CN111876461A - 鼠单抗IgG1 F(ab′)2的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗体制备技术领域，尤其涉及鼠单抗IgG1 F(ab')2的制备方法。本发明提供的制备方法采用Bromelain酶对鼠单抗进行酶消化处理，其过程简单，技术含量和成本要求相对较低，而且可以快速获得产品。并且，Bromelain酶在中性条件下即可完成蛋白酶切，避免了抗体在酸性条件下结构和活性的改变。并且，本发明使用一步ProteinA纯化F(ab')2，避免了操作步骤的繁琐，提高了片段回收率，ProteinA特异性结合抗体的Fc段，并且载量比ProteinG高。

Description

鼠单抗IgG1 F(ab′)2的制备方法
技术领域
本发明涉及抗体制备技术领域，尤其涉及鼠单抗IgG1 F(ab′)2的制备方法。
背景技术
单克隆抗体虽然在生物学和医学研宄领域中有着广泛的应用，但也有其明显的局限性，主要体现在其抗原性以及分子结构的复杂性，前者易产生排异等副作用，后者造成其组织的穿透力差，特异性低。因此，目前单克隆抗体的另一种发展趋势就是抗体结构的简单化，抗体片段(如F(ab′)2、Fab等)具有不受位于细胞上的Fc受体的影响、免疫原性低、不易受到吞噬细胞攻击等特点。因此，在许多研究工作中往往不使用整个免疫球蛋白分子，而是使用其某个片段。
单克隆抗体片段在生物免疫学及免疫诊断学等研究领域有着广泛的应用，如可用于抗体一抗原间的相互作用分析。一些体外诊断试剂盒存在有异常干扰样本，原因可能由于一些嗜异性抗体通过结合抗体的Fc片段，干扰免疫测定过程，通过对标记抗体切除Fc再标记HRP，可消除绝大部分的异常干扰样本。
目前抗体片段化的方法主要包括酶消化和基因工程制备法。基因工程法主要是利用抗体库，筛选出所需的特异性目标克隆，导入适当的受体细胞进行表达，纯化得到所需的抗体片段，这种技术过程复杂，对技术含量及成本要求都较高。另一种获得抗体片段的方法就是直接酶解法，采用特异性水解酶直接对单克隆抗体进行酶解处理，然后分离得到目的片段。
国内外文献及专利报道，单抗F(ab′)2片段的制备，常用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶水解获得，但是胃蛋白酶只有在酸性条件下才发挥作用，酶切所用缓冲液一般为20mM醋酸缓冲液或柠檬酸缓冲液pH3.5-4.2,抗体在低pH值的条件下其结构和活性都有可能受到损伤，而使用木瓜蛋白酶酶切耗时较长。
目前纯化F(ab′)2片段的技术手段主要是疏水层析、离子交换、凝胶层析，疏水层析回收率较低只有50％，离子交换得到的F(ab′)2片段纯度不高，并且洗脱时用线性梯度洗脱，步骤繁琐，凝胶层析不适用于F(ab′)2的大量制备，Protein L只能与轻链为κ的F(ab′)2片段结合，使用有局限。因此，关于鼠单抗IgG1F(ab′)2的制备方法仍在进一步的研究中。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供鼠单抗IgG1 F(ab′)2的制备方法，该方法制得的IgG1 F(ab′)2纯度高，收率大。
本发明提供的鼠单抗IgG1 F(ab′)2的制备方法，其包括：
步骤1：IgG1亚型鼠单抗经透析后，以Bromelain酶解；
步骤2：终止酶解反应后，再次透析，透析液上Protein A亲和层析柱，收集含有鼠单抗IgG1 F(ab′)2的流穿液；
其中，所述Bromelain酶解以L-cysteine激活酶解反应。
本发明中，步骤1中所述透析的透析液中包含水和50mmol/L Tris、2mmol/L EDTA。
步骤1中所述透析的IgG1亚型鼠单抗的以pH7.2的0.01M PBS溶解，溶解至浓度为5～10mg/ml，IgG1亚型鼠单抗溶液与透析液的体积比为1：(50～100)。
本发明中，所述Bromelain酶解中，Bromelain酶与IgG1亚型鼠单抗的质量比为1:(30～50)。
所述L-cysteine以含有50mM Tris和2mM EDTA的缓冲液溶解。所述缓冲液的pH值为6.8-7.4，溶解至L-cysteine的浓度为1mM。一些实施例中，所述以L-cysteine激活酶解反应中，L-cysteine的浓度为1mmol/L；
所述Bromelain酶解的条件为36℃～38℃，100-150rpm振荡反应2～8h。
一些具体实施例中，所述酶解的条件包括：酶/抗体(w/w)＝1:30，37℃120rpm振荡酶解3h。
另一些具体实施例中，所述酶解的条件包括：酶/抗体(w/w)＝1:40，38℃120rpm振荡酶解3.5h。
另一些具体实施例中，所述酶解的条件包括：酶/抗体(w/w)＝1:50，38℃120rpm振荡酶解4h。
另一些具体实施例中，所述酶解的条件包括：酶/抗体(w/w)＝1:50，37℃120rpm振荡酶解3.5h。
另一些具体实施例中，所述酶解的条件包括：酶/抗体(w/w)＝1:30，36℃120rpm振荡酶解4h。
本发明中，所述终止酶解反应采用终止液，所述终止液为α2巨球蛋白，TPCK，TLCK或烷化剂中的一种。
一些实施例中，所述终止液为α2巨球蛋白，TPCK，TLCK或烷化剂中的一种，所述烷化剂中为100mM N-ethyl maleimide。
本发明中，步骤2中所述透析的透析液为0.02mol/L，pH值为7.0～7.5的PBS缓冲液。步骤2中所述透析的体积比为1：(50～100)。
步骤2中所述透析前，流穿液经过0.22～0.45μm滤膜过滤。
所述Protein A亲和层析柱的平衡缓冲液为pH 7.0～7.5 20mM PBS或者20mM磷酸钠。
所述收集流穿液后，还包括收集含有Fc的洗脱液的步骤，所述洗脱液为pH 2.7～2.9的100mM的甘氨酸-盐酸缓冲液或者100mM的柠檬酸钠缓冲液。
本发明中，还包括将所述流穿液浓缩到浓度为2～4mg/ml。
所述浓缩采用3KD-10KD的超滤管、中空纤维柱或膜胞的任意一种
本发明所述方法制备的鼠单抗IgG1 F(ab′)2。
本发明还提供了含有所述鼠单抗IgG1 F(ab′)2的检测试剂。
本发明所述的检测试剂中，其还包括保护剂和防腐剂。
所述保护剂为50％甘油或6％海藻糖；防腐剂为1‰P300或NaN3。
本发明提供的制备方法采用Bromelain酶对鼠单抗进行酶消化处理，其过程简单，技术含量和成本要求相对较低，而且可以快速获得产品。并且，Bromelain酶在中性条件下即可完成蛋白酶切，避免了抗体在酸性条件下结构和活性的改变。并且，本发明使用一步ProteinA纯化F(ab′)2，避免了操作步骤的繁琐，提高了片段回收率，ProteinA特异性结合抗体的Fc段，并且载量比ProteinG高。
附图说明
图1为鼠单抗IgG1酶切分离各阶段样品SDS-PAGE电泳图；
图2为IgG1 F(ab′)2的HPLC分析结果；
图3为鼠单抗IgG1木瓜蛋白酶酶切各阶段样品SDS-PAGE电泳图；
图4为鼠单抗IgG1胃蛋白酶酶切各阶段样品SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
本发明提供了鼠单抗IgG1 F(ab′)2的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
本发明的方法对于IgG1亚型的鼠单抗的来源或制备方法无特殊要求，其来源或制备方法不影响本发明提供方法的效果。例如，本发明实施例中采用的所述鼠单抗为小鼠、大鼠单克隆抗体。具体的，实施例中采用为小鼠单抗。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
所述的鼠单抗IgG1 F(ab′)2的制备方法包括下述步骤：
第一步，将IgG1亚型的鼠单抗，按体积比1：100透析到50mMTris+2mM EDTA pH7.2中，搅拌透析，每隔2小时换一次透析液，期间换液2次；
第二步，解透析袋，测量抗体体积和浓度，称量Bromelain酶，用50mM Tris+2mMEDTA pH7.2将酶溶解为1mg/ml，按质量比1:30E/S将酶加入到抗体溶液中，然后加入终浓度为1mM的L-cysteine激活反应，37℃水浴摇床中震荡反应3h，摇床转速120rpm；第三步，在抗体和酶的混合物中加入终止液终止反应，终止2h后按体积比1：100透析到0.02M PBS pH7.4的缓冲液中，搅拌透析，每隔2小时换一次透析液，期间换液2次；
第四步，解透析袋，样品用0.45μm滤膜过滤，Protein A亲和层析分离F(ab′)2和Fc，分别收集流穿F(ab′)2和洗脱液Fc；
第五步，将第四步得到的流穿用超滤管浓缩到浓度为4mg/ml，即为目的片段F(ab′)2，加入50％甘油和1‰P300，低温保存，经测定，其回收率为92％。
实施例2
所述的鼠单抗IgG1 F(ab′)2的制备方法包括下述步骤：
第一步，将IgG1亚型的鼠单抗，按体积比1：100透析到50mM Tris+2mM EDTA pH7.2中，搅拌透析，每隔2小时换一次透析液，期间换液2次；
第二步，解透析袋，测量抗体体积和浓度，称量Bromelain酶，用50mM Tris+2mMEDTA pH7.2将酶溶解为1mg/ml，按质量比1:40E/S将酶加入到抗体溶液中，然后加入终浓度为1mM的L-cysteine激活反应，38℃水浴摇床中震荡反应3.5h，摇床转速120rpm；第三步，在抗体和酶的混合物中加入终止液终止反应，终止2h后按体积比1：100透析到0.02M PBSpH7.4的缓冲液中，搅拌透析，每隔2小时换一次透析液，期间换液2次；
第四步，解透析袋，样品用0.45μm滤膜过滤，Protein A亲和层析分离F(ab′)2和Fc，分别收集流穿F(ab′)2和洗脱液Fc；
第五步，将第四步得到的流穿用超滤管浓缩到浓度为4mg/ml，即为目的片段F(ab′)2，加入50％甘油和1‰P300，低温保存，经测定，其回收率为90％。
实施例3
所述的鼠单抗IgG1 F(ab′)2的制备方法包括下述步骤：
第一步，将IgG1亚型的鼠单抗，按体积比1：100透析到50mM Tris+2mM EDTA pH7.2中，搅拌透析，每隔2小时换一次透析液，期间换液2次；
第二步，解透析袋，测量抗体体积和浓度，称量Bromelain酶，用50mM Tris+2mMEDTA pH7.2将酶溶解为1mg/ml，按质量比1:50E/S将酶加入到抗体溶液中，然后加入终浓度为1mM的L-cysteine激活反应，38℃水浴摇床中震荡反应4h，摇床转速120rpm；第三步，在抗体和酶的混合物中加入终止液终止反应，终止2h后按体积比1：100透析到0.02M PBS pH7.4的缓冲液中，搅拌透析，每隔2小时换一次透析液，期间换液2次；
第四步，解透析袋，样品用0.45μm滤膜过滤，Protein A亲和层析分离F(ab′)2和Fc，分别收集流穿F(ab′)2和洗脱液Fc；
第五步，将第四步得到的流穿用超滤管浓缩到浓度为4mg/ml，即为目的片段F(ab′)2，加入50％甘油和1‰P300，低温保存，经测定，其回收率为93％。
实施例4
所述的鼠单抗IgG1 F(ab′)2的制备方法包括下述步骤：
第一步，将IgG1亚型的鼠单抗，按体积比1：100透析到50mM Tris+2mM EDTA pH7.2中，搅拌透析，每隔2小时换一次透析液，期间换液2次；
第二步，解透析袋，测量抗体体积和浓度，称量Bromelain酶，用50mM Tris+2mMEDTA pH7.2将酶溶解为1mg/ml，按质量比1:50E/S将酶加入到抗体溶液中，然后加入终浓度为1mM的L-cysteine激活反应，37℃水浴摇床中震荡反应3.5h，摇床转速120rpm；第三步，在抗体和酶的混合物中加入终止液终止反应，终止2h后按体积比1：100透析到0.02M PBSpH7.4的缓冲液中，搅拌透析，每隔2小时换一次透析液，期间换液2次；
第四步，解透析袋，样品用0.45μm滤膜过滤，Protein A亲和层析分离F(ab′)2和Fc，分别收集流穿F(ab′)2和洗脱液Fc；
第五步，将第四步得到的流穿用超滤管浓缩到浓度为4mg/ml，即为目的片段F(ab′)2，加入50％甘油和1‰P300，低温保存，经测定，其回收率为95％。
实施例5
所述的鼠单抗IgG1 F(ab′)2的制备方法包括下述步骤：
第一步，将IgG1亚型的鼠单抗，按体积比1：100透析到50mM Tris+2mM EDTA pH7.2中，搅拌透析，每隔2小时换一次透析液，期间换液2次；
第二步，解透析袋，测量抗体体积和浓度，称量Bromelain酶，用50mM Tris+2mMEDTA pH7.2将酶溶解为1mg/ml，按质量比1:30E/S将酶加入到抗体溶液中，然后加入终浓度为1mM的L-cysteine激活反应，36℃水浴摇床中震荡反应4h，摇床转速120rpm；第三步，在抗体和酶的混合物中加入终止液终止反应，终止2h后按体积比1：100透析到0.02M PBS pH7.4的缓冲液中，搅拌透析，每隔2小时换一次透析液，期间换液2次；
第四步，解透析袋，样品用0.45μm滤膜过滤，Protein A亲和层析分离F(ab′)2和Fc，分别收集流穿F(ab′)2和洗脱液Fc；
第五步，将第四步得到的流穿用超滤管浓缩到浓度为4mg/ml，即为目的片段F(ab′)2，加入50％甘油和1‰P300，低温保存，经测定，其回收率为88％。
对比例1本发明所述的鼠单抗IgG1 F(ab′)2的制备方法包括下述步骤：
第一步，将IgG1亚型的鼠单抗，按体积比1：100透析到50mM Tris+2mM EDTA pH7.2中，搅拌透析，每隔2小时换一次透析液，期间换液2次；
第二步，解透析袋，测量抗体体积和浓度，称量Bromelain酶，用50mM Tris+2mMEDTA pH7.2将酶溶解为1mg/ml，按质量比1:20E/S将酶加入到抗体溶液中，然后加入终浓度为1mM的L-cysteine激活反应，37℃水浴摇床中震荡反应4h，摇床转速120rpm；第三步，在抗体和酶的混合物中加入终止液终止反应，终止2h后按体积比1：100透析到0.02M PBS pH7.4的缓冲液中，搅拌透析，每隔2小时换一次透析液，期间换液2次；
第四步，解透析袋，样品用0.45μm滤膜过滤，Protein A亲和层析分离F(ab′)2和Fc，分别收集流穿F(ab′)2和洗脱液Fc；
第五步，将第四步得到的流穿用超滤管浓缩到浓度为4mg/ml，即为目的片段F(ab′)2，加入50％甘油和1‰P300，低温保存，经测定，其回收率为60％。由于，抗体中引入酶量较多，抗体被切成F(ab′)2又会进一步酶切，造成Fab的比例增大，导致F(ab′)2的纯度降低，
对比例2本发明所述的鼠单抗IgG1 F(ab′)2的制备方法包括下述步骤：
第一步，将IgG1亚型的鼠单抗，按体积比1：100透析到50mM Tris+2mM EDTA pH7.2中，搅拌透析，每隔2小时换一次透析液，期间换液2次；
第二步，解透析袋，测量抗体体积和浓度，称量Bromelain酶，用50mM Tris+2mMEDTA pH7.2将酶溶解为1mg/ml，按质量比1:60E/S将酶加入到抗体溶液中，然后加入终浓度为1mM的L-cysteine激活反应，37℃水浴摇床中震荡反应4h，摇床转速120rpm；第三步，在抗体和酶的混合物中加入终止液终止反应，终止2h后按体积比1：100透析到0.02M PBS pH7.4的缓冲液中，搅拌透析，每隔2小时换一次透析液，期间换液2次；
第四步，解透析袋，样品用0.45μm滤膜过滤，Protein A亲和层析分离F(ab′)2和Fc，分别收集流穿F(ab′)2和洗脱液Fc；
第五步，将第四步得到的流穿用超滤管浓缩到浓度为4mg/ml，即为目的片段F(ab′)2，加入50％甘油和1‰P300，低温保存，经测定，其回收率为50％。绝大部分抗体不能被切开，最终导致F(ab′)2回收率降低。
对比例3鼠单抗IgG1按现有技术中的酶解法-木瓜蛋白酶酶切：
步骤一，将从小鼠腹水中SPA纯化的IgG1亚型的鼠单抗，装入截留分子量小于3KD的透析袋中，透析到50mM Tris+2mM EDTA pH7.2中，搅拌透析。
步骤二，用50mM Tris+2mM EDTA+1mM cysteine pH7.2激活木瓜蛋白酶(1-2mg/ml),37℃反应15min；按酶/抗体(W/W)＝1:50比例将酶加入到抗体溶液中，37℃-38℃水浴摇床中震荡反应8-10h；加入终止液碘乙酰胺至终浓度为20mM，1-2h后于平衡缓冲液0.02MPBS pH7.4中透析。
其结果见图3：将原抗体及酶切后样品，用0.01M PBS pH7.2稀释至2mg/ml，各取20μL进行10％SDS-PAGE变性非还原胶检测，结果IgG1没有完全被切成F(ab′)2，还有部分IgG1剩余。
对比例4鼠单抗IgG1按现有技术中的酶解法-胃蛋白酶酶切：
步骤一，将从小鼠腹水中SPA纯化的IgG1亚型的鼠单抗，装入截留分子量小于3KD的透析袋中，透析到NaAC pH4.0-4.2中，搅拌透析。
步骤二，用NaAC pH4.0-4.2将Pepsin溶解为1mg/ml,按酶/抗体(W/W)＝1:50比例将酶加入到抗体溶液中，37℃-38℃水浴摇床中震荡反应3-4h；加入1M Tris致其pH值为8.0终止反应，1-2h后于平衡缓冲液0.02M PBS pH 7.4中透析。
其结果见图4：将原抗体及酶切后样品，用0.01M PBS pH7.2稀释至2mg/ml，各取20μL进行10％SDS-PAGE变性非还原胶检测，结果IgG1没有被完全切开，还有部分IgG1剩余。
效果验证
1、鼠单抗IgG1按实施例1酶切分离效果分析，结果见图1。
将酶切及片段分离各阶段样品分别取出20μL于1.5mL离心管内，并用0.01M PBSpH7.2稀释至2mg/ml，最终各取样20μL进行10％SDS-PAGE变性非还原胶和还原胶检测，另外附带Mark-100KD，考马斯亮蓝染色后使用molecular Imager凝胶成像仪进行纯度分析，其结果如下：
结论：由上图可知，鼠单抗IgG1酶切后经变性非还原处理，泳道2IgG1被切成F(ab′)2和Fc，再经Protein G分离后，泳道3是目的片段F(ab′)2，纯度98％，泳道8F(ab′)2经变性还原处理后，包含轻链和Fd’，符合预期的位置，实施例2～4制备的产物的电泳结果与此相似。
2、将实施例1分离的F(ab′)2进行HPLC分析，其结果见图2。
分析条件详见下表：
表1
色谱柱型号 SEC3 300A 7.8*300mm
流动相组成 0.01M PBS pH7.2
流速 0.8ml/min
柱温 25℃
进样条件 稀释至1mg/ml，进样10ul
检验波长 280nm
结论：鼠单抗IgG1 F(ab′)2，在SEC上分析主要由2个色谱峰组成：左起第一峰为F(ab’)2，峰面积98％，分子量在45KD-150KD之间，小于IgG1整分子150KD；左起第二峰为极少量的Fab，峰面积2％，分子量在17KD～45KD之间，符合预期目标，实施例2～4制备的产物色谱图与此相似。
3、用途说明
检测5批临床样本所用的试剂盒中抗体片段F(ab’)2均是在不同条件下进行的酶切，试剂盒酶标抗体酶切前后临床对比结果：
表2：
Figure BDA0002636590090000091
检测随机标本，酶切后比酶切前特异性明显提升。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.鼠单抗IgG1 F(ab')2的制备方法，其包括：
步骤1：IgG1亚型鼠单抗经透析后，以Bromelain酶解；
步骤2：终止酶解反应后，再次透析，透析液上Protein A亲和层析柱，收集含有鼠单抗IgG1 F(ab')2的流穿液；
其中，所述Bromelain酶解以L-cysteine激活酶解反应。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述透析的透析液中包含水和50mmol/L Tris、2mmol/L EDTA。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Bromelain酶解中，Bromelain酶与IgG1亚型鼠单抗的质量比为1:(30～50)。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述以L-cysteine激活酶解反应中，L-cysteine的浓度为1mmol/L；
所述Bromelain酶解的条件为36℃～38℃，100-150rpm振荡反应2～8h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述终止酶解反应采用终止液，所述终止液为α2巨球蛋白，TPCK，TLCK或烷化剂中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述透析的透析液为0.02mol/L，pH值为7.0～7.5的PBS缓冲液。
7.根据权利要求1～6任一项所述的制备方法，其特征在于，还包括将所述流穿液浓缩到浓度为2～4mg/ml。
8.权利要求1～7任一项所述方法制备的鼠单抗IgG1 F(ab')2。
9.含有权利要求8所述鼠单抗IgG1 F(ab')2的检测试剂。
10.根据权利要求9所述的检测试剂，其特征在于，其还包括保护剂和防腐剂。
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