CN111876460A

CN111876460A - 鼠单抗IgG2a F(ab`)2的制备方法

Info

Publication number: CN111876460A
Application number: CN202010825924.0A
Authority: CN
Inventors: 杨俊华; 张春鸽; 赵巧辉; 李桂林; 祝艳云; 付光宇; 吴学炜; 杨增利
Original assignee: Zhengzhou Immuno Biotech Co Ltd
Current assignee: Zhengzhou Immuno Biotech Co Ltd
Priority date: 2020-08-17
Filing date: 2020-08-17
Publication date: 2020-11-03

Abstract

本发明涉及抗体制备技术领域，尤其涉及鼠单抗IgG2aF(ab')2的制备方法。本发明提供的制备方法采用Bromelain酶对IgG2a亚型鼠单抗进行酶消化处理，酶解过程简单，操作方便，不需要把抗体透析到酸性缓冲液中，避免了抗体结构和活性的改变。并且，本发明使用ProteinA纯化F(ab')2和Fab，再用Superdex 200 Increase10/30GL分离F(ab')2和Fab，2步即可将Fc、F(ab')2、Fab三者分离，避免了操作步骤的繁琐，片段回收率达到70％以上，并且2步使用的缓冲液一致，省去了缓冲液更换步骤，节省了纯化时间。

Description

鼠单抗IgG2a F(ab’)2的制备方法

技术领域

本发明涉及抗体制备技术领域，尤其涉及鼠单抗IgG2a F(ab’)2的制备方法。

背景技术

鼠单克隆抗体的片段，目前被广泛用于临床诊断和治疗等研究领域，抗体片段化后，因去掉了某些功能结构域以及分子量的改变，比全长抗体有明显的优势：在抗原-抗体结合研究中可避免Fc相关作用因子的干扰，避免全长抗体的空间位阻效应，在固相抗原检测中灵敏度更高。一些体外诊断试剂盒存在有假阳性，将酶标抗体进行Fc段切除后，样本假阳性均可得到消除，因而F(ab’)2在生物制品中有较大的实际应用价值，对其的制备具有重要的研究意义。

目前鼠单抗F(ab’)2片段的制备目前大多采用胃蛋白酶进行酶切，但有些单克隆抗体，尤其是小鼠IgG亚类对胃蛋白酶具有抵抗性，因此，对于不同的抗体，特别是对胃蛋白酶酶切不敏感甚至有抗性的抗体，寻求一种合适的酶酶切此类抗体很有必要。一般来说，不同亚型的鼠单抗对蛋白水解酶的敏感性顺序是IgG2b>IgG3>IgG2a>IgG1，鼠IgG1可以被一步酶切成F(ab’)2，而IgG2a被酶切时，首先产生F(ab’)2，暴露新的位点后进一步被切成Fab，所以IgG2a被酶切后的产物有F(ab’)2、Fab、Fc，由于F(ab’)2与Fab等电点较接近，离子交换不能把二者分离；F(ab’)2与Fab分子量比较接近，Sephacryl S-200凝胶法很难实现二者的分离。因此寻求一种相对简单、实用并且能够分离F(ab’)2、Fab、Fc的方法非常重要。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供鼠单抗IgG2a F(ab’)2的制备方法，该方法制得的IgG2a F(ab’)2纯度高，收率大。

本发明提供的鼠单抗IgG2a F(ab’)2的制备方法，其包括：

步骤1：IgG2a亚型鼠单抗经透析后，以Bromelain酶解；

步骤2：终止酶解反应后，再次透析，透析液上Protein A亲和层析柱，收集含有鼠单抗IgG2a F(ab’)2的流穿液；

步骤3：将流穿液过Superdex 200Increase10/30GL柱，用1～3倍柱体积平衡缓冲液洗脱，收集含F(ab’)2的洗脱液；

其中，所述Bromelain酶解以L-Glutathione激活酶解反应；

所述平衡缓冲液0.02mol/L，pH值为7.0～7.5的PBS缓冲液。

本发明中，步骤1中所述透析的透析液中包含水和50mmol/L Tris、2mmol/L EDTA。步骤1中所述透析液的pH值为7.0～7.4。

步骤1中所述透析的IgG2a亚型鼠单抗的以pH7.2～7.4的0.01M PBS溶解，溶解至浓度为5～10mg/ml，IgG2a亚型鼠单抗溶液与透析液的体积比为1：(50～100)。步骤1中所述透析的截留分子量为3kDa。

本发明中，所述以L-Glutathione激活酶解反应中，L-Glutathione的浓度为1mmol/L。

在本发明中，所述Bromelain酶解中，Bromelain酶与IgG2a亚型鼠单抗的质量比为1:(50～75)。所述Bromelain酶解的条件为37℃～38℃，100～150rpm振荡反应3～4h。

一些实施例中，所述Bromelain酶解中的条件为：酶/抗体(w/w)＝1:50，37℃，120rpm振荡酶解3.5h。

本发明中，所述终止酶解反应采用终止液，所述终止液为TPCK，TLCK或烷化剂中的任意一种。一些具体实施例中，所述终止液为NEMI。

一些实施例中，步骤2中所述透析的透析液为0.02mol/L，pH值为7.0～7.5的PBS缓冲液。步骤2中所述透析的截留分子量为3kDa。酶解液与透析液的体积比为1：(50～100)。

透析液在上Protein A亲和层析柱前还包括过滤的步骤，所述过滤采用0.45μm滤膜。收集的流穿液中包括包含F(ab’)2和Fab。以pH 2.7～3.5，0.2mol/L的甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱Protein A亲和层析柱，收集含有Fc的洗脱液。所述含有Fc的洗脱液以pH 9.0，1mol/L的Tris-Hcl溶液中和。

所述Superdex 200Increase10/30GL填料的颗粒直径不超过20μm。

流穿液过Superdex 200Increase10/30GL柱，先以1～3倍柱体积平衡缓冲液洗脱收集含有F(ab’)2的流分，然后再收集含有Fab的流分。

本发明中，还包括将所述洗脱液浓缩到浓度为5mg/ml。

本发明所述方法制备的鼠单抗IgG2a F(ab’)2。

本发明还提供了含有所述鼠单抗IgG2a F(ab’)2的检测试剂。

本发明所述的检测试剂中，其还包括保护剂和防腐剂。

所述保护剂为50％甘油或6％海藻糖；防腐剂为1‰P300或NaN₃。

本发明提供的制备方法采用Bromelain酶对IgG2a亚型鼠单抗进行酶消化处理，小分子中酶切位点比较偏向于-R-R-/-的序列，是比较广普的肽内切酶。该酶解过程简单，操作方便，不需要把抗体透析到酸性缓冲液中，避免了抗体结构和活性的改变。并且，本发明使用ProteinA纯化F(ab’)2和Fab，再用Superdex 200Increase10/30GL分离F(ab’)2和Fab，2步即可将Fc、F(ab’)2、Fab三者分离，避免了操作步骤的繁琐，片段回收率达到70％以上，并且2步使用的缓冲液一致，省去了缓冲液更换步骤，节省了纯化时间。

附图说明

图1为鼠单抗IgG2a酶切及片段分离过程样品SDS-PAGE电泳图；

图2为鼠单抗IgG2a F(ab’)2和Fab分离后SDS-PAGE电泳图；

图3为IgG2a F(ab’)2和Fab混合物的HPLC分析结果；

图4为IgG2a F(ab’)2的HPLC分析结果；

图5为鼠单抗IgG2a木瓜蛋白酶酶切各阶段样品SDS-PAGE电泳图；

图6为鼠单抗IgG2a胃蛋白酶酶切各阶段样品SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

本发明提供了鼠单抗IgG2a F(ab’)2的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

本发明的方法对于IgG1亚型的鼠单抗的来源或制备方法无特殊要求，其来源或制备方法不影响本发明提供方法的效果。例如，本发明实施例中采用的所述鼠单抗为小鼠、大鼠单克隆抗体。具体的，实施例中采用为小鼠单抗。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1本发明所述的鼠单抗IgG2a F(ab’)2的制备方法包括下述步骤：

步骤一，将IgG2a亚型的鼠单抗，装入截留分子量为3KD的透析袋中，透析到50mMTris+2mM EDTA pH7.0中，搅拌透析。

步骤二，用步骤一中的透析液50mM Tris+2mM EDTA pH7.0将Bromelain酶溶解为1mg/ml，按质量比1:50E/S将酶加入到抗体溶液中，然后按体积比(V抗体+V酶)/100加入L-Glutathione，37℃～40℃(优选37℃)水浴摇床中震荡反应3.5h；加入终止液1h后于0.02MPBS pH 7.4中透析。

步骤三，解透析袋，样品过0.45μm滤膜过滤，将过滤后上清泵入Protein A亲和层析柱，收集流穿液即为F(ab’)2，再用5倍柱体积0.2M甘氨酸-盐酸缓冲液pH 2.7洗脱Fc，并用1M Tris-Hcl pH 9.0中和。

步骤四，由于IgG2a亚型的鼠单抗在酶切时第一步产生F(ab’)2，暴露新的位点后又被进一步切成Fab，Protein A亲和层析收集的流穿中实际包含F(ab’)2和Fab，将流穿液过Superdex 200Increase10/30GL，用0.02M PBS pH 7.4洗脱依次收集第一峰(1倍柱体积)主要成分是F(ab’)2；第二峰(1.5倍柱体积)主要成分是Fab，F(ab’)2回收率80％。

步骤五，将步骤四中收集到的第一峰和第二峰分别浓缩到浓度为5mg/ml，即为抗体片段F(ab’)2和Fab，其中，F(ab’)2的收率为80％，Fab的收率为15％。分别加入50％甘油和1‰P300，-20℃保存。

功效验证

1、鼠单抗IgG2a按实施例1酶切及片段分离效果，结果见图1：将原抗体、酶切后样品、及片段分离后样品，取样浓度稀释至1mg/ml，进行10％SDS-PAGE变性非还原胶和还原胶检测，泳道2为IgG2a亚型抗体酶切后，主要有3条带，从上往下依次为F(ab’)2、Fab、Fc；泳道3为过SPA分离后的F(ab’)2、Fab。IgG2a F(ab’)2和Fab的分离效果见图2：泳道2为分离后的F(ab’)2，泳道3为Fab，F(ab’)2纯度达98％。

结论：鼠单抗IgG2a首先被切成F(ab’)2和Fc，然后暴露新的位点后，F(ab’)2又被进一步切成Fab，经Protein A分离后，图1泳道3是目的片段F(ab’)2和Fab的混合物，再经分辨率较高的Superdex 200Increase10/30GL分离后，图2泳道2为目的片段F(ab’)2，达到了较好的分离效果。

2、将实施例1分离的F(ab’)2和Fab的混合物、F(ab’)2分别进行HPLC分析，其结果见图3、图4。图3中从右到左峰对应的分子量分别为1KD、17KD、45KD、150KD、300KD、670KD、1340KD。从右到左第一个峰对应Fab，第二个峰对应F(ab’)2，分子量都在Marker标示的范围内。

图4是经Superdex 200Increase10/30GL分离的F(ab’)2的HPLC图，F(ab’)2，峰面积99％，分子量在45KD-150KD之间，符合预期目标。

对比例1本发明所述的鼠单抗IgG2a F(ab’)2的制备方法包括下述步骤：

步骤二，用步骤一中的透析液50mM Tris+2mM EDTA pH7.0将Bromelain酶溶解为1mg/ml，按质量比1:40E/S将酶加入到抗体溶液中，然后按体积比(V抗体+V酶)/100加入L-Glutathione，37℃-40℃水浴摇床中震荡反应3.5h；加入终止液1h后于0.02M PBS pH 7.4中透析。

步骤四，由于IgG2a亚型的鼠单抗在酶切时第一步产生F(ab’)2，暴露新的位点后又被进一步切成Fab，Protein A亲和层析收集的流穿中实际包含F(ab’)2和Fab，将流穿液过Superdex 200Increase10/30GL，用1～3倍柱体积0.02M PBS pH 7.4洗脱分别收集第一峰F(ab’)2和第二峰Fab，F(ab’)2回收率65％。

步骤五，将步骤四中收集到的第一峰和第二峰分别浓缩到浓度为5mg/ml，即为抗体片段F(ab’)2和Fab，其中，F(ab’)2的收率为63％，Fab的收率为31％。分别加入50％甘油和1‰P300，-20℃保存。说明抗体被切成单价Fab的比例增大，导致F(ab’)2的纯度降低。

对比例2本发明所述的鼠单抗IgG2a F(ab’)2的制备方法包括下述步骤：

步骤二，用步骤一中的透析液50mM Tris+2mM EDTA pH7.0将Bromelain酶溶解为1mg/ml，按质量比1:80E/S将酶加入到抗体溶液中，然后按体积比(V抗体+V酶)/100加入L-Glutathione，37℃-40℃水浴摇床中震荡反应3.5h；加入终止液1h后于0.02M PBS pH 7.4中透析。

步骤四，由于IgG2a亚型的鼠单抗在酶切时第一步产生F(ab’)2，暴露新的位点后又被进一步切成Fab，Protein A亲和层析收集的流穿中实际包含F(ab’)2和Fab，将流穿液过Superdex 200Increase10/30GL，用1～3倍柱体积0.02M PBS pH 7.4洗脱分别收集第一峰F(ab’)2和第二峰Fab，F(ab’)2回收率53％。

步骤五，将步骤四中收集到的第一峰和第二峰分别浓缩到浓度为5mg/ml，即为抗体片段F(ab’)2和Fab，其中，F(ab’)2的收率为50％，Fab的收率为14％。分别加入50％甘油和1‰P300，-20℃保存。说明绝大部分抗体不能被切开，最终导致F(ab’)2回收率降低。

对比例3鼠单抗IgG2a按现有技术中的酶解法-木瓜蛋白酶酶切：

步骤一，将从小鼠腹水中SPA纯化的IgG2a亚型的鼠单抗，装入截留分子量小于3KD的透析袋中，透析到50mM Tris+2mM EDTA pH7.0-7.4中，搅拌透析。

步骤二，用50mM Tris+2mM EDTA+1mM cysteine pH7.0-7.4激活木瓜蛋白酶(1-2mg/ml),37℃反应15min；按酶/抗体(W/W)＝1:50比例将酶加入到抗体溶液中，37℃-38℃水浴摇床中震荡反应8-10h；加入终止液碘乙酰胺至终浓度为20mM，1-2h后于平衡缓冲液0.02M PBS pH 7.4中透析。

其结果见图5：将原抗体及酶切后样品，稀释至1mg/ml，各取20μL进行10％SDS-PAGE变性非还原胶检测，结果IgG2a没有完全被切成F(ab’)2和Fab，还有部分IgG2a整分子剩余。

对比例4鼠单抗IgG2a按现有技术中的酶解法-胃蛋白酶酶切：

步骤一，将从小鼠腹水中SPA纯化的IgG2a亚型的鼠单抗，装入截留分子量小于3KD的透析袋中，透析到NaAC pH4.0-4.2中，搅拌透析。

步骤二，用NaAC pH4.0-4.2将Pepsin溶解为1mg/ml，按酶/抗体(W/W)＝1:50比例将酶加入到抗体溶液中，37℃-38℃水浴摇床中震荡反应3-4h；加入1M Tris致其pH值为8.0终止反应，1-2h后于平衡缓冲液0.02M PBS pH 7.4中透析。

其结果见图6：将原抗体及酶切后样品，稀释至1mg/ml，各取20μL进行10％SDS-PAGE变性非还原胶检测，结果IgG2a没有被完全切开，还有部分完整的IgG2a剩余。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.鼠单抗IgG2a F(ab')2的制备方法，其包括：

步骤1：IgG2a亚型鼠单抗经透析后，以Bromelain酶解；

步骤2：终止酶解反应后，再次透析，透析液上Protein A亲和层析柱，收集含有鼠单抗IgG2a F(ab')2的流穿液；

步骤3：将流穿液过Superdex 200 Increase10/30GL柱，用3～5倍柱体积平衡缓冲液洗脱，收集含F(ab')2的洗脱液；

其中，所述Bromelain酶解以L-Glutathione激活酶解反应；

所述平衡缓冲液0.02mol/L，pH值为7.0～7.5的PBS缓冲液。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述透析的透析液中包含水和50mmol/L Tris、2mmol/L EDTA。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Bromelain酶解中，Bromelain酶与IgG2a亚型鼠单抗的质量比为1:(50～75)。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述以L-Glutathione激活酶解反应中，L-Glutathione的浓度为1mmol/L；

所述Bromelain酶解的条件为37℃～38℃，100～150rpm振荡反应3～4h。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述终止酶解反应采用终止液，所述终止液为TPCK，TLCK或烷化剂中的任意一种。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述透析的透析液为0.02mol/L，pH值为7.0～7.5的PBS缓冲液。

7.根据权利要求1～6任一项所述的制备方法，其特征在于，还包括将所述洗脱液浓缩到浓度为5mg/ml。

8.权利要求1～7任一项所述方法制备的鼠单抗IgG2a F(ab')2。

9.含有权利要求8所述鼠单抗IgG2a F(ab')2的检测试剂。

10.根据权利要求9所述的检测试剂，其特征在于，其还包括保护剂和防腐剂。