RU2333557C2

RU2333557C2 - Микроволновой способ получения комплексов, меченных радиоактивным изотопом галлия

Info

Publication number: RU2333557C2
Application number: RU2005130862/06A
Authority: RU
Inventors: Ирина ВЕЛИКИАН; Бенгт ЛАНГСТРОМ
Original assignee: Джи-И Хелткер Лимитед
Priority date: 2003-04-11
Filing date: 2004-04-08
Publication date: 2008-09-10
Also published as: US8007766B2; ATE366122T1; KR20060006030A; AU2004228746B2; AU2004228746A1; NO20054615L; DE602004007371D1; US20070027307A1; WO2004089425A1; CA2520653C; CA2520653A1; CN1771058A; KR101108420B1; ES2288255T3; PL1620134T3; IL170864A; EP1620134B1; CN1771058B; RU2005130862A; NO332419B1

Abstract

Изобретение относится к способу получения комплексов, меченных радиоактивным изотопом галлия. Эти комплексы можно использовать в качестве диагностических средств, например для получения изображений с помощью позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ). Способ получения меченного радиоактивным изотопом галлия комплекса состоит в обеспечении реакции взаимодействия радиоактивного изотопа ⁶⁸Ga³⁺ с хелатобразующим агентом с использованием активации микроволнами. Изобретение позволяет повысить эффективность и воспроизводимость образования комплекса ⁶⁸Ga-хелатобразующий агент. 14 з.п. ф-лы.

Description

Настоящее изобретение относится к способу получения комплексов, меченных радиоактивным изотопом галлия. Эти комплексы можно использовать в качестве диагностических средств, например для получения изображений с помощью позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ).

Получение изображений ПЭТ - это методика получения изображений с помощью ядерной томографии, в которой используют молекулы с радиоактивной меткой, испускающие позитроны. Когда позитрон встречает электрон, оба аннигилируют, и в результате высвобождается энергия в форме гамма-лучей, которые и детектируют сканеры ПЭТ. Используя природные вещества, которые играют в организме роль меченых молекул, ПЭТ не только дает информацию о структурах организма, но также информацию о физиологических функциях организма или определенных систем организма. Хорошо известная молекула-метка представляет собой, например, 2-фтор-2-деокси-D-глюкозу (ФДГ), которая подобна природной глюкозе, но имеет дополнительный атом ¹⁸F. Сканер ПЭТ детектирует гамма-излучение от этого атома фтора, и это дает информацию о метаболизме ФДГ в определенных областях или тканях организма, например в мозге или в сердце. Выбор молекулы-метки зависит от обследуемой области. В общем случае выбирают такую метку, которая аккумулируется в обследуемой области или избирательно поглощается определенным видом ткани, например раковыми клетками. В результате обследования получают либо серию динамических изображений, либо статическое изображение, получаемое после периода, в течение которого молекула с радиоактивной меткой участвует в исследуемом биохимическом процессе. Сканер определяет пространственное и временное распределение молекулы-метки. ПЭТ представляет собой также и количественный способ получения изображений, дающий возможность измерять местные концентрации молекул с радиоактивной меткой.

В качестве меток для ПЭТ обычно используют ¹¹С, ¹⁸F, ¹⁵O, ¹³N или ⁷⁶Br. Недавно были получены новые метки для ПЭТ на основе меченых радиоактивным изотопом комплексов металлов, включающих бифункциональный хелатобразующий агент и радиоактивный металл. Бифункциональные хелатобразующие агенты представляет собой хелатобразующие агенты, которые координируются с ионом металла и связаны с адресным переносчиком (targeting vector), который будет связываться с требуемым местом в организме пациента. Такой адресный переносчик может представлять собой пептид, который связывается с определенным рецептором, возможно связанным с определенным участком в организме или с определенным заболеванием. Адресный переносчик может представлять собой олигонуклеотид, специфичный, например, для активированного онкогена, и, следовательно, нацеленный на место локализации опухоли. Преимущество таких комплексов состоит в том, что бифункциональные хелатобразующие агенты можно метить различными радиоактивными металлами, например, ⁶⁸Ga, ²¹³Bi или ⁸⁶Y. Таким образом, меченые радиоактивным изотопом комплексы с особыми свойствами могут быть "скроены" для конкретных приложений.

⁶⁸Ga представляет особый интерес для получения меченых радиоактивным изотопом Ga комплексов металла, используемых в качестве меток для получения изображений с помощью ПЭТ. ⁶⁸Ga получают при помощи генератора ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga, а это означает, что циклотрон не нужен. ⁶⁸Ga на 89% распадается с испусканием позитрона (2,92 МэВ), и его период полураспада (68 мин) достаточен для участия во многих биохимических процессах in vivo без нежелательной радиации. При степени окисления +III ⁶⁸Ga образует стабильные комплексы с различными типами хелатобразующих агентов, и метки на основе ⁶⁸Ga уже используют для получения изображений мозга, почек, костей, кровеносной системы, легких и опухолей.

Дж. Шумахер с соавторами [J.Schumacher et al., Canser res. 61, 2001, 3712-3717] описали синтез ⁶⁸Ga-N,N'-[2-гидрокси-5-(этилен-β-карбокси)бензил]этилендиамин-N,N'-диуксусной кислоты (⁶⁸Ga - HBED-CC). Полученный из генератора ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga ⁶⁸Ga и носитель Ga⁺³ взаимодействуют с хелатобразующим агентом HBED-CC в ацетатном буфере при 95°С в течение 15 минут. Не вошедший в состав комплекса ⁶⁸Ga отделяют от комплекса при помощи катионообменной колонки. Сообщают, что общее время получения составляет 70 минут. Слишком долгое время получения меченого радиоактивным изотопом комплекса является недостатком этого способа. Вследствие добавления "холодного" носителя Ga⁺³ удельная активность реакции низка. Более того, меченные радиоактивным изотопом комплексы необходимо очищать после реакции их образования.

В WO-A-99/56791 описана реакция ⁶⁸GaCl₃, полученного из генератора ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga, с тетрадентатным аминотритиолатным хелатобразующим агентом трис-(2-меркаптобензил)амином (S₃N). Образование комплекса происходит при комнатной температуре в течение 10 минут. Недостаток описанного способа заключается в том, что меченый радиоактивным изотопом комплекс необходимо очищать при помощи жидкостной хроматографии перед тем, как использовать его для исследований in vivo. Другим недостатком способа является относительно длительное время реакции.

О. Угур с соавторами [O.Ugur et al., Nucl. Med. Biol. 29, 2002, 147-157] описали синтез меченого радиоактивным изотопом ⁶⁸Ga аналога соматостатина - DOTA-DPhe¹-Tyr³-октреотида (octreotide) (DOTATOC). Соединение получают взаимодействием ⁶⁸GaCl₃, полученного из генератора ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga, с хелатобразующим агентом DOTATOC при 100°С в течение 15 минут. Недостаток этого способа заключается в том, что реакционную смесь необходимо нагревать до относительно высокой температуры. Хелатобразующий агент DOTA функционализирован пептидным адресным переносчиком, а пептиды и протеины, как известно, представляют собой вещества, чувствительные к нагреванию. Таким образом, при использовании описанного О. Угуром способа существует риск разложения чувствительных к нагреванию адресных переносчиков во время образования комплекса. Кроме того, недостаток описанного способа заключается в том, что комплекс необходимо очищать при помощи жидкостной хроматографии перед тем, как использовать его для исследований животных.

В US-A-5070346 описаны меченные радиоактивным изотопом ⁶⁸Ga комплексы хелатобразующего агента тетраэтилциклогексил-бис-аминоэтантиола (ВАТ-ТЕСН). Комплексы синтезируют взаимодействием ⁶⁸GaCl₃, полученного из генератора ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga, с ВАТ-ТЕСН при 75°С в течение 15 минут с последующим фильтрованием. Получение комплекса происходит в течение 40 минут. Из-за высокой температуры реакции этот способ не подойдет для бифункциональных хелатобразующих агентов, включающих чувствительный к нагреванию адресный переносчик, например пептид или протеин. Дополнительным недостатком этого способа является длительное время протекания реакции образования комплекса.

Вследствие относительно короткого периода полураспада ⁶⁸Ga существует необходимость в быстром способе синтеза меченных радиоактивным ⁶⁸Ga комплексов, которые можно использовать в качестве молекул-меток для получения изображений с помощью ПЭТ.

Было обнаружено, что использование активации микроволнами существенно улучшает эффективность и воспроизводимость образования комплекса ⁶⁸Ga-хелатобразующий агент. Благодаря активации микроволнами время протекания химических реакций можно существенно сократить; т.е. реакция завершается в течение 2 и менее минут. Это является очевидным достижением, так как 10-минутное сокращение времени реакции сохраняет около 10% активности ⁶⁸Ga. Более того, активация микроволнами также сокращает число побочных реакций и увеличивает радиохимический выход, что происходит вследствие повышенной селективности. Растворы радиоизотопов ⁶⁶Ga³⁺, ⁶⁷Ga³⁺ и ⁶⁸Ga³⁺, которые получают в циклотроне или в генераторе, содержат так называемые псевдоносители, т.е. другие катионы металлов, например Fe³⁺, Al³⁺, Cu²⁺, Zn²⁺ и In³⁺. Так как все эти псевдоносители конкурируют с Ga³⁺ в реакции образования комплекса, то важно повысить селективность реакции внесения радиоактивной метки. Следовательно, активация микроволнами положительно влияет на внесение радиоактивных меток всеми изотопами Ga, а именно ⁶⁶Ga, ⁶⁷Ga и ⁶⁸Ga.

Активацию микроволнами использовали в реакции нуклеофильного ароматического радиационного фторирования атомами ¹⁸F, и было обнаружено, что в этом случае при более коротком времени реакции получается сравнимый или более высокий выход, чем в случае термической обработки [S.Stone-Elander et al., Appi. Rad. Isotopes 44(5), 1993, 889-893]. Однако использование активации микроволнами для реакций внесения галлиевой радиоактивной метки еще не было описано.

Следовательно, в данном изобретении описан способ получения комплекса, меченного радиоактивным изотопом галлия, путем взаимодействия радиоизотопа Ga³⁺ с хелатобразующим агентом, отличающийся тем, что реакцию проводят с использованием активации микроволнами.

В соответствии с изобретением подходящими радиоизотопами Ga³⁺ являются ⁶⁶Ga³⁺, ⁶⁷Ga³⁺ и ⁶⁸Ga³⁺, предпочтительно ⁶⁸Ga³⁺ и ⁶⁸Ga³⁺, и особенно предпочтительно ⁶⁸Ga³⁺. ⁶⁶Ga³⁺ и ⁶⁸Ga³⁺ особенно подходят для синтеза меченых комплексов, пригодных для получения изображений с помощью ПЭТ, в то время как ⁶⁷Са³⁺ особенно подходит для синтеза меченых комплексов, пригодных для использования в однопротонной эмиссионной компьютерной томографии (ОПЭКТ).

⁶⁸Ga³⁺ можно получить в циклотроне путем облучения мишеней из элементарного цинка. Для того чтобы минимизировать количество образующегося ⁶⁷Ga, толщину мишени необходимо поддерживать предпочтительно такой, чтобы энергия распавшегося протона составляла более 8 МэВ, а время облучения должно быть коротким, например менее 4 часов. Химическое разделение можно выполнить, используя методики экстракции растворитель-растворитель, применяя изопропиловый эфир и HCl, как описано в [L.C.Brown, Int. J. Appl. Radiat. lsot. 22, 1971, 710-713]. ⁶⁸Ga имеет относительно длинный период полураспада - 9,5 часов, и наиболее вероятный из испускаемых позитронов имеет необычно высокую энергию - 4,2 МэВ.

⁶⁷Ga³⁺ можно получить в циклотроне, а получаемый также в циклотроне ⁶⁷GaCl₃ доступен для приобретения. Период полураспада ⁶⁷Ga составляет 78 часов.

⁶⁸Ga можно получить в генераторе ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga. Такие генераторы известны в данной области техники и описаны, например, в [C.Loc'h et al, J. Nucl. Med. 21, 1980, 171-173]. В общем случае ⁶⁸Ge помещают в колонку, состоящую из органической смолы или неорганического оксида металла, например диоксида олова, оксида алюминия или диоксида титана. ⁶⁸Ga элюируют из колонки водным раствором HCl и получают его в виде ⁶⁸GaCl₃. ⁶⁷Ga³⁺ особенно предпочтителен в предлагаемом здесь способе, так как его можно получить без применения циклотрона, а его период полураспада (68 минут) достаточен для участия во многих биохимических процессах in vivo при получении изображений с помощью ПЭТ без длительного облучения.

Предпочтительные хелатобразующие агенты для использования в предлагаемом способе представляют собой такие агенты, которые содержат радиоактивные изотопы Ga³⁺ в физиологически приемлемой форме. Кроме того, предпочтительны также хелатобразующие агенты, которые образуют комплексы с радиоизотопами Ga³⁺, стабильные в течение времени, необходимого для диагностических исследований с использованием меченых комплексов.

Подходящие хелатобразующие агенты представляют собой, например, полиаминополикислотные хелатобразующие агенты, такие как DTPA, EDTA, DTPA-BMA, DOA3, DOTA, HP-DOA3, ТМТ или DPDP. Эти хелатобразующие агенты хорошо известны в качестве радиофармацевтических и радиодиагностических препаратов. Их использование и синтез описаны, например, в US-A-4647447, US-A-5362475, US-A-5534241, US-A-5358704, US-A-5198208, US-A-4963344, ЕР-А-230893, ЕР-А-130934, ЕР-А-606683, ЕР-А-438206, ЕР-А-434345, WO-A-97/00087, WO-A-96/40274, WO-A-96/30377, WO-A-96/28420, WO-A-96/16678, WO-A-96/11023, WO-A-95/32741, WO-A-95/27705, WO-A-95/26754, WO-A-95/28967, WO-A-95/28392, WO-A-95/24225, WO-A-95/17920, WO-A-95/15319, WO-A-95/09848, WO-A-94/27644, WO-A-94/22368, WO-A-94/08624, WO-A-93/16375, WO-A-93/06868, WO-A-92/11232, WO-A-92/09884, WO-A-92/08707, WO-A-91/15467, WO-A-91/10669, WO-A-91/10645, WO-A-91/07191, WO-A-91/05762, WO-A-90/12050, WO-A-90/03804, WO-A-89/00052, WO-A-89/00557, WO-A-8 8/01178, WO-A-86/02841 и WO-A-86/02005.

Подходящие хелатобразующие агенты включают макроциклические хелатобразующие агенты, например порфириноподобные молекулы и пентааза-макроциклы, как описано в [Zhang et al., Inorg. Chem. 37(5), 1998, 956-963], фталоцианины, краун-эфиры, например краун-эфиры с азотом, такие как сепульхраты (sepulchrates), криптаты и т.д., гемин (протопорфирин IX хлорид), гем и хелатобразующие агенты, имеющие квадратно-планарную симметрию.

В предлагаемом способе предпочтительно использовать макроциклические хелатобразующие агенты. В предпочтительном воплощении изобретения эти макроциклические хелатобразующие агенты включают по меньшей мере один атом сильного донора, такого как кислород и/или азот, как в полиаза- и полиоксомакроциклах. Предпочтительные примеры полиазамакроциклического хелатобразующего агента включают DOTA, TRITA, ТЕТА и НЕТА, причем DOTA особенно предпочтителен.

Особенно предпочтительные макроциклические хелатобразующие агенты включают функциональные группы, такие как карбоксигруппы или аминогруппы, которые не играют важной роли в координации Ga³⁺, а значит, их можно использовать для образования связей между хелатобразующими агентами и другими молекулами, например с адресными переносчиками. Примеры таких макроциклических хелатобразующих агентов, включающих функциональные группы, представляют собой DOTA, TRITA или НЕТА.

В следующем предпочтительном воплощении изобретения в предлагаемом способе используют бифункциональные хелатобразующие агенты. В контексте данного изобретения "бифункциональный хелатобразующий агент" означает хелатобразующий агент, связанный адресным переносчиком. Подходящие для используемых в предлагаемом способе бифункциональных хелатобразующих агентов адресные переносчики представляют собой химические или биологические фрагменты, которые связываются с требуемым местом в организме пациента, когда в организм вводят меченые радиоактивным изотопом галлия комплексы, включающие указанные адресные переносчики. Подходящие для используемых в предлагаемом способе бифункциональных хелатобразующих агентов адресные переносчики представляют собой протеины, гликопротеины, липопротеины, полипептиды, такие как антитела или фрагменты антител, гликополипептиды, липополипептиды, пептиды, такие как связывающие RGD пептиды, гликопептиды, липопептиды, углеводы, нуклеиновые кислоты, например ДНК и РНК, олигонуклеотиды, такие как антисмысловые олигонуклеотиды, или часть, фрагмент, производное или комплекс вышеперечисленных соединений или любых других подходящих химических соединений, таких как относительно маленькие органические молекулы, а особенно маленькие органические молекулы массой менее 2000 дальтон.

В особенно предпочтительном воплощении изобретения в предлагаемом способе используют макроциклические бифункциональные хелатобразующие агенты. Предпочтительные макроциклические бифункциональные хелатобразующие агенты включают DOTA, TRITA или НЕТА, связанные с адресным переносчиком, предпочтительно с адресным переносчиком, выбранным из группы, состоящей из протеинов, гликопротеинов, липопротеинов, полипептидов, гликополипептидов, липополипептидов, пептидов, гликопептидов, липопептидов, углеводов, нуклеиновых кислот, олигонуклеотидов, или части, фрагмента, производного или комплекса вышеперечисленных соединений и малых органических молекул; особенно предпочтительно с адресным переносчиком, выбранным из группы, состоящей из пептидов и олигонуклеотидов.

Адресный переносчик может быть связан с хелатобразующим агентом посредством связующей группы или посредством молекулы-спейсера (spacer molecule). Примеры связующих групп представляют собой дисульфиды, сложные эфиры или амиды, примеры молекул-спейсеров представляют собой цепочкообразные молекулы, например лизин или гексиламин, или короткие спейсеры на основе пептидов. В предпочтительном воплощении изобретения связь между адресным переносчиком и хелатобразующей частью меченого радиоактивным изотопом галлия комплекса такова, что адресный переносчик может взаимодействовать с мишенью в организме, и при этом присутствие меченого изотопом галлия комплекса не блокирует его и не создает пространственных помех.

Предлагаемую активацию микроволнами можно подходящим образом выполнять путем использования микроволновой печи, предпочтительно путем использования мономодальной микроволновой печи. Соответствующую микроволновую активацию проводят при 80-120 Вт, предпочтительно при 90-110 Вт, а особенно предпочтительно приблизительно при 100 Вт. Соответствующий интервал времени активации микроволнами составляет от 20 с до 2 мин, предпочтительно от 30 с до 90 с, а особенно предпочтительно от 45 с до 60 с.

Контролировать температуру реакции целесообразно тогда, когда в предлагаемом способе используют чувствительные к температуре хелатобразующие агенты, например бифункциональные хелатобразующие агенты, включающие пептиды или протеины в качестве адресных переносчиков. Продолжительность микроволновой активации следует регулировать таким образом, чтобы температура реакционной смеси не достигала значений, при которых разлагаются хелатобразующий агент и/или адресный переносчик. Если используемые в предлагаемом способе хелатобразующие агенты включают пептиды или протеины, то, как правило, больше подходят более высокие температуры в течение более короткого времени, чем более низкие температуры в течение более длительного периода времени.

Активацию микроволнами можно проводить непрерывно или в виде нескольких циклов во время протекания реакции.

В предпочтительном воплощении изобретение обеспечивает способ получения меченой радиоактивным изотопом ⁶⁸Ga метки для создания изображений при помощи ПЭТ путем взаимодействия ⁶⁸Ga³⁺ с макроциклическим бифункциональным хелатобразующим агентом, включающим атомы сильных доноров, отличающийся тем, что реакцию проводят с использованием микроволновой активации.

В особенно предпочтительном воплощении описанного в предыдущем абзаце способа микроволновую активацию проводят от 30 с до 90 с при 110 Вт.

Если в предлагаемом по изобретению способе используют ⁶⁸Ga³⁺, то предпочтительно получать его путем взаимодействия элюата из генератора ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga с анионитом, где ⁶⁸Ga³⁺ элюируют из указанного анионита. В предпочтительном воплощении изобретения анионит представляет собой анионит, включающий НСО₃ ^- в качестве противоионов.

Использование анионитов для обработки элюата ⁶⁸Ga, полученного из генератора ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga, описано в [J.Schuhmacher et al., Int. J.appl. Radiat. lsotopes 32, 1981, 31-36]. Для обработки полученного из генератора ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga элюата 4,5 Н HCl ⁶⁸Ga с целью уменьшения присутствующего в элюате ⁶⁸Ge использовали анионит Bio-Rad AG 1×8.

Было обнаружено, что использование анионитов, включающих НСО₃ ^- в качестве противоионов, особенно подходит для очистки и концентрации исходящего из генератора элюата. Можно уменьшить не только количество присутствующего в элюате ⁶⁸Ge, но и количество так называемых псевдоносителей, т.е. катионов других металлов, например Fe³⁺, Al³⁺, Cu²⁺, Zn²⁺ и In³⁺, которые элюируются из генератора вместе с ⁶⁸Ga³⁺. Так как эти псевдоносители конкурируют с ⁶⁸Ga³⁺ в последующей реакции образования комплекса, то особенно важно уменьшить количество этих катионов настолько, насколько это возможно, до реакции введения радиоактивной метки. Дополнительным преимуществом стадии анионообменной очистки является то, что концентрацию ⁶⁸Ga³⁺, которая после элюирования находится в интервале от пикомолярной до наномолярной, можно повысить до наномолярного-микромолярного уровня. Следовательно, можно существенно уменьшить количество хелатобразующего агента в последующей реакции образования комплекса, что значительно повышает удельную радиоактивность. Этот результат важен для получения меченых радиоактивным изотопом ⁶⁸Ga меток для ПЭТ, которые включают бифункциональный хелатобразующий агент; т.е. хелатобразующий агент, связанный с адресным переносчиком, так как повышение удельной радиоактивности дает возможность уменьшить количество таких меток, вводимых в организм пациента.

Следовательно, другим предпочтительным воплощением предлагаемого в изобретении способа является способ получения меченного радиоактивным изотопом ⁶⁸Ga комплекса путем взаимодействия ⁶⁸Ga³⁺ с хелатобразующим агентом с активацией микроволнами, в котором ⁶⁸Ga³⁺ получают путем приведения в контакт злюата из генератора ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga с анионитом, предпочтительно с анионитом, включающим НСО₃ ^- в качестве противоионов, и элюирования ⁶⁸Ga³⁺ из указанного анионита.

Генераторы ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga известны в данной области техники, см., например [C.Loc'h et al., J.Nucl. Med. 21, 1980, 171-173] или [J.Schuhmacher et al., Int. J.appl. Radiat. Isotopes 32, 1981, 31-36]. ⁶⁸Ge можно получить в циклотроне при облучении, например, Ga₂(SO₄)₃ протонами с энергией 20 МэВ. Он также имеется в продаже, например, в виде ⁶⁸Ge в 0,5 М HCl. В общем случае ⁶⁸Ge подают в колонку, состоящую из органической смолы или неорганического оксида металла, такого как диоксид олова, оксид алюминия или диоксид титана. ⁶⁸Ga элюируют из колонки водным раствором HCl, при этом получают ⁶⁸GaCl₃.

Подходящие для роли генератора ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga колонки состоят из неорганических оксидов, таких как оксид алюминия, диоксид титана или диоксид олова, или из органических смол, таких как смолы, включающие фенольные гидроксильные группы (US-A-4264468) или пирогаллол [J.Schuhmacher et al., Int. J.appl. Radiat Isotopes 32, 1981, 31-36]. В предпочтительном воплощении предлагаемого способа используют генератор ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga, включающий колонку, включающую диоксид титана.

Концентрация водного раствора HCl, используемого для элюирования ⁶⁸Ga из колонки-генератора ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga, зависит от материала колонки. Удобно использовать для элюирования ⁶⁸Ga 0,05-5 М HCl. В предпочтительном воплощении изобретения элюат получают из генератора ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga, включающего колонку, включающую диоксид титана, и элюируют ⁶⁸Ga при помощи 0,05-0,1 М HCl, предпочтительно приблизительно 0,1 М HCl.

В предпочтительном воплощении предлагаемого способа используют сильный анионит, включающий НСО₃ ^- в качестве противоионов, предпочтительно сильный анионит, включающий НСО₃ ^- в качестве противоионов. В дополнительном предпочтительном воплощении изобретения этот анионит включает функциональные группы четвертичного амина. В другом дополнительном предпочтительном воплощении изобретения, этот анионит представляет собой сильную анионообменную смолу на основе полистирола-дивинилбензола. В особенно предпочтительном воплощении изобретения используемый в предлагаемом способе анионит представляет собой сильную анионообменную смолу, включающую НСО₃ ^- в качестве противоионов, функциональные группы четвертичного амина и смолу на основе полистирола-дивинилбензола.

В предлагаемом способе для элиюрования ⁶⁸Ga из анионита можно использовать воду.

Примеры

Пример 1

Сравнение внесения радиоактивной метки изотопом ⁶⁸Ga в DOTA-D-Phe¹-Tyr³ - октреотид (DOTA-TOC) при использовании традиционного нагревания и активации микроволнами.

1а) Внесение радиоактивной метки изотопом ⁶⁸Ga в DOTA-TOC при использовании традиционного нагревания

К элюату из генератора ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga добавляли ацетат натрия (36 мг на 1 мл), чтобы довести рН элюата до примерно 5,5; смесь хорошо перемешивали. К реакционной смеси добавляли DOTA-TOC (20 нмоль) и нагревали ее при 96°С в течение 25 мин. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и подавали в колонку из твердого полимерного электролита С-18 (С-18 SPE-column) (HyperSEP S C18), которую затем промывали 2 мл Н₂О, и элюировали продукт смесью этанол-вода 50:50 (1 мл).

Реакционную смесь и продукт анализировали при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии, используя гелевые фильтрационные колонки Vydac RP и Fast Desalting HR 10/10 FPLC.

Аналитический радиохимический выход составил 67%.

Изолированный радиохимический выход составил 34%.

Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением (МС-ИЭР) была выполнена на платформе Fisons (Micromass, Manchester, UK) с использованием позитивного режима получения данных и регистрации [М+2Н]²⁺. DOTATOC регистрировали при m/z=711,26, а аутентичный Ga-DOTATOC регистрировали при m/z=746,0 (по расчетам m/z=746,5).

1б) Внесение радиоактивной метки изотопом ⁶⁸Ga в DOTA-TOC при использовании активации микроволнами

Реакционную смесь готовили точно так же, как описано в примере 1а), и переносили в пробирку из стекла Pyrex для активации микроволнами в течение 1 мин при 100 Вт. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и помещали в колонку из твердого полимерного электролита С-18 (HyperSEP S С18), которую затем промывали 2 мл Н₂О, и элюировали продукт смесью этанол-вода 50:50 (1 мл).

Реакционную смесь и продукт анализировали при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии, используя гелевые фильтрационные колонки Vydac RP и Fast Desalting MR 10/10 FPLC.

Аналитический радиохимический выход составил более 98%.

Изолированный радиохимический выход составил 70%.

1в) результаты сравнения

В случае активации микроволнами количество радиоактивного вещества и удельная активность продукта увеличились на 21%. Изолированный радиохимический выход увеличился в 2 раза по сравнению с результатами, полученными для традиционного нагревания. Так как радиохимический выход реакционной смеси в случае активации микроволнами был более 98%, то в дальнейшей очистке не было необходимости, и для применения in vivo была использована неочищенная реакционная смесь.

Пример 2

Внесение радиоактивной метки изотопом ⁶⁸Ga в DOTA, связанный с олигонуклеотидами

На первой стадии с DOTA связывали четыре различных антисмысловых олигонуклеотида, специфичных к активированному K-ras онкогену человека:

- 17-мерный фосфодиэфирный олигонуклеотид со связующим гексиламином на 5'-конце;

- 17-мерный фосфодиэфирный олигонуклеотид со связующим гексиламином на 3'-конце;

- 17-мерный фосфоротиоатный олигонуклеотид со связующим гексиламином на 5'-конце;

- 2'-O-метил фосфодиэфир со связующим гексиламином на 5'-конце.

2а) Конъюгация DOTA с олигонуклеотидами

К раствору EDC (13 мг, 68 μмоль) в H₂O (250 μл) добавляли DOTA (32 мг, 66 μмоль) и сульфо-NHS (14 мг, 65 μмоль) в H₂O (250 μл), перемешивали на льду в течение 30 минут, а затем нагревали до комнатной температуры для получения DOTA-сульфо-NHS. К раствору олигонуклеотида (70-450 nмоль) в 1М карбонатном буфере (рН=9) добавляли по каплям 100-кратный избыток раствора DOTA-NHS, а затем охлаждали на льду. Смесь оставляли при комнатной температуре на 10 часов. Сначала реакционную смесь очищали гель-фильтрацией в колонках NAP 5, элюировали водой и к 1 мл получившегося элюата добавляли 100 мкл 1М ТЕАА (триэтиламмонийацетатного буфера). Затем получившийся элюат подавали в колонку из твердого полимерного электролита С-18 (Supeico), и промывали колонку 50 мМ ТЕАА (5 мл), 50 мМ раствором ТЕАА, содержащим 5% ацетонитрила (3 мл), и элюировали DOTA-олигонуклеотид смесью вода-ацетонитрил 50:50 (1 мл). Фракцию вода-ацетонитрил сушили, используя вакуумную центрифугу. Продукты анализировали при помощи масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. Анализ в негативном режиме после прямого введения дал следующие результаты: 1. DOTA-фосфодиэфир: МС (И^-ЭР) m/z: 662,27 [М-8Н]^8-; 756,36 [М-7Н]^7-; 882,91 [М-6Н]^6-. Воспроизведение данных дало М=5303,71; 2. DOTA-фосфоротиоат: МС (И^-ЭР) m/z: 656,58 [М-8Н]^9-; 738,56 (М-7Н]^8-. Воспроизведение данных дало М=5917,35; 3. DOTA-2'-O-метилфосфодиэфир: МС (И^-ЭР) m/z: 674,02 [М-6Н]^9-; 770,19 [М-8Н]^8-; 885,00 [М-7Н]^7-. Воспроизведение данных дало М=6148,84.

2б) Внесение радиоактивной метки изотопом ⁶⁸Ga

К элюату из генератора ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga добавляли ацетат натрия (36 мг на 1 мл), чтобы довести рН элюата до примерно 5,5; смесь хорошо перемешивали. К смеси добавляли DOTA-олигонуклеотид (10-100 нмоль) и переносили ее в пробирку из стекла Pyrex для активации микроволнами в течение 1 мин при 100 Вт. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, а затем добавляли 1 мл 150 мМ ТЕАА в Н₂O. Смесь помещали в колонку из твердого полимерного электролита С-18 (Supelco), которую затем промывали 50 мМ ТЕАА (1 мл), 50 мМ ТЕАА, содержащего 5% ацетонитрила (1 мл). Продукт элюировали смесью этанол-вода 50:50 (1 мл) или вода-ацетонитрил 50:50 (1 мл). Реакционную смесь анализировали при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии, используя гелевые фильтрационные колонки Vydac RP и Fast Desalting HR 10/10 FPLC. Аналитический радиохимический выход находился в интервале от 50% до 70%, изолированный радиохимический выход находился в интервале от 30% до 52%. Большие количества более сильных элюентов могут повысить изолированный радиохимический выход.

Пример 3

Внесение радиоактивной метки изотопом ⁶⁸Ga в DOTA, связанный с пептидами

На первой стадии с DOTA связывали четыре различных пептида:

- вазоактивный кишечный пептид (VIP); 28 аминокислотных остатков;

- Y-фрагмент нейропептида 18-36 (NPY); 19 аминокислотных остатков;

- фрагмент панкреастатина 37-52 (Р); 16 аминокислотных остатков; и

- ангиотензин II (А); 8 аминокислотных остатков.

3а) Конъюгация DOTA с пептидами

Конъюгацию осуществляли так же, как описано в 2а), но использовали пептиды (0,5-3 μмоль) вместо олигонуклеотидов.

Реакционные смеси и продукты анализировали при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии, используя гелевые фильтрационные колонки Vydac RP и Fast Desalting HR 10/10 FPLC.

Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением (МС-ИЭР) была выполнена на платформе Fisons (Micromass, Manchester, UK) с использованием позитивного режима получения данных и регистрации [M+2H]²⁺, [М+4Н]⁴⁺ и [М+6Н]⁵⁺.

VIP регистрировали при m/z=832,07 [М+4Н]⁴⁺. (DOTA)2-VIP регистрировали при m/z=1025,00 [М+4Н]⁴⁺. (DOTA)₃-VIP регистрировали при m/z=1122,0 [М+4H]⁴⁺. (DOTA)₄-VIP регистрировали при m/z=1218,00 [М+4Н]⁴⁺ _. NPY регистрировали при m/z=819,31 [М+3Н]³⁺. DOTA-NPY регистрировали при m/z=948,18 [М+3Н]³⁺. Р регистрировали при m/z=909,55 [M+2H]²⁺ _. DOTA-P регистрировали при m/z=1103,02 [М+2Н]²⁺. А регистрировали при m/z=524,1 [М+2H]²⁺, a DOTA-A регистрировали при m/z=717,20 [М+2H]²⁺.

3б) Внесение радиоактивной метки изотопом ⁶⁸Ga

Внесение радиоактивной метки изотопом ⁶⁸Ga осуществляли так же, как описано в 2б), используя DOTA-пептиды в количестве 10-20 нмоль.

Реакционную смесь анализировали при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии, используя гелевые фильтрационные колонки Vydac RP и Fast Desalting HR 10/10 FPLC. Аналитический радиохимический выход находился в интервале от 80% до 90%, изолированный радиохимический выход находился в интервале от 60% до 70%. Большие количества более сильных элюентов могут повысить изолированный радиохимический выход.

Claims

1. Способ получения меченного радиоактивным изотопом галлия комплекса путем взаимодействия радиоактивного изотопа Ga³⁺ с хелатобразующим агентом, отличающийся тем, что реакцию проводят с использованием активации микроволнами.

2. Способ по п.1, где радиоактивный изотоп Ga³⁺ выбирают из группы, состоящей из ⁶⁶Ga³⁺, ⁶⁷Ga³⁺ и ⁶⁸Ga³⁺.

3. Способ по п.2, где радиоактивный изотоп Ga³⁺ представляет собой ³⁸Ga³⁺.

4. Способ по п.1, где хелатобразующий агент представляет собой макроциклический хелатобразующий агент.

5. Способ по п.1, где хелатобразующий агент включает атомы сильных доноров, предпочтительно атомы О и N.

6. Способ по п.1, где хелатобразующий агент представляет собой бифункциональный хелатобразующий агент.

7. Способ по п.1, где хелатобразующий агент представляет собой бифункциональный хелатобразующий агент, включающий адресный переносчик, выбранный из группы, состоящей из протеинов, гликопротеинов, липопротеинов, полипептидов, гликополипептидов, липополипептидов, пептидов, гликопептидов, липопептидов, углеводов, нуклеиновых кислот, олигонуклеотидов или части, фрагмента, производного или комплекса вышеперечисленных соединений и малых органических молекул.

8. Способ по п.7, где адресный переносчик представляет собой пептид или олигонуклеотид.

9. Способ по п.1, где активацию микроволнами проводят при 80-120 Вт, предпочтительно при 90-110 Вт.

10. Способ по п.1, где активацию микроволнами проводят в течение от 20 с до 2 мин, предпочтительно от 30 до 90 с.

11. Способ по п.3, где ⁶⁸Ga³⁺ получают путем приведения в контакт элюата из генератора ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga с анионитом и элюирования ⁶⁸Ga³⁺ из указанного анионита.

12. Способ по п.11, где генератор ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga включает колонку, включающую диоксид титана.

13. Способ по п.11, где анионит включает НСО₃ ^- в качестве противоионов.

14. Способ по п.11, где анионит представляет собой сильный анионит.

15. Способ по пп.6-14 для получения меток ПЭТ, меченных радиоактивным изотопом ⁶⁸Ga.