JPH07146280A - アフィニティクロマトグラフィー用吸着体及びこれを 用いた抗体の分離方法、抗体濃度の測定方法、抗体断 片の精製濃縮方法 - Google Patents
アフィニティクロマトグラフィー用吸着体及びこれを 用いた抗体の分離方法、抗体濃度の測定方法、抗体断 片の精製濃縮方法Info
- Publication number
- JPH07146280A JPH07146280A JP5296347A JP29634793A JPH07146280A JP H07146280 A JPH07146280 A JP H07146280A JP 5296347 A JP5296347 A JP 5296347A JP 29634793 A JP29634793 A JP 29634793A JP H07146280 A JPH07146280 A JP H07146280A
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- affinity chromatography
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- adsorbent
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ウシＩｇＧの妨害を受けることなくマウスや
ラットのＩｇＧのみを分離、測定でき、また抗体断片を
高濃度に濃縮する方法を提供する。 【構成】 抗体のカッパー軽鎖結合蛋白をリガンドとし
て支持体に結合し、アフィニティクロマトグラフィー用
吸着体とする。これを用いてアフィニティクロマトグラ
フィーにより混合物から抗体を分離する。また牛血清成
分を含有する細胞培養上清中の抗体濃度を、高速液体ク
ロマトグラフィーにより測定する。更に抗体を酵素分解
して得られる断片を含む混合物から、抗原結合部位を有
する抗体断片を精製・濃縮する。
ラットのＩｇＧのみを分離、測定でき、また抗体断片を
高濃度に濃縮する方法を提供する。 【構成】 抗体のカッパー軽鎖結合蛋白をリガンドとし
て支持体に結合し、アフィニティクロマトグラフィー用
吸着体とする。これを用いてアフィニティクロマトグラ
フィーにより混合物から抗体を分離する。また牛血清成
分を含有する細胞培養上清中の抗体濃度を、高速液体ク
ロマトグラフィーにより測定する。更に抗体を酵素分解
して得られる断片を含む混合物から、抗原結合部位を有
する抗体断片を精製・濃縮する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＩｇＧ等の抗体の分離
精製に使用されるアフィニティクロマトグラフィー用吸
着体及びこれを用いた抗体の分離方法、抗体濃度の測定
方法、抗体断片の精製濃縮方法に関するものである。
精製に使用されるアフィニティクロマトグラフィー用吸
着体及びこれを用いた抗体の分離方法、抗体濃度の測定
方法、抗体断片の精製濃縮方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】アフィニティクロマトグラフィーでは、
精製の目的物質と親和性のある物質（リガンド）を不溶
性担体に固定化しておき、精製の目的物質をこのリガン
ドに特異的に吸着させて回収し、精製を行う。そして抗
体の精製を行う場合に最もよく使用されるリガンドは、
プロティンＡとプロティンＧである。
精製の目的物質と親和性のある物質（リガンド）を不溶
性担体に固定化しておき、精製の目的物質をこのリガン
ドに特異的に吸着させて回収し、精製を行う。そして抗
体の精製を行う場合に最もよく使用されるリガンドは、
プロティンＡとプロティンＧである。
【０００３】プロティンＡは様々な動物由来のＩｇＧの
Ｆｃ領域と特異的に結合する性質を持っており、血清、
細胞培養上清、腹水等からのＩｇＧ精製に広く使用され
ている。またプロティンＧは、広い範囲の動物由来のＩ
ｇＧと特異的に結合する。そのため、プロティンＧをリ
ガンドとしたカラムは、ＨＰＬＣ法（高速液体クロマト
グラフィー法）による抗体定量分析にも用いられてい
る。
Ｆｃ領域と特異的に結合する性質を持っており、血清、
細胞培養上清、腹水等からのＩｇＧ精製に広く使用され
ている。またプロティンＧは、広い範囲の動物由来のＩ
ｇＧと特異的に結合する。そのため、プロティンＧをリ
ガンドとしたカラムは、ＨＰＬＣ法（高速液体クロマト
グラフィー法）による抗体定量分析にも用いられてい
る。
【０００４】ところで、血清培地で培養された抗体産生
細胞（ハイブリドーマ）の培養上清から有用なＩｇＧ、
ＩｇＭ等の抗体を精製する場合、通常のプロティンＡや
プロティンＧをリガンドとしたアフィニティクロマトグ
ラフィーによる精製法を用いると、精製物中に血清中の
ウシＩｇＧが多量に混入し、精製物中の有用なＩｇＧの
比活性が低くなるという問題点があった。即ち、抗体産
生細胞であるハイブリドーマの培養には、細胞増殖促進
作用のあるウシ胎児血清（ＦＣＳ）を基本培地に添加し
た培地が頻繁に使われている。しかしＦＣＳ中にはウシ
ＩｇＧが含まれており、ロットによってはハイブリドー
マの産出する抗体量と同等あるいはそれ以上のレベルと
なることもある。このため精製物中にウシＩｇＧが多量
に混入することとなるのである。
細胞（ハイブリドーマ）の培養上清から有用なＩｇＧ、
ＩｇＭ等の抗体を精製する場合、通常のプロティンＡや
プロティンＧをリガンドとしたアフィニティクロマトグ
ラフィーによる精製法を用いると、精製物中に血清中の
ウシＩｇＧが多量に混入し、精製物中の有用なＩｇＧの
比活性が低くなるという問題点があった。即ち、抗体産
生細胞であるハイブリドーマの培養には、細胞増殖促進
作用のあるウシ胎児血清（ＦＣＳ）を基本培地に添加し
た培地が頻繁に使われている。しかしＦＣＳ中にはウシ
ＩｇＧが含まれており、ロットによってはハイブリドー
マの産出する抗体量と同等あるいはそれ以上のレベルと
なることもある。このため精製物中にウシＩｇＧが多量
に混入することとなるのである。
【０００５】また最近では、血清を含まない無血清培地
が開発されてきてはいるが、それらの培地では増殖しな
い細胞も多く、あまり頻繁には使われていない。更にこ
の無血清培地と血清培地の中間的な培地として、牛血清
中の成長因子を抽出してきたギット培地（日本製薬製）
が市販されているが、このギット培地中にはウシＩｇＧ
が約0.2mg/mLという高濃度で含まれている。このためや
はり上記した問題は未解決のままである。
が開発されてきてはいるが、それらの培地では増殖しな
い細胞も多く、あまり頻繁には使われていない。更にこ
の無血清培地と血清培地の中間的な培地として、牛血清
中の成長因子を抽出してきたギット培地（日本製薬製）
が市販されているが、このギット培地中にはウシＩｇＧ
が約0.2mg/mLという高濃度で含まれている。このためや
はり上記した問題は未解決のままである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記した従来
の問題点を解決し、ウシＩｇＧを含む培地で培養された
ハイブリドーマの培養上清から、有用なマウスやラット
のＩｇＧを確実に分離精製することができるアフィニテ
ィクロマトグラフィー用吸着体を提供することを目的と
するものである。また本発明の他の目的は、このアフィ
ニティクロマトグラフィー用吸着体を用いた抗体の分離
方法、抗体濃度の測定方法、抗体断片の精製濃縮方法を
提供することである。
の問題点を解決し、ウシＩｇＧを含む培地で培養された
ハイブリドーマの培養上清から、有用なマウスやラット
のＩｇＧを確実に分離精製することができるアフィニテ
ィクロマトグラフィー用吸着体を提供することを目的と
するものである。また本発明の他の目的は、このアフィ
ニティクロマトグラフィー用吸着体を用いた抗体の分離
方法、抗体濃度の測定方法、抗体断片の精製濃縮方法を
提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めになされた請求項１のアフィニティクロマトグラフィ
ー用吸着体は、抗体のカッパー軽鎖結合蛋白をリガンド
として支持体に結合したことを特徴とするものである。
また請求項２の抗体の分離方法は、請求項１のアフィニ
ティクロマトグラフィー用吸着体を用いて、アフィニテ
ィクロマトグラフィーにより混合物から抗体を分離する
ことを特徴とするものである。
めになされた請求項１のアフィニティクロマトグラフィ
ー用吸着体は、抗体のカッパー軽鎖結合蛋白をリガンド
として支持体に結合したことを特徴とするものである。
また請求項２の抗体の分離方法は、請求項１のアフィニ
ティクロマトグラフィー用吸着体を用いて、アフィニテ
ィクロマトグラフィーにより混合物から抗体を分離する
ことを特徴とするものである。
【０００８】また請求項３の抗体濃度の測定方法は、牛
血清成分を含有する細胞培養上清中の抗体濃度を、請求
項１に記載のアフィニティクロマトグラフィー用吸着体
を用いて高速液体クロマトグラフィーにより測定するこ
とを特徴とするものである。更に請求項４の抗体断片の
精製濃縮方法は、抗体を酵素分解して得られる断片を含
む混合物から、請求項１に記載のアフィニティクロマト
グラフィー用吸着体を充填したアフィニティクロマトグ
ラフィーにより、抗原結合部位を有する抗体断片を精製
・濃縮することを特徴とするものである。
血清成分を含有する細胞培養上清中の抗体濃度を、請求
項１に記載のアフィニティクロマトグラフィー用吸着体
を用いて高速液体クロマトグラフィーにより測定するこ
とを特徴とするものである。更に請求項４の抗体断片の
精製濃縮方法は、抗体を酵素分解して得られる断片を含
む混合物から、請求項１に記載のアフィニティクロマト
グラフィー用吸着体を充填したアフィニティクロマトグ
ラフィーにより、抗原結合部位を有する抗体断片を精製
・濃縮することを特徴とするものである。
【０００９】
【作用】上記したように、本発明においては抗体のカッ
パー軽鎖結合蛋白をリガンドとして使用する。図１に示
すように、抗体には２つの重鎖（Heavy chain)と２つの
軽鎖（Light chain)とからなり、軽鎖にはカッパー(Kap
pa) 型とラムダ(lambda)型との２種類がある。そして牛
血清中に含まれるウシＩｇＧの軽鎖ではラムダ型の存在
率が95％以上と極めて高く、逆にマウスやラットではほ
とんどの軽鎖はカッパー型である。請求項１の発明では
この点に着目し、血清培養上清中のモノクローナル抗体
の精製や抗体濃度の定量に、カッパー軽鎖結合蛋白をリ
ガンドとして用いた。カッパー軽鎖結合蛋白を不溶性担
体に固定化させたアフィニティクロマトグラフィー用吸
着体を用いれば、ウシＩｇＧの妨害を受けることなく有
用なマウスやラットのＩｇＧのみを分離することができ
る。このようにして得られた精製物中には、ウシＩｇＧ
が混入していないことを確認した。
パー軽鎖結合蛋白をリガンドとして使用する。図１に示
すように、抗体には２つの重鎖（Heavy chain)と２つの
軽鎖（Light chain)とからなり、軽鎖にはカッパー(Kap
pa) 型とラムダ(lambda)型との２種類がある。そして牛
血清中に含まれるウシＩｇＧの軽鎖ではラムダ型の存在
率が95％以上と極めて高く、逆にマウスやラットではほ
とんどの軽鎖はカッパー型である。請求項１の発明では
この点に着目し、血清培養上清中のモノクローナル抗体
の精製や抗体濃度の定量に、カッパー軽鎖結合蛋白をリ
ガンドとして用いた。カッパー軽鎖結合蛋白を不溶性担
体に固定化させたアフィニティクロマトグラフィー用吸
着体を用いれば、ウシＩｇＧの妨害を受けることなく有
用なマウスやラットのＩｇＧのみを分離することができ
る。このようにして得られた精製物中には、ウシＩｇＧ
が混入していないことを確認した。
【００１０】また請求項３の抗体濃度の測定方法におい
ては、上記したカッパー軽鎖結合蛋白をリガンドとした
アフィニティクロマトグラフィー用吸着体を使用するた
め、精度のよい測定や精製濃縮が可能となる。即ち、細
胞培養上清や腹水中の抗体濃度を迅速に測定する方法と
して、プロティンＡやプロティンＧをリガンドとしたア
フィニティクロマトグラフィー用カラムを高速液体クロ
マトグラフィー装置に装着し、試料を少量注入後に抗体
を溶出させ、その溶出ピーク面積から検量線により抗体
濃度を決定する方法が知られている。ところが試料が牛
血清成分を含む培養上清である場合には、ウシＩｇＧも
リガンドに吸着されるので、マウスＩｇＧを直接測定で
きない。これに対して請求項３の抗体濃度の測定方法に
よれば0.2mg/mL以上含まれているウシＩｇＧを捕らえる
ことなく、マウス型、ラット型、ヒト型等の測定したい
物質のみを捕らえて測定できるため、正確な測定が可能
となる。
ては、上記したカッパー軽鎖結合蛋白をリガンドとした
アフィニティクロマトグラフィー用吸着体を使用するた
め、精度のよい測定や精製濃縮が可能となる。即ち、細
胞培養上清や腹水中の抗体濃度を迅速に測定する方法と
して、プロティンＡやプロティンＧをリガンドとしたア
フィニティクロマトグラフィー用カラムを高速液体クロ
マトグラフィー装置に装着し、試料を少量注入後に抗体
を溶出させ、その溶出ピーク面積から検量線により抗体
濃度を決定する方法が知られている。ところが試料が牛
血清成分を含む培養上清である場合には、ウシＩｇＧも
リガンドに吸着されるので、マウスＩｇＧを直接測定で
きない。これに対して請求項３の抗体濃度の測定方法に
よれば0.2mg/mL以上含まれているウシＩｇＧを捕らえる
ことなく、マウス型、ラット型、ヒト型等の測定したい
物質のみを捕らえて測定できるため、正確な測定が可能
となる。
【００１１】また請求項４の抗体断片の精製濃縮方法に
よれば、抗体を酵素分解して得られる断片を含む混合物
から、抗原結合部位を有する抗体断片を高濃度に精製・
濃縮することができる。ここで図１、図２に抗体の構造
を示すとともに、抗体をパパイン酵素で分解した場合
と、ペプシン酵素で切断した場合で生じる抗体断片（フ
ラグメント）の違いについて示した。
よれば、抗体を酵素分解して得られる断片を含む混合物
から、抗原結合部位を有する抗体断片を高濃度に精製・
濃縮することができる。ここで図１、図２に抗体の構造
を示すとともに、抗体をパパイン酵素で分解した場合
と、ペプシン酵素で切断した場合で生じる抗体断片（フ
ラグメント）の違いについて示した。
【００１２】まずパパインにより抗体を切断すると、抗
原結合部位を有するFabフラグメント２本とFcフラグメ
ント１本が生じる。また、ペプシンで切断するとF(ab
´)2フラグメント１本と細分化されたFcフラグメントが
生じる。これらの酵素切断で得られるFab フラグメント
もしくはF(ab´)2フラグメントは抗原結合部位を有し、
不要なFcフラグメントが切り離されているので、抗原検
出等でこれらのフラグメントを使用すれば、非特異吸着
が減少してバックグラウンドが低く抑えられ、測定感度
が上昇するなどの利点がある。
原結合部位を有するFabフラグメント２本とFcフラグメ
ント１本が生じる。また、ペプシンで切断するとF(ab
´)2フラグメント１本と細分化されたFcフラグメントが
生じる。これらの酵素切断で得られるFab フラグメント
もしくはF(ab´)2フラグメントは抗原結合部位を有し、
不要なFcフラグメントが切り離されているので、抗原検
出等でこれらのフラグメントを使用すれば、非特異吸着
が減少してバックグラウンドが低く抑えられ、測定感度
が上昇するなどの利点がある。
【００１３】さて前記したように、請求項４の抗体断片
の精製濃縮方法によれば、抗体を酵素分解して得られる
断片を含む混合物から、抗原結合部位を有する抗体断片
を高濃度に精製・濃縮することができる。即ち、抗原濃
度を高感度で測定できるＥＩＡ（エンザイム・イノム・
アッセイ）検出法やサンドイッチＥＬＩＳＡ法において
は、完全な抗体分子よりも酵素分解により断片化したFa
b フラグメントやF(ab´)2フラグメントが好んで用いら
れているのであるが、これらを分離精製する一般的な方
法は、ＤＥＡＥ─陰イオン交換クロマトグラフィーやプ
ロティンＡをリガンドとしたアフィニティクロマトグラ
フィーである。
の精製濃縮方法によれば、抗体を酵素分解して得られる
断片を含む混合物から、抗原結合部位を有する抗体断片
を高濃度に精製・濃縮することができる。即ち、抗原濃
度を高感度で測定できるＥＩＡ（エンザイム・イノム・
アッセイ）検出法やサンドイッチＥＬＩＳＡ法において
は、完全な抗体分子よりも酵素分解により断片化したFa
b フラグメントやF(ab´)2フラグメントが好んで用いら
れているのであるが、これらを分離精製する一般的な方
法は、ＤＥＡＥ─陰イオン交換クロマトグラフィーやプ
ロティンＡをリガンドとしたアフィニティクロマトグラ
フィーである。
【００１４】しかしＤＥＡＥ−陰イオン交換クロマトグ
ラフィーではFcフラグメントは吸着されるが、Fab フラ
グメントは素通りするだけではなくゲルに保持されるも
のもあるので、緩衝液のNaCl濃度を上げて保持されたFa
b フラグメントを溶出させる必要がある。従って、回収
物中のFab 濃度は希釈されて薄くなり、収率も落ちて精
製度も悪くなるという問題点があった。またプロティン
Ａをリガンドとしたアフィニティクロマトグラフィーで
は、吸着体がFcフラグメントと無傷の未分解ＩｇＧを結
合するので、Fab フラグメントが未分解抗体を含まずに
素通り画分として回収できるが、予め遊離酵素を前処理
で除去しなければならず、更に希釈によりFab 濃度は低
くなる。
ラフィーではFcフラグメントは吸着されるが、Fab フラ
グメントは素通りするだけではなくゲルに保持されるも
のもあるので、緩衝液のNaCl濃度を上げて保持されたFa
b フラグメントを溶出させる必要がある。従って、回収
物中のFab 濃度は希釈されて薄くなり、収率も落ちて精
製度も悪くなるという問題点があった。またプロティン
Ａをリガンドとしたアフィニティクロマトグラフィーで
は、吸着体がFcフラグメントと無傷の未分解ＩｇＧを結
合するので、Fab フラグメントが未分解抗体を含まずに
素通り画分として回収できるが、予め遊離酵素を前処理
で除去しなければならず、更に希釈によりFab 濃度は低
くなる。
【００１５】これに対して請求項４の発明では、Fab フ
ラグメントやF(ab´)2フラグメントに存在する抗体のカ
ッパー軽鎖に結合する蛋白をリガンドとしたアフィニテ
ィクロマトグラフィー用吸着体により、抗原結合部位を
有するFab フラグメントやF(ab´)2フラグメントを精製
する。これを用いれば分解のための遊離酵素を予め除く
必要はなく直接処理することができ、Fab フラグメント
やF(ab´)2フラグメントのみをカラム内に保持できるの
で、精製によりFab 濃度やF(ab´)2濃度が低くならな
い。特に支持体として硬質で高吸着容量を有するゲルを
用いることにより、精製と同時にFab フラグメントやF
(ab´)2フラグメントを高濃度に濃縮することが可能と
なる。以下にこれらの各発明の実施例を示す。
ラグメントやF(ab´)2フラグメントに存在する抗体のカ
ッパー軽鎖に結合する蛋白をリガンドとしたアフィニテ
ィクロマトグラフィー用吸着体により、抗原結合部位を
有するFab フラグメントやF(ab´)2フラグメントを精製
する。これを用いれば分解のための遊離酵素を予め除く
必要はなく直接処理することができ、Fab フラグメント
やF(ab´)2フラグメントのみをカラム内に保持できるの
で、精製によりFab 濃度やF(ab´)2濃度が低くならな
い。特に支持体として硬質で高吸着容量を有するゲルを
用いることにより、精製と同時にFab フラグメントやF
(ab´)2フラグメントを高濃度に濃縮することが可能と
なる。以下にこれらの各発明の実施例を示す。
【００１６】
〔吸着体の調製・・実施例１〕 CNBr−セファローズ4B（アガロース）10g を１mMのHCl
200mL に懸濁し、ゲルを膨潤させて洗浄を行った。洗浄
後、ゲルを固定化バッファー(0.5M のNaClを含む0.1Mの
NaHCO3、pH8.3)で再懸濁させた。カッパー軽鎖結合蛋白
100mg を固定化バッファー35mLに溶解し、丸底フラスコ
に入れた。上記CNBr−セファローズ4Bの懸濁液を加え、
攪拌しながら４℃で一晩反応させ、カッパー軽鎖結合蛋
白とCNBr−セファローズ4Bのカップリングを行った。反
応後、固定化バッファー200mL で洗浄し、1Mエタノール
アミン (pH8)に再懸濁して未反応の活性化基をブロッキ
ングした。室温、1 時間でブロッキング終了し、PBS(pH
7.6)バッファーで洗浄してアフィニティクロマトグラフ
ィー用吸着体を調製した。
200mL に懸濁し、ゲルを膨潤させて洗浄を行った。洗浄
後、ゲルを固定化バッファー(0.5M のNaClを含む0.1Mの
NaHCO3、pH8.3)で再懸濁させた。カッパー軽鎖結合蛋白
100mg を固定化バッファー35mLに溶解し、丸底フラスコ
に入れた。上記CNBr−セファローズ4Bの懸濁液を加え、
攪拌しながら４℃で一晩反応させ、カッパー軽鎖結合蛋
白とCNBr−セファローズ4Bのカップリングを行った。反
応後、固定化バッファー200mL で洗浄し、1Mエタノール
アミン (pH8)に再懸濁して未反応の活性化基をブロッキ
ングした。室温、1 時間でブロッキング終了し、PBS(pH
7.6)バッファーで洗浄してアフィニティクロマトグラフ
ィー用吸着体を調製した。
【００１７】〔吸着体の調製・・実施例２〕 ポリスチレンとジビニルベンゼンのコポリマーを素材と
したパーフュージョンクロマトグラフィー用アルデヒド
活性化担体（商品名ポロス）を3.5g測り取り、固定化バ
ッファー(0.5M のNaClを含む0.1MのNaHCO3、pH8.3)を加
えろ過した。その後に固定化バッファーで再懸濁し、カ
ッパー軽鎖結合蛋白溶液と混合し、１時間反応させた。
次に水素化シアノ硼素ナトリウムを10mg/mL 濃度で加
え、２時間反応させた。更に0.2Mトリス−塩酸（pH8)で
未反応の活性化基をブロッキングした。
したパーフュージョンクロマトグラフィー用アルデヒド
活性化担体（商品名ポロス）を3.5g測り取り、固定化バ
ッファー(0.5M のNaClを含む0.1MのNaHCO3、pH8.3)を加
えろ過した。その後に固定化バッファーで再懸濁し、カ
ッパー軽鎖結合蛋白溶液と混合し、１時間反応させた。
次に水素化シアノ硼素ナトリウムを10mg/mL 濃度で加
え、２時間反応させた。更に0.2Mトリス−塩酸（pH8)で
未反応の活性化基をブロッキングした。
【００１８】〔吸着体の調製・・実施例３〕 シリカゲルを基材とし、ポリエチレングリコールがスペ
ーサであり、活性化アルデヒド基を有する高速アフィニ
ティ担体（商品名クロマトップ、日本碍子製）を１g 測
り取り、固定化バッファーでゲルを懸濁し、カッパー軽
鎖結合蛋白溶液と混合し、１時間反応させた。次に水素
化シアノ硼素ナトリウムを10mg/mL 濃度で加え、２時間
反応させた。反応終了後、実施例２と同様にブロッキン
グを行い、アフィニティクロマトグラフィー用吸着体を
得た。
ーサであり、活性化アルデヒド基を有する高速アフィニ
ティ担体（商品名クロマトップ、日本碍子製）を１g 測
り取り、固定化バッファーでゲルを懸濁し、カッパー軽
鎖結合蛋白溶液と混合し、１時間反応させた。次に水素
化シアノ硼素ナトリウムを10mg/mL 濃度で加え、２時間
反応させた。反応終了後、実施例２と同様にブロッキン
グを行い、アフィニティクロマトグラフィー用吸着体を
得た。
【００１９】〔抗体の分離精製・・実施例４〕 牛胎児血清を10％含む培地でマウスＩｇＧ産生細胞を培
養し、得られた細胞培養液を遠心分離し、更に濾紙によ
りろ過して細胞を除去した。この細胞培養上清(マウス
ＩｇＧ濃度10μg/mL）５L を0.45μm の膜でろ過し、実
施例１、２で作製したカッパー軽鎖結合蛋白をリガンド
としたアフィニティカラム（容量22mL)に72カラム容積/
hr の流速で通液した。PBS(pH7.4)バッファーで洗浄
後、0.15MのNaClを含む0.1Mグリシン塩酸 (pH2.5)で溶
出し、溶出後直ちに中和した。280nm の吸光度と抗マウ
スＩｇＭ−ペルオキシダーゼのサンドイッチＥＬＩＳＡ
アッセイから回収率は83％であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電
気泳動で純度を調べたところマウスＩｇＭの単一バンド
であった。
養し、得られた細胞培養液を遠心分離し、更に濾紙によ
りろ過して細胞を除去した。この細胞培養上清(マウス
ＩｇＧ濃度10μg/mL）５L を0.45μm の膜でろ過し、実
施例１、２で作製したカッパー軽鎖結合蛋白をリガンド
としたアフィニティカラム（容量22mL)に72カラム容積/
hr の流速で通液した。PBS(pH7.4)バッファーで洗浄
後、0.15MのNaClを含む0.1Mグリシン塩酸 (pH2.5)で溶
出し、溶出後直ちに中和した。280nm の吸光度と抗マウ
スＩｇＭ−ペルオキシダーゼのサンドイッチＥＬＩＳＡ
アッセイから回収率は83％であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電
気泳動で純度を調べたところマウスＩｇＭの単一バンド
であった。
【００２０】〔マウスＩｇＧの定量分析・・実施例５〕 実施例２の方法により作製した吸着体を定量分析用のス
テンレス製カラム（4.6mm 径×50mm長) に100kg/cm2 の
圧力で充填した。このカラムを高速液体クロマトグラフ
ィー装置（ウォーターズ600 Ｅシステム）に装着し吸液
後、PBS(pH7.6)バッファーと溶離液(0.1M グリシン−HC
l 、pH2.5)で交互に200 カラム容積/hr以上の高流速で
洗浄した。次に吸着液でカラムを平衡化した後、牛胎児
血清を10％含有する細胞培養上清（マウスＩｇＧ含有）
1mL をカラム内にインジェクターを通して注入し、マウ
スＩｇＧを溶出した。7 分後に溶出ピーク面積から予め
標準品より作製した検量線でマウスＩｇＧ濃度を決定し
たところ、22μg/mLであった。この値はＥＬＩＳＡ法で
の測定結果とよく一致した。なお、プロティンＡやプロ
ティンＧをリガンドとしたカラムで測定した場合には、
ウシＩｇＧが数mg溶出回収されてしまうために、マウス
ＩｇＧ濃度の決定ができない。
テンレス製カラム（4.6mm 径×50mm長) に100kg/cm2 の
圧力で充填した。このカラムを高速液体クロマトグラフ
ィー装置（ウォーターズ600 Ｅシステム）に装着し吸液
後、PBS(pH7.6)バッファーと溶離液(0.1M グリシン−HC
l 、pH2.5)で交互に200 カラム容積/hr以上の高流速で
洗浄した。次に吸着液でカラムを平衡化した後、牛胎児
血清を10％含有する細胞培養上清（マウスＩｇＧ含有）
1mL をカラム内にインジェクターを通して注入し、マウ
スＩｇＧを溶出した。7 分後に溶出ピーク面積から予め
標準品より作製した検量線でマウスＩｇＧ濃度を決定し
たところ、22μg/mLであった。この値はＥＬＩＳＡ法で
の測定結果とよく一致した。なお、プロティンＡやプロ
ティンＧをリガンドとしたカラムで測定した場合には、
ウシＩｇＧが数mg溶出回収されてしまうために、マウス
ＩｇＧ濃度の決定ができない。
【００２１】〔Fab フラグメントの濃縮精製・・実施例
６〕 パパイン（Sigma 製) を2mM のEDTAと10mMのシステイン
を含む200mM リン酸ナトリウム緩衝液 (pH7.4)に10mg/m
L となるように溶解した。ＩｇＧ100mg に対して酵素1m
g となるように酵素溶液を同じ緩衝液のＩｇＧ溶液に加
えて、37度で12時間穏やかに振とうした。分解後、PBS
(pH7.4)バッファーに対して透析した。この液を、実施
例３で作製したカラムに通液し、PBS で洗浄した後、0.
1Mグリシン−HCl(pH2.5)で溶出した。溶出後、PBS に対
して透析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で解析した結
果、Fab フラグメントの単一バンドであり、Fab フラグ
メントを1mg/mLの高濃度で濃縮できた。
６〕 パパイン（Sigma 製) を2mM のEDTAと10mMのシステイン
を含む200mM リン酸ナトリウム緩衝液 (pH7.4)に10mg/m
L となるように溶解した。ＩｇＧ100mg に対して酵素1m
g となるように酵素溶液を同じ緩衝液のＩｇＧ溶液に加
えて、37度で12時間穏やかに振とうした。分解後、PBS
(pH7.4)バッファーに対して透析した。この液を、実施
例３で作製したカラムに通液し、PBS で洗浄した後、0.
1Mグリシン−HCl(pH2.5)で溶出した。溶出後、PBS に対
して透析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で解析した結
果、Fab フラグメントの単一バンドであり、Fab フラグ
メントを1mg/mLの高濃度で濃縮できた。
【００２２】〔F(ab´)2フラグメントの濃縮精製・・実
施例７〕 ペプシン（Worthington 製) を200mM 酢酸ナトリウム緩
衝液 (pH4.2)に溶解し、同じ緩衝液のＩｇＧ溶液に加
え、37℃で12時間反応させた。F(ab´)2フラグメントに
分解後、PBS(pH7.4)バッファーに対して透析した。この
液を実施例２で作製したカラムに通液し、PBS で洗浄し
た後、0.1Mグリシン−HCl(pH2.5)で溶出した。溶出後、
PBS に対して透析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で解
析した結果、F(ab´)2フラグメントの単一バンドである
ことが確認できた。
施例７〕 ペプシン（Worthington 製) を200mM 酢酸ナトリウム緩
衝液 (pH4.2)に溶解し、同じ緩衝液のＩｇＧ溶液に加
え、37℃で12時間反応させた。F(ab´)2フラグメントに
分解後、PBS(pH7.4)バッファーに対して透析した。この
液を実施例２で作製したカラムに通液し、PBS で洗浄し
た後、0.1Mグリシン−HCl(pH2.5)で溶出した。溶出後、
PBS に対して透析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で解
析した結果、F(ab´)2フラグメントの単一バンドである
ことが確認できた。
【００２３】
【発明の効果】以上に説明したように、本発明のアフィ
ニティクロマトグラフィー用吸着体及びこれを用いた抗
体の分離方法によれば、ウシＩｇＧの妨害を受けること
なく有用なマウスやラットのＩｇＧのみを分離すること
ができる。また本発明の抗体濃度の測定方法によれば、
ウシＩｇＧを捕らえることなく、マウス型、ラット型、
ヒト型等の測定したい物質のみの正確な測定が可能とな
る。さらに本発明の抗体断片の精製濃縮方法によれば、
Fab フラグメントやF(ab´)2フラグメントを高濃度に濃
縮することができる。
ニティクロマトグラフィー用吸着体及びこれを用いた抗
体の分離方法によれば、ウシＩｇＧの妨害を受けること
なく有用なマウスやラットのＩｇＧのみを分離すること
ができる。また本発明の抗体濃度の測定方法によれば、
ウシＩｇＧを捕らえることなく、マウス型、ラット型、
ヒト型等の測定したい物質のみの正確な測定が可能とな
る。さらに本発明の抗体断片の精製濃縮方法によれば、
Fab フラグメントやF(ab´)2フラグメントを高濃度に濃
縮することができる。
【図１】抗体と、抗体をパパイン酵素で切断した場合の
フラグメントの模式図である。
フラグメントの模式図である。
【図２】抗体と、抗体をペプシン酵素で切断した場合の
フラグメントの模式図である。
フラグメントの模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 馬島 剛 愛知県名古屋市瑞穂区須田町２番56号 日 本碍子株式会社内
Claims (4)
- 【請求項１】 抗体のカッパー軽鎖結合蛋白をリガンド
として支持体に結合したことを特徴とするアフィニティ
クロマトグラフィー用吸着体。 - 【請求項２】 請求項１に記載のアフィニティクロマト
グラフィー用吸着体を用いて、アフィニティクロマトグ
ラフィーにより混合物から抗体を分離することを特徴と
する抗体の分離方法。 - 【請求項３】 牛血清成分を含有する細胞培養上清中の
抗体濃度を、請求項１に記載のアフィニティクロマトグ
ラフィー用吸着体を用いて高速液体クロマトグラフィー
により測定することを特徴とする抗体濃度の測定方法。 - 【請求項４】 抗体を酵素分解して得られる断片を含む
混合物から、請求項１に記載のアフィニティクロマトグ
ラフィー用吸着体を充填したアフィニティクロマトグラ
フィーにより、抗原結合部位を有する抗体断片を精製・
濃縮することを特徴とする抗体断片の精製濃縮方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5296347A JPH07146280A (ja) | 1993-11-26 | 1993-11-26 | アフィニティクロマトグラフィー用吸着体及びこれを 用いた抗体の分離方法、抗体濃度の測定方法、抗体断 片の精製濃縮方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5296347A JPH07146280A (ja) | 1993-11-26 | 1993-11-26 | アフィニティクロマトグラフィー用吸着体及びこれを 用いた抗体の分離方法、抗体濃度の測定方法、抗体断 片の精製濃縮方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07146280A true JPH07146280A (ja) | 1995-06-06 |
Family
ID=17832379
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5296347A Pending JPH07146280A (ja) | 1993-11-26 | 1993-11-26 | アフィニティクロマトグラフィー用吸着体及びこれを 用いた抗体の分離方法、抗体濃度の測定方法、抗体断 片の精製濃縮方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07146280A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7317059B2 (en) | 2004-09-24 | 2008-01-08 | Fuji Xerox Co., Ltd. | Ligand immobilization support |
| US7935541B2 (en) | 2007-09-28 | 2011-05-03 | Fujifilm Corporation | Immunochromatography method using fragmented antibody |
| CN114894911A (zh) * | 2022-03-18 | 2022-08-12 | 辽宁成大生物股份有限公司 | 一种控制牛血清产品质量方法 |
-
1993
- 1993-11-26 JP JP5296347A patent/JPH07146280A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7317059B2 (en) | 2004-09-24 | 2008-01-08 | Fuji Xerox Co., Ltd. | Ligand immobilization support |
| US7935541B2 (en) | 2007-09-28 | 2011-05-03 | Fujifilm Corporation | Immunochromatography method using fragmented antibody |
| CN114894911A (zh) * | 2022-03-18 | 2022-08-12 | 辽宁成大生物股份有限公司 | 一种控制牛血清产品质量方法 |
| CN114894911B (zh) * | 2022-03-18 | 2023-10-24 | 辽宁成大生物股份有限公司 | 一种控制牛血清产品质量方法 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
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