DE602004007371T2

DE602004007371T2 - Mikrowellenverfahren zur herstellung von radiomarkierten gallium komplexe

Info

Publication number: DE602004007371T2
Application number: DE602004007371T
Authority: DE
Inventors: Irina Velikyan; Bengt Langstrom
Original assignee: GE Healthcare Ltd
Current assignee: GE Healthcare Ltd
Priority date: 2003-04-11
Filing date: 2004-04-08
Publication date: 2008-03-06
Anticipated expiration: 2024-04-09
Also published as: IL170864A; BRPI0409101A; RU2333557C2; NO332419B1; CN1771058A; GB0308408D0; DE602004007371D1; WO2004089425A1; CN1771058B; CA2520653A1; NO20054615L; CA2520653C; EP1620134A1; EP1620134B1; US8007766B2; KR20060006030A; AU2004228746A1; AU2004228746B2; MXPA05010854A; PL1620134T3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von radiomarkierten Gallium-Komplexen. Die Komplexe könnten als diagnostische Mittel verwendet werden, z.B. für Positronenemissionstomographie-(PET)-Bildgebung.
PET-Bildgebung ist eine tomographische Bildgebungstechnik, die radioaktive Tracermoleküle verwendet, die Positronen emitieren. Wenn ein Positron ein Elektron trifft, werden die beiden annihiliert und das Ergebnis ist die Freisetzung von Energie in Form von Gammastrahlen, die durch den PET-Scanner detektiert werden. Durch Einsetzen natürlicher Substanzen, die vom Körper als Tracermoleküle verwendet werden, liefert PET nicht nur Informationen über Strukturen im Körper, sondern auch Information über die physiologische Funktion des Körpers oder bestimmten Gebieten darin. Ein übliches Tracermolekül ist z.B. 2-Fluoro-2-desoxy-D-glucose (FDG), die ähnlich ist zu natürlich auftretender Glucose, mit dem Zusatz eines ¹⁸F-Atoms. Gamma-Strahlung, erzeugt von dem Positronen-emitierenden Fluor, wird detektiert durch den PET-Scanner und zeigt den Metabolismus von FDG in bestimmten Gebieten oder Geweben des Körpers, z.B. in dem Gehirn oder im Herzen. Die Wahl des Tracermoleküls hängt ab von dem, was gescannt wird. Allgemein wird ein Tracer gewählt, der im Gebiet von Interesse akkumulieren wird oder selektiv von einem bestimmten Typ von Gewebe aufgenommen wird, z.B. Krebszellen. Das Scannen besteht aus entweder einer dynamischen Serie oder einem statischen Bild, das nach einem Intervall erhalten wird, während dem das radioaktive Tracermolekül in den biochemischen Prozess von Interesse eintritt. Der Scanner detektiert die räumliche und zeitliche Verteilung des Tracermoleküls. PET ist auch ein quantitatives Bildgebungsverfahren, das die Messung von regionalen Konzentrationen des radioaktiven Tracermoleküls ermöglicht.
Üblicherweise verwendete Radionuklide in PET-Tracern sind ¹¹C, ¹⁸F, ¹⁵O, ¹³N oder ⁷⁶Br. Kürzlich wurden neue PET-Tracer hergestellt, die auf radiomarkierten Metallkomplexen basieren, die ein biofunktionelles chelatierendes Mittel und ein Radiometall umfassen. Biofunktionelle chelatierende Mittel sind chelatierende Mittel, die sich an ein Metallion koordinieren und an ein Zielausrichtungs-Vektor gebunden sind, der an eine Zielstelle im Körper des Patienten binden wird. Ein derartiger Zielausrichtungs-Vektor kann ein Peptid sein, das an einen bestimmten Rezeptor bindet, wahrscheinlich verbunden mit einem bestimmten Gebiet im Körper oder mit einer bestimmten Krankheit. Ein Zielausrichtungs-Vektor kann auch ein Oligononuklid, das spezifisch für z.B. für ein aktiviertes Oncogen ist und so auf eine Tumor-Lokalisierung abzielt. Der Vorteil derartiger Komplexe ist, dass die biofunktionellen chelatierenden Mittel markiert sein können mit einer Vielfalt von Radiometallen, wie z.B. ⁶⁸Ga, ²¹³Bi oder ⁸⁶Y. Auf diese Weise können radiomarkierte Komplexe mit speziellen Eigenschaften für bestimmte Anwendungen „maßgeschneidert" werden.
⁶⁸Ga ist von speziellem Interesse für die Herstellung von Ga-radiomarkierten Metallkomplexen, die als Tracermolküle in PET-Bildgebung verwendet werden. ⁶⁸Ga wird erhalten aus einem ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-Generator, was bedeutet, dass kein Cyclotron erforderlich ist. ⁶⁸Ga zerfällt zu 89% durch Positronenemission von 2,92 MeV und seine Halbwertszeit von 68 Minuten ist ausreichend, um viele biochemische Prozesse in-vivo ohne unnötige Strahlung zu verfolgen. Mit seinem Oxidationszustand von +111, bildet ⁶⁸Ga stabile Komplexe mit verschiedenen Typen von chelatierenden Mitteln und ⁶⁸Ga-Tracer wurden verwendet für Hirn-, renale, Knochen-, Bloodpool-, Lungen- und Tumorbildgebung.
J. Schumacher et al., Cancer Res. 61, 2001, 3712-3717 beschreiben die Synthese von ⁶⁸Ga-N,N'[2-Hydroxy-5-(ethylen-β-carboxy)benzyl]ethylendiamine-N,N'-diessigsäure (⁶⁸Ga-HBED-CC). ⁶⁸Ga, erhalten von einem ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-Generator, und ein Ga³⁺-Träger werden umgesetzt mit dem chelatierenden Mittel HBED-CC in Acetatpuffer für 15 Minuten bei 95°C. Unkomplexiertes ⁶⁸Ga wird getrennt von Komplex unter Verwenden einer Kationenaustauschsäule. Es wird berichtet, dass die gesamte Herstellung 70 Minuten dauert. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, dass die gesamte Herstellungszeit des radiomarkierten Komplexes sehr lang ist. Auf Grund der Zugabe von „kaltem" Ga³⁺-Träger ist die spezifische Aktivität der Reaktion gering. Außerdem musste der radiomarkierte Komplex nach der Komplexbildungsreaktion gereinigt werden.
WO-A-99/56791 offenbart die Reaktion von ⁶⁸GaCl₃, erhalten von einem ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-Generator mit dem Tetradentat-amintrithiolat-Chelatbildner Tris(2-mercaptobenzyl)amin (S₃N). Die Komplexbildung wird ausgeführt bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Ein Nachteil des beschriebenen Verfahrens ist, dass der radiomarkierte Komplex durch Flüssigkeitschromatographie gereinigt werden musste, bevor er für in-vivo-Studien verwendet werden konnte. Ein weiterer Nachteil des Verfahrens ist die relative lange Reaktionszeit.
Ö. Ugur et al., Nucl. Med. Biol. 29, 2002, 147-157 beschreiben die Synthese des ⁶⁸Ga-markierten Somastotatin-Analogons DOTA-DPhe¹-Tyr³-octreotid (DOTATOC). Die Verbindung wird hergestellt durch Umsetzen von ⁶⁸GaCl₃, erhalten von einem ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-Generator mit dem chelatierenden Mittel DOTATOC für 15 Minuten bei 100°C. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, dass die Reaktionsmischung bei relativ hohen Temperaturen erwärmt werden musste. Der DOTA-Chelatbildner wurde funktionalisiert mit einem Peptid-Zielausrichtungs-Vektor, und Peptide und Proteine sind Substanzen, die dafür bekannt sind, dass sie gegenüber Wärme empfindlich sind. So gibt es mit dem beschriebenen Verfahren ein Risiko, dass wärmeempfindliche Zielausrichtungs-Vektoren während der Komplexbildung zerstört werden. Ein weiterer Nachteil ist, dass der Komplex durch HPLC gereinigt werden musste, bevor er für Tierstudien verwendet werden konnte.
US-A-5070346 offenbart ⁶⁸Ga-markierte Komplexe des chelatierenden Mittels Tetraethylcyclohexyl-bis-aminoethanthiol (BAT-TECH). Die Komplexe werden synthetisiert durch Umsetzen von ⁶⁸GaCl₃, erhalten von einem ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-Generator mit BAT-TECH bei 75°C für 15 Minuten und nachfolgender Filtration. Die Herstellung des Komplexes wurde ausgeführt in 40 Minuten. Auf Grund der hohen Reaktionstemperatur würde dieses Verfahren nicht geeignet sein für bifunktionelle chelatierende Mittel, die einen wärmeempfindlichen Zielausrichtungs-Vektor umfassen, z.B. ein Peptid oder ein Protein. Ein weiterer Nachteil ist die lange Reaktionszeit der Komplexbildungsreaktion.
Im Hinblick auf die relativ kurze Halbwertszeit von ⁶⁸Ga gibt es eine Notwendigkeit für ein schnelles Verfahren zur Synthese von ⁶⁸Ga-markierte Komplexen, die als Tracer-Moleküle für PET-Bildgebung verwendet könnten.
Es wurde nun gefunden, dass die Verwendung von Mikrowellen-Aktivierung wesentlich die Effizienz und Reproduzierbarkeit der ⁶⁸Ga-Chelatbildner-Komplexbildung verbessert. Auf Grund der Mikrowellenaktivierung könnten chemische Reaktionszeiten wesentlich verkürzt werden; d.h. die Reaktion ist abgeschlossen innerhalb von 2 Minuten und weniger. Dies ist eine klare Verbesserung, da eine 10-minütige Verkürzung der Reaktionszeit ungefähr 10% der ⁶⁸Ga-Aktivität einspart. Außerdem führt die Mikrowellenaktivierung auch zu weniger Nebenreaktionen und zu einer vergrößerten radiochemischen Ausbeute, die auf einer vergrößerten Selektivität beruht. Lösungen von ⁶⁶Ga³⁺, 67Ga³⁺ und ⁶⁸Ga³⁺-Radioisotopen, die die durch Cyclotronherstellung oder von einem Generator erhalten worden sind, enthalten sogenannte Pseudo-Träger, d.h. andere Metallkationen, wie z.B. Fe³⁺, Al³⁺, Cu²⁺, Zn²⁺ und In³⁺. Da diese Pseudo-Träger mit Ga³⁺ in der Komplexbildungsreaktion wetteifern, ist es wichtig, die Selektivität der Radiomarkierungsreaktion zu vergrößern. Daher besitzt die Mikrowellenaktivierung einen positiven Effekt auf die Radiomarkierung mit allen Ga-Radioisotopen, nämlich mit ⁶⁶Ga, ⁶⁷Ga und ⁶⁸Ga.
Mikrowellenaktivierung wurde verwendet in nukleophilen aromatischen Radiofluorierungen mit ¹⁸F, und es wurde gefunden, dass vergleichbare oder bessere Ausbeuten als jene, die für Wärmebehandlungen berichtet wurden, erhalten wurden in kürzeren Reaktionszeiten (S. Stone-Elander et al., Appl. Rad. Isotopes 44 (5), 1993, 889-893). Jedoch wurde die Verwendung der Mikrowellenaktivierung in Ga-Radiomarkierungsreaktionen noch nicht beschrieben.
Die Erfindung stellt daher ein Verfahren zum Herstellen eines radiomarkierten Gallium-Komplexes durch Umsetzen eines Ga³⁺-Radioisotops mit einem chelatierenden Mittel bereit, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion ausgeführt wird unter Verwenden von Mikrowellenaktivierung.
Geeignete Ga³⁺-Radioisotope gemäß der Erfindung sind ⁶⁶Ga³⁺, ⁶⁷Ga³⁺ und ⁶⁸Ga³⁺, bevorzugt ⁶⁶Ga³⁺ und ⁶⁸Ga³⁺, und besonders bevorzugt ⁶⁸Ga³⁺. ⁶⁶Ga³⁺ und ⁶⁸Ga³⁺ sind besonders geeignet für die Herstellung von radiomarkierten Komplexen, die in der PET-Bildgebung nützlich sind, wohingegen ⁶⁷Ga³⁺ besonders geeignet für die Herstellung von radiomarkierten Komplexen ist, die in Single Photon Emission Computerised Tomography (SPECT) nützlich sind.
⁶⁶Ga³⁺ ist erhältlich durch Cyclotronproduktion durch Bestrahlung von Targets aus elementarem Zink. Um die Mengen der ⁶⁷Ga-Herstellung zu minimieren, wird bevorzugt die Traget-Dicke derart beibehalten, dass die Energie der zerstreuten Protonen über 8 MeV liegt und die Bestrahlungszeit kurz gehalten wird, z.B. < 4 h. Die chemische Trennung kann erreicht werden unter Verwenden von Lösungsmittel-Losungsmittel-Extrationstechniken, unter Verwenden von Isopropylether und HCl, wie beschrieben in L.C. Brown, Int. J. Appl. Radiat. Isot. 22, 1971, 710-713. ⁶⁶Ga besitzt eine relative lange Halbwertszeit von 9,5 h und das am reichlichsten vorhandene emittierte Positron besitzt eine einzigartig hohe Energie von 4,2 MeV.
⁶⁷Ga³⁺ ist erhältlich durch Cyclotronherstellung und ⁶⁷GaCl₃, erhalten durch Cyclotronproduktion ist eine kommerziell erhältliche Verbindung. Die Halbwertszeit von ⁶⁷Ga beträgt 78 h.
⁶⁸Ga ist erhältlich von einem ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-Generator. Derartige Generatoren sind in der Technik bekannt und z.B. beschrieben von C. Loc'h et al, J. Nucl. Med. 21, 1980, 171-173. Im Allgemeinen wird ⁶⁸Ge geladen auf eine Säule, die besteht aus einem organischen Harz oder einem anorganischen Metalloxid, wie Zinndioxid, Alluminiumdioxid oder Titandioxid. ⁶⁸Ga wird eluiert aus der Säule mit wässriger HCl, was ⁶⁸GaCl₃ ergibt. ⁶⁸Ga³⁺ ist besonders bevorzugt in dem Verfahren gemäß der Erfindung, da seine Produktion kein Cyclotron erfordert und seine 68-minütige Halbwertszeit ausreicht, um vielen biochemischen Prozessen in vivo zu folgen durch PET-Bildgebung ohne lange Bestrahlung.
Bevorzugte chelatierende Mittel zur Verwendung im Verfahren der Erfindung sind jene, die Ga³⁺-Radioisotope in einer physiologisch tolerierbaren Form präsentieren. Weitere bevorzugte chelatierende Mittel sind jene, die Komplexe mit Ga-Radioisotopen bilden, die stabil sind für die Zeit, die für diagnostische Untersuchungen unter Verwenden der radiomarkierten Komplexe benötigt wird.
Geeignete chelatierende Mittel sind z.B. Polyaminopolysäure-Chelatbilder wie DTPA, EDTA, DTPA-BMA, DOA3, DOTA, HP-DOA3, TMT oder DPDP. Jene chelatierende Mittel sind gut bekannt für Radiopharmazeutika und Radiodiagnostika. Ihre Verwendung und Synthese sind beschrieben in bspw., US-A-4647447 , US-A-5362 475 , US-A-5534241 , US-A-5358704 , US-A-5198208 , US-A- 4963344 , EP-A-230893 , EP-A-130934 , EP-A-606683 , EP-A-438206 , EP-A-434345 , WO-A-97/00087 , WO-A-96/40274 , WO-A-96/30377 , WO-A-96/28420 , WO-A-96/16678 , WO-A-96/11023 ; WO-A-95/32741 , WO-A-95/27705 , WO-A-95/26754 , WO-A-95/28967 , WO-A-28392 , WO-A-95/24225 , WO-A-95/17920 , WO-A-95/15319 , WO-A-95/09848 , WO-A-94/27644 , WO-A-94/22368 , WO-A-94/108624 , WO-A-93/16375 , WO-A-06868 , WO-A-92/11232 , WO-A-92/09884 , WO-A-92/08707 , WO-A-91/15467 , WO-A-91/10669 , WO-A-91/10645 , WO-A-91/07191 , WO-A-91/05762 , WO-A-90/12050 , WO-A-90/03804 , WO-A-89/00052 , WO-A-89/00557 , WO-A-88/01178 , WO-A-86/02841 und WO-A-86/02005 .
Geeignete chelatierende Mittel umfassen makrozyklische chelatierende Mittel, z.B. Porphyrin-artige Moleküle und Pentaaza-Macrocylen, wie beschrieben von Zhang et al., Inorg. Chem. 37 (5), 1998, 956-963, Phthalocyanine, Kronenether, z.B. Sickstoff- Kronenether, wie die Sepulcrate, Cryptate etc., Hemin (Protoporphyrin-IX-Chlorid) Häm und chelatierende Mittel mit einer quadratisch-planaren Symmetrie.
Macrozyklische chelatierende Mittel werden bevorzugt verwendet im Verfahren der Erfindung. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen diese macrozyklischen chelatierenden Mittel mindestens ein hartes Donatoratom, wie Sauerstoff und/oder Stickstoff wie in Polyaza- und Polyoxomacrozyklen. Bevorzugte Beispiele von polyazamacrozyklischen chelatierenden Mitteln umfassen DOTA, TRITA, TETA und HETA, wobei DOTA besonders bevorzugt ist.
Besonders bevorzugte macrozyklische chelatierende Mittel umfassen funktionelle Gruppen, wie Carboxylgruppen oder Amingruppen, die nicht wesentlich für das Koordinieren an Ga³⁺ sind und daher verwendet werden können, um andere Moleküle, z.B. Zielausrichtungs-Vektoren, an das chelatierende Mittel zu koppeln.
Beispiele derart marcrozyklischer chelatierender Mittel, die funktionelle Gruppen umfassen, sind DOTA, TRITA oder HETA.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden bifunktionelle chelatierende Mittel im Verfahren gemäß der Erfindung verwendet. „Eifunktionale chelatierende Mittel" im Kontext der Erfindung bedeutet chelatierende Mittel, die an einen Zielausrichtungs-Vektor gebunden sind. Geeignete Zielausrichtungs-Vektoren für bifunktionelle chelatierende Mittel, die im Verfahren gemäß der Erfindung nützlich sind, sind chemische oder biologische Einheiten, die an Zielstellen in einem Körper eines Patienten binden, wenn die radiomarkierten Gallium-Komplexe, die die Zielausrichtungs-Vektoren umfassen, an den Körper des Patienten verabreicht worden sind. Geeignete Zielausrichtungs-Vektoren für bifunktionelle chelatierende Mittel, die im Verfahren gemäß der Erfindung nützlich sind, sind Proteine, Glycoproteine, Lipoproteine, Polypeptide, wie Antikörper oder Antikörper-Fragmente, Glycopolypeptide, Lipopolypeptide, Peptide, wie RGD-bindende Peptide, Glycopeptide, Lipopeptide, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren, z.B. DNA, RNA, Oligonukleotide, wie Gegensinn-Oligonukleotide oder ein Teil, ein Fragment oder ein Derivat oder ein Komplex der zuvor genannten Verbindungen, oder eine beliebige andere chemische Verbindung von Interesse, wie relativ kleine organische Moleküle, insbesondere kleine organische Moleküle von weniger als 2000 Da.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden makrozyklische bifunktionelle chelatierende Mittel im Verfahren gemäß der Erfindung verwendet. Bevorzugte makrozyklische bifunktionelle chelatierende Mittel umfassen DOTA, TRITA oder HETA, gebunden an einen Zielausrichtungs-Vektor, bevorzugt an einen Zielausrichtungs-Vektor, der aus einer Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Proteinen, Glycoproteinen, Lipoproteinen, Polypeptiden, Glycopolypeptiden, Lipopolypeptiden, Peptiden; Glycopeptiden, Lipopeptiden, Kohlenhydraten, Nukleinsäuren, Oligonukleotiden oder ein Teil, ein Fragment, ein Derivat oder ein Komplex der zuvor genannten Verbindungen und kleine organische Moleküle; besonders bevorzugt an einen Zielausrichtungs-Vektor, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus Peptiden und Oligonukleotiden.
Der Zielausrichtungs-Vektor kann gebunden werden an das chelatierende Mittel über eine Linker-Gruppe oder über ein Spacer-Molekül. Beispiele von Linker-Gruppen sind Disulfide, Ester oder Amide, Beispiele von Spacer-Molekülen sind Ketten-artige Moleküle, z.B. Lysin oder Hexylamin oder kurze Peptid-basierende Spacer. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bindung zwischen dem Zielausrichtungs-Vektor und dem Chelatbildnerteil des radiomarkierten Galliumkomplexes derart, dass der Zielausrichtungs-Vektor mit seinem Ziel im Körper Wechselwirken kann, ohne blockiert oder behindert zu werden durch das Vorhandensein des radiomarkierten Galliumkomplexes.
Mikrowellenaktivierung gemäß der Erfindung wird geeigneterweise ausgeführt durch Verwenden eines Mikrowellenofens, bevorzugt durch Verwenden eines monomodalen Mikrowellenofens as. Geeigneterweise wird die Mikrowellenaktivierung ausgeführt bei 80 bis 120 W, bevorzugt bei 90 bis 110 W, besonders bevorzugt bei ungefähr 100 W. Geeignete Mikrowellenaktivierungszeiten reichen von 20 s bis 2 min, bevorzugt von 30 s bis 90 s, besonders bevorzugt von 45 s bis 60 s.
Eine Temperatursteuerung der Reaktion ist angeraten, wenn temperaturempfindliche chelatierende Mittel, wie z.B. bifunktionelle chelatierende Mittel, die Peptide oder Proteine als Zielausrichtungs-Vektoren umfassen, im Verfahren gemäß der Erfindung eingesetzt werden. Die Dauer der Mikrowellenaktivierung sollte eingestellt werden auf eine derartige Weise, dass die Temperatur der Reaktionsmischung nicht zur Zersetzung des cheltatierenden Mittels und/oder des Zielausrichtungs-Vektors führt. Falls chelatierende Mittel, die im Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, Peptide oder Proteine umfassen, sind höhere Temperaturen, die für eine kürzere Zeit angewandt werden, im Allgemeinen günstiger als niedrigere Temperaturen, die für eine längere Zeitdauer angewandt werden.
Mikrowellenaktivierung kann ausgeführt werden kontinuierlich oder in mehreren Mikrowellenaktivierungszyklen während des Verlaufs der Reaktion.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung bereit ein Verfahren zum Herstellen eines ⁶⁸Ga-radiomarkierten PET-Bildgebungstracers durch Umsetzen von ⁶⁸Ga³⁺ mit einem makrozyklischen bifunktionellen chelatierenden Mittel, umfassend harte Donatoratome, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion ausgeführt wird unter Verwenden von Mikrowellenaktivierung.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des in dem letzten vorstehenden Paragraphen beschriebenen Verfahrens wird die Mikrowellenaktivierung ausgeführt von 30 s bis 90 s bei 90 bis 110 W.
Falls ⁶⁸Ga³⁺ im Verfahren gemäß der Erfindung verwendet wird, wird das ⁶⁸Ga³⁺ bevorzugt erhalten durch In-Kontaktbringen des Eluats von einem ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-Generator mit einem Anionenaustauscher und Eluieren von ⁶⁸Ga³⁺ aus dem Anionenaustauscher. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Anionenaustauscher ein Anionenaustauscher, umfassend HCO₃ ^– als Gegenionen.
Die Verwendung von Anionenautauscher, um ein ⁶⁸Ga-Eluat zu behandeln, das von einem ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-Generator erhalten wird, ist beschrieben von J. Schumacher et al. Int. Appl. Radiat. Isotopes 32, 1981, 31-36. Ein Bio-Rad-AG-1×8-Anionenaustauscher wurde verwendet zum Behandeln des 4,5 N HCl-⁶⁸Ga-Eluats, erhalten von einem ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-Generator, um die Menge von ⁶⁸Ge zu verringern, das im Eluat vorhanden ist.
Es wurde nun gefunden, dass die Verwendung von Anionenaustauschern, die HCO₃ ^– als Gegenionen umfassen, besonders geeignet ist für die Reinigung und Konzentrierung des Generatoreluats. Nicht nur die Menge von ⁶⁸Ge, das im Eluat vorhanden ist, könnte verringert werden, sondern auch die Menge von sogenannten Pseudo-Trägern, d.h. andere Metallkationen, wie Fe³⁺, Al³⁺, Cu²⁺, Zn²⁺ und In³⁺, die zusammen mit dem ⁶⁸Ga³⁺ vom Generator eluiert werden. Da diese Pseudo-Träger mit ⁶⁸Ga³⁺ im der nachfolgenden Komplexbildungsreaktion wetteifern, ist es speziell günstig, die Menge jener Kationen so weit wie möglich vor der Markierungsreaktion zu reduzieren. Ein weiterer Vorteil des Anionenaustauschreinigungsschrittes ist, dass die Konzentration von ⁶⁸Ga³⁺, die sich im pikomolaren bis nanomolaren Bereich nach der Elution befindet, vergrößert werden kann bis zu einem nanomolaren bis mikromolaren Niveau. Daher ist es möglich, die Menge des chelatierenden Mittels in einer nachfolgenden Komplexbildungsreaktion zu verringern, was beträchtlich die spezifische Radioaktivität vergrößert. Dieses Ergebnis ist wichtig für die Herstellung von ⁶⁸Ga-radiomarkierten PET-Tracern, die ein bifunktionelles chelatierendes Mittel umfassen; d.h. ein chelatierendes Mittel, das an einen Zielausrichtungs-Vektor gebunden ist, da der Anstieg in der spezifischen Radioaktivität die Reduktion in der Menge derartiger Tracer ermöglicht, wenn sie in einem Patienten verwendet werden.
Daher ist eine andere bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines ⁶⁸Ga-radiomarkierten Komplexes durch Umsetzen von ⁶⁸Ga³⁺ mit einem chelatierenden Mittel unter Verwenden von Mikrowellenaktivierung, wobei das ⁶⁸Ga³⁺ erhalten wird durch In-Kontaktbringen des Eluats von einem ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-Generator mit einem Anionenaustauscher, bevorzugt mit einem Anionenaustauscher umfassend HCO₃ ^– als Gegenionen, und Eluieren von ⁶⁸Ga³⁺ aus dem Anionenaustauscher.
⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-Generatoren sind in der Technik bekannt, siehe z.B. C. Loc'h et al., J. Nucl. Med. 21, 1980, 171-173 oder J. Schuhmacher et al. Int. J. Appl. Radiat. Isotopes 32, 1981, 31-36. ⁶⁸Ge kann erhalten werden durch Cyclotronherstellung durch Bestrahlung von bwsp. Ga₂(SO₄)₃ mit 20 MeV-Protonen. Es ist auch kommerziell erhältlich z.B. als ⁶⁸Ge in 0,5 M HCl. Im Allgemeinen wird ⁶⁸Ge geladen auf eine Säule, die besteht aus organischem Harz und einem anorganischen Metalloxid, wie Zindioxid, Aluminiumdioxid oder Titandioxid. ⁶⁸Ga wird eluiert aus der Säule mit wässriger HCl, was ⁶⁸GaCl₃ ergibt.
Geeignete Säulen für ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-Generatoren bestehen aus anorganischen Oxiden, wie Aluminiumdioxid, Titandioxid oder Zinndioxid oder organischen Harzen, wie Harzen, die Phenolhydroxylgruppen umfassen ( US-A-4264468 ) oder Pyrogallol (J. Schuhmacher et al. Int. J. appl. Radiat. Isotopes 32, 1981, 31-36). In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-Generator, der eine Säule umfasst, die Titandioxid umfasst, im Verfahren gemäß der Erfindung verwendet.
Die Konzentration des wässrigen HCl, das zum Eluieren des ⁶⁸Ga aus der ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-Generatorsäule verwendet wird, hängt von dem Säulenmaterial ab. Geeigneterweise wird 0,05 bis 5 M HCl für die Elution von ⁶⁸Ga verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Eluat erhalten von einem ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-Generator, umfassend eine Säule, umfassend Titandioxid, und ⁶⁸Ga wird eluiert unter Verwenden von 0,05 bis 0,1 M HCl, bevorzugt ungefähr 0,1 M HCl.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung wird ein starker Anionenaustauscher, umfassend HCO₃ ^– als Gegenionen, bevorzugt ein starker Anionenaustauscher, umfassend HCO₃ ^– als Gegenionen, verwendet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst dieser Anionenaustauscher quaternäre funktionelle Amingruppen. In einer anderen weiter bevorzugten Ausführungsform ist dieser Anionenaustauscher in starkes Anionenaustauschharz, basierend auf Polystyroldivinylbenzol. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendete Anionenaustauscher ein starkes Anionenaustauschharz, umfassend HCO₃ ^– als Gegenionen, quaternäre funktionelle Amingruppen und das Harz basiert auf Polystyroldivinylbenzol.
Geeigneterweise wird Wasser verwendet, um das ⁶⁸Ga aus dem Anionenaustauscher in dem Verfahren gemäß der Erfindung zu eluieren.
Beispiele
Beispiel 1:
Vergleich des ⁶⁸Ga-Radiomarkierens von DOTA-D-Phe¹-Tyr³-Octreotide (DOTATOC) unter Verwenden herkömmlicher Heiz- und Mikrowellenaktivierung:
1a) ⁶⁸Ga-Radiomarkieren von DOTA-TOV unter Verwenden von herkömmlichem Erwärmen:
Natriumacetat wurde zugegeben zum Eluat aus einem ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-Generator (36 mg mit 1 ml) um den pH des Eluats auf annähernd 5,5 einzustellen und die Mischung wurde gut verwirbelt. DOTA-TOC (20 nmol) wurde zugegeben und die Reaktionsmischung wurde erwärmt bei 96°C für 25 Minuten. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und aufgebracht auf eine C-18-SPE-Säule (HyperSEP S C18), die dann mit 2 ml H₂O gewaschen wurde, und das Produkt wurde mit Ethanol:Wasser 50:50 (1 ml) eluiert.
Die Reaktionsmischung und das Produkt wurden analysiert durch HPLC unter Verwenden von Vydac RP und Fast Desalting HR 10/10 FPLC-Gel-Filtrations-Säulen.
Die analytische radiochemische Ausbeute (RCY) betrug 67%.
Die isolierte RCY betrug 34%.
Elektrosprüh-Ionisations-Massenspektometrie ESI-MS wurde ausgeführt auf einer Fisons Platform (Micromass, Manchester, UK), unter Verwenden vom Positive Modus Scanning und Detektieren von [M+2H]²⁺. DOTATOC wurde detektiert bei m/z = 711.26 und authentisches Ga-DOTATOC wurde detektiert bei m/z = 746.0 (berechnet m/z = 746.5).
1b) ⁶⁸Ga-Radiomarkierung von DOTATOC unter Verwenden von Mikrowellenaktivierung
Die Reaktionsmischung wurde hergestellt identisch wie beschrieben unter 1a) und übertragen in ein Pyrex-Glasfläschchen für Mikrowellenaktivierung für 1 min bei 100 W. Die Reaktionsmischung wurde gekühlt auf Raumtemperatur und aufgebracht auf eine C-18-SPE-Säule (HyperSEP S C 18), die dann gewaschen wurde mit 2 ml H₂O und das Produkt wurde eluiert mit Ethanol:Wasser 50:50 (1 ml).
Die Reaktionsmischung und das Produkt wurden analysiert durch HPLC unter Verwenden von Vydac RP und Fast Desalting HR 10/10 FPLC-Gelfiltrationssäulen.
Die analytische RCY betrug über 98%
Die isolierte RCY betrug 70 % Elektosprüh-Ionisations-Massenspektrometrie ESI-MS wurde ausgeführt auf einer Fisons Platform (Micromass, Manchester, UK), unter Verwenden vom Positive Modus Scanning und Detektieren von [M+2H]²⁺. DOTATOC wurde detektiert bei m/z = 711.26 und authentisches Ga-DOTATOC wurde detektiert bei m/z = 746.0 (berechnet m/z = 746,5).
1c) Ergebnisse des Vergleichs
Im Falle der Mikrowellenaktivierung wurde die Menge des radioaktiven Materials und die produktspezifischen, Aktivität vergrößert um 21%. Die isolierte radiochemische Ausbeute wurde zweifach vergrößert im Vergleich zu den Ergebnissen, die mit herkömmlichem Heizen erhalten wurden. Da die radiochemische Ausbeute der Reaktionsmischung im Falle der Mikrowellenaktivierung über 98% betrug, würde eine weitere Reinigung nicht nötig sein und die rohe Reaktionsmischung hätte verwendet werden können sein für eine in-vivo-Anwendung.
Beispiel 2
⁶⁸Ga-Radiomarkierung von DOTA, gebunden an Oligonulkeotide
In einem ersten Schritt wurden vier verschiedene Gegensinn-Oligonukleotide, die für ein aktiviertes menschliches K-ras-Onkogen spezifisch waren, an DOTA gebunden:

• 17-mer Phophodiester-Oligonukleotid mit Hexylaminolinker am 5' Ende;
• 17-mer Phophodiester-Oligonukleotid mit Hexylaminolinker am 3' Ende;
• 17-mer Phophorothioat-Oligonukleotid mit Hexylaminolinker am 5' Ende; und
• 2'-O-Methyl-phosphodiester mit Hexylaminolinker am 5'Ende.

2a) Konjugation von DOTA an Oligonukleotide:
DOTA (32 mg, 66 μmol) und Sulfo-NHS (14 mg, 65 μmol) in H₂O (250 μl) wurden zugegeben zu EDC (13 mg, 68 μmol) in H₂O (250 μl), gerührt auf Eis für 30 Minuten und dann erwärmt auf Raumtemperatur, um DOTA-Sulfo-NHS zu ergeben. Ein 100-facher Überschuss von DOTA-NHS-Lösung wurde tropfenweise zum Oligonukleotid (70-450 nmol) in 1 M Carbonatpuffer (pH 9) gegeben und dann auf Eis gekühlt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 10 Stunden stehen gelassen. Die Reaktionsmischung wurde zu erst gereinigt durch Gelfiltration mit NAP-5-Säulen, eluiert mit H₂O, und 100 μl von 1 M TEAA (Triethylammoiumacetatpuffer) wurde zugegeben zu 1 ml des Produkteluats. Das Produkteluat wurde dann aufgebracht auf eine C-18-SPE-Säule (Supelco), die Säule wurde gewaschen mit 50 mM TEAA (5ml), 50 mM TEAA, enthaltend 5% Acetonitril (3 ml), und das DOTA-Oligonukletid wurde eluiert mit Wasser:Acetonitril 50:50 (1 ml). Die Wasser-Acetonitril-Fraktion wurde getrocknet unter Verwenden einer Vakuumzentrifuge. Die Produkte wurden analysiert unter Verwenden von Elektrosprüh-Ionisationsmassenspektrometrie. Analyse im negativen Modus nach direkter Infusion führte zu den folgenden Daten: 1. DOTA-Phophodiester: MS (ESI^–) m/z: 662.27 [M-8H]^8–; 756.36 [M-7H]^7–; 882.91 [M-6H]^6–. Rekonstitution der Daten ergab M = 5303.71; 2. DOTA-Phosphorothioat: MS (ESI-) m/z: 656.58 [M-8H]^9–; 738.56 [M-7H]^8–. Rekonstitution der Daten ergab M = 5917.35; 3. DOTA-2'-O-methyl-phosphodiester: MS (ESI^–) m/z: 674.02 [M-6H]^9–; 770.19 [M-8H]^8–; 885.00 [M-7H]^7–. Rekonstitution der Daten ergab M = 6148.84.
2b) ⁶⁸Ga-Radiomarkierung
Natriumacetat wurde zugegeben zum Eluat aus einem ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-Generator (36 mg zu 1 ml) um den pH des Eluats einzustellen auf annähernd 5,5 und die Mischung wurde gut verwirbelt. DOTA-Oligonukletide (10-100 nmol) wurde zugegeben und die Mischung wurde übertragen in ein Pyrex-Glasfläschchen für Mikrowellenaktivierung für 1 Minuten bei 100 W. Die Reaktionsmischung wurde gekühlt auf Raumtemperatur, dann wurde 1 ml 150 mM TEAA in H₂O zugegeben. Die Mischung wurde aufgebracht auf eine C-18-SPE-Säule (Supelco), die dann gewaschen wurde mit 50 mM TEAA (1 ml), 50 mM TEAA, enthaltend 5% Acetonitril (1 ml). Das Produkt wurde eluiert mit Ethanol:Wasser 50:50 (1 ml) oder Wasser:Acetonitril 50:50 (1 ml). Die Reaktionsmischung wurde analysiert durch HPLC unter Verwenden von Vydac RP und Fast Desalting HR 10/10 FPLC-Gelfiltrationssäulen. Die analytische RCY reichte von 50% bis 70%, die isolierte RCY reichte von 30 bis 52%. Größere Mengen stärkerer Eluenten könnten die isolierte RCY verbessern.
Beispiel 3:
⁶⁸Ga-Radiomarkierung von DOTA, gebunden an Peptide
In einem ersten Schritt wurden vier verschiedene Peptide an DOTA gebunden:

• Vasocative Intestinal Peptid (VIP); 28 Aminosäurereste;
• Neuropeptid Y Fragment 18-36 (NYP); 19 Aminosäurereste;
• Pancreastatin Fragment 37-52 (P); 16 Aminosäurereste; und
• Angiotensin II (A); 8 Aminosäurereste.

3a) Konjugation von DOTA an Peptide:
Eine Konjugation wurde ausgeführt wie beschrieben in 2a), unter Verwenden von Peptiden (0,5-3 μmol), anstelle von Oligonukleotiden. Die Reaktionsmischungen und Produkte wurden analysiert durch HPLC unter Verwenden von Vydac RP und Fast-Desalting-10/10-Gelfiltrationssäulen. Elektrosprüh-Ionisations-Massenspektrometrie, ESI-MS, wurde ausgeführt auf Fisons Platform, (Micromaa, Manchester, UK), unter Verwenden von Positive Modus Scanning und Detektieren von [M+2H]²⁺ [M+4H]⁴⁺ und [M+5H]⁵⁺. VIP wurde detektiert bei m/z = 832.07 [M+4H]⁴⁺. (DOTA)₂-VIP wurde detektiert bei m/z = 1025.00 [M+4H]⁴⁺. (DOTA)₃-VIP wurde detektiert bei m/z = 1122.0 [M+4H]⁴⁺. (DOTA)₄-VIP wurde detektiert bei m/z = 1218.00 [M+4H]⁴⁺. NPY wurde detektiert bei m/z = 819.31 [M+3H]³⁺. DOTA-NPY wurde detektiert bei m/z = 948.18 [M+3H]³⁺. P wurde detektiert bei m/z = 909.55 [M+2H]²⁺. DOTA-P wurde detektiert bei m/z = 1103.02 [M+2H]²⁺. A wurde detektiert bei m/z = 524.1 [M+2H]²⁺ und DOTA-A wurde detektiert bei m/z = 717.20 [M+2H]²⁺.
3b) ⁶⁸Ga-Radiomarkierung
⁶⁸Ga-Radiomarkierung wurde ausgeführt wie beschrieben in 2b) unter Verwenden von 10-20 nmol DOTA-Peptid.
Die Reaktionsmischung wurde analysiert durch HPLC unter Verwenden von Vydac RP und Fast Desalting HR 10/10 FPLC-Gelfiltrationssäulen. Die analytische RCY reichte von 80% bis 90%, die isolierte RCY reichte von 60 bis 70%. Größere Mengen stärkerer Eluenten könnten das isolierte RCY verbessern.

Claims

Verfahren zum Herstellen eines radiomarkierten Gallium-Komplexes durch Umsetzen eines Ga³⁺-Radioisotops mit einem chelatierendem Mittel, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion ausgeführt wird unter Verwenden von Mikrowellenaktivierung.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Ga³⁺-Radioisotop ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus ⁶⁶Ga³⁺, ⁶⁷Ga³⁺ und 68Ga³⁺.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, bei dem das Ga³⁺-Radioisotop ⁶⁸Ga³⁺ ist.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, bei dem das chelatierende Mittel ein makrozyklisches chelatierendes Mittel ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, bei dem das chelatierende Mittel harte Donatoratome umfasst, bevorzugt O- und N-Atome.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, bei dem das chelatierende Mittel ein bifunktionelles chelatierendes Mittel ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, bei dem das chelatierende Mittel ein bifunktionelles chelatierendes Mittel ist, umfassend einen Zielausrichtungs-Vektor, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus Proteinen, Glykoproteinen, Lipoproteinen, Polypeptiden, Glykopolypeptiden, Lipopolypeptiden, Peptiden, Glykopeptiden, Lipopeptiden, Kohlenhydraten, Nukleinsäuren, Oligonukleotiden oder ein Teil, ein Fragment oder ein Derivat oder einen Komplex der zuvor genannten Verbindungen und kleinen organischen Molekülen.
Verfahren nach Anspruch 7, bei dem der Zielvektor ein Peptid oder Oligonukleotid ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, bei dem die Mikrowellenaktivierung ausgeführt wird bei 80 bis 120 W, bevorzugt bei 90 bis 110 W.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, bei dem die Mikrowellenaktivierung ausgeführt wird für 20 s bis 2 min, bevorzugt für 30 s bis 90 s.
Verfahren nach den Ansprüchen 3 bis 10, bei dem das ⁶⁸Ga³⁺ erhalten wird durch In-Kontaktbringen des Eluats aus einem ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-Generator mit einem Anionenaustauscher und Eluieren von ⁶⁸Ga³⁺ aus dem Anionenaustauscher.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-Generator eine Säule umfasst, die Titandioxid umfasst.
Verfahren nach den Ansprüchen 11 bis 12, bei dem der Anionenaustauscher HCO₃ ^– als Gegenionen umfasst.
Verfahren nach den Ansprüchen 11 bis 13, bei dem der Anionenaustauscher ein starker Anionenaustauscher ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 6 bis 14 zur Herstellung von ⁶⁸Ga-radiomarkierten PET-Tracern.