DE69020007T2 - Vernetzte Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung. - Google Patents

Vernetzte Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung.

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DE69020007T2
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Description

    Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft vernetzte Antikörper, Zusammensetzungen, welche diese enthalten, Verfahren zu ihrer Herstellung, und ihre Verwendung in der Medizin und für Diagnose.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Antikörperkonjugate, in welchen Antikörper an Reporter- oder Effektorgruppen kovalent angebracht sind, werden in der Diagnose und in einem eingeschränkteren Ausmaß in der Therapie verwendet. Der Antikörper wird in der Regel auf Basis seiner Affinität und seiner Spezifität für ein bestimmtes Zielantigen derart ausgewählt, daß er bei Verwendung in der Lage ist, die Reporter- oder Effektorgruppe an eine gewünschte Stelle abzugeben und sie dort für eine Zeitspanne halten kann.
  • Bispezifische heterodimere Antikörper wurden früher beschrieben, in weichen Fab'-Fragmente über eine Thioetherverbindung verbunden wurden [Glennie M.J. et al J. Immunol 139 2367, (1987)]. Antikörper, in welchen das Fluoreszeinderivat Crabescein über eine Disulfidbindung verbunden wurden, wurden ebenso beschrieben [Packard B.P. et al Biochemistry 25, 3548 (1986)]. Das Markieren der gesamten Antikörper ist ebenfalls beschrieben, und zwar in der europäischen Patentanmeldung EP-A-0 224 120
  • Wir haben nun gefunden, daß durch Vernetzen von mindestens zwei Ketten eines Antikörperfragmentes in einer Vernetzung, welche von den Antigen-Bindungsbereichen entfernt ist, die Bindungskapazität des modifizierten Antikörperfragmentes in vorteilhafter Weise relativ zum unmodifizierten Antikörper gesteigert ist. Modifizierte Antikörperfragmente dieses Typus haben in vivo auch eine gute Blutklearance und ergeben bei Anwesenheit eines Tumors vorteilhafterweise hohe Tumor:Blut- und Tumor:Knochen-Verhältnisse. Solche Antikörperfragmente bieten daher, wenn sie mit einer Reporter- oder Effektorgruppe markiert sind, mögliche Vorteile gegenüber herkömmlichen markierten Antikörpern.
    • Kurzfassung der Erfindung
  • Gemäß einem Aspekt der Erfindung stellen wir daher ein Antikörperfragment-Konjugat zur Verfügung, das ein für eine antigene Determinate spezifisches Antikörperfragment umfaßt, an welchem eine Reporter- oder Effektorgruppe kovalent angebracht ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörperfragment-Konjugat mit mindestens einer Nicht-Disulfid-Zwischenkettenbrücke vernetzt ist, welche Brücke anjede Kette an einer oder mehreren Brückenstellen, die außerhalb der Antigen-bindenden Bereiche des Antikörpers angeordnet sind, angebracht ist.
  • In den Antikörperfragment-Konjugaten gemäß der Erfindung kann die Zwischenkettenbrücke jede schwere oder leichte Kette im Antikörperfragmentmolekül an eine oder mehrere andere schwere und/oder leichte Ketten im gleichen Molekül verbinden. Die Brücke wird jedoch vorzugsweise zwei Ketten, insbesondere zwei schwere Ketten, verbinden. Es kann mehr als eine Zwischenkettenbrückengruppe vorhanden sein, obwohl Konjugate mit einer solchen Brücke bevorzugt sind.
  • Der Ausdruck Nicht-Disulfid-Zwischenkettenbrücke soll bedeuten, daß S-S-Brücken desjenigen Typus, der normalerweise in Antikörpern gefunden wird, ausgeschlossen sind.
  • Die Brückenstelle in jeder Antikörperfragmentkette kann im allgemeinen an der Seitenkette eines Aminosäurerestes sein, welcher einen Teil der Kette bildet, aber nicht direkt am Antigenbindungsbereich teilnimmt. Geeignete Aminosäuren sind z.B. solche mit einer Seitenkette, welche eine Amino-, eine Sulfhydryl-, eine Carboxyl-, eine Phenolgruppe oder eine andere aromatische oder heteroaromatische funktionelle Gruppe enthält, über welche die Zwischenkettenbrücke verbunden werden kann. Besondere Aminosäurereste dieser Typen sind z.B. Lysin-, Cystein-, Glutaminsäure-, Asparaginsäure- und Thyrosinreste. Alternativ kann die Brückenstelle an einem Kohlehydratrest sein, der an die Antikörperfragmentkette angebracht ist, und zwar insbesondere ein oxidierter Kohlehydratrest, welcher mindestens eine Aldehydgruppe enthält, über welche die Zwischenkettenbrücke verbunden werden kann.
  • Besonders bevorzugte Brückenstellen sind die Sulfhydrylgruppen von Cysteinresten, zum Beispiel jene, welche in Zwischenkettendisulfidbrücken normal wirken. Bevorzugte Stellen dieses Typus sind Sulfhydrylgruppen von Cysteinresten, die in schweren Ketten im Gelenksbereich des Antikörperfragmentes vorhanden sind.
  • In einem anderen Vorzug kann die Brückenstelle an der Seitenkette eines Aminosäurerestes sein, welcher normalerweise im Immunglobulin nicht vorhanden ist, welcher jedoch durch die Anwendung rekombinanter DNA-Techniken, wie später beschrieben, eingebracht worden ist. Solche Stellen sind z.B. die Sulfhydryl- und Aminogruppen von Cystein- bzw. Lysinresten.
  • Die Zwischenkettenbrücken in den Konjugaten gemäß der Erfindung können in der Regel jegliche erwünschte Länge oder Zusammensetzung aufweisen. Geeignete Brücken sind z.B. Reste von homo- oder heterofunktionellen Vernetzungsreagenzien, insbesondere homo- oder heterobifunktionelle Vernetzungsreagenzien. Die Brücken können solche sein, daß sie zwei oder mehrere Brückenstellen verbinden. Besondere Brücken sind z.B. gegebenenfalls substituierte polyvalente, insbesondere bivalente, Reste von aliphatischen, aromatischen oder araliphatischen Verbindungen.
  • Die Zwischenkettenbrücke kann zum Beispiel die Struktur [-X¹-]m-Y¹-Y²-[-X²-]n (worin X¹ und X² jeweils der Rest einer reaktiven funktionellen Gruppe ist, Y¹ und Y² zusammen den Rest der Brücke bilden, und m und n, welche gleich oder verschieden sein können, jeweils eine ganze Zahl 1 oder höher sein können) aufweisen.
  • In den Brücken der obigen besonderen Typen können Y¹ und Y² zusammen sein: gerade oder verzweigte C&sub1;-&sub2;&sub0;Alkylen- (z.B.C&sub1;-C&sub1;&sub0;Alkylen-, wie z.B. C&sub4;-&sub1;&sub0;Alkylen-, z.B. Butylen, Pentylen, Hexylen oder Heptylen), C&sub2;-C&sub2;&sub0;Alkenylen- oder C&sub2;-C&sub2;&sub0;Alkynylenketten, die gegebenenfalls durch ein oder mehrere -O- oder -S-Atome unterbrochen sind, oder C&sub5;-&sub8;Cycloalkylen- (z.B. Cyclopentylen oder Cyclohexylen), aromatische C&sub6;-&sub1;&sub2; (z.B. Phenylen oder substituiertes Phenylen), heteroaromatische C&sub5;- &sub1;&sub0;(z.B. Furanyl, Pyrydyl), -N(R¹)- (worin R¹ ein Wasserstoffatom odereine C&sub1;-&sub6;Alkylgruppe ist), -CON(R¹)- oder -N(R¹)CO-Gruppen.
  • Im allgemeinen sind Reste von reaktiven funktionellen Gruppen, für welche X¹ oder X² stehen, zum Beispiel Reste von Gruppen, die in der Lage sind, mit einer Thiol-, Amino-, Carboxyl-, Hydroxyl-, Aldehydgruppe, aromatischen oder heteroaromatischen Gruppe zu reagieren. So können zum Beispiel X¹ oder X² sein: -CH&sub2;-, -S-, -NH-, -NHN=, -N(CH&sub3;)N=, -NHCONHN=, -NHCSNHN=, -N(Ph)N= (worin Ph Phenyl ist), -NC(O)-, -NC(S)-, -CO-,
  • -Het¹C(Het²)CH&sub2;- (worin Het¹ und Het², welche gleich oder verschieden sein können, jeweils eine eine Stickstoff enthaltende heterocyclische Gruppe, z.B. eine Pyridylgruppe, sind, oder Het¹ eine einen Stickstoff enthaltende heterocyclische Gruppe ist und Het² ein Wasserstoffatom ist), oder
  • (worin Alk ein C&sub1;-&sub4;alkyl, z.B. eine Methylgruppe, ist).
  • Es wird anerkannt werden, daß dann, wenn die Brücke verzweigt ist, eine reaktive funktionelle Gruppe in jedem Zweig vorgesehen werden kann, was eine Anbringung der Brücke an jede Kette über mehr als eine Brückenstellung gestattet.
  • Der Ausdruck markiertes Antikörperfragmentmolekül in Konjugaten gemäß der Erfindung soll ein Antikörperfragmentmolekül bedeuten, an welches eine Reporter- oder Effektorgruppe angebracht ist.
  • Reportergruppe sollte so verstanden werden, daß sie jede Gruppe oder Verbindung bedeutet, welche in vitro und/oder in vivo mittels analytischer Mittel auf einfache Weise nachgewiesen werden kann, und welche diese Eigenschaft dem Konjugat verleiht. Effektorgruppe soll so verstanden werden, daß sie jede Gruppe oder Verbindung bedeutet, welche in der Lage ist, eine Anderung im oder eine Antwort aus einem biologischen System auszulösen und welche diese Eigenschaft auch auf die Konjugate der Erfindung überträgt.
  • Geeignete Reporter- oder Effektormoleküle sind z.B. Radionuclide, z.B. ¹²&sup5;I und ¹³¹I; chelatisierte Metalle; fluoriszierende Verbindungen oder Verbindungen, welche mittels NMR- oder ESR-Spektroskopie nachgewiesen werden können; pharmakologische Mittel, z.B. zytotoxische Verbindungen und Toxine, z.B. Ricin und Fragmente davon; Enzyme; und Hormone.
  • Chelatisierte Metalle sind z.B. Chelate von zweifach oder dreifach positiven Metallen, die eine Koordinationszahl von 2 bis einschließlich 8 aufweisen. Besondere Beispiele solcher Metalle sind z.B. Technetium (Tc), Rhenium (Re), Cobalt (Co), Kupfer (Cu), Gold (Au), Silber (Ag), Blei (Pb), Wismuth (Bi), Indium (In), Gallium (Ga), Yttrium (Y), Terbium (Tb), Gadolinium (Gd) und Scandium (Sc). Im allgemeinen ist das Metall voizugsweise ein Radionuclid. Besondere Radionuclide sind z.B. 99mTc, ¹&sup8;&sup6;Re, ¹&sup8;&sup8;Re, &sup5;&sup8;Co, &sup6;&sup0;Co, &sup6;&sup7;Cu, ¹&sup9;&sup5;Au, ¹&sup9;&sup9;Au, ¹¹&sup0;Ag, ¹¹¹Ag, ²&sup0;³Pb, ²&sup0;&sup6;Bi, ²&sup0;&sup7;Bi, ¹¹¹In, &sup6;&sup7;Ga, &sup6;&sup8;Ga, &sup8;&sup8;Y, &sup9;&sup0;Y, ¹&sup6;&sup0;Tb, ¹&sup5;³Gd und &sup4;&sup7;Sc.
  • Das chelatisierte Metall kann zum Beispiel eines der obigen Typen von Metallen sein, die mit irgendeinem geeigneten vielzälinigen Chelatbildner, zum Beispiel acyclischen oder cyclischen Polyaminen, Polyether (z.B. Kronenether und Derivaten davon); Polyamiden; Porphyrinen und Carbonsäurederivaten, chelatisiert sind.
  • Im allgemeinen wird der Typus des Chelatbildners vom verwendeten Metall abhäagen. Eine besonders brauchbare Gruppe von Chelatbildnern in den Konjugaten gemäß der Erfindung sind jedoch acyclische und cyclische Polyamine, insbesondere Polyaminocarbonsäuren, zum Beispiel Diethylentriaminpentaessigsäure und Derivate davon, und makrocyclische Amine, z.B. cyclische Triaza- und Tetraazaderivate; und Polyamide, insbesondere Desferrioxamin und Derivate davon.
  • Beispiele besonderer makrocyclischer Amine sind z.B. Verbindungen der Formel (1)
  • (worin L eine reaktive Gruppe ist, B eine C&sub2;-&sub4;Alkylenkette ist, die durch ein oder zwei gegebenenfalls substituierte Stickstoffatome unterbrochen ist; W¹ und W², welche gleich oder verschieden sein können, jeweils ein gegebenenfälls substituiertes Stickstoffatom sind; p null oder eine ganze Zahl 1 ist, und q null oder eine ganze Zahl 1 oder 2 ist, mit der Maßgabe, daß, wenn p null ist, q eine ganze Zahl 1 oder 2 ist). Es wird anerkannt werden, daß die Gruppe L den Anbringungspunkt für den Makrocyclus in Konjugaten gemäß der Erfindung zur Verfügung stellt.
  • Bevorzugte Amine der Formel (1) sind z.B. Triazaderivate der Formel (2):
  • [worin die Gruppe L so ist, wie gerade definiert wurde, W¹ und W², welche gleich oder verschieden sein können, jeweils eine Gruppe -N[(CH&sub2;)rR¹]- (worin r null oder eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist, und R¹ eine Alkyl-, Alkoxyalkyl-, -CO&sub2;H-, -SO&sub3;H-, -PO&sub3;H&sub2;- oder eine Arylgruppe ist), und B eine Gruppe -CH&sub2;(CH&sub2;)sN(R)(CH&sub2;)tCH&sub2;- ist (worin s und t, welche gleich oder verschieden sein können, jeweils null oder eine ganze Zahl 1, 2 oder 3 sind, und R für -(CH&sub2;)rR¹ steht, worin r und R¹ soeben beschrieben wurden)]; und Tetraazaderivate der Formel (3)
  • [worin die Gruppe L so wie eben definiert ist, W¹ und W², welche gleich oder verschieden sein können, jeweils eine Gruppe N[(CH&sub2;)rR¹]- (wie eben definiert) sind, und B eine Gruppe -CH&sub2;(CH&sub2;)sN(R)CH&sub2;(CH&sub2;)dN(R)(CH&sub2;)tCH&sub2;- ist (worin d null oder eine ganze Zahl 1, 2 oder 3 ist und s, t und R wie eben definiert sind].
  • Ein besonders brauchbares Amin der Formel (2) ist die Verbindung der Formel (4):
  • Ein besonders brauchbares Amin der Formel (3) ist die Verbindung der Formel (5):
  • Bevorzugte chelatisierte Metalle in den Konjugaten gemäß der Erfindung sind z.B. Indium, welches mit einer Verbindung der Formel (2), insbesondere der Verbindung der Formel (4), chelatisiert ist; oder Yttrium, welches mit einer Verbindung der Formel (3), insbesondere der Verbindung der Formel (5), chelatisiert ist. ¹¹¹In und &sup9;&sup0;Y sind besonders bevorzugt.
  • Die Reporter- oder Effektorgruppe kann an das Antikörperfragment entweder direkt (zum Beispiel wie im Fall eines Radionuclids, wie z.B. Jod) oder indirekt über eine reaktive funktionelle Gruppe, zum Beispiel eine Gruppe X¹, wie oben beschrieben, angebracht sein.
  • Das Antikörperfragment in den Konjugaten gemäß der Erfindung kann im allgemeinen jeder Immunglobulinklasse angehören. Es kann so zum Beispiel ein Immunglobulin M-Antikörper oder insbesondere ein Immunglobulin G-Antikörper, einschließlich der Isotypen IgG1, IgG2, IgG3 und 19G4 sein. Die Isotypen IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4 sind in den Konjugaten gemäß der Erfindung besonders brauchbar, insbesondere die Isotypen IgG1 und IgG4.
  • Das Antikörperfragmentmolekül kann tierischen, zum Beispiel säugetierischen, Ursprungs sein und kann zum Beispiel murinen Ursprungs sein oder von der Ratte oder dem Menschen stammen. Es kann ein Fragment eines natürlichen Antikörpers oder, falls erwünscht, eines rekombinanten Antikörperfragmentes, d.h., ein Antikörperfragment, welches unter Anwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt worden ist, sein.
  • Besondere rekombinante Antikörperfragmente sind z.B. (1) jene, welche eine Antigenbindungsstelle aufweisen, von welcher zumindest ein Teil von einem anderen Antikörper abgeleitet ist, zum Beispiel jenen, in welchen die hypervariablen oder die Komplementarität bestimmenden Bereiche eines Antikörpers in die variablen Rahmenbereiche eines zweiten, verschiedenen Antikörpers gepfropft worden sind (wie in der Beschreibung des Europäischen Patentes Nr. 239400 beschrieben); (2) rekombinante Fragmente, in welchen nicht-Fv-Sequenzen gegen nicht-Fv-Sequenzen von anderen, verschiedenen Antikörpern substituiert worden sind (wie in der Beschreibung der Europäischen Patente Nrn. 171496, 173494 und 194276 beschrieben); oder (3) rekombinante Fragmente, welche im wesentlichen die Struktur eines natürlichen Immunglobulins besitzen, aber wobei ein oder mehrere Aminosäurereste geändert sind, zum Beispiel wobei der Gelenksbereich des Antikörperfragmentes eine andere Anzahl von Cysteinresten besitzt als jener, der im natürlichen Immunglobulin gefunden wird, oder worin ein oder mehrere Cysteinreste in einer Oberflächentasche des rekombinanten Antikörperfragments anstelle eines anderen Aminosäurerestes vorhanden ist, der im natürlichen Immunglobulin anwesend ist (wie in den internationalen Patentbeschreibungen Nr. WO89/01974 bzw. WO89/01782 beschrieben) oder wobei ein Lysinrest an der Stelle eines anderen Aminosäurerestes ist, welcher im natürlichen Immunglobulin vorhanden ist.
  • Das Antikörperfragment kann zum Beispiel ein proteolytisches Fragment sein, welches durch enzyrnatische Verdauung eines ganzen Antikörpers erhalten wird. Alternativ kann das Antikörperfragment ein Fragment sein, welches durch rekombinante DNA-Techniken erhalten wird, zum Beispiel Fv- Fragmente (wie in der internationalen Patentbeschreibung Nr. WO89/02465 beschrieben).
  • Im allgemeinen sind Konjugante gemäß der Erfindung, in welchen das Antikörperfragment ein F(ab')&sub2;-Fragment ist, bevorzugt.
  • Das Antikörperfragment kann polyklonalen oder vorzugsweise monoklonalen Ursprungs sein. Es sollte fur eine antigene Determinante spezifisch sein. Die antigene Determinante kann jedes Hapten oder eine antigene Determinante, welche mit irgendeinem Antigen assoziiert ist, sein. Besondere Antigene sind z.B. solche, die mit Tieren, z.B. Menschen, assoziiert sind [zum Beispiel Antigene, die mit normalem Tiergewebe oder mit Organzellen assoziiert sind, mit Tumorzellen assoziierte Antigene (zum Beispiel onkofötale Antigene, wie z.B. ein carcinoembryonisches Antigen oder Alphafötoprotein, Plazentaantigene, wie z.B. Choriongonadotropin und alkalische Plazentaphosphatase, und Prostataatitigene, wie z.B. saure Prostataphosphatase und Prostata-spezifisches Antigen) und Antigene, die mit Komponenten von Körperflüssigkeiten assoziiert sind, wie z.B. Fibrin oder Plättchen], Viren, Bakterien und Pilze.
  • In einem bevorzugten Aspekt kann das Antikörperfragment in der Lage sein, ein mit Tumorzellen assoziiertes Antigen zu erkennen und zu binden, und zwar insbesondere ein oder mehrere Epitope auf dem Antigen TAG-72, welches mit Brust- und Dickdarmtumoren beim Menschen assoziiert ist. Ein besonders bevorzugtes Antikörperfragment dieses Typus ist ein Fragment des monoklonaren Antikörpers B72.3 [Colcher, D. et al Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1981), 78, 3199], insbesondere ein F(ab')&sub2;- Fragment.
  • Eine bevorzugte Gruppe von Konjugaten gemäß der Erfindung ist jene, worin jedes Antikörperfragment-Konjugat ein markiertes Antikörperfragment-Molekül mit einer nicht-Disulfid-Schwere- Ketten-Zwischenbrücke, welche Brücke an jede schwere Kette über die Sulfhydrylgruppe eines Cysteinrestes, der in jeder der Seitenketten im Gelenksbereich des Antikörperfragment-Moleküls vorhanden ist, angebracht ist.
  • Besonders brauchbare Konjugate dieses Typus sind solche, in welchen das Antikörperfragment nur einen Cysteinrest, der in jeder schweren Kette im Gelenksbereich vorhanden ist, aufweist, welche Cysteinreste die Brückenstellen für die Zwischenkettenbrücke bilden.
  • Andere brauchbare Konjugate dieses Typus sind solche, bei denen das Antikörperfragment in der Lage ist, ein mit Tumorzellen assoziiertes Antigen, insbesondere ein oder mehrere Epitope auf dem Antigen TAG-72, welches mit Brust- und Dickdarmtumoren beim Menschen assoziiert ist, zu erkennen und zu binden. Das Antikörperfragment kann ein Fragment eines natürlich vorkommenden Antikörpers, insbesondere ein F(ab')&sub2;-Fragment, oder ein rekombinantes Antikörperfragment, wie oben beschrieben, sein. Das Antikörperfragment ist vorzugsweise ein Fragment eines Antikörpers B72.3, einschließlich eines rekombinanten Antikörpers B72.3.
  • In Konjugaten dieses bevorzugten Typus ist der Marker vorzugsweise ein Jodatom, insbesondere ¹²&sup5;I oder ¹²¹I, oder ein Chelatbildner der Formel (1), insbesondere eine Verbindung der Formeln (2) oder (3), besonders eine Verbindung der Formeln (4) oder (5), mit einem Metall komplexiert. Das Metall ist vorzugsweise ein zweifach oder dreifach positives Metall mit einer Koordinationszahl von 2 bis einschließlich 8 und ist insbesondere ein Radionuclid. Indium, insbesondere ¹¹¹In, und Yttrium, insbesondere &sup9;&sup0;Y, sind besonders bevorzugt.
  • Die Konjugate gemäß der Erfindung sind als diagnostische und therapeutische Mittel verwendbar. In Anhängigkeit von der Natur des Antikörperfragmentes und der Reporter- oder Effektorgruppe kann das Konjugat in vivo in Verbindung mit einem geeigneten Detektor verwendet werden, um normales oder krankes Gewebe, einschließlich Tumoren und Thromben, abzubilden; oder bei der Behandlung abnormaler Zellstörungen, z.B. Tumore, Thromben und kranke, einschließlich infizierte Gewebe. Alternativ können die Konjugate gemäß der Erfindung bei diagnostischen Techniken in vitro verwendbar sein, zum Beispiel in Radioimmuntests oder Enzyin-verbundenen Immuntests.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung stellen wir daher ein Antikörperfragment-Konjugat zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung oder Diagnose eines Menschen oder eines Tieres zur Verfügung, welches Antikörperfragment-Konjugat ein Antikörperfragment umfaßt, welches für eine antigene Determinante spezifisch ist, und an welchem eine Reporter- oder Effektorgruppe kovalent angebracht ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörperfragmentkonjugat mit mindestens einer Nicht-Disulfid-Zwischenkettenbrücke vernetzt ist, welche Brücke an jede Kette an einer oder mehreren Brückenstellen, die außerhalb der Antigen-bindenden Bereiche des Antikörpers angeordnet sind, angebracht ist.
  • Für eine Verwendung in vivo kann das Antikörperkonjugat als eine geeignete Zusammensetzung in einer geeignenten Dosierung formuliert werden.
  • Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird daher eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, welche ein Antikörperfragment-Konjugat gemäß der Erfindung zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern oder Exzipienten umfaßt.
  • Eine Verabreichung des Konjugates in vivo kann auf jedem geeigneten Weg vorgenommen werden und ist vorzugsweise parenteral, z.B. durch Injektion oder Infusion. Geeignete Formulierungen des Konjugates für eine parenterale Verabreichung sind z.B. Suspensionen, Lösungen oder Einulsionen des Konjugates in öligen oder wäßrigen Trägern und können Formulierungsmittel, wie z.B. suspendierende, stabilisierende und/oder dispergierende Mittel, enthalten. Alternativ kann das Konjugat vor Verwendung in Pulverform zur Rekonstitution mit einem geeignenten Träger, z.B. sterilem pyrogenfreiem Wasser, vorliegen. Falls erwünscht, kann das Konjugat in Einheitsdosisform und/oder zusammen mit einem oder mehreren anderen aktiven Inhaltsstoffen oder Abbildungsmitteln vorliegen.
  • Die genauen Dosen, mit denen das Konjugat verabreicht wird, hängen vom Verabreichungsweg, der Natur des Antikörperfragmentes und der Reporter- oder Effektorgruppe und der beabsichtigten Verwendung ab, d.h. ob für Diagnose oder Therapie, zusammen mit anderen Variablen, wie z.B. dem Körpergewicht und dem Krankheitszustand des Patienten. Die Dosis für jede Anwendung wird daher gewöhnlich empirisch unter Anwendung von Standardverfahren bestimmt werden müssen.
  • Wo das Konjugat gemäß der Erfindung für eine Diagnose in vitro gedacht ist, kann es für die Anwendung adaptiert werden, wobei herkömmliche Verfahren angewendet werden, wie sie zum Beispiel in Enzymology 84, 1982 und 92 377-523, 1983 (Gen. Ed. Langone, J.J und Van Vunakis, H, Academic Press, New York) beschrieben sind.
  • Konjugate gemäß der Erfindung können im allgemeinen durch Umsetzung eines Antikörperfragmentes davon mit einem Vernetzungsreagens hergestellt werden. Es wird anerkannt werden, daß die Vernetzungsreaktion entweder mit einem markierten oder mit einem unmarkierten Antikörperfragment- Molekül bewirkt werden kann.
  • Die Umsetzung kann im allgemeinen in einem geeignenten Lösungsmittel bewirkt werden, z.B. in einem wäßrigen Lösungsmittel, wie z.B. Wasser oder einem wäßrigen anorganischen oder organischen Puffer, z.B. ein Phosphat-, Citrat- oder Acetatpuffer oder Gemische davon; oder in einem waßriges organischen Lösungsmittel, zum Beispiel, wäßrigem Aceton oder Dimethylformamid, bei einer geeignenten Temerpatur, zum Beispiel im Bereich von 0º-30ºC, insbesondere bei etwa Raumtemperatur.
  • Es wird anerkannt werden, daß bei Vernetzungsreaktionen dieses allgemeinen Typus, wo das Antikörperfragment und/oder die Reporter- und Effektorgruppen, sofern sie vorhanden sind, eine Anzahl von potentiell reaktiven Gruppen enthalten, ein wahlloses Vernetzen auftreten kann, was zu einem heterogenen Gemisch von Produkten führt. Um dies zu vermeiden, kann das allgemeine Vernetzungsverfahren durch geeignete Wahl von Reaktanten und/oder Reaktionsbedingnngen, entweder allein oder in Kombination, angepaßt werden, um ein homogenes Produkt zu erhalten.
  • In einer Option können die Vernetzungsreagentien mit funktionellen Gruppen gewahlt werden, welche gezielt mit spezifischen funktionellen Gruppen im Antikörperfragment reagieren. Es gibt zahlreiche Beispiele solcher Gruppen, zum Beispiel aminoreaktive und thiolreaktive funktionelle Gruppe, die dem Fachmann gut bekannt sind [zum Beispiel wie in den Europäischen Patentbeschreibungen Nr. 173629 und 175617, der UK-Patentbeschreibung Nr. 2109407 und der internationalen Patentbeschreibung Nr. WO88/05433 beschrieben], welche unter geeignenten Bedingungen auf eine selektive Weise reagieren.
  • In einer zweiten Option können potentiell reaktive Gruppen im Antikörperfragment und/oder in der Reporter- oder Effektorgruppe, welche nicht vernetzen sollen, geschützt werden, bevor die Vernetzungsreaktion bewirkt wird. Es können herkömmliche Verfahren zum Schutz von reaktiven Gruppen in Proteinen zusammen mit Standard-Entschützungstechniken angewendet werden.
  • In einer weiteren Option kann das Antikörperfragment so gewählt werden, daß es mindestens ein Paar einzigartige Brückenstellen besitzt, welche für die Vernetzung herangezogen werden können. Es ist daher möglich, ein Antikörperfragment teilweise zu reduzieren, wobei zum Beispiel ein mildes Reduktionsmittel, wie z.B. β-Mercaptomethylamin, verwendet wird, so daß freie Sulfhydrylgruppen aus den Disulfidbrücken erzeugt werden, welche die schweren Ketten des Antikörperfragmentes verbinden, während der Rest des Moleküls im wesentlichen unbeeinträchtigt bleibt. Die Sulfhydrylgruppen können dann als Brückenstellen für eine selektive Umsetzung mit einem Thio-spezifischen Vernetzungsreagens verwendet werden. Alternativ kann der Antikörper unter Anwendung chemischer oder enzymatischer Techniken, wie z.B. in der Europäischen Patentbeschreibung Nr. 173629 beschrieben, oxydiert werden, um Aldehydgruppen in Kohlehydratseitenketten zu erzeugen, welche dann mit einem Vernetzungsmittel umgesetzt werden, wie oben allgemein beschrieben.
  • In einer weiteren Alternative können einzigartige Brückenstellen in ein Antikörperfragment unter Anwendung von rekombinanten DNA-Techniken vor der Umsetzung mit dem Vernetzungsreagens eingebracht werden. Es kann zum Beispiel ein Antikörperfragment zur Verfügung gestellt werden, in welchem die Anzahl an Cysteinresten im Gelenksbereich jeder schweren Kette auf eins verringert worden ist. Dies kann zweckmäßigerwcise erzielt werden, indem in einem Expressionsvektor zuerst ein Operon produziert wird, welches eine DNA-Sequenz aufweist, die eine schwere Kette eines Antikörpers mit einem Gelenksbereich, der normalerweise mit dem CH1-Bereich des Antikörperfragment-Moleküls assoziiert ist, codiert.
  • Das Operon kann produziert werden, indem eine DNA-Sequenz, welche den CHI-Bereich codiert, von einem Antikörper einer Klasse zu einer DNA-Sequenz gespalten wird, welche den Gelenksbereich von einem Antikörper von einer anderen Klasse codiert. Alternativ kann es produziert werden, indem der CHI-Bereich und der Gelenksbereich von einem Antikörper einer Klasse geklont und die Anzahl an Cysteinresten-kodierenden DNA-Tripletts auf ein solches Triplett geändert wird, und zwar durch punktgerichtete Mutagenese, zum Beispiel durch Mutation zu Alanin-codierenden Sequenzen. Eine Transfektion einer geeigneten Zellinie mit dem Vektor und ein anschließendes Kultivieren der transfizierten Linie produziert dann das erwünschte Schwerkettenpolypeptid.
  • Da der Vektor lediglich das Schwerkettenpolypeptid codiert, wird es notwendig sein, daß fur die Zellinie vorgesehen wird, eine komplementäre leichte Kette zu produzieren. Um dies zu erreichen, kann eine von drei alternativen Strategien angewendet werden. In einer ersten Alternative kann die Zellinie mit einem zweiten Vektor transflziert werden, welcher zweite Vektor ein von einer komplementären leichten Kette abgeleitetes Polypeptid codiert. Vorzugsweise sind die Vektoren identisch, außer was die codierenden Sequenzen und die wählbaren Marker betriffi, damit soweit wie möglich sichergestellt wird, daßjede Polypeptidkette auf gleiche Weise exprimiert wird.
  • In einer zweiten Alternative kann der Vektor Sequenzen aufweisen, die Polypeptide codieren, die sowohl von einer leichten Kette als auch von einer schweren Kette abgeleitet sind. In einer dritten Alternative kann eine Host-Zelle, welche auf natürliche Weise eine komplementäre leichte Kette absondert, verwendet werden. Die allgemeinen Verfahren, mit welchen die Vektoren konstruiert werden können, die Transfektionsverfahren und die Kultivierungsverfahren sind gut bekannt (siehe zum Beispiel Maniatis et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, 1982; Primrose und Old, Principles of Gene Manipulation, Blackwell, Oxford 1980). Das obige Verfahren wird detaillierter in der internationalen Patentbeschreibung Nr. WO 89/01974 beschrieben.
  • Es wird anerkannt werden, daß die oben beschriebenen Techniken so ausgerichtet werden können, daß sie jedes Paar schwere Kette - leichte Kette, welches einen Gelenksbereich mit einem Cysteinrest enthält, ergeben. Solche Konstruktionen können mit einem Vernetzungsreagens umgesetzt werden, wie im allgemeinen oben und in den Beispielen unten beschrieben.
  • Unter Anwendung älinlicher rekombinanter DNA-Techniken wie jene, die eben beschrieben wurden (siehe auch die internationale Patentbeschreibung Nr. WO89/0 1782), kann ein Cysteinrest in jede schwere Kette eines Antikörpermoleküls eingebracht werden, um einzigartige Brückenstellen für eine anschließende Umsetzung mit einem Vernetzungsreagens vorzusehen, um ein Konjugat gemäß der Erfindung herzustellen. Die beschriebenen Verfahren können auch in einer zwecktnäßig adaptierten Form mit geeignenten Ausgangsmaterialien angewendet werden, wo es erwünscht ist, andere rekombinante Antikörperfragmente herzustellen, und zwar zum Beispiel rekombinante Antikörperfragmente, welche zusätzliche Lysingruppen oder andere Aminosäuren enthalten, welche einzigartige Brückenstellen für das Vernetzungsreagens zur Verfügung stellen.
  • Wir haben im allgemeinen gefunden, daß es in Vernetzungsreaktionen zur Herstellung von Verbindungen gemäß der Erfindung, insbesondere dort, wo das Antikörperfragment einzigartige Bruckenstellen besitzt, zum Beispiel wie oben beschrieben, bevorzugt ist, das Vernetzungsreagens mit einem Überschutz an Antikorperfragment umzusetzen. Indem dies gemacht wird, wird ein wahlloses Vernetzen vermieden, und das erwunschte Antikorperfragmentprodukt wird in guter Ausbeute und Reinheit hergestellt. Vernetzungsreaktionen, in welchen das Antikorperfragment in einer Überschußkonzentration (zum Beispiel 2 X und größerer Überschuß) relativ zum Vernetzungsreagens verwendet wird, bilden ein weiteres Merkmal der Erfindung.
  • Wo in den Konjugaten der Erfindung die Reporter- oder Effektorgruppe ein chelatisiertes Metall ist, kann der letzte Schritt bei der Herstellung des Konjugates eine Umsetzung sein, um das Metall einzubringen. Das Metall kann eingebracht werden, indem ein Antikörper mit einem Metallsalz (z.B. einem Metallhalogenid) in einem geeigneten Lösungsmittel, zum Beispiel einem wäßrigen oder nichtwäßrigen Lösungsmittel (z.B. Acetonitril, Aceton, Propylencarbonat, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid) bei jeder geeignenten Temperatur von 0ºC bis 50ºC, z.B. bei etwa Raumtemperatur, umgesetzt wird.
  • Antikörper zur Verwendung als Ausgangsmaterial bei der Herstellung von Konjugaten gemäß der Erfindung können mit herkömmlichen Mitteln hergestellt werden, zum Beispiel aus den Seren immunisierter Tiere oder vorzugsweise Myelom- oder Hybridomzellen, oder durch rekombiniinte DNA- Techniken, wie in den Europäischen Patentbeschreibungen 171496, 173494, 194276 und 239400 und in den internationalen Patentbeschreibungen Nr. WO89/0 1974, WO89/0 1782, WO89/02465 und WO89/01783 beschrieben. Antikörperfragmente können durch enzymatische oder chemische Mittel oder eine Kombination beider gemäß herkömmlicher Praxis aus ganzen Antikörpern oder durch die oben erwälinten rekombinanten DNA-Techniken hergestellt werden.
  • Vernetzungsreagentien für die Herstellung von Konjugaten gemäß der Erfindung können in der Regel ein heterofunktionelles Vernetzungsreagens sein. Verfahren zum Erhalten heterofunktioneller Vernetzungsreagentien sind gut bekannt [siehe zum Beispiel Ghose, T. I. et al in Methods in Enzymology (1983), 93 280-333].
  • Effektor- oder Reportergruppen zur Verwendung in den Konjugaten gemäß der Erfindung sind leicht erhältlich (siehe zum Beispiel die Beschreibung des UK-Patentes 2109407, die Beschreibung des US-Patentes 4472509, die Beschreibung des europäischen Patentes Nr. 175617 und die Beschreibung der internationalen Patente Nr. WO89/01475 und WO89/01476), oder können aus diesen bekannten Verbindungen durch einfache chemische Modifizierung unter Anwendung herkömmlicher Techniken erhalten werden, oder können aus bekannten Ausgangsmaterialien unter Anwendung von Verfahren erhalten werden, die analog jenen sind, die zur Herstellung der bekannten Verbindungen angewendet werden.
  • Besondere makrocyclische Amine der Formeln (1), (2) und (3) können mit den Verfahren hergestellt werden, die in den Beschreibungen der internationalen Patente Nr. WO89/01475 und WO89/01476 beschrieben sind.
  • Reporter- und Effektorgruppen können mit dem Antikörperfragment unter Anwendung herkömmlicher Mittel verbunden werden. Es kann so zum Beispiel Jod direkt mit dem Antikörper unter Anwendung des Chloramin T-Verfahrens verbunden werden (siehe zum Beispiel die Beschreibung des US-Patentes 4331647), während andere Reporter- oder Effektorgruppen durch Umsetzung einer geeigneten funktionellen Gruppe auf der Reporter- oder Effektorgruppe mit dem Antikörperfragment unter Anwendung von Standardverfahren verbunden werden, wie sie zum Beispiel in der Beschreibung des UK-Patentes Nr. 2109407 und in den Beschreibungen der internationalen Patente Nr. WO89/01475 und WO89/01476 beschrieben sind.
    • Beschreibung spezifischer Ausfuhrungsformen
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung
    • Beispiel 1
  • (a) Herstellung von F(ab')&sub2;-Fragmenten aus B72.3-IgG [Colcher D et al Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1981), 78, 3199]. F(ab')&sub2;-Fragmente wurden aus B72.3-IgG durch Verdauung mit Bromelain hergestellt. Das Bromelain wurde zuerst durch Inkubieren einer 1,0 mg/ml-Lösung mit 50 mMol Cystein in 0,1 Mol Acetat, pH 5,50, enthaltend 3 mMol EDTA, bei 37ºC während 30 Minuten aktiviert. Aktiviertes Bromelain wurde in 0,1 Mol Acetat, pH 5,50, enthaltend 3 mMol EDTA, unter Verwendung von einer PD10-(Sephadex G25)-Säule entsalzt, um Cystein zu entfernen und einer 2,0 mg/ml-Lösung von B72.3 (1(Gew/Gew):50(Gew/Gew) Enzym:IgG) im gleichen Puffer zugegeben. Das Verdaute wurde etwa 2 Stunden lang bei 37ºC inkubiert, und die Umwandlung von IgG zu einem Peak der Größe F(ab')&sub2; wurde mittels SDS-PAGE überwacht. Nach Beendigung der Verdauung wurden Antipain und Leupeptin zugegeben (Endkonzentration 0,05 mg/ml), und der pH des Gemisches wurde mit NaOH für eine nachfolgende S Sepharose-Schnellstromionenaustauschchromatographie auf pH 6,0 eingestellt. Das F(ab')&sub2;, Fc und das restliche IgG eluierten im Durchfluß und das Bromelain blieb auf der Matrix gebunden. Dieser negative Reinigungsschritt entfernte wirksam das gesamte Bromelain aus dem Verdauungsgemisch.
    • (b) Reinigung von F(ab')&sub2;-Fragmenten
  • Das restliche Verdauungsgemisch wurde zuerst in 20 mMol Tris, pH 7,8, dialysiert und auf eine DEAE Sepharose-Schnellstromsäule geladen. Das F(ab')&sub2; eluierte aus der Säule im Durchfluß, wahrend der Fc-Teil und das restliche intakte IgG zurückgehalten wurden. Das gebundene Material eluierte mit 0,1 Mol NaCl in 20 mMol Tris, pH 7,8, wobei die Säule regeneriert wurde.
    • (c) Herstellung von chemisch vernetzten F(ab')&sub2;-Molekülen
  • B72.3 F(ab')&sub2; bei 5,0 mg/ml in 0,15 Mol Phosphatpuffer, pH 8,0 enthaltend 2 mMol EDTA, wurde durch die Zugabe von 2-Mercaptoethylamin bis zu einer Endkonzentration von 5 mMol und durch Inkubation bei 37ºC während 30 Minuten reduziert. Nach Reduktion wurde die Probe durch eine Sephadex G25 (Pharmacia)-Säule, welche mit 0, 1 Mol Zitronensäure/0,2 Mol Na&sub2;HPO&sub4;, pH 6,0, die 2 mMol EDTA enthielt, äquilibriert war, entsalzt.
  • 1,6-Bismaleinimidohexan wurde in Dimethylformamid bis zu einer Endkonzentration von 72 mMol gelöst und dem frisch reduzierten Fab'SH bei einem Pegel von 0,9 mMol (annäherd 22facher Überschuß uber titrierbare Thiole) zugegeben. Nach 90minutiger Inkubation mit konstanten Mischen bei Raumtemperatur wurde N-Ethylmaleinimid bis zu einer Endkonzentration von 9 mMol und weitere 30 Minuten lang inkubiert, bevor in 0,1 Mol Zitronensaure/0,2 Mol Na&sub2;HPO&sub4; 2 mMol EDTA entsalzt wurde. Das maleinimidierte Fab' (Fab'mal) wurde sofort einem frischen Ansatz von Fab'SH zu einem Molverhältnis von Fab'mal:Fab'SH von 1,1:1,0 zugegeben und bei Raumtemperatur unter konstantem Mischen etwa 20 Stunden lang inkubiert. Das vernetzte F(ab')&sub2; wurde mittels HPLC-Gelfiltration aus dem Reaktionsgemisch gereinigt.
  • Die Zusammensetzung des Vernetzungsreaktionsgemisches wurde mittels HPLC-Gelfiltration nach der Inkubation über Nacht bestimmt. 10 ul des Reaktionsgemisches wurden 10 ul 200 mMol 2- Mercaptoethylamin zugegeben und 15 Minuten lang inkubiert. Es wurde eine weitere Zugabe von 20 ul 800 mMol Jodacetamid getätigt und 15 Minuten lang umgesetzt. Die reduzierte und alkylierte Probe wurde dann mittels HPLC GF 250 analysiert, und die Prozentsatzzusammensetzung des Chromatogrammes wurde durch Integration bestimnit. Das chemisch vernetzte Molekül eluierte mit einer Retentionszeit von 8,62 min, wogegen nicht-umgesetztes Fab' später bei 9,48 min unter HPLC- Standardbedingungen mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min in einem 0,2 Mol Phosphatpuffer, ph 7,0, mobile Phase, eluierte. Das vernetzte F(ab')&sub2; wurde nach Reinigung auch durch reduzierende SDS-PAGE veriflziert, wobei das F(ab')&sub2; eine vernetzte H'-H'-Bande (Mr: 46.000) und L- Bande (Mr 22.000) zeigte, wogegen eine Kontrolle die üblichen H'-(Mr: 23.000) und L-(Mr: 22.000) Banden zeigte.
  • Die Umsetzung wurde wiederholt, wobei die folgenden vernetzenden Reagentien anstelle von 1,6-Bismaleinhnidohexan verwendet wurden: N,N'-O-Phenylendimaleinimid; Bismaleinimidomethylether; und Lysinbismaleinimid.
  • Jeder der vernetzten Antikörper, der oben hergestellt wurde, wurdejodiert, wobei das Chloramin T-Verfahren angewendet wurde, um einen Konjugatantikörper der Erfindung zu erhalten, in welchem der Marker Jod und die Verbrückungsgruppe entweder der Rest von 1,6-Bismaleinimidohexan, N,N¹- O-Phenylendiinaleinimid, Bismaleinimidmethylether oder Lysinbismaleinimid, ist, verbunden mit jeder schweren Kette des Antikörpers über eine Cystein-Verbrückungsstelle, die ini Gelenksbereich vorhanden ist.
    • Beispiel 2
  • Dieses veranschaulicht die Herstellung von mit entweder 1,6-Bismaleinimidohexan oder Lysinbismaleinimid delta Cys-vernetztem, chimerem B72.3-Fab'. Das chimere B72.3-Fab'-delta Cys- Ausgangsmaterial wurde gemäß der Verfahren hergestellt, die in den internationalen Patentbeschreibungen WO89/01974 und WO89/01783 spezifisch beschrieben sind.
  • Chimeres B72.3-Fab'-delta Cys wurde bei 1,0 bis 2,0 mg/ml in einem 0,1 Mol Natriumacetatpuffer, ph 6,0, enthaltend 0,86 mMol Zitronensaure und 2mMol ETDA, durch die Zugabe von 2- Mercaptomethylamin bis zu einer Endkonzentration von 5 mMol reduziert und bei 37ºC 30 Minuten lang inkubiert. Nach Reduktion wurden die Probenuber eine Sephadex G25 (Pharmacia) Saule, die mit 0,1 Mol Natriumacetat/Zitratpuffer, pH 6,0, enthaltend 2 mMol EDTA, aquilibriert war, entsalzt.
  • Lysinbismaleinimid wurde in Wasser gelost und frisch reduziertem Fab'SH bei einer Konzen- tration von 3,8 mMol (annahernd 40facher Überschuß uber titrierbare Thiole) zugegeben und unter konstantem Mischen 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. N-Ethylmaleinimid wurde bis zu einer Endkonzentration von 9 mMol zugegeben und ferner 30 Minuten lang inkubiert, bevor in eine mit Phosphat gepufferte Salzlösung, ph 7,5, entsalzt wurde. Das maleinimidierte Fab' (Fab'mal) wurde sofort einem frischen Ansatz von Fab'SH zu einem Gewichtsverhältnis von Fab'mal:Fab'SH von 1,1:1,0 zugegeben und bei Raumtemperatur unter konstantem Mischen während etwa 20 Stunden inkubiert.
  • Die Zusammensetzung des Vernetzungsreaktionsgemisches wurde nach Inkubation über Nacht mittels HPLC-Gelfiltration bestimmt. 10 ul des Reaktionsgemisches wurden 10 ul 200 mMol 2-Merkaptoethylamin zugegeben und 15 Minuten inkubiert. Es wurden weitere 20 ul 800 mMol Jodacetamid zugegeben und 15 Minuten umgesetzt. Dann wurde die reduzierte, alkylierte Probe mittels HPLC (Zorbax GF-250 Gel-Filtrationssäule) analysiert und der Prozentsatz der Zusammensetzung des Chromatogrammes mittels Integration bestimmt. Mit Bismaleinimid vernetztes Material eluierte mit einer Retentionszeit von 8,62 Min, wogegen nicht umgesetztes cFab' später bei 9,48 Min bei Standard-HPLC- Bedingungen mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/Min in 0,2 Mol Phosphatpuffer pH 7,0 als mobile Phase eluierte. Das vernetzte Material wurde auch nach Reinigung durch reduzierende SDS- PAGE verifiziert, wobei es eine vernetzte H'-H'-Bande (Mr: 46.000) und L-Bande (Mr 22.000) zeigte, wogegen eine Kontrolle die üblichen H1-(Mr: 23.000) und L-(Mr: 22.000) Banden zeigte.
  • Der Versuch wurde wiederholt, wobei 1,6-Bismaleinimidohexan in trockenem Dimethylformamid anstelle des Lysinbismaleinimids in Wasser verwendet wurde, wobei ein Antikörpermaterial, welches mit Bismaleinimidohexan vernetzt war, erhalten wurde.
  • Die Produkte aus beiden Versuchen wurden jodiert, wobei das Chloramin T-Verfahren angewendet wurde, um einen konjugierten Antikörper der Erfindung zu erhalten, in welchem der Marker Jod ist und in welchem die Verbrückungsgruppe entweder der Rest von Lysinbismaleinimid oder von 1,6- Bismaleinimidohexan war, über den einzigen Cysteinrest, der in jeder Kette vorhanden ist, verbunden mit jeder schweren Kette des Antikörpers.
    • Beispiel 3
  • Die in Beispiel 2 beschriebenen Versuche wurden wiederholt, außer daß jeder Vernetzer dem reduzierten Fab'SH bei einem molaren Äquivalentverhältnis von Fab'SH:Vernetzer von 2,2:1 zugegeben wurde. Nach 60minütigem Inkubieren bei 37ºC wurde vernetztes Material isoliert, wie in Beispiel 2 beschrieben ist, und es wurde mittels SDS-PAGE gezeigt, daß es mit dem in Beispiel 2 erhaltenen Material identisch war. Eine anschließende Jodierung, wie sie in Beispiel 2 beschrieben ist, ergab einen markierten vernetzten Antikörper.

Claims (19)

1. Antikörperfragment-Konjugat, umfassend ein für eine antigene Determinate spezifisches Antikörperfragment, an welchem eine Reporter- oder Effektorgruppe kovalent angebracht ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörperfragment-Konjugat mit mindestens einer Nicht-Disulfid-Zwischenkettenbrücke vernetzt ist, wobei die Brücke an jede Kette an einer oder mehreren Brückenstellen, die außerhalb der Antigen-bindenden Bereiche des Antikörpers angeordnet sind, angebracht ist.
2. Konjugat nach Anspruch 1, wobei die Brückenstelle eine in der Seitenkette eines Aminosäurerestes vorhandene Amino-, Sulfhydryl-, Carboxyl- oder Phenolgruppe oder eine andere aromatische oder heteroaromatische funktionelle Gruppe ist.
3. Konjugat nach Anspruch 2, wobei die Brückenstelle eine in der Seitenkette eines Cysteinrestes vorhandene Sulfhydrylgruppe ist.
4. Konjugat nach Anspruch 3, wobei der Cysteinrest in jeder schweren Kette im Gelenksbereich vorhanden ist.
5. Konjugat nach Anspruch 4, wobei der Cysteinrest der einzige, im Gelenksbereich vorhandene Cysteinrest ist.
6. Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Antikörper ein rekombinantes Antikörperfragment ist.
7. Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Fragment ein F(ab')&sub2;-Fragment ist.
8. Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nicht-Disulfid-Zwischenkettenbrücke der Rest eines homo- oder heterofunktionellen Vernetzungsmittels ist.
9. Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Reporter- oder Effektorgruppe ein Radionuklid, ein chelatisiertes Metall, eine fluoreszierende Verbindung, eine Verbindung, welche mittels NMR- oder ESR-Spektroskopie nachgewiesen werden kann, ein pharmakologisches Mittel, ein Enzym oder ein Hormon ist.
10. Konjugat nach Anspruch 9, wobei die Reporter- oder Effektorgruppe ein Radionuklid oder ein chelatisiertes Metall ist.
11. Konjugat nach Anspruch 10, wobei das Radionuklid Radiojodid ist.
12. Konjugat nach Anspruch 11, wobei das chelatisierte Metall ein Chelat eines zwei- oder dreipositiven Metalls mit einer Koordinationszahl von 2 bis einschließlich 8 und eines vielzähnigen Chelatbildners ist.
13. Konjugat nach Anspruch 12, wobei der vielzähnige Chelatbildner ein acyclisehes oder cyclisches Polyamin, ein Polyether, ein Polyamid, ein Porphyrin oder ein carbocyclisches Derivat ist.
14. Konjugat nach Anspruch 13, wobei das acyclische Polyamin eine Polyaminocarbonsäure ist.
15. Konjugat nach Anspruch 13, wobei das cyclische Polyamin ein cyclisches Triaza- oder Tetraazaderivat ist.
16. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Antikörperfragment-Konjugat, wie in einem der vorhergehenden Ansprüche definiert, in Verbindung mit einem oder mehreren pharmazeutischen Trägern oder Exzipienten.
17. Verfahren zur Herstellung eines Antikörperfragment-Konjugates, wie in einem der Ansprüche 1 bis 15 definiert, welches ein Umsetzen eines Vernetzungsmittels mit einem Antikörperfragment umfaßt.
18. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Antikörperfragment in Überschußkonzentration relativ zum Vernetzungsmittel vorhanden ist.
19. Antikörperfragment, wie in einem der Ansprüche 1 bis 15 definiert, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Diagnose an einem Menschen oder einem Tier.
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