반적으로 통상의 방법으로 수행된다. 과테크네튬산염은, 통상 염수용액 중에 가장 통상적으로는 NaTcO4의 형태로 상업적으로 입수가능한 공급원으로부터 수득된다. 새로운 형태의 공급원이 공급자에 의해 제시되거나 본 분야의 숙련가에게는 명백한 바와 같은 방법을 적절하게 변형시켜 다른 형태의 과테크네튬산염을 사용할 수 있다.
환원반응은 일반적으로 수용액 중에서, 여러 가지 통상의 환원제중 어느 하나, 바람직하게는 주석이온으로 수행된다. 다른 적합한 환원제는 예를 들어, 디티오나이트, 보로하이드라이드, 제1철이온 등을 포함한다. 주석이온은 예를 들어, 포일, 과립, 분말, 터닝(turning) 등과 같은 주석 금속을 수성산, 예를 들어 HC1과 접촉시킴으로써 동일계 내에서 형성될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
과테크네튬산염은 일반적으로 약 3 내지 7의 pH, 바람직하게는 3.5 내지 5.5, 더욱 바람직하게는 약 4.5 내지 5.0의 pH에서 완충된 0.9%(생리학적) 식염수와 같은 염수 중에서 약 0.2 내지 10mCi/ml의 활성에서 사용된다. 적합한 완충액은 예를 들어 아세테이트, 타르트레이트, 시트레이트, 포스페이트 등을 포함한다.
주석이온을 사용하는 경우, 정상적으로 이를 과량으로 가하여 과테크네튬산염을 완전히 환원시켜 사용한다. 주석이온 농도는 일반적으로 10-4내지 10-3N의 범위이고 대개 SnCl2/0.1N HCl의 형태로 가한다.
환원은 통상적으로 예를 들어 질소, 아르곤 등과 같은 불활성 가스 대기하에 수행한다. 반응온도는 일반적으로 실온, 예를 들어 18 내지 25℃를 유지하며, 반응이 실질적으로 완결되기 위해 약 0.5 내지 3시간이 필요하다.
주석이온에 대한 트랜스킬레이팅제 및/또는 안정화제를 가하는 것이 유리하다. 환원제가 주석이온인 경우, 아스코르베이트는 환원된 과테크네튬산염과의 킬레이터의 특이 적재를 개선시키고 TcO2의 형성을 최소화한다는 것은 공지되었다. 예를 들어, 타르트레이트, 시트레이트, 프탈레이트, 이미노디아세테이트, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA) 등과 같은 기타 폴리카복실산 또한 사용할 수 있다. 이러한 제제의 정확한 역할을 공지되어 있지 않지만, 이들은 주석이온을 킬레이트하여 우발적인 반응을 방지할 수 있고/있거나, 주석이온을 안정화시켜 환원을 촉진시키고, 이들은 또한 특정 산화상태의 환원된 과테크네튬산염 및 과레늄산염을 킬레이트화-안정화-함으로써, 이들 테크네튬 및 레늄이온을 하나 이상의 티올 그룹과의 보다 안정한 킬레이트체 및 단백질상의 다른 인접 리간드에 이동시키기 위한 트랜스킬레이팅제로서 제공된다. 이러한 제제를 본원에서는 트랜스킬레이터라 한다.
트랜스킬레이터는, 설프하이드릴 그룹(들)의 황원자(들)에게 및 가능하게는 리신 또는 아스파르테이트/글루타메이트 잔기로부터의 인접한 아민 및/또는 카복실 그룹에게 이온을 용이하고 급속하게 상실하는 테크네튬 또는 레늄 이온과 킬레이트를 형성한다. 폴리카복실산이 예시적으로 언급되었으나, 여러 가지 음이온성 및/또는 하이드록실 산소-함유종 중 어느 하나, 예를 들어, 살리실레이트, 아세틸아세토네이트, 하이드록시산, 카테콜, 글리콜 및 다른 폴리올(예: 글루코헵토네이트) 등도 이의 기능을 수행할 수 있다. 트랜스킬레이터 대 설프하이드릴-함유 단백질의 몰비는 약 100:1 내지 1:1, 바람직하게는 50:1 내지 20:1, 더욱 바람직하게는 약 10:1이어야 한다.
트랜스킬레이터는 고체 지지체상에 고정화될 수 있고, 이의 제조에 사용된 환원시스템의 나머지 성분으로부터 환원된 과테크네튬산염 또는 과레늄산염을 분리하는데 사용되거나, 단백질의 설프하이드릴 그룹으로 방사선금속을 급속하게 이동시키도록 하는 형태로 방사선금속을 보유하는데 사용될 수 있다. 이러한 방편의 이점은 단백질 용액이 킬레이트되는 방사선금속 이온을 함유하는 고체상과 접촉하는 경우, 방사선금속 이온만이 실질적으로 단백질로 이동되는 점이다. 그후 고체상을 물리적으로 분리하여 라벨링 시약 시스템의 다른 이온 또는 성분에 의해 오염되지 않은 라벨링된 단백질이 잔류하게 된다. 이상적으로, 형성된 라벨링된 단백질은 주사제로서 직접적으로 사용할 수 있다.
라벨링된 단백질로부터 비반응된 방사선금속 및/또는 환원제를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 이온에 대한 스캐빈저, 예를 들어 트랜스킬레이터와 유사할 수 있는 킬레이터를 가함으로써 수행될 수 있다. 이러한 스캐빈저를 가하는 것 외에 또다른 방도로서 환원 혼합물을 과테크네튬산염을 트랩핑할 수 있는 유도체화된 흡착제를 함유하는 컬럼, 즉, 환원된 과테크네튬산염 및/또는 제1주석/제2주석 이온에 대한 결합된 킬레이터를 함유하는 겔 컬럼을 통과시킨다. 예를 들어, 켈렉스(Chelex)라 불리는 결합된 이미노디아세트산으로 충진된 중합체 컬럼을 바이오 래드사로부터 입수한다. 이러한 다른 적합한 컬럼 충진제는 DTPA, EDTA 등을 함유하도록 변형된 중합체 또는 겔을 포함하고, 이들 중 다수는 상업적으로 입수가능하다. 동일한 고체상 결합된 리간드가 필요한 경우, 트랜스킬레이팅 및 제거를 위해 사용될 수 있다.
방사선금속의 결합이 실질적으로 완결된 후 유리 설프하이드릴 그룹에 대한 스캐빈저를 반응 혼합물에 가할 수 있다. 이러한 적합한 스캐빈저는 예를 들어 말레이미드, 요오도아세트아미드, 요오도아세트산 등을 포함한다. 티올-함유 화합물에 의해 방사선금속의 흡수 정도를 초기에 측정한 후, 실질적으로 모든 잔여의 설프하이드릴 그룹과 반응할 수 있는 스캐빈저의 양을 사용한다. 과량의 이러한 설프하이드릴 그룹 스캐빈저는, 바람직하게는, 이들이 더욱 가용성이 되어 더욱 용이하게 분비될 수 있도록 시스테인 또는 이러한 유사한 티올 화합물에 의해 더욱 제거되어 결합반응 혼합물을 주사 제제로서 바로 사용할 수 있게 한다. 또다른 방도로서, 저분자량 물질의 추가의 분리를 라벨링된 단백질의 주사 전에 수행할 수 있다.
레늄 라벨링은, 시스템내에 공기 또는 산소가 존재하지 않도록 특별히 주의하면서 테크네튬 라벨링과 실질적으로 동일한 방법으로 수행할 것이다. Re-186은 통상적으로 입수 가능한 테크네튬 공급원과 유사한 공급원을 사용함으로써 나트륨 과레늄산염의 형태로 제조된다.
구리 라벨링은 티올-함유 단백질을, 예를 들어 클로라이드, 시트레이트, 타르트레이트 등과 같은 통상의 염형태의 구리이온 통상 Cu(Ⅱ) 이온의 용액과 반응시키거나, 예를 들어 클로라이드를, 예를 들어 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 시트레이트, 타르트레이트 등과 혼합함으로써 수행될 수 있다. Cu-67은 통상적으로 테네시에 소재하는 오크 릿지 내셔날 래보러토리즈(Oak Ridge National Laboratories) 또는 뉴멕시코에 소재하는 로스 알라모스 내셔날 래보러토리즈(Los Alamos National Laboratories)로부터 CuCl2로서 입수가능하다.
설프하이드릴 그룹에 우선적으로 결합하고 염으로 또는 용이하게 염으로 전환될 수 있는 형태로 입수가능한 다른 금속성 α-, β-, γ-및/또는 양전자 방사 방사선핵종, 예를 들어, Hg-197, Pb-203, Pb-212도 또한 본 발명의 킬레이터를 사용하여 킬레이트될 수 있다. 이들은 유리하게는 본 발명의 방법에 따라 제조된 항체/단편 결합체의 형태로 영상화를 위한 방사선라벨로서, 또는 방사선 치료제로서 사용할 수 있다. 항체 단백질에 대한 킬레이트화는 Cu-67 라벨링과 유사하게 수행된다.
수은 방사선 동위원소는 보통 오크 릿지 내셔날 래보러토리즈로부터 HgCl2또는 Hg(No3)2로서 입수가능하다.
납/비스무트 방사선동위원소는 보통 지지된 라돈 발생체의 형태로 아르곤 내셔날 래보러토리즈(Argonne National Laboratories)로부터 입수가능하다.
본 발명의 중요한 양태는 또한 하나 이상의 외인성 리간드로 티올-결합된 방사선금속 이온을 좀더 안정화시키거나 캡핑(capping)하는 것을 포함한다. 이들은 일반적으로 이온의 배위 구체를 완성하고 단백질에 의해 이미 제공된 설프하이드릴 그룹을 보완할 수 있도록 고안된다. 이온과 단단하게 결합하여 단백질 티올 그룹에 대한 황-금속 결합을 약화시키고 혈청내에서 방사선금속 라벨의 안정성을 감소시키는 리간드와, 혈청 또는 골수 또는 간, 비장 또는 신장과 같이 제거가 일어나는 기관에서 다른 외인성 리간드에 의해 단백질로부터 이온이 용이하게 추출되도록 불충분한 킬레이팅력을 제공하는 리간드 사이의 균형이 파괴되어야 한다.
본 발명의 접근법은, 다좌배위자 리간드를 먼저 단백질에 결합시키고난 다음 방사선금속 이온을 적재하여 킬레이트 결합체를 형성하거나 다좌배위자 리간드를 먼저 방사선금속 이온으로 적재하고난 다음 단백질에 결합시키는 선행의 연구와 매우 상이함을 인식해야만 한다. 본 발명은, 단백질상에의 아민/카복실 리간드 및 물 또는 초기 라벨링 용액에 가한 트랜스킬레이터에 대해 우수한 배위능력을 갖는 외인성 리간드에 결합하는데 유용한 이온에 대해 하나 이상의 배위 부위와 함께 단백질상의 하나 이상의 티올 그룹과 방사선금속 이온의 킬레이트화를 고찰하는 것이다. 하나 또는 2개의 설프하이드릴 그룹에 이온을 결합시킨 후에만 외인성 리간드를 가하여 잔여의 배위부위를 충전시키고 이온을 캡핑한다.
외인성 리간드는 1좌배위 또는 다좌배위일 수 있고, 바람직하게는 하나 이상의 황원자 또는 다른 약염기성 전자쌍 공여그룹을 함유함으로써, 외인성 리간드가 방사선금속 이온 배위구에서 보다 약한 공여체 리간드를 치환할 수 있고 치환된 리간드보다 더욱 단단하게 이온에 결합될 수 있다. 외인성 리간드의 기능은 첫번째 예로써, 금속 이온을 둘러싸고 혈청성분으로부터의 외인성 리간드와의 접촉으로부터 금속이온을 차폐함으로써 이온을 캡핑하고 단백질로부터 라벨을 제거하는 추가의 공격에 대해 수득된 킬레이트를 안정화시키는 것이다.
이러한 외인성 캡핑 리간드의 예는 단순한 티올, 예를 들어 C1-30머캅토알칸, 티오에스테르, 티오아미드, 티오 우레아, 포스핀, 포스포네이트 등과 같은 1좌 배위 황/인 화합물을 포함한다. S/S, S/N, P/N 등의 여러 가지 2좌 배위 리간드 또한 적합하고, 특히 S/N 리간드, 예를 들어 머캅토 퓨린, 2-아미노에틸아민 등이 적합하다. 3좌 배위 리간드 S/S/N, S/N/N, 및 동족체 인 리간드, 특히 S/N/N 리간드 또한 사용될 수 있다. 상기는 단백질상의 설프하이드릴 그룹에 결합된 방사선금속을 안정화시키는데 사용될 수 있는 이러한 캡핑 리간드의 많은 형태 및 변형물의 단지 대표적인 예이다.
그러나 이러한 리간드에 대한 다른 작용을 생각할 수 있다. 예를 들어, 외인성 리간드는 탄수화물 중합체 또는 폴리올 그룹을 함유하여 형성된 방사선금속 킬레이트를 면역원성이 적게 할 수 있고 라벨의 손실에 대해 이를 더 보호할 수 있다. 실시예로는 덱스트란, 다당류, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등에 결합된 상기 리간드 중 어느 것도 포함된다.
또다른 방도로서, 외인성 리간드는 방사선금속과 함께, 단백질의 소형 대사물의 분비 및 제거에 일조하는 가용성 그룹을 포함할 수 있다. 실시예로는 추가의 카복실, 하이드록실, 설포네이트 등을 또한 함유하는 상기 리간드 중 어느 것도 포함된다. 단백질의 대사로 가용성 그룹을 함유하는 단쇄 올리고펩타이드가 생성되고 후자의 대사물은 생체기관에 위험을 초래하는 신장에 보유되기 보다는 뇨중에 더욱 용이하게 분비된다.
외인성 리간드의 다소 상이한 기능은 세포독성 제제로 사용되어 방사선 동위 원소를 보완하고/하거나 강화시킬 수 있거나, 치료제로서 또는 치료제용 담체로서 사용될 수 있다. 하나의 양태는 방사선 치료성 금속 동위원소의 세포독성 효과를 강화시키기 위해 방사선 증감제를 외인성 캡핑 리간드와 결합시키는 것이다.
특정의 세포독성 약물은 그 자체로, 예를 들어 6- 머캅토 퓨린은 캡핑 리간드로서 사용되도록 추천된다.
상기 예는 절대적인 것은 아니며, 표적화의 향상, 제거율 또는 순환율 또는 표적화된 방사선라벨링된 단백질의 감소, 라벨링된 단백질 등의 생물학적 분포의 변화와 같은 다른 기능도 본 발명의 광범위한 범주내에 속한다.
단백질, 예를 들어 항체의 Fab'-SH단편을 예를 들어 Tc-99m으로 방사선라벨링시키는데 사용하기 위한 키트(본 분야의 숙련가에게 명백한 변형법을 포함한 일반적인 방법)는 불활성 가스 대기하에 바람직하게는 멸균된 적합한 용기내의 가장 단순한 형태의 하기 시약을 포함한다:
1. 동결건조되고, 바람직하게는 안정화된 단백질, 예를 들어 Fab'-SH,
2. 방사선 라벨링을 위한 방사선핵종 이온 또는 시약.
통상적으로, 키트는 방사선라벨링 단계를 수행하기 위한 하나 이상의 보조제, 완충액, 필터, 바이알, 컬럼 등과 조합되어 사용되고/거나 제공된다.
이러한 키트의 하나의 예는
1. 동결건조되고 슈크로즈로 안정화된 Fab'-SH,
2. 동결건조된 SnCl2,
3. 바람직하게는 타르트레이트, 시트레이트, EDTA, 글루코헵토네이트 등과 같은 트랜스-킬레이터를 함유하는 포스페이트-완충된 염수(PBS),
4. SnCl2를 용해시키기 위해 금속-비함유 10N HCl, 및
5. SnCl2를 희석시키기 위한 PBS 또는 완충액 3을, 이전을 수행하기 위한 멸균, 아르곤-퍼징된 바이알 및 주사기 및 오염물을 제거하기 위한 멸균필터와 함께 포함한다.
주석 글루코헵타노에이트는 과테크네튬산염을 환원시키기 위해 상업적으로 입수가능하고 염화주석 대신에 사용될 수 있다. 환원제, 예를 들면 시스테인과 함께 F(ab')2또는 F(ab)2를 함유하는 키트 및 크기 배제 크로마토그래피용 컬럼을 동일계내에서 Fab'-SH 또는 Fab-SH 형성을 위해 공급될 수 있다. 트라우트(Traut) 시약은 설프하이드릴 그룹을 라벨링시킬 단백질에 부착하는데 사용하기 위해 공급될 수 있다.
상기는 단지 예시적이며 상술된 본 발명의 방법에 있어 다수의 변형을 생각할 수 있다.
다른 노력없이, 본 분야의 숙련가는 상술된 방법을 사용하여 이의 완전한 정도까지 본 발명을 사용할 수 있다. 따라서, 하기 바람직한 특이 양태는 단순히 예시적인 것으로 간주되고 어떤 방법으로도 제한하고자함이 아니다. 하기 실시예에서, 모든 온도는 다른 지시가 없는한 ℃이고 모든 부 및 %는 중량을 기준으로 한다.
[실시예]
1. Tc-99m-항-CEA-Fab'의 제조
SnCl2의 용액은 고체 SnCl2조각을 1N 수성 HCl로 세척하여 표면 산화물을 제거하고, 건조시키며 측량한 다음 고체를 금속을 함유하지 않은 10N HCl에 용해시켜 제조한다. 수득된 용액을 금속을 함유하지 않는 증류수 및 프탈레이트/타르트레이트 완충액, pH 5.5(0.13mg Sn/ml)으로 희석시키고, 여과시키며 아르곤으로 퍼징시킨다.
항-CEA-Fab'-SH의 용액을 13㎍ Sn/㎎의 Fab'-SH의 비로 상기 SnCl2용액과 혼합하고, 아르곤으로 퍼징시키며, 실온에서 99m-TcO4를 가하고(약 20mCi/㎎), 약 30분 동안 향온처리시킨다. 생성된 라벨링된 항체 용액은 거의 100%의 Fab'에 결합된 라벨을 함유하고, 멸균여과시킨 후 멸균 필터가 장착된 주사바늘을 통하여 환자용 주사에 직접적으로 사용할 수 있다.
2. Tc-99m-항-CEA-Fab'를 사용하는 폐종양의 방사면역 검출방법
실시예 1에서와 같이 제조된, Tc-99m-항-CEA-Fab'의 멸균용액을 좌우엽 모두 전이성 폐종양에 걸린 여성 환자에게 정맥내 주입한다. 방사선라벨링된 단편을 주사한지 1.75시간에, 양 폐의 종양을 검출할 수 있고, 2 내지 5시간 후에는 개선된 상이 수득된다. 동일한 환자를 Ⅰ-123-항-CEA-Fab'를 사용하여 영상화하면 유사한 결과가 수득된다. 라벨의 무시할만한 간 흡수가 2시간 후에 관찰되었고 부근의 약간의 혈액 풀 활성에도 불구하고 폐가 연루됨을 용이하게 검출할 수 있다. 약 1.2x2㎝ 크기의 병변이 검출되었다.
상기 실시예는 상기 실시예에서 사용된 본 발명의 일반적이거나 특이적인 반응물 및/또는 작동조건을 치환함으로써 유사한 결과를 반복할 수 있다.
상기 기술로부터, 본 발명의 숙련가는 본 발명의 필수적인 특성을 용이하게 규명할 수 있고, 이의 취지 및 범주를 벗어남이 없이, 여러 가지 용도 및 조건에 적합하게 본 발명을 여러 가지로 변화 및 변경시킬 수 있다.

Claims (24)

  1. (a) 하나 이상의 펜던트(pendant) 설프하이드릴 그룹을 함유하는 단백질과 (b) 과테크네튬산염 또는 과레늄산염에 대한 환원제의 혼합물을 저분자량의 티올 화합물의 실질적인 부재하에서 용액상태로 99m-과테크네튬산염, 186-과레늄산염 또는 188-레늄산염 이온과 접촉시키고, 방사선 라벨링된 단백질의 생성 용액을 회수하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 단백질의 직접적인 방사선라벨링 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단백질이 항체 또는 항체 단편인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 항체 단편이 보다 고분자량인 항체 또는 항체 단편 전구체내의 디설파이드 결합을 환원시킴으로써 제조된 항체 단편인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 항체 단편이 (a) 2가 F(ab)2또는 F(ab')2전구체 단편의 환원적 분해에 의해 제조된 1가 Fab-SH 또는 Fab'-SH 단편 또는 (b) 전체 면역 글로불린의 환원적 분해에 의해 제조된 1가 Fabc'-SH 경/중쇄 단편인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 접촉반응을 환원된 과테크네튬산염 또는 과레늄산염 이온에 대한 트랜스킬레이터의 존재하에 수행하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 방사선라벨링된 생성 단백질을 방사선금속 이온과 결합하는 외인성 리간드와 접촉시키고, 안정화되고 방사선금속 라벨링된 단백질의 생성 용액을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 외인성 리간드가 (a) C1-30머캅토알칸, 티오에스테르, 티오아미드, 티오우레아, 포스핀 및 포스포네이트로 이루어진 그룹중에서 선택된 1좌 배위 황 또는 인 화합물, (b) 2좌 배위 S/S, S/N 또는 P/N 리간드 또는 (c) 3좌 배위 S/S/N, S/N/N, P/P/N 또는 P/N/N 리간드인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 외인성 리간드가 방사선 라벨링된 생성 단백질을 저면역원성이 되게 하는 하나 이상의 당, 덱스트란 또는 폴리올 잔기 및 방사선 증감제를 포함하는 방법.
  9. 단일 용기내에 (a) 하나 이상의 유리 설프하이드릴 그룹을 함유하는 단백질과 (b) 과테크네튬산염 또는 과레늄산염을 환원시키기 위한 주석이온의 공급원의 혼합물을 저분자량 티올 화합물의 실질적인 부재하에 제1항의 방법에 따라 단백질을 방사선 라벨링시키기 위한 교시와 함께 포함함을 특징으로 하는, Tc-99m, Re-186 또는 Re-188로 단백질을 방사선 라벨링시키기에 적합한 키트.
  10. 제9항에 있어서, 단백질이 항체 또는 항체 단편인 키트.
  11. 제9항에 있어서, 단백질이 Fab-SH 또는 Fab'-SH인 키트.
  12. 제9항에 있어서, 주석이온의 공급원이 염화주석 또는 주석 글루코헵토네이트인 키트.
  13. 제9항에 있어서, 환원된 과테크네튬산염 또는 과레늄산염에 대한 트랜스킬레이터를 추가로 포함하는 키트.
  14. 제1항에 있어서, 환원제가 주석 이온의 공급원을 포함하는 방법.
  15. 하나 이상의 펜던트 설프하이드릴 그룹을 함유하는 단백질을 저분자량의 티올 화합물의 실질적인 부재하에서 용액 상태로 Cu-67, Hg-197, Pb-203 및 Bi-212 이온으로 이루어진 그룹중에서 선택된 방사선금속 이온과 접촉시키고, 방사선 라벨링된 단백질의 생성 용액을 방사선금속 이온에 결합하는 외인성 리간드와 접촉시킨 후, 안정화된 방사선금속-라벨링된 단백질의 생성 용액을 화수하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 단백질의 직접적인 방사선라벨링 방법.
  16. 제15항에 있어서, 외인성 리간드가 (a) C1-30머캅토알칸, 티오에스테르, 티오아미드, 티오우레아, 포스핀 및 포스포네이트로 이루어진 그룹중에서 선택되면 1좌 배위 황 또는 인 화/합물, (b) 2좌 배위 S/S, S/N 또는 P/N 리간드 또는 (c) 3좌 배위 S/S/N, S/N/N, P/P/N, 또는 P/N/N 리간드인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 외인성 리간드가 방사선라벨링된 생성 단백질을 저면역원성이 되게 하는 하나 이상의 당, 덱스트란 또는 폴리올 잔기 및 방사선증감제를 포함하는 방법.
  18. 제15항에 있어서, 단백질이 항체 또는 항체 단편인 방법.
  19. 제15항에 있어서, 항체 단편이 보다 고분자량의 항체 또는 항체 단편 전구체 내의 디설파이드 결합을 환원시킴으로써 제조된 항체 단편인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 항체 단편이 (a) 2가 F(ab)2또는 F(ab')2전구체 단편의 환원적 분해에 의해 제조된 1가 Fab-SH 또는 Fab'-SH 단편 또는 (b) 전체 면역 글로불린의 환원적 분해에 의해 제조된 1가 Fabc' 경/중쇄 단편인 방법.
  21. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제5항, 제6항, 제7항,제8항 및 제14항중의 어느 한 항의 방법에 의해 라벨링된 방사선금속-라벨링된 단백질.
  22. 제15항 내지 제20항중의 어느 한 항의 방법에 의해 라벨링된 방사선금속-라벨링된 단백질.
  23. 적합한 용기내에 저분자량 티올 화합물의 실질적인 부재하에 (a) 하나 이상의 유리 설프하이드릴 그룹을 함유하는 단백질, (b) 과테크네튬산염 또는 과레늄산염을 환원시키기 위한 주석이온의 공급원 및 (c) 테크네튬 또는 레늄 이온에 단단히 결합하고, 방사선라벨링된 단백질을 저면역원성이 되게하는 당, 덱스트란 또는 폴리올 잔기 또는 방사선증감제가 결합된 외인성 리간드를 제12항의 방법에 따라 단백질을 방사선라벨링시키기 위한 교시와 함께 포함함을 특징으로 하는, Tc-99m, Re-186, 또는 Re-188로 단백질을 방사선라벨링 시키기에 적합한 키트.
  24. 적합한 용기내에 (a) 저분자량 티올 화합물의 실질적인 부재하에 하나 이상의 유리 설프하이드릴 그룹을 함유하는 단백질 및 (b) 구리, 수은, 납 또는 비스무트 이온에 결합하는 외인성 리간드를 제42항의 방법에 따라 단백질을 방사선 라벨링시키기 위한 교시와 함께 포함함을 특징으로 하는, Cu-67, Hg-197, Pb-203 또는 Bi-212로 단백질을 방사선라벨링 시키기에 적합한 키트.
KR1019890702248A 1988-04-01 1989-03-29 단백질의 직접적 방사선 라벨링 방법 KR0151105B1 (ko)

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US176,421 1988-04-01
US07/176,421 US5061641A (en) 1988-04-01 1988-04-01 Method for radiolabeling proteins
PCT/US1989/001217 WO1989009405A1 (en) 1988-04-01 1989-03-29 Method for radiolabeling proteins

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