DE60032175T2

DE60032175T2 - Markierte ascorbinsäurederivate

Info

Publication number: DE60032175T2
Application number: DE60032175T
Authority: DE
Inventors: Susan Champion; Pither Richard
Original assignee: GE Healthcare Ltd
Current assignee: GE Healthcare Ltd
Priority date: 1999-12-23
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2020-12-23
Also published as: ATE346616T1; JP2003518512A; CA2394959A1; ES2277598T3; EP1239886B1; US6749832B2; DE60032175D1; EP1239886A2; WO2001047564A3; WO2001047564A2; AU2206401A; US20030153736A1

Description

Gebiet der Erfindung und Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Klasse von Verbindungen, die in der Diagnose oder Radiotherapie von metastatischen Knochenerkrankungen nützlich sind, pharmazeutische Formulierungen, die sie enthalten, ihre Verwendung in der Diagnose der Erkrankung und der Überwachung des Fortschreitens und der Behandlung der Erkrankung, und Verfahren für ihre Herstellung.
Gegenwärtige Knochenbildgebungsmittel
Der Knochen ist eine übliche Stelle einer metastatischen Erkrankung, wobei ungefähr 70-80% von Brust- und Prostatakrebsarten im Knochen metastasieren. Lungen-, Schilddrüsen-, Nieren- und Blasenkrebsarten können auch zum Knochen metastasieren. Sobald Tumorzellen in Knochenmark implantiert sind, setzten sie biochemische Mediatoren frei, die Osteoblasten aktivieren. Die osteoblastische Reaktion, die bei einem Knochenscan detektiert wird, ist eine sekundäre Reaktion. Osteoblasten sind Knochen-produzierende Zellen, die in die Pathologie einbezogen sind, die mit metastatischer Knochenerkrankung assoziiert ist. Aktivierte Osteoblasten erzeugen große Mengen von Kollagen, das zusätzlich zu seiner strukturellen Rolle wichtig ist in der Osteoblastendifferentiation.
Die Diagnose der metastatischen Knochenerkrankung kann erreicht werden durch eine von vier Verfahren – Radiographie, CT-Scaning, Radioisotopen-Knochenscan oder MRI. Der Radioisotopen-Knochenscan war das anfängliche Standard-Bildgebungsverfahren für die letzten 25 Jahre. Der übliche Tracer für Knochenscans ist ^99mTc-Methylen-diphosphonat (^99mTc-MDP). ^99mTc-HMDP (Hydroxymethylen- diphosphonat) und ^99mTc-HEDP (1-Hydroxyethyl-1,1-diphosphonat) können auch verwendet werden. Diese Mittel besitzen allgemein ähnliche Eigenschaften. Um 550-750 Mbq (15–20 mCe) werden injiziert und eine starke Aufnahme in den Knochen (30-50% der injizierten Dosis) erfolgt innerhalb von zwei Stunden. Scans werden typischerweise drei bis vier h nach der Verabreichung des Mittels ausgeführt, auf Grund der langsamen Clearance aus dem Blut und/oder Gewebe. Die gesamte Körperbildgebung (anterior/posterior) mit einer Aufnahmezeit von 20-30 Minuten erzeugt Bilder einer hohen Qualität, guten Auflösung und hohen Sensitivität/Spezifität.
^99mTc-MBP wird auf dem Calcium von Hydroxyapatit im Knochen absorbiert. Dieser Prozess wird beeinflusst durch die Niveaus der osteoblastischen Aktivität und durch Skelettvaskularität. Es gibt eine bevorzugte Aufnahme an Stellen der aktiven Knochenbildung, und das Ausmaß der Akkumulation ist empfindlich gegenüber dem Niveau des Blutflusses. Der Knochenscan reflektiert deshalb die metabolische Reaktion des Knochens auf den Krankheitsprozess, ungeachtet ob die metabolische Aktivität neoplastisch, traumatisch oder entzündlich in ihrer Natur ist. Daher sammelt sich der Tracer an einer beliebigen Stelle des erhöhten Knochenumsatzes und der Scan ist deshalb sehr unspezifisch.
Osteoblastische Metastasen, die in heißen Spots resultieren, werden detektiert ungeachtet der Größe, aber eine kalter (photopenischer) Spot, der als eine Folge der osteolytischen Erkrankung verursacht wird, muss eine bestimmte Größe erreichen, um detektiert zu werden.
Die allgemeinen Vorteile des Radioisotopenscans sind ein großes Gesichtsfeld, niedrige Kosten, niedrige Sterblichkeit, hohe Sensitivität für die Detektion von Skelettmetastasen, die Leichtigkeit der Ausführung an einem beliebigen Patienten und eine relativ niedrige Körpergesamtdosis.
Nachteile und Probleme, die mit gegenwärtigen Radioisotopen-Knochenbildgebungsmitteln verbunden sind
Eine Tracer-Akkumulation kann erfolgen an einer beliebigen Skelettstelle mir einer erhöhten Umsatzrate und liefert in diesem Fall keine funktionelle oder vaskuläre Information. Da der Knochenscan eine geringe Spezifität hat, kann die Natur einer Abnormalität aus dem Scan nicht bestimmt werden, daher können benigne und maligne Läsionen oft nicht unterschieden werden. Diese Technik ist auch anatomisch unpräzise. Binden an einen Knochen kann noch erfolgen, nachdem Tumorzellen tot sind, da Kollagen noch produziert wird. Daher gibt es keinen Unterschied zwischen einer Knochenheilung und einer Tumorprogression, mit dem Ergebnis, dass es schwierig ist, Effekte der Behandlung zu überwachen. Ein Anstieg in der Aufnahme von ^99mTc-MDP aufgrund von Knochenheilung kann gesehen werden bis zu sechs Monaten nach der Behandlung und ist als die Flare Response bekannt.
Es gibt keine Netto-Produktion von Kollagen in der osteolytischen Erkrankung, daher treten falsche Negative auf – einige oder alle Läsionen werden übersehen. Derartige negative Scans müssen wiederbewertet werden mit klinischen und Labor-Ergebnissen. Wenn diese nicht schlüssig sind, wird Radiographie verwendet werden, falls dies immer noch nicht schlüssig ist, wird eine Knochenbiopsie oder MRI verwendet.
Die niedrige Spezifität von ^99mTc-MDP bedeutet, dass die Natur der Abnormalität z.B. von benigner gegenüber maligner Läsion nicht detektiert werden kann. In einem Patienten mit bekannten Primärtumoren können mehrfache Hot Spots in Knochenscans Metastasen anzeigen. Jedoch können 50 % dieser Hot Spots andere nicht metastatische Läsionen sein. Deshalb bedeutet ein Mangel an Spezifität, die mit ^99mTc-MDP beobachtet wird, dass positive Scans auch oft von einer radiographischen Korrelation begleitet sein müssen (ein positives Radiograph bestätigt das Vorhandensein von Metastasen, da der Knochenscan empfindlicher ist, aber ein negatives Radiograph schließt sie nicht aus).
MRI wird manchmal gewählt, hauptsächlich auf Grund seiner Fähigkeit Abnormalitäten im Knochenmark zu zeigen. Jedoch kann MRI oft nicht zwischen Änderungen unterscheiden, die auf Behandlung, Bruch und Tumor beruhen, und ist weniger geeignet, um lange Knochen zu scannen.
Trotz der Probleme, die mit den gegenwärtigen Radioisotopen-Knochen-Bildgebungsmitteln verbunden sind, machen ihre einzigartigen Merkmale sie zur ersten Wahl zum Screenen nach Metastasen in asymptomatischen Patienten. Jedoch sollte ein negativer Scan immer wiederbewertet werden mit klinischen und Laborergebnissen, auf Grund der Möglichkeit von falschen Negativen. Außerdem muss die Möglichkeit einer nicht metastatischen Ursache eines abnormalen Scans immer berücksichtigt werden. Nicht schlüssige Ergebnisse führen allgemein zu einer ergänzenden Untersuchung mit Radiographie. Falls die Diagnose immer noch unklar ist, wird eine Knochenbiopsie oder MRI ausgeführt werden.
Es gibt deshalb einen Bedarf für ein diagnostisches Bildgebungsmittel, das eine Spezifität für metastatische Knochenläsionen besitzt (im Gegensatz zu anderen Läsionstypen), und das eine klinisch nützliche Information in einem einzelnen Bildgebungsprotokoll geben kann, ohne die Notwendigkeit für zusätzliches Testen.
Skelettmetastasen können auf Chemotherapie oder Hormontherapie ansprechen, die zum Behandeln des primären Tumors verwendet werden. Sie können auch auf Strahlung oder Mittel ansprechen, die entworfen sind, um eine Knochenresorption zu blockieren, wie die neue Klasse von Bisphosphonat(BP)-Arzneimitteln. Bisphosphonate besitzen starke Inhibitor-Effekte auf die Knochenresorption und sind die Behandlung der Wahl für eine Hyperkalzämie der Malignität. Eine Behandlung kann zu einer Verringerung der Anzahl und der Rate von Skelettkomplikationen bei mehrfachen Myelomen und fortgeschrittenem Brustkrebs führen und kann den Einsatz der progressiven Erkrankung im Knochen nach einer palliativen Chemotherapie bei Brustkrebs und Myelom verzögern. BPs lindern auch den Schmerz bei metastatischem Knochen in ungefähr 50% der Patienten, aber dies erfordert eine intravenöse Injektion, da BPs nicht stark genug sind und nicht gut toleriert werden, wenn sie oral eingenommen werden. Eine Reaktion auf die Behandlung kann gemessen werden durch biochemische Macker, z. B. der Ausscheidung von Kollagen-Quervernetzungen. Radioisotope werden auch bei der Behandlung von Knochenmetastasen verwendet [Ben-Josef & Porter, Ann Med. 29, 31-35, (1997); Lewington, Phys Med Biol. 41, 2027-2042 (1996)]. ⁸⁹Sr wurde erfolgreich bei der Schmerzlinderung verwendet. Andere knochenaufsuchende Isotope umfassen ³²P (eine Nebenwirkung der Myelotoxizität), ¹⁵³Sm (komplexiert mit EDTMP) und ¹⁸⁶Re (komplexiert mit HEDP).
¹⁴C- und ³H-markierte Ascorbinsäurederivate sind bekannt. Yamamoto et al [Appl. Radiat. Isot. 43, 633-639 (1992)] haben die Herstellung von 6-Desoxy-6-[¹⁸F]fluor-L-ascorbinsäure (¹⁸F-DFA) beschrieben, d.h. ein Ascorbinsäurederivat, das mit dem Positronen emittierenden Isotop [¹⁸F] über nukleophile Ersetzung eines cyclischen Sulfats mit einem Fluoridion markiert ist. Die Biodistribution dieser Verbindung wurde in Ratten und Fibrosarcom-tragenden Mäusen studiert. Yamamoto et al. [Radiosiotopes 44, 93-98 (1995)] haben auch die Biodistribution von ¹⁸F-DFA in normalen Wistar-Ratten, ODS-Ratten, die nicht fähig sind zum Synthetisieren von Ascorbinsäure, und männlichen Wistar-Ratten, denen intrazerebral RG-G6-Gliome implantiert waren, und [Nucl. Med. Biol., 23, 479-486 (1996)] die in-vivo-Aufnahme und Verteilung von ¹⁸F-DFA in Rattengehirnen nach einer post-ischämischen Reperfusion studiert.
Die Aufhahme in den Knochen, die für ¹⁸F-DFA berichtet wurde, ist sehr gering, und es gibt kein Anzeichen, dass markierte Ascorbinsäurederivate für entweder die Knochenbildgebung im allgemeinen oder die Bildgebung der metastatischen Knochenerkrankung im besonderen nützlich sein könnte. Zusätzlich besitzt ¹⁸F eine Halbwertszeit von 1,8 h und ist deshalb nur nutzbar für ein paar Stunden (einschließlich Synthese- und Reinigungszeit). Daher ist eine beliebige klinische Verwendung von derartigen PET(Positronenemissionstomographie)-Mitteln auf eine sehr begrenzte Anzahl von medizinischen Einsatzorten beschränkt, die ein Cyclotron vor Ort besitzen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung umfasst diagnostische Mittel für die Detektion und Überwachung der metastatischen Knochenerkrankung, wie auch Radiotherapie einer derartigen Erkrankung. Die Mittel umfassen eine modifizierte Ascorbinsäure, die mit einer detektierbaren Einheit markiert ist, die für äußere Bildgebung (z.B. durch Scintigraphie oder MRI) geeignet ist, wie ein Radionuklid oder ein paramagnetisches Metallion.
Unmodifizierte Ascorbinsäure besitzt die Formel:
Die Mittel der vorliegenden Erfindung wirken durch Akkumulieren in Osteoblastenzellen, die an Stellen eines vergrößerten Knochenumsatzes vorhanden sind. Diese Stellen umfassen Gebiete einer Hyperproliferation, die mit der metastatischen Knochenerkrankung verbunden ist, wie auch andere pathologische Zustände von Knochen. Da die Ascorbinsäurederivate nur durch Osteoblasten an aktiven Läsionen aufgenommen werden, sind sie von diagnostischem und prognostischen Wert für osteoblastische Läsionen und ermöglichen eine schnelle Überwachung des Fortschreitens der Erkrankung. Die Verwendung von Ascorbaten kann auch das Auftreten von falschen negativen Scans verhindern über Sichtbarmachung von lytischen Läsionen aufgrund einer damit verbundenen osteoblastischen Aktivität und ermöglichen auch eine frühe Diagnose von kleinen Läsionen aufgrund eines spezifischen Aufnahmemechanismus. Die Aufnahme in einen normalen Knochen wird erfolgen und wird nützlich sein zum Lokalisieren der Läsionsstelle, wobei die Aufnahme stark vergrößert sein wird.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung.
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung bereit eine Verbindung der Formel:
wobei X¹ für OH oder SH oder NH₂ oder -L-Z steht;
X² und X³ dieselben oder verschieden sind und jeweils stehen für H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Fluoralkyl, Benzyl, eine Schutzgruppe oder -L-Z;
X⁴ für H oder C_1-4 Alkyl steht;
L für einen Linker steht, der eine Kette von 0 bis 10 Atomen umfasst;
Z für eine Gruppe steht, die eine detektierbare Einheit umfasst; mit der Maßgabe, dass die Verbindung mindestens eine detektierbare Einheit umfasst.
X¹ steht bevorzugt für -L-Z. X² und X³ stehen bevorzugt für H oder C₁-Alkyl, am meisten bevorzugt stehen sowohl X² als auch X³ für H. X⁴ steht bevorzugt für H oder C₁-Alkyl, am meisten bevorzugt für H. Der Linker L ist geeigneterweise eine Kette von 0 bis 10 Atomen der Formel (A)_m,
wobei: A steht für -CR₂-, -CR=CR-, -C≡C-, -NRCO-, -CONR-, -O(CO)-, -(CO)O-, -SO₂NR-, -NRSO₂-, -OCR₂-, -SCR₂-, -NRCR₂-, eine C_4-8-Cycloheteroalkylengruppe, eine C_4-8-Cycloalkylengruppe, eine C_5-12-Arylengruppe oder eine C_3-12-Hetero-arylengruppe;
m für eine ganze Zahl des Wertes 0 bis 10 steht;
jede R-Gruppe unabhängig ausgewählt ist aus H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkenyl, C_1-4-Alkinyl, C_1-4-Alkoxyalkyl oder C_1-4-Hydroxyalkyl. L umfasst bevorzugt eine 0-4-Atomkette.
Bevorzugte Verbindungen besitzen die gezeigte definierte Stereochemie:
wobei X¹-X⁴, L und Z wie oben definiert sind.
Die „detektierbare Einheit" ist eine Substanz, die für die externe Bildgebung nach einer Verabreichung an den Menschen geeignet ist, und kann ein Radionuklid sein, wobei das Radionuklid ein Gamma-Emitter ist, der eine Gammastrahlung emittiert, die weiches Gewebe durchdringen kann, ein Beta-Emitter oder ein Emitter von Röntgenstrahlung niedriger Energie ist. Radionuklide, die Positronen-Emitter sind, wie ¹¹C und ¹⁸F, stehen ausserhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. ³H und ¹⁴C sind keine geeigneten Radioisotope für entweder äußere Bildgebung oder Radiotherapie und liegen daher auch ausserhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Die detektierbare Einheit kann auch sein: eines oder mehrere hyperpolarisierte Atom(e), wie das ¹³C-Kohlenstoffatom einer ¹³C-angereicherten Verbindung für MRI-Bildgebung; eine paramagnetische Einheit als ein Kontrastmittel für MRI (z.B. bestimmte Metallionen, wie Gadolinium(III) oder Mangan(II)); eine strahlenundurchlässige Einheit, wie Iopamidol für Röntgenstrahlungs-Kontrast-Bildgebung (computerunterstützte Tomographie) oder ein Ultraschallkontrastmittel. Bevorzugt ist die detektierbare Einheit entweder ein Radionuklid-γ-Emitter, wie ¹²³I, ^99mTc; ¹¹¹In, ^113mIn oder ⁶⁷Ga oder ein hyperpolarisiertes Material. Die meisten bevorzugten Radionuklid-γ-Emitter sind ¹²³I und ^99mTc, speziell ^99mTc. Es wird auch in Betracht gezogen, dass bestimmte Radionuklide der markierten Ascorbinsäure nützliche radiotherapeutische Eigenschaften verleihen werden. So könnten z.B. ⁹⁰Y-, ⁸⁹Sr-, ¹⁸⁶Re-, ¹⁸⁸Re-, ¹²⁵I-,¹³¹I, ³²P- oder ³³P-markierte Ascorbinsäuren bei der Behandlung der metastatischen Knochenerkrankung verwendet werden. In derartigen Anwendungen würde der therapeutische Effekt auf der lokalen zielausgerichteten radioaktiven Dosis beruhen, die an spezifische Zellen geliefert wird, in Gegensatz zu einem beliebigen pharmakologischen Effekt aufgrund der Ascorbinsäure. Welche detektierbare Einheit auch immer gewählt wird, es ist stark bevorzugt, dass sie an die Ascorbinsäure auf eine derartige Weise gebunden ist, dass sie nicht einem einfachen Metabolismus unterliegt (entweder in vivo oder in vitro), da ein derartiger Metabolismus zur Biodistribution der detektierbaren Einheit führen würde, die nicht länger jene der Ascorbinsäure reflektiert.
Wenn die detektierbare Einheit ein hyperpolarisiertes ¹³C-Atom ist, kann dieses Atom einen integralen Teil der chemischen Struktur der Ascorbinsäure bilden, oder kann als eine ergänzende Gruppe gebunden sein. Die meisten anderen detektierbaren Einheiten müssen ergänzende strukturelle Elemente bilden, und können an die 2-, 3-, 4-, 5- oder 6-Positionen des Ascorbinsäurederivats gebunden werden. Bevorzugte Positionen für die detektierbare Einheit sind die 2-, 3-, und 6-Positionen, wobei die 6-Position am meisten bevorzugt ist.
Mit dem Begriff „Schutzgruppe" sind jene Einheiten gemeint, die jenen Fachleuten bekannt sind, und die eine metabolische Modifikation der Ascorbinsäureeinheit verhindern würden. Dies kann umfassen Alkyl-, Alkoxyalkyl-, Benzyl- oder Acylgruppen. Die Schutzgruppe kann auch dazu dienen, eine beliebige Oxidation oder einen anderen chemischen Abbauprozess der Ascorbinsäure-Hydroxylgruppen zu verhindern und für derartige Zwecke ist sie gewählt, um ausreichend labil zu sein, damit die Schutzgruppe während des Markier- oder Radiomarkierprozesses abgespalten wird.
Wenn die detektierbare Einheit ein radioaktives oder paramagnetisches Metall ist, wird das Metallion immer komplexiert. Dieser Metallkomplex wird bevorzugt erreicht durch Binden eines Liganden, der stark an Metalle an der Ascorbinsäureeinheit bindet. Derartige stark Metall-bindende Liganden umfassen Monodentat-Verbindungen, die gut an Übergangsmetalle binden, wie Phosphine, Isonitrile oder Hydrazide, und Polydentate, wie chelatierende Mittel. Das Liganden-Ascorbinsäure-Konjugat wird komplexiert mit dem radioaktiven oder paramagnetischen Metallion, und das Metall bindet selektiv an den Liganden, was einen Metallkomplex des Liganden ergibt, der an das Ascorbinsäurederivat gebunden ist.
Die chelatierenden Mittel der vorliegenden Erfindung umfassen zwei bis zehn Metalldonatoratome, die kovalent durch ein nicht-koordinatives Rückgrat verbunden sind. Geeignete chelatierende Bidentat-Mittel umfassen Bisphosphonate und Diphosphine. Bisphophonat-Komplexe von Radiometallen besitzen den Vorteil, dass der Radiometallkomplex bereits auf den Knochen in-vivo zielausgerichtet ist. Bevorzugte chelatierende Mittel besitzen vier bis acht Metalldonatoratome und weisen die Metalldonatoratome in entweder einer offenen Kette oder einer makrocyclischen Anordnung oder Kombinationen davon auf. Am meisten bevorzugte chelatierende Mittel besitzen vier bis sechs Metalldonatoratome und bilden 5- oder 6-gliedrige Chelatringe, wenn sie an das Metallzentrum koordiniert sind. Derartige Polydentat- und/oder makrocyclische chelatierende Mittel bilden stabile Metallkomplexe, die die Herausforderung durch endogene konkurrierende Liganden für das Metall in vivo überleben können, wie Transferrin oder Plasmaproteine. Der Metallkomplex sollte auch von einer geringen Lipophilizität sein (da eine hohe Lipophilizität oft verbunden ist mit einer nichtspezifischen Aufnahme) und zeigen eine geringe Plasmaprotein-Bindung, da ein plasmagebundener Marker wieder zu einem unerwünscht hohen, nicht-spezifischen Untergrund für das Bildgebungsmittel beiträgt.
Beispiele geeigneter chelatierender Mittel sind Diamindioxime ( US 4615876 ) oder derartige Chelate, die Amid-Donatoren eingebaut haben (WO 94/08949); die Tetradentat-Chelate von WO 94/22816; N₂S₂-Diamindithiole, Diamiddithiole oder Amidamindithiole; N₃S-Thioltriamide; N₂O₂-Diamindiphenole; N₄-Chelate, wie Tetraamine, makrocyklische Amine oder Amid-Chelate, wie Cyclam, Oxocyclam (das einen neutralen Technetiumkomplex bildet) oder Dioxocylcam; oder Dithiosemicarbazone. Die oben beschriebenen Chelate sind besonders geeignet für Technetium, sind aber auch nützlich für andere Metalle. Andere geeignete Chelate sind beschrieben in WO 91/01144, die Chelate umfasst, die besonders geeignet sind für Indium, Ytrium und Gadolinium; speziell makrozyklische Aminocarboxylat- und Aminophosphonsäure-Chelate. Chelate, die nicht-ionische, d.h. neutrale Metallkomplexe des Gadolinium bilden, sind bekannt und beschrieben in US 4885363 . Das Chelat kann auch eine kurze Sequenz von Aminosäuren umfassen, wie das Cys/Aminosäure/Cys-Tripeptid der WO 92/13572 oder die Peptidchelate, die in EP 0719790 A2 beschrieben sind.
Wenn die detektierbare Einheit ein radioaktives Isotop von Iod ist, ist das Radioiodatom bevorzugt gebunden über eine direkte kovalente Bindung an einen aromatischen Ring, wie einen Benzolring, oder an eine Vinylgruppe, da es bekannt ist, dass Iodatome, die an gesättigte aliphatische Systeme gebunden sind, zu in-vivo-Metabolsimus und daher dem Verlust der detektierbaren Einheit neigen.
Knochenmetastasen können osteoblastisch (10%), osteolytisch (65%) oder gemischt (25%) im Erscheinungsbild sein. Es wird geglaubt, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung nur von aktivierten Osteoblasten an Stellen eines vergrößerten Knochenumsatzes, d.h. aktiven Läsionen, aufgenommen werden. Derartige Stellen umfassen Gebiete der Hyperproliferation, die mit metastatischer Knochenerkrankung verbunden ist, wie auch andere pathologische Knochenzustände. Es wird deshalb erwartet, dass die vorliegenden Verbindungen von hohem diagnostischen und prognostischem Wert für osteoblastische Läsionen sind, und schnelles Überwachen des Erkrankungs- und Behandlungsfortschrittes ermöglichen. Dies steht im Gegensatz zum [^99mTc]-MDP des Standes der Technik, das an Stellen der Collagenproduktion akkumuliert, lange nachdem Tumorzellen tot sind, was keine Information über die Zelllebensfähigkeit ergibt. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch darin unterstützen, das Auftreten falscher negativer Scans zu verhindern, über das Sichtbarmachen von osteolytischen Läsionen aufgrund einer verbundenen osteoblastischen Aktivität und ermöglicht eine frühe Diagnose von kleinen Läsionen aufgrund des spezifischen Aufnahmemechanismus. Die relativ schnelle erwartete Clearance-Zeit sollte eine schnelle Bildgebung und einen hohen Patientendurchsatz ermöglichen. Die vorliegenden Verbindungen können auch akkumulieren in Fibroblasten und könnten daher nützlich sein in der diagnostischen Bildgebung von Stellen einer Wundreparatur, und können auch nützlich sein in der Diagnose anderer pathologischer Knochenzustände, z.B. Osteoporose und Arthritis.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Offenbarung neuer Ascorbinsäurederivate. Diese können als Pharmazeutika für die Behandlung von Tumoren nützlich sein, die dafür bekannt sind, dass sie Ascorbinsäure akkumulieren, insbesondere Knochentumore, und können auch an therapeutische Radioisotope oder cytotoxische Arzneimittel gebunden sein.
Neue Ascorbinsäurederivate, einschließlich jene, die mit nicht-radioaktiven ¹²⁷I-markiert sind, sind hergestellt worden und es ist gezeigt worden, dass sie mit ¹⁴C-markierter Ascorbinsäure für die Aufnahme in Murin-Präosteoblasten(MC3T3-E1)-Zellen konkurrieren. Derartige Derivate haben im wesentlichen identische chemische Eigenschaften für die radioaktiven Gegenstücke, die mit Radioiod markiert sind, z.B. ¹²³I oder ¹³¹I. Zusätzlich sind auch ein paar bekannte Verbindungen synthetisiert und für sie ist gezeigt worden, dass sie mit ¹⁴C-markierter Ascorbinsäure um die Aufnahme in MC3T3-E1-Zellen konkurrieren. Außerdem wurde gezeigt, dass ein ¹⁴C-markiertes Ascorbinsäurederivate (Verbindung 17) in primären Rattenosteoblasten über eine Zeitdauer von 5 h akkumulieren und über diese Zeit stabil bleiben. Unter Verwenden von Autoradiographie wurde auch eine Akkumulation in mineralisierten Knochenknötchen gezeigt, die von Ratten-Osteoblasten über eine Zeitdauer einer 21-Tage-Kultur erzeugt wurden. In vivo wurde die Menge der ¹⁴C-Verbindung 17, die in der Epiphyse der Ratten 60 min nach der i.v.-Injektion akkumulierte, mit jener verglichen, die in der Diaphyse akkumulierte, und wurde als 2,3-mal größer befunden aufgrund einer vergrößerten Osteoblastenaktivität an diesen Stellen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden wie folgt. Wenn die detektierbare Einheit radioaktives Iod ist, muss der Substituent, der an Ascorbinsäure gebunden ist, ein nicht-radioaktives Halogenatom (um einen Radioiod-Austausch zu ermöglichen), einen aktivierten aromatischen Ring (z.B. eine Phenolgruppe), eine organometallische Vorläuferverbindung, wie Trialkylzinn oder Trialkylsilyl, eine organische Vorläuferverbindung, wie Triazene oder andere derartige Einheiten, die jenen Fachleuten bekannt sind, umfassen. Beispiele geeigneter Substituenten, an die radioaktives Iod gebunden werden kann, sind unten angegeben:
Beide Substituenten enthalten Gruppen, die eine einfache Radioiod-Substitution auf dem aromatischen Ring ermöglichen. Alternative Substituenten, die radioaktives Iod enthalten, können durch direkte Iodierung über Radiohalogen-Austausch synthetisiert werden, z.B.
Gruppen für die Substitution von Radioiod können gebunden werden an Ascorbinsäure wie folgt. Ein Substituent, der mit einer Carbonsäuregruppe funktionalisiert ist, kann mit dem 6-OH der Ascorbinsäure umgesetzt werden, um eine Esterbindung zu ergeben [J. Carbohyd. Chem. 17 (3) 397-404 (1998)]. Alternativ kann 6-Bromdesoxy-L-ascorbinsäure [Suskovic, Croat. Chem. Acta, 58, 231 (1985)] umgesetzt werden mit einem Amino- oder Thiol-funktionalisierten Substituenten, um eine Amino- [Kralj et al, Eur. J. Med. Chem., 31, 23, (1996)] oder Thioether- [Carbohyd. Res., 134, 321, (1984)] Bindung zu ergeben. 6-Amino-6-desoxy-L-ascorbinsäure [Suskovic, Croat. Chem. Acta, 62, 537 (1989)] kann umgesetzt werden mit Substituenten, die mit Carbonsäure oder einem aktiven Ester funktionalisiert sind, um eine Amidverbindung zu ergeben. Fachleute werden erkennen, dass viele alternative Synthesen von Ascorbinsäurederivaten, die für Radioiodierung geeignet sind, basierend auf dieser Offenbarung möglich sind.
Ein alternatives Verfahren zum Synthetisieren von Ascorbinsäurederivaten, die für die Radioiodierung geeignet sind, umfasst eine Wiederanordnung eines L-Gulonats (unten gezeigt) unter sauren Bedingungen [Crawford et al., Adv. Carbohyd. Chem. Biochem., 37, 79 (1980)].
Die 4,6-Isopropyliden-Schutzgruppe wird entfernt und ein Substituent, der für Radioiodierung geeignet ist, wird an das primäre Hydroxyl des L-Gulonats über beispielsweise eine Ether- oder Esterbindung gebunden und das modifizierte L-Gulonat umgelagert, um das entsprechende Ascorbinsäurederivat zu ergeben. Alternativ kann das primäre Hydroxyl durch eine Brom- oder Aminogruppe zur Reaktion mit einer annähernd funktionalisierten Gruppe substituiert werden, die zur Radioiodierung geeignet ist, vor der Umlagerung zur Ascorbinsäure.
Wenn die detektierbare Einheit ein radioaktives oder paramagnetisches Metallion ist, wird ein chelatierendes Mittel an das Ascorbat gebunden, was ein Chelat-Ascorbinsäure-Konjugat ergibt. Derartige Chelat-Ascorbinsäure-Konjugate können hergestellt werden unter Verwenden des bifunktionalen Chelat-Ansatzes. Daher ist es gut bekannt, chelatierende Mittel herzustellen, die eine daran gebundene funktionelle Gruppe besitzen („bifunktionelle Chelate"). Funktionelle Gruppen, die an chelatierende Mittel gebunden worden sind, umfassen: Amin, Thiocyanat, Maleimid, und ein aktives Ester, wie N-Hydroxysuccinimid. Derartige bifunktionelle Chelate können umgesetzt werden mit geeigneten funktionellen Gruppen auf der Ascorbinsäure, um das erwünschte Konjugat zu bilden. Beispiele von Chelat-Amin-Konjugaten für Diamindioxim-Liganden sind angegeben in WO 95/19817. Im besonderen Fall der Ascorbinsäure kann ein chelatierendes Mittel an der 6-Position wie folgt gebunden werden. Ascorbinsäure kann umgesetzt werden mit einem Chelat-Carbonsäure-Konjugat, um ein Chelat-Ascorbinsäure-Derivat zu ergeben, das über eine Esterbindung gebunden ist. 6-COOH-6-Desoxy-L-ascorbinsäure [Stuber er al., Carbohyd. Res., 60, 25 (1978)] kann umgesetzt werden mit einem Chelat-Amin-Konjugat, oder 6-NH₂-6-Desoxy-L-ascorbinsäure kann mit einem aktiven Chelat-Ester oder einem Chelat-Carbonsäure-Konjugat umgesetzt werden, um Chelat-Ascorbinsäure-Derivate zu ergeben, die über Amidbindungen verbunden sind. 6-Br-6-Desoxy-L-ascorbinsäure kann umgesetzt werden mit einem Chelat-Amin- oder Chelat-Thiol-Konjugat, um entweder eine Amin- oder Thioether-Bindung zu ergegen.
Ein alternatives Verfahren zum Synthetisieren von Ascorbinsäurederivaten beinhaltet die Umlagerung eines L-Gulonat-Derivats wie oben beschrieben. Diese Reaktion kann verwendet werden in der Synthese von Chelat-Ascorbinsäure-Konjugaten. Ein Chelat kann gebunden werden an das L-Gulonat unter Verwenden eines der Verfahren, die oben beschrieben sind, und das resultierende Chelat-L-Gulonat-Konjugat kann umgelagert werden, um das entsprechende Chelat-Ascorbinsäure-Derivat zu ergeben. Fachleute werden erkennen, dass viele alternative Synthesen von Chelat-Ascorbinsäure-Konjugaten möglich sind basierend auf dieser Offenbarung.
Wenn die detektierbare Einheit ein hyperpolarisiertes Atom ist, wie ein hyperpolarisiertes ¹³C-Atom, kann die erwünschte hyperpolarisierte Verbindung hergestellt werden durch einen Polarisationsaustausch aus einem hyperpolarisierten Gas (wie ¹²⁹Xe oder ³He) zu einem geeigneten ¹³C-angereichertem Ascorbinsäure-Derivat. Sowohl [1-¹³C]- als auch [2-¹³C]-markierte Ascorbinsäurederivate sind bekannt, und wurden verwendet, um einen Transport und einen Redox-Kreislauf in menschlichen Erythrocyten zu untersuchen [Himmelreich et al., Biochem. 37, 7578 (1998)]. ¹³C-angereicherte Ascorbinsäure-Derivate können auch hergestellt werden in einer zu den synthetischen Routen für ¹⁴C-markierten Ascorbinsäurederivate der Literatur analogen Weise. So haben Hornig et al. [Int. J. Vit. Nutr. Res. 42, 223 (1997) und ibid 42, 511 (1972)] die autoradiographische Biodistribution von [1-¹⁴C]-L-Ascorbinsäure in normal gefütterten und Vitamin-C-verarmten Meerschweinchen nach der intravenösen Injektion studiert. Karr et al. [J. Lab. Comp., 6, 155 (1970)] haben auch [6-¹⁴C]-L-Ascorbinsäure und [5-¹⁴C]-L-Ascorbinsäure aus D-Glucose-1-¹⁴C bzw. D-Glucose-2¹⁴C hergestellt. Williams et al. (Carbohyd. Res., 63, 149 (1978)] beschrei ben die Synthese von [4-¹⁴C]-L-Ascorbinsäure aus D-[3-¹⁴C]-Glucopyranose und [6-¹⁴C]-L-Ascorbinsäure aus D-[1-¹⁴C]-Glucopyranose.
Unmarkierte Ascorbinsäurederivate der vorliegenden Erfindung wurden auf ihre Fähigkeit getestet, um die Aufnahme von ¹⁴C-Ascorbinsäure in MC3T3-E1-Zellen zu konkurrieren, eine Murin-Präosteoblasten-Zelllinie. MC3T3-E1-Zellen werden in Gewebekulturplatten gezogen und die geeignete Assay-Lösung, die eine Standardkonzentration von ¹⁴C-Ascorbinsäure plus eine konkurrierende Konzentration von Ascorbinsäurederivat enthält, zu jedem Well gegeben. Die Menge von ¹⁴C-Ascorbinsäure, die von den Zellen in 60 min aufgenommen werden, wird dann gemessen.
Es wurde gefunden, dass von den Verbindungen 11 bis 15 nur jene um die Aufnahme von ¹⁴C-Ascorbinsäure in MC3T3-E1-Zellen konkurrieren, die einen Iodphenyl-, Bromphenyl- oder Iodvinyl-Subsituenten enthalten. Ergebnisse sind in Tabelle 10 angegeben. Beide Verbindungen 16 und 17 konkurrierten um die Aufnahme von ¹⁴C-Ascorbinsäure in MC3T3-E1-Zellen, obwohl die Konkurrenz um die Verbindung 16 sehr schwach war. Obwohl beide von diesen Verbindungen bekannt sind, wurde von keiner in der Literatur berichtet, dass sie eine Konkurrenz mit ¹⁴C-Ascorbinsäure um die Aufnahme in Prä-Osteoblasten oder Osteoblastenzellen zeigen.
Ascorbinsäurederivate, die mit einer detektierbaren Einheit der vorliegenden Erfindung markiert sind, können hergestellt werden unter Verwenden von Kits. Die Kits sind entworfen, um sterile Produkte zu ergeben, die für die Verabreichung an den Menschen geeignet sind, z.B. über eine Injektion in den Blutstrom. Wenn die detektierbare Einheit ^99mTc ist, würde das Kit ein Fläschchen umfassen, enthaltend entweder ein Ascorbinsäurederivat, das zum Bilden eines Metallkomplexes mit ^99mTc geeignet ist, oder ein Chelat-Ascorbinsäure-Konjugat, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Reduktionsmittel, wie Natriumdithionit, Natriumbisulfit, Formamidinsulfonsäure, Zinnion, Fe(II) oder Cu(I). Das Reduktionsmittel ist bevorzugt ein Zinnsalz wie Zinnchlorid oder Zinntartrat.
Alternativ könnte das Ascorbinsäurederivat oder das Konjugat des chelatierenden Mittels mit Ascorbinsäure vorhanden sein als der Metallkomplex eines geeigneten nicht-radioaktiven Metalls, der bei Zugabe des Radiometalls eine Transmetallierung durchläuft (d.h. Ligandenaustausch), was das erwünschte Produkt ergibt. Das Kit kann lyophilisiert sein und ist entworfen, um mit sterilem ^99mTc-Pertechnetat (TcO₄ ^-) aus einem ^99mTc-Radiositotopengenerator wiederhergestellt zu werden, um eine Lösung zu ergeben, die für die Verabreichung an den Menschen ohne weitere Manipulation geeignet ist.
Die Mittel für die vorliegende Erfindung können auch bereitgestellt werden in einer Einheitsdosisform, die für die Injektion in den Menschen bereit ist, und könnte z.B. in einer vorgefüllten sterilen Spritze geliefert werden. Wenn die detektierbare Einheit ein radioaktives Isotop ist, wie ^99mTc, würde die Spritze, die die Einheitsdosis enthält, auch mit einer Spritzenabschirmung geliefert werden (um den Anwender vor einer möglichen radioaktiven Dosis zu schützen).
Die oben genannten Kits oder vorgefüllten Spritzen können gegebenenfalls weitere Inhaltsstoffe enthalten, wie Puffer; pharmazeutisch annehmbare Lösungsvermittler (z.B. Cyclodextrine oder oberflächenaktive Stoffe, wie Pluronic, Tween oder Phospholipide); pharmazeutisch annehmbare Stabilisatoren/Antioxidantien (wie Gentisinsäure oder para-Aminobenzoesäure) oder Füllstoffe für die Lyophilisierung (wie Natriumchlorid oder Mannitol).
Die Struktur der Verbindung 10 ist in Schema 1 angegeben. Die Strukturen der Verbindungen 11 bis 28 sind angegeben in den Tabellen 1 bis 4. Die Herstellung der Verbindungen 10-19 und 21-28 ist in Beispielen 1 bis 6 beschrieben. NMR-Daten für die Verbindungen sind in Tabellen 4 bis 9 angegeben. Die biologischen Eigenschaften der Verbindungen 11 bis 18 sind in Beispiel 7 und Tabelle 10 gezeigt. Die biologischen Eigenschaften der Verbindung 17 sind weiter in den Beispielen 8 und 9 diskutiert. Schema 1: Synthese der Verbindung 10

Tabelle 1
Tabelle 2
Tabelle 3
wobei: [Diamindiphenol]-Linker sind:
wobei: [Pn216]-Linker sind:
wobei: [Isopropylamin]-Linker sind:
wobei [Hynic]-Linker ist
Tabelle 4
Experimentelles
Beispiel 1: Synthese eines Bisphosphonat-Konjugats 10.
Chemische ¹H-NMR-Verschiebungen beziehen sich auf TMS; chemische ¹³C-NMR-Verschiebungen beziehen sich auf CDCl₃ bei 77 ppm oder, für wässrige Lösungen, MeOH bei 49,2 ppm; chemische ³¹P-NMR-Verschiebungen beziehen sich auf externe 85%-ige H₃PO₄.
3,3-Bis(diisopropoxyphosphinyl)propionsäure (3)
Natriumhydrid (700 mg, 0,29 mmol) wurde in kleinen Portionen unter einem Strom von trockenem Stickstoff zu einer kräftig gerührten Lösung von Tetraisopropylmethan-1,1-bisphosphonat (1) (5,0 g, 14,5 mmol) in trockenem Toluol (25 ml) gegeben. Nachdem das Sprudeln endete, wurde das Rühren 15 min lang fortgesetzt. Ethylbromacetat (3,2 g, 19,2 mmol) wurde dann tropfenweise über eine Zeit (2 min) zugegeben, wobei der Kolben warm wurde und sich ein weißes Präzipitat zu formen begann. Rühren wurde fortgesetzt für weitere 2 h bei Raumtemperatur. Wasser (20 ml) wurde dann vorsichtig zugegeben und die Mischung kräftig gerührt. Die Toluol schicht wurde getrennt und extrahiert mit Wasser (20 ml). Die wässrigen Extrakte wurden kombiniert, mit Ether (50 ml) gewaschen, angesäuert auf pH 1 und wieder extrahiert mit Dichlormethan (2 × 25 ml). Die Dichlormethanextrakte wurden kombiniert, getrocknet (MgSO₄), filtriert und das Lösungsmittel unter verringertem Druck verdampft, um die Säure (3) als eine blassgelbe Flüssigkeit (800 mg) zurückzulassen. Die Toluolschicht wurde auch getrocknet (MgSO₄), filtriert und das Lösungsmittel verdampft, um ein Öl zu hinterlassen, das als das Ethylester (2) und nicht umgesetztes Ausgangsmaterial gefunden wurde. Dieses Öl wurde in einer Mehtanol:Wasser-Mischung (20 ml, 3:1) enthaltend Lithiumhydroxid (1 g, 24 mmol) aufgelöst und die Lösung bei Raumtemperatur für 16 h gerührt. Das Methanol wurde entfernt durch Verdampfen und Wasser (20 ml) wurde dann zugegeben. Diese wässrige Lösung wurde mit Ether (2 × 20 ml) gewaschen, auf pH 1 angesäuert mit verdünnter HCl und dann extrahiert mit Dichlormethan (2 × 25 ml). Die Dichlormethanextrakte wurde kombiniert, getrocknet (MgSO₄), filtriert und flüchtige Komponenten wurden unter verringertem Druck entfernt, um die Säure (3) (2,77 g) als eine blassgelbe Flüssigkeit zu hinterlasen. Das kombinierte Produkt (3) (3,57 g, 61%) war ausreichend rein, um in nachfolgenden Reaktionen ohne weitere Reinigung verwendet zu werden.

δ_P (CDCl₃) 21,79
δ_C (CDCl₃) 23,7 (m), 30,6 (s), 34,0 (t, J_PC = 138 Hz), 71,8 (m), 172,8 (s)

(N-Succinimidyl)-3,3-bis(bisisopropoxyphosphinyl)propionat (4)
Eine Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid (2,0 g, 9,71 mmol) in Dichlormethan (10 ml) wurde in einer Portion zu einer gerührten Lösung von 3,3-Bis(bisisopropoxyphosphinyl)propionsäure (3) (3,57 g, 8,88 mmol) und N-Hydroxysuccinimid (1,15 g, 10 mmol) in trockenem Dichlormethan (35 ml) gegeben. Nach ungefähr 10 Minuten begann ein weißes Precipitat von Dicyclohexylharnstoff zu erscheinen. Die Mischung wurde gerührt für 16 h und der gebildete Feststoff wurde abfiltriert und mit Dichlormethan gewaschen (15 ml). Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck aus den kombinierten Dichlormethanlösungen entfernt, um einen viskosen Rückstand zu hinterlassen, für den gezeigt wurde durch NMR, dass er die Titelverbindung in einem guten Zustand der Reinheit war. Eine schließliche Reinigung dieses Rückstandes wurde ausgeführt unter Verwenden von Chromatographie auf Silica mit einer Dichlormethan:Methanol-Mischung(19:1) als Eluent. Das Produkt (4,0 g, 91%) (R_f0,2) wurde als ein viskoses Öl isoliert.

δ_P (CDCl₃) 20,0
δ_H (CDCl₃) 1,25-1,31 (24H, m, CH₃ × 8), 2,77 (4H, s, CH₂ × 2), 2,83 (1H, m, CH), 2,7-3,1 (2H, m, CH₂), 4,37 (4H, dq, J_HH = 6 Hz, J_PH = 13,5 Hz, CH × 4)

(R)-5-(2-Azido-(S)-1-hydroxyethyl)-3,4-dibenzyloxy-5H-furan-2-on (6)
(R)-5-[2-(4-Methylphenylsulfonyloxy)-(S)-1-hydroxyethyl]-3,4-dibenzyl-oxy-5H-furan-2-on (5)(550 mg, 1,1 mmol), Natriumazid (190 mg, 1,7 mmol) und Methanol (2 ml) wurden unter Rückfluss sechs Stunden lang erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde gekühlt und das meiste des Lösungsmittels durch Verdampfen bei Raumtemperatur entfernt. Das resultierende Material wurde aufgeteilt zwischen Wasser (25 ml) und Dichlormethan (25 ml) und die wässrige Phase mit Dichlormethan (25 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Fraktionen wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und flüchtige Komponenten verdampft unter verringertem Druck (8 mm/Hg) bei Raumtemperatur, um das Produkt (6) als einen gelben wachsartigen Feststoff (357 mg, 89%) zu ergeben. Dieses Material wurde ohne weitere Reinigung verwendet.

δ_H (CDCl₃) 3,22 (1H, dd, J = 6 und 12,5 Hz, CH₂N₃), 3,40 (1H, br d, OH), 3,46 (1H, dd, J = 7 und 12,5 Hz, CH₂N₃), 3,88 (1H, br m, CHO), 4,55 (1H, d, J = 2 Hz, CHO-Ring), 4,95 (2H, br s, OCH₂), 5,03 (1H, d, J = 12 Hz, OCH), 5,08 (1H, d, J = 12 Hz, CHO), 7,12 (2H, m, Ar), 7,21-7,31 (8H, m, Ar)

(R)-5-(2-Amino-(S)-1-hydroxyethyl)-3,4-dibenzyloxy-5H-furan-2-on (7)
Triphenylphosphin (600 mg, 2,4 mmol) wurde zu einer gerührten Lösung von (R)-5-(2-Azido-(S)-1-hydroxyethyl)-3,4-dibenzyloxy-5H-furan-2-on (5) (750 mg, 2 mmol) in THF (10 ml) gegeben und nach ein paar Minuten entwickelte sich Gas. Das Rühren wurde fortgesetzt, bis das Sprudeln abklang (typischerweise 2-3 Stunden) und Wasser (2 ml) wurde dann zugegeben und die Mischung für eine weitere Stunde gerührt. Das THF wurde entfernt unter verringertem Druck und der Rückstand aufgeteilt zwischen Dichlormethan (25 ml) und Wasser (25 ml). Die organische Phase wurde getrennt, getrocknet (MgSO₄), filtriert und jegliche flüchtige Komponenten wurden unter verringertem Druck (45°C bei 8 mm/Hg) verdampft, um einen viskosen orangefarbenen Rückstand zu hinterlassen, der gereinigt wurde durch Chromatographie auf Silica. Die anfängliche Elution mit einer Dichlormethan:Methanol(19:1)-Mischung entfernte die weniger polaren Nebenprodukte und das Produkt wurde dann isoliert durch eine Dichlormethan:Methanol(3:1)-Mischung als ein blasses gelbes Öl (150 mg, 21 %) (R_f0,25).

δ_H (CDCl₃) 2,49 (3H, br s, NH₂ und OH), 2,76 (1H, dd, J = 5 und 13 Hz, NCH), 2,83 (1H, dd, J = 7 und 13 Hz, NCH), 3,70 (1H, m, CHO), 4,47 (1H, d, J = 2 Hz, CHO Ring), 4,98 (2H, s, OCH₂), 5,05 (1H, d, J = 12 Hz, OCH), 5,11 (1H, d, J = 12 Hz, CHO), 7,10-7,17 (2H, m Ar), 7,20-7,32 (8H, m, Ar)

(R)-5-(3-Aza-6,6-bis(bisisopropoxyphosphinyl)-(S)-1-hydroxy-4-oxo-hexyl)-3,4-dibenzyloxy-5H-furan-2-on (8)
(R)-5-(2-Amino-(S)-1-hydroxyethyl)-3,4-dibenzyloxy-5H-furan-2 on (7) (180 mg, 0,5 mmol) in trockenem Dichlormethan (1 ml) wurde zugegeben in einer Portion zu einer gerührten Lösung aus (N-Succinimidyl)-3,3-bis(bisisopropoxyphosphinyl)propionat (4) (250 mg, 0,5 mmol) in trockenem Dichlormethan (1 ml), wobei Kristalle von N-Hydroxysuccinimid auszufallen begannen. Die Mischung wurde 30 Minuten lang gerührt, Dichlormethan (10 ml) wurde dann zugegeben und die Lösung mit Wasser (2 × 10 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde dann getrocknet (MgSO₄), filt riert und das Lösungsmittel verdampft unter verringertem Druck, um (8) als ein blassgelbes viskoses Öl in einem virtuell reinen Zustand zu hinterlassen. Die schließliche Reinigung konnte erreicht werden durch Chromatographie auf Silica mit einer Dichlormethan:Methanol-Mischung (19:1) als dem Eluenten. Das Produkt (8) (180 ml, 49%) (R_f 0,25) wurde als blassgelbes viskoses Öl erhalten.

δ_H (CDCl₃) 21,9 (d, J_PP = 4 Hz), 22,0 (d, J_PP = 4 Hz) Mass. spek. (FABS), berechnet für C₃₅H₅₂NO₁₂P₂ 740,2965 (M+H)⁺, gefunden 740,2965.

(R)-5-(3-Aza-6,6-bis(bisisopropoxyphosphinyl)-(S)-1-hydroxy-4-oxo-hexyl)-3,4-dihydroxy-5H-furan-2-on (9)
Eine Lösung von (R)-5-(3-Aza-6,6-bis(bisisopropoxyphosphinyl)-(S)-1-hydroxy-4-oxo-hexyl)-3,4-dibenzyloxy-5H-furan-2-on (8) (700 mg, 0,96 mmol) in Methanol (10 ml) wurde hydriert über einem Palladiumkatalysator (200 mg, 10% Pd/C) in einer Wasserstoffatmosphäre (30 atm) für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Der Katalysator wurde durch Filtration durch Celite entfernt und der Filterkuchen wurde mit Methanol gewaschen (50 ml). Diese Waschlösungen wurden kombiniert mit dem Methanolfiltrat und die flüchtigen Komponenten verdampft unter verringertem Druck, um (9) als ein viskoses Öl in einem guten Zustand der Reinheit zu hinterlassen. Der Rückstand wurde gereinigt durch Chromatographie auf Silica und unter Verwenden einer Ethylacetat:Methanol(9:1)-Mischung als den Eluenten. Das reine Produkt (9) (50 mg, 9%) (R_f 0,3) wurde als ein cremefarbiger Feststoff isoliert.

δ_P (CDCl₃) 21,8 (br s), 22,98 (br s) Mass. spek. (FABS), berechnet für C₂₁H₄₀NO₁₂P₂ 560,2026 (M+H)⁺, gefunden 560,2026.

6-[(R)-5-(2,5-Dihydro-3,4-dihydroxy-2-oxo-furan-5-yl)]-4-aza-(S)-6-hydroxy-3-oxo-hexan-1,1-bisphosphonsäure (10)
Zu einer Lösung von (R)-5-(3-Aza-6,6-bis(bisisopropoxyphosphinyl-(S)-1-hydroxy-4-oxo-hexyl)-3,4-dihydroxy-5N-furan-2-on (9) (370 mg, 0,6 mmol) in Dichlormethan (10 ml) wurde Bromtrimethylsilan (1 g, 6,4 mmol) gegeben. Die Mischung wurde unter Rückfluss sechs Stunden lang erwärmt und das Lösungsmittel wurde dann entfernt unter verringertem Druck. Methanol (25 ml) wurde zugegeben und flüchtige Komponenten unter verringertem Druck verdampft. Dieser Prozess wurde zweimal wiederholt, um einen braunen Rückstand zu hinterlassen. Das Produkt (10) wurde gereinigt durch Revers-Phasen-HPLC auf einer C₁₈-Säule unter Verwenden von wässrigem Methanol (50%) als Eluenten und isoliert als ein blassbrauner Feststoff (120 mg, 46%).

δ_P (D₂O) 21 (br)
δ_P (D₂O) 32,1 (br s), 34,8 (t, J_PC = 138 Hz), 42,1 (s), 67,1 (s), 76,8 (s), 118,1 (s), 155,5 (s), 173,4 (s), 173,5 (br s).

Beispiel 2: Synthese der Verbindungen 11 bis 15
Die Verbindungen 11 bis 15, alle Ester der Ascorbinsäure, wurden direkt aus Ascorbinsäure und der entsprechenden Carbonsäure synthetisiert unter Verwenden des Verfahrens, das von Gan et al. berichtet wurde [J. Carbohyd.Chem., 17, 397-404 (1998)]. Die Verbindungen 11 und 13 bis 15 wurden alle synthetisiert unter Verwenden einer Prozedur, die jener ähnlich ist, die unten für 6-O-(4-Iodbenzoyl)-L-ascorbinsäure (Verbindung 12) angegeben ist:

4-Iodbenzoesäure (0,5 g, 2,48 mmol) und L-Ascorbinsäure (2 g, 11,3 mmol) wurden gemischt und gerührt in konzentrierter Schwefelsäure (10 ml) für 24 Stunden bei Raumtemperatur. Die Reaktion wurde gequencht durch die Zugabe von Eis und festem Natriumchlorid. Die Mischung wurde extrahiert mit Ethylacetat und die organische Schicht über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Titelverbindung wurde isoliert durch Verdampfen unter verringertem Druck ge folgt von Kristallisation aus einer Chloroform/Hexan-Mischung und Trocknen unter Vakuum (200 mg, 5,6 mmol).

Beispiel 3: Synthese der Verbindungen 16 und 17
Diese Verbindungen wurden synthetisiert unter Verwenden von Verfahren, die den Literaturprozeduren ähnlich sind, [Carbohyd.Res., 134, 321, (1984)] für die Verbindung 16 und [J.Biol.Chem., 271, 26032, (1996)] für die Verbindung 17. Die ¹⁴C-Verbindung 17 wurde hergestellt unter Verwenden eines ähnlichen Verfahrens, aber ausgehend von ¹⁴C-Brom-ascorbinsäure.
Beispiel 4: Synthese der Verbindungen 18 und 19
Diese Verbindungen wurden synthetisiert unter Verwenden sehr ähnlicher Verfahren. Zu einer Lösung aus Natriumcarbonat (960 mg) in Methanol (2 ml) und Wasser (6 ml) wurde 6-Brom-L-ascorbinsäure (500 mg) und Thiosalicylsäure (350 mg; für die Verbindung 18) oder 3-Mercaptopropionsäure (240 mg; für die Verbindung 19) gegeben. Die resultierende Mischung wurde mindestens vier Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und die Reaktion auf Vollständigkeit durch TLC überprüft. Die Reaktion wurde angesäuert unter Verwenden von 2M HCl und das Produkt in Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Salzwasser gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Filtration und Verdampfen zum Trocknen ergab einen gelbbraun gefärbten Feststoff, der mit Chloroform behandelt wurde und filtriert wurde, um 590 mg Verbindung 18/200 mg Verbindung 19 zu ergeben.
Beispiel 5: Synthese der Verbindungen 21 bis 27
Verbindung 21
Die Trityl-geschützte Säure wurde hergestellt durch ein Verfahren, das beschrieben ist in [Inorg.Chem. 23 (23) 3795-3797 (1984)]. S-Trityl-mercapto-essigsäure (5,6 g) wurde aufgelöst in trockenem Acetonitril (60 ml) unter Stickstoff. Dazu wurde eine Lösung von N-Hydroxysuccinimid (2 g) in Acetonitril (10 ml) gegeben. Diesem folgte die Zugabe von DCC (4,4 g) in Acetonitril (20 ml). Die Mischung wurde gerührt über Nacht bei Raumtemperatur. Das Produkt wurde isoliert durch Filtration gefolgt von Verdampfen des Filtrats, um einen weißen Feststoff (6 g) zu ergeben. Das S-Trityl-mercapto-essigsäure-NHS-ester (400 mg) wurde aufgelöst in trockenem Dichlormethan (10 ml) unter Stickstoff. Dazu wurde der Diaminodiphenol-Ligand (300 mg) gegeben, gefolgt von Triethylamin (146 μl). Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und das Produkt durch Verdampfen isoliert, gefolgt von Flash-Säulen-Chromatographie auf Silica. Der Trityl-geschützte Diaminodiphenol-Linker (270 mg) wurde in DCM (6 ml) aufgelöst, dazu wurde Triethylsilan (100 μl) gegeben, gefolgt von Trifluoressigsäure (300 μl). Die Mischung wurde vier Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, wonach sie zum Trocknen verdampft und direkt im schließlichen Schritt verwendet wurde, der ausgeführt wurde wie beschrieben für die Verbindungen 18 und 19. Die Verbindungen 22 bis 27 wurden hergestellt in einer analogen Weise.
Beispiel 6: Synthese der Verbindung 28
Diese Verbindung wurde synthetisiert unter Verwenden einer Kombination von Verfahren, die in der Literatur beschrieben sind. Das Chelat MAG3 wurde hergestellt unter Verwenden des Verfahrens, das von Winnard et al. beschrieben ist [Nucl Med Biol 24, 425-432 (1997)]. N-Methyl-6-amino-6-desoxy-O³-benzyl-L-ascorbinsäure wurde hergestellt durch ein Verfahren, das beschrieben ist von Kralj M et al. [Eur J Med Chem 31, 23-35 (1996)]. Die Kopplungsreaktion zwischen MAG3 und der N-Methyl-6-amino-6-desoxy-O³-benzyl-L-ascorbinsäure wurde erreicht unter Verwenden von PyBrop (ein Mittel, das speziell für N-Methylamine verwendet wird), in einer Weise, die jener ähnlich ist, die beschrieben ist von Coste J [Tet. Lett. 32 (17) 1967-1970 (1991)]. So wurde N-Methyl-6-amino-6-desoxy-O³-benzyl-L-ascorbinsäure (91 mg, 3,26 × 10^-4 mol) in trockenem DMF (5 ml) unter Stickstoff MAG3 (100 mg, 3,26 × 10^-4 Mol) zugegeben. Während des Rührens bei Raumtemperatur wurde Diisopropylethylamin (211 mg, 1,63 × 10^-3 Mol) zugegeben, gefolgt von PyBrop (182,5 mg, 3,914 × 10^-4 Mol). Nach dem Rühren über Nacht wurde das Lösungsmittel in vacuo entfernt und das Produkt durch präparative HPLC isoliert.
Tabelle 5:¹H-NMR-Daten für die Verbindungen 11, 12, 13 und 14
Tabelle 6:¹H-NMR-Daten für die Verbindung 15
Tabelle 7:¹H-NMR-Daten für die Verbindungen 16 und 17
Tabelle 8:¹H-NMR-Daten für die Verbindungen 21 bis 27
Tabelle 9:¹H-NMR-Daten für die Verbindung 28
Beispiel 7: Standard-Zellen-Aufnahme-Assay
Lösungen und Reagenzien

Transportpuffer: 134 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 0,8 mM MgSO₄, 20 mM HEPES, 10 mM Glukose, pH7,3, gelagert bei Raumtemperatur
Assaypuffer: Transportpuffer + 40 μM Homocystein
¹⁴C-Ascorbinsäure (Amersham Pharmacia Biotech)
Stammlösung: 50 μCi in 50 μl Analar-Wasser, gelagert bei –20°C
Assaylösung: 200nCi ¹⁴C-Ascorbinsäure in 200 μl Assaypuffer/Well (125 μM)
Ascorbinsäure (Sigma)
Dehydroascorbinsäure (Sigma)
Testverbindungen
Stoppuffer: 200 μM Phloretin in Assaypuffer, abgekühlt auf 4°C
Lyse-Lösung: 0,1% SDS in Analar-Wasser.

Verfahren:
MC3T3-E1-Murin-Präosteoblasten-Zellen wurden in einer 24-Well-Platte bei 2 × 10⁵ Zellen/Well in 1 ml Minimal-Essential-Medium plus 10% FCS, Penicillin und Streptomycin angesetzt. Zellen wurden über Nacht bei 37°C, 5% CO₂ gezogen. Der Assaypuffer und die Lösungen wurden hergestellt am Morgen des Assays. Zellen wurden untersucht unter dem Mikroskop auf Konfluenz und Lebensfähigkeit. Wachstumsmedien wurden entfernt unter Verwenden einer Liquipipette und jedes Well wurde mit 2 × 200 μl Assaypuffer gewaschen. Die geeignete Assaylösung wurde zu jedem Well gegeben und die Platte bei 37°C für die erforderliche Zeit inkubiert. Um die Reaktion zu stoppen, wurde 0,5 ml abgekühlter Stopp-Puffer zu jedem Well gegeben. Jedes Well wurde dann mit 0,5 ml Stopp-Puffer gewaschen. Zellen wurden in 0,1% SDS-Lösung für annähernd 10 Minuten lysiert und Lösungen in Scintillationsfläschchen übertragen. Jedes Well wurde dann mit Assaypuffer gewaschen und diese Waschlösung wurde auch in das geeignete Scintillationsfläschchen übertragen. Scintillations-Fluid (5 ml) wurde zu jedem Fläschchen gegeben, die Fläschchen wurden verwirbelt und gezählt auf einem Rackbeta-Zähler.
Tabelle 10: Ergebnisse des Zell-Assays
Beispiel 8: Aufnahme der ¹⁴C-Verbindung 17 in Ratten-Osteoblasten
Herstellung und Kultur primärer Ratten-Osteoblasten
Fötusköpfe wurden gesammelt und mit 70% Isopropanol besprüht. Calvaria wurden dann entfernt durch Schneiden der Haut vom oberen Ende des Kopfes, durch Durchführen eines Einschnitts durch die Calvaria von dem externen Auditor-Meatus quer hinter die parietalen Knochen und ein zweiter vorwärts bis oberhalb der Augenhöhlen. Wenn alle Calvaria isoliert waren, wurden sie mit PBS (Ca²⁺ und Mg²⁺-frei) gespült, dann in Trypsin bei 37°C zehn Minuten lang inkubiert. Die Calvaria wurden in 0,2% Collagenase (Typ II) in HBSS 30 Minuten lang bei 37°C übertragen. Dieser Collagenase-Verdau wurde wiederholt 60 Minuten lang, um die Osteoblasten- Populationen freizusetzen. Der Überstand wurde entfernt und herunterzentrifugiert, um ein Zell-Pellet zu erhalten. Das Pellet wurde in Medien resuspendiert, lebensfähige Zellen wurden gezählt und in einen T75-Kolben ausplattiert. Sobald sie konfluent waren, wurden die Zellen subkultiviert in 6-Multiwell-Platten bei 2 × 10⁴ bis 2 × 10⁵ Zellen/Well in 3 ml Medium, das 1 mM β-Glycerophosphat enthielt. Zusätzlich wurden Ascorbinsäure (50 μg/ml), ¹⁴C-Ascorbinsäure (19,6 μCi/ml) oder ¹⁴C-Verbindung 7 (2,8 μCi/ml) mit Osteoblasten über die Kultivierzeitdauer inkubiert. Die Zellen wurden zwei- bis dreimal pro Woche gefüttert und kultiviert bis zu 21 Tagen. Knötchen waren makroskopisch sichtbar nach ungefähr sieben bis zehn Tagen und begannen eine Mineralisierung (eingeschätzt durch Alizarin-Rotfärbung) bald danach.
Autoradiographie
Am Ende der Kultivierzeitdauer wurden Zellen mit 2,5% Glutaraldehyd fixiert und dehydriert mit einer ansteigenden Reihe von Ethanolkonzentrationen. Annähernd 2 ml Hypercoat-Emulsion (LM-1; APB) wurde zu jedem Well gegeben und bei Raumtemperatur im Dunklen 24 bis 36 Stunden lang inkubiert. Die Emulsion wurde dann Standardverfahren folgend entwickelt.
HPLC-Analyse
Die Trennung von DHAA, AA, Verbindung 7 und Benzylmercaptan wurde erfolgreich abgeschlossen unter Verwenden des folgenden HPLC-Profils:

Mobile Phase: A und B = 50% Acetonitril: 50% 50 mM KH₂PO₄ Detektor: UV (235 nm)/Flow Scintillation Analyser (β-Strahlung) Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min Säule: Waters Spherisorb S5NH2 – 5 μm – 4,6 × 250 mm

Die ¹⁴C-Verbindung-7-Proben, die unter Verwenden des oben angegebenen HPCL-Profils analysiert wurden, waren:

MEM-Lösung (Standard) 0,1 % SDS-Lösung (Standard) MEM – entfernt von Zellen 0,1 % SDS-lysierte Zellen an Zeitpunkten von 1, 3, 5, 24, 48, 72, 96 und 168 Stunden.

Ergebnisse
Die HPLC-Ergebnisse zeigten einen Nachweis der Peak-Aktivität innerhalb der Zellen bis zu fünf Stunden, was das Vorhandensein der ¹⁴C-Verbindung 17 anzeigte. Die anderen Zeitdauern ergaben keine Peaks, da das Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu gering war, was anzeigt, dass die ¹⁴C-Verbindung 17 innerhalb der Zelle zersetzt worden war. 0,1 % SDS wurde verwendet als ein Test, um zu sehen, ob der Extraktionsprozess von den Zellen den Abbau der ¹⁴C-Verbindung 17 verursachte. Die Analyse der ¹⁴C-Verbindung 17 in MEM und SDS zeigte jedoch, dass sie bis zu fünf Stunden ziemlich stabil innerhalb dieser Lösungen war.
Man kann zu dem Schluss kommen, dass die ¹⁴C-Verbindung 17 stabil genug ist innerhalb dieser Umgebungsbedingungen, um innerhalb der Zellen aufgenommen worden zu sein und nachfolgend abgebaut worden zu sein.
Autoradiographie-Experimente zeigen, dass sowohl die ¹⁴C-Ascorbinsäure als auch die ¹⁴C-Verbindung 17 mit den mineralisierenden Knötchen in Verbindung stehen und nicht mit der umgebenden konfluenten Osteoblasten-Monolage.
Beispiel 9: In-Vivo-Biodistribution der ¹⁴C-Verbindung 17
Verfahren
Drei Ratten wurden anästhesiert mit Halothan und injiziert mit 0,2 ml ¹⁴C-Verbindung 17 in PBS (4 μCi Gesamtdosis; spezifische Aktivität 5 mCi/mmol). Nach 60 Minuten wurden die Ratten durch Cervixdislokation getötet. Gewebe wurde angeordnet in ausgewogene Glas-Scintillationsfläschchen und 3 ml Toluol wurde zugegeben. Die Proben wurden über Nacht bei 50°C inkubiert. Die Proben wurden dann entfärbt mit 0,1 ml Na-EDTA:0,5 ml H₂O₂ über Nacht bei 50°C. Schließlich wurden 10 ml Hionic-Fluor (Packard) zu jedem Fläschchen gegeben und die Proben wurden auf einem LKB-Scintillationszähler gezählt.
Ergebnisse
In dieser vorläufigen Studie war das meiste der Aktivität im Blut, in der Leber und in den Nieren nach 60 Minuten vorhanden. Die Messung der Aktivität, die in dem Femur vorhanden war, zeigte 0,041 % id/g in der Diaphyse und 0,095% id/g in der Epiphyse, ein Verhältnis von 2,3, was eine größere Aufnahme in die aktiv gewachsenen Spitzen der Knochen zeigt.
Eine HPLC-Analyse zeigte, dass die Verbindung in Plasma stabil war, daher ist es wahrscheinlich, dass die gesehene Aufnahme auf der intakten ¹⁴C-Verbindung 17 beruht.

Claims

Verbindung der Formel
wobei X¹ für OH oder SH oder NH₂ oder -L-Z steht; X² und X³ dieselben oder verschieden sind und jeweils stehen für H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Fluoralkyl, Benzyl, eine Schutzgruppe oder -L-Z; X⁴ für H oder C_1-4 Alkyl steht; L für einen Linker steht, der eine Kette von 0 bis 10 Atomen umfasst; Z für eine Gruppe steht, die eine detektierbare Einheit umfasst; mit der Maßgabe, dass die Verbindung mindestens eine detektierbare Einheit umfasst, wobei die detektierbare Einheit eine Substanz ist, die für eine externe Bildgebung nach der Verabreichung an einen Menschen geeignet ist, ausgewählt aus: (i) Gamma-Emittern, (ii) Beta-Emittern, (iii) Emittern von Röntgenstrahlung niedriger Energie, (iv) hyperpolarisierten Atomen, (v) paramagnetischen Einheiten, (vi) strahlungsundurchlässigen Einheiten, oder (vii) Ultraschallkontrastmitteln; mit der Maßgabe dass, wenn die detektierbare Einheit für ein radioaktives oder paramagnetisches Metall steht, das Metall mit einem Liganden komple xiert ist, der stark an das Metall bindet und an die Ascorbinsäure-Einheit gebunden ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die detektierbare Einheit einen Metallkomplex eines chelatierenden Mittels umfasst, umfassend zwei bis zehn Metalldonator-Atome, die kovalent miteinander durch ein nicht-koordinierendes Hauptgerüst verbunden sind.
Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die detektierbare Einheit ein Radionuklid ist.
Verbindung nach Anspruch 3, wobei das Radionuklid ein Gamma-Emitter ist.
Verbindung nach Anspruch 4, wobei der Gamma-Emitter 99mTc oder ¹²³I ist.
Verbindung nach Anspruch 3, wobei das Radionuklid ¹²³I, ¹²⁵I oder ¹³¹I ist und Z für eine Iodvinylgruppe oder Iod- C_1-4-arylgruppe steht.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei X¹ steht für -L-Z.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei L für eine Linkergruppe steht, die eine 0-10-Atomkette umfasst und die Formel (A)_m besitzt wobei A steht für -CR₂-, -CR=CR-, -C≡C-, -NRCO-, -CONR-, -O(CO)-, -(CO)O-, -SO₂NR-, -NRSO₂-, -OCR₂-, -SCR₂-, -NRCR₂-, eine C_4-8-Cycloheteroalkylen-gruppe, eine C_4-8-Cycloalkylengruppe, eine C_5-12-Arylengruppe oder eine C_3-12-Heteroarylengruppe; m für eine ganze Zahl des Wertes 0 bis 10 steht; jede R-Gruppe unabhängig ausgewählt ist aus H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkenyl, C_1-4-Alkinyl, C_1-4-Alkoxyalkyl oder C_1-4-Hydroxyalkyl.
Verbindung nach Anspruch 8, wobei die Linkergruppe eine 0-4-Atomkette umfasst.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, der Formel:
Verbindung nach Anspruch 10, wobei X² und X³ jeweils für H steht.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, zur Verwendung in der Medizin.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, zur Verwendung bei der Diagnose oder Behandlung metastatischer Knochenläsionen.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 bei der Herstellung eines Mittels für die Diagnose oder Behandlung metastatischer Knochenläsionen.