BR112013031575B1 - Composto peptídico ciclado de estrutura principal, composição farmacêutica, uso de um composto, e, processo para a manufatura de um composto - Google Patents

Abstract

COMPOSTO PEPTÍDICO CICLADO DE ESTRUTURA PRINCIPAL, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DE UM COMPOSTO, E, PROCESSO PARA A MANUFATURA DE UM COMPOSTO Peptídeomiméticos de beta-hairpin da fórmula geral ciclo (-Tyr1- His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7-Xaa8-Arg9-Tyr10-Cys11-Tyr12-Xaa13-Xaa14DPro15-Pro16-) (I), ligação dissulfeto entre Cys4 e Cys11, e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, com Xaa3, Xaa7, Xaa8, Xaa13 e Xaa14 sendo resíduos de aminoácido de certos tipos, que são definidos na descrição e nas reivindicações, possuem propriedades farmacológicas favoráveis e podem ser usados para a prevenção de infecções por HIV em indivíduos saudáveis ou ainda para retardar e deter a progressão viral em pacientes infectados; ou em que o câncer é mediado ou resultante a partir da atividade do receptor CXCR4; ou em que as doenças imunológicas são mediadas ou resultantes da atividade do receptor CXCR4; ou ainda para o tratamento de imunossupressão; ou durante as coletas de aférese de células-tronco sanguíneas periféricas e/ou de agentes para induzir a mobilização de células-tronco, de um modo a regular o reparo do tecido. Estes peptídeomiméticos podem ser manufaturados através de um processo, que é baseado em uma estratégia sintética de uma fase sólida e (...).

Description

[01] A presente invenção provê peptídeomiméticos de β-hairpin, que apresentam atividade antagonizante e que são abrangidos pela exposição geral de, mas não são especificamente descritos na WO2004/096840 A1.

[02] Os peptídeomiméticos de β-hairpin da invenção são ciclo(- 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Tyr -HIs -Xaa -Cys -Ser -Ala -Xaa -Xaa -Arg -Tyr -Cys -Tyr -Xaa - Xaa14-DPro15-Pro16-), ligante dissulfeto entre Cys4 e Cys11, e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, com Xaa3 sendo Ala, Tyr ou Tyr(Me), tal como aqui descrito abaixo, Xaa7 sendo Dtyr, Dtyr(me), tal como aqui abaixo descrito, ou Dpro, Xaa8 sendo Dab ou Orn(iPr), tal como aqui abaixo descrito, Xaa13 sendo Gln ou Glu, e Xaa14 sendo Lys(iPr), tal como acima descrito.

[03] Em adição, a presente invenção provê um processo sintético eficiente, através do qual estes compostos podem, se desejado, ser produzidos em paralelo em um formato de biblioteca. Estes peptídeomiméticos de β- hairpin apresentam propriedades farmacológicas favoráveis e, de um modo adicional, apresentam ainda um ligante de proteína do plasma adequado e taxas de eliminação apropriadas. Deste modo, eles podem ser ainda usados como ingredientes ativos, em baixas quantidades, para todos os tipos de formulações de droga, de um modo particular para formulações de droga de liberação estendida.

[04] Muitos processos biológicos medicamente significativos são mediados através de transdução de sinal, que envolve quimioquinas e os seus receptores de um modo geral e o fator 1 derivado de estromal (SDF- 1/CXCL12) e o seu receptor CXCR4 em particular.

[05] CXCR4 e o seu ligante SDF-1 estão envolvidos no tráfego de células B, células-tronco hematopoiéticas (HSC) e células progenitoras hematopoiéticas (HPC). Por exemplo, CXCR4 é expressado em células CD34+ e foi implicado no processo de migração celular de CD34+ e de alojamento (S.M.Watt, S.P. Forde, Vox Sanguinis 2008, 94- 18-32). Foi também demonstrado que o receptor CXCR4 desempenha uma função importante na liberação das células-tronco e progenitoras a partir da medula óssea para o sangue periférico (L. M. Pelus, S. Fukuda, Leukemia, 2008, 22, 466- 473). Esta atividade de CXCR4 poderia ser muito importante para coleções de aferese eficientes de células-tronco sanguíneas periféricas. As células sanguíneas periféricas autólogas proporcionam uma recuperação hematopoiética rápida e sustentada seguindo-se ao autotransplante, após a administração de quimioterapia de alta dose ou de radioterapia em pacientes com malignidades hematológicas e tumores sólidos (W. C. Liles et al., Blood 2003, 102, 2728-2730).

[06] Recentemente, foi demonstrado que o SDF-1 está localizado regulado para cima em modelos animais de injúria, que incluem o derrame isquêmico focal, isquemia cerebral crônica, enfarte do miocárdio e isquemia do membro traseiro, assim como está envolvido na recuperação após a isquemia periférica ou seguindo-se ao dano ao fígado, rins ou pulmão (A. E. Ting, R. W. Mays, M. R. Frey, W. Van't Hof, Medicetty, R. Deans, Critical Reviews in Oncology/Hematology 2008, 65, 81-93 e na literatura aqui citada; F. Lin, K. Cordes, L. Li, L. Hood, W. G. Couser, S. J. Shankland et al., J. Am. Soc. Nephrol. 2003, 14, 1188- 1199; C.C. Dos Santos, Intensive Care Med. 2008, 34, 619-630). Estes resultados sugerem que o SDF-1 pode ser um quimioatraente para células-tronco CXCR4- positivas para o reparo/regeneração de tecido e de órgão (M. Z. Ratajczak, M. Kucia, R. Reca, M. Majka, A. Janowska- Wieczorek, J. Ratajczak, Leukemia 2004, 18, 29-40). Deste modo, a modulação do eixo SDF-1/CXCR4 por inibidores de CXCR4 deveria resultar em um benefício terapêutico significativo através do uso de células-tronco liberadas, de um modo a regular o reparo do tecido.

[07] Mais recentemente, foi demonstrado que a ruptura do eixo CXCR4/SDF-1 por inibidores de CXCR4 desempenha uma função crucial na mobilização diferencial de células progenitoras, tais que HPCs, células progenitoras endoteliais (EPCs) e células progenitoras estromais (SPCs) a partir da medula óssea (S.C. Pitchford, R. C. Furze, C. P. Jones, A. M. Wegner, S. M. Rankin, Cell Stem Cell 2009, 4, 62). Em adição, Células- Tronco do Tipo Embriônico Muito Pequenas CXCR4+ derivadas de medula óssea (VSELs) foram modificadas em pacientes com enfarte do miocárdio agudo, indicando um mecanismo reparatório hipotético (W. Wojakowski, M. Tendra, M. Kucia, E. Zuba-Surma, E. Paczkowska, J. Ciosek, M. Halasa, M. Król, M. Kazmierski, P. Buszman, A. Ochala, J. Ratajczak, B. Machalinski, M. Z. Ratajczak, J. Am. Coll. Cardiol., 2009, 53, 1). Estas descobertas podem ser ainda exploradas de um modo a prover uma terapia de célula-tronco eficaz para a regeneração de tecido.

[08] As células-tronco mesenquimais (MSC) são células progenitoras não hematopoiéticas tendo a capacidade de se diferenciar em tecidos, tais que os ossos e a cartilagem (D. J. Prockop, Science 1997, 276, 71). Como uma pequena proporção de MSCs expressa fortemente a funcionalidade ativa CXCR4, a modulação do eixo CXCR4/SDF-1 pode mediar a migração específica e o alojamento destas células (R. F. Wynn, C. A. Hart, C. Corradi- Perini, L. O' Neill, C. A . Evans, J. E. Wraith, L. J. Fairbaim, I. Bellantuono, Blood 2004, 104, 2643).

[09] Existe uma evidência crescente, que sugere que as quimioquinas, de um modo geral, e a interação de SDF-1/CXCR4, de um modo particular, desempenham uma função pivotal na angiogênese. As quimioquinas induzem a angiogênese diretamente através da ligação de seus receptores cognatos em células endoteliais ou indiretamente através da promoção de infiltrados celulares promocionais, que fornecem outros estímulos angiogênicos. Um número de quimioquinas pró-inflamatórias, que incluem a interleucina 8 (IL-8), o oncogênio regulado pelo crescimento, o fator 1 derivado da célula estromal (SDF-1), a proteína quimiotáctica de monócito 1 (MCP-1), eotaxina 1, e I-309 foram demonstrados para agir como indutores diretos da angiogênese (X. Chen. J. A. Beutler, T. G. McCloud, A. Loehfelm, L.Yang, H. F. Dong, O. Y. Chertov, R. Salcedo, J. J. Oppenheim, O. M. Howard, Clin. Cancer Res., 2003, 9 (8), 3115- 3123 ; R. Salcedo, J. J. Oppenheim, Microcirculation 2003, (3-4), 359-370)).

[10] Os resultados recentemente obtidos demonstram que o receptor de CXCR4 está envolvido na atividade quimiotáctica de células de câncer, tais que na metástase de câncer de mama, ou na metástase do câncer ovariano (A. Muller, B. Homey, H. Soto, N. Ge, D. Catron, M. E. Buchana, T. Mc Clanahan, E. Murphey, W.Yuan, S. N. Wagner, J. L. Barrera, A Mohar, E. Verastegui, A Zlotnik, Nature 2001, 50, 410; J. M. Hall, K. S. Korach, Molecular Endocrinology 2003, 17, 792-803), Non- Hodgin's Lymphoma (F.Bertolini, C. Dell'Agnola. P. Manusco, C. Rabascio, A. Bertolini, S. Monestiroli, A. Gobbi, G. Pruneri, G. Martinelli, Cancer Research 2002, 62, 3106-3112), ou câncer de pulmão (T. Kijima, G. Maulik, P. C. Ma, E.V. Tibaldi, R. E. Turner, B. Rollins, M. Sattler, B. E. Johnson, R. Salgia, Cancer Research, 2002, 62, 6304- 6311), melanoma, câncer de próstata, câncer renal, neuroblastomia, câncer pancreático, mieloma múltiplo, leucemia linfocítica crônica, carcinoma hepatocelular, carcinoma colorretal, câncer endometrial e tumor da célula germinal (h. Tamamura et al. FEBS Letters 2003, 550, 79-83, ref. Citadas; Z. Wang, Q. Ma, Q. Liu, H. Yu, L. Zhao, S. Shen, J. Yao, Britisch Journal of Cancer 20-08, 99, 1695; B. Sung,. S. Jhurani, K. S. Ahn, Y. Mastuo, T. Yi, S. Guha, M. Liu, B. Aggarwal, Cancer Res., 2008, 68, 8938; H. Liu, Z. Pan, A. Li, S. Fu, Y. Lei, H. Sun, M. Wu, W. Zhou, Cellular and Molecular Immunology, 2008, 5, 373.; C. Rubie, O. Kollmar, V. O. Frich, M. Wagner, B. Brittner, S. Graber, M. K. Schilling, Scandinavian Journal of Immunology 2008, 68, 635; Sl Gelmini, M. Mangoni, F. Castiglioe, C. Beltrami, A. Pieralli, K. L. Andersson, M. Fambrini, G. I. Taddie, M. Serio, C. Orlando, Clin. Exp. Metastasis 2009, 26, 261; D.C. Gilbert, I. Chandler, A. Mcintyre, N. C. Goddard, R. Gabe. R. A. Huddart, J. Shipley, J. Pathol, 2009, 217, 94). O bloqueio da atividade quimiotáctica com um inibidor de CXCR não deveria interromper a migração de células de câncer e, deste modo a metástase.

[11] O CXCR4 foi também implicado no crescimento e na proliferação de tumores sólidos e de leucemia/linfoma. Foi ainda demonstrado que a ativação do receptor CXCR4 foi crítica par o crescimento tanto de tumores gliais, como neuronais malignos. Além disso, a administração sistêmica do antagonista de CXCR4 AMD3100 inibe o crescimento do glioblastoma intracraniano e de xenoenxertos de meduloblastoma através do aumento da apoptose e do decréscimo da proliferação das células de tumor (J. B. Rubin, A. L. Kung, R. S. Klein, J. A. Chan, Y. Sun, K. Schmidt, M. W. Kieran, A. D. Luster, R. A . Segal, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2003, 100 (23), 13513 - 13518; S. Barbero, R. Bonavia, A. Bajetto, C. Porcile, P. Pirani, J. L. Ravetti, G. L. Zona, R. Spaziante, T. Florio, G. Schettini, Cancer Res. 2003, 63 (8), 1969-1974; T. Kijima, G. Maulik, P. C. Ma, E. V. Tibaldi, R.E. Turner, B. Rolllins, M. Sattler, B. E. Johnson, R. Salgia, Cancer Res. 2002, 62 (21), 6304 - 6311). Os inibidores de CXCR4 também demonstrram eficácias promissoras in vitro e in vivo em câncer de mama, câncer de pulmão de célula pequena, câncer pancreático, câncer gástrico, câncer colorretal, melanoma maligno, câncer ovariano, rabdomio-sarcoma, câncer da próstata, assim como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda, mieloma múltiplo e linfoma Não Hodgkin's (J. A. Burger, A. Peled, Leukemia 2009, 23, 43-52 e a literatura citada na mesma).

[12] Está bem estabelecido que as quimioquinas estão envolvidas em um número de patologias inflamatórias e que algumas delas demonstram uma função pivotal na modulação do desenvolvimento do osteoclasto. O imunomanchamento para SDF-1 (CXCL12) em biópsias do tecido ósseo e sinovial a partir tanto de amostras de artrite reumatoide (RA), como de amostras de osteoartrite (OA), revelaram fortes aumentos nos níveis de expressão de quimioquinas sob condições inflamatórias (F. Grassi, S. Cristino, S. Toneguzzi, A. Piacentini, A. Facchini, G. Lisignoli, J. Cell. Physiol. 2004; 199(2), 244-251). Parece igualmente que o receptor de CXCR4 desempenha uma função importante em doenças inflamatórias, tais que a artrite reumatoide, asma, esclerose múltipla, mal de Alzheimer, mal de Parkinson, aterosclerose, ou doenças dos olhos, tais que a retinopatia diabética e a degeneração macular relacionada à idade (K. R. Shadidi et al., Scandinavian Journal of Immunology, 2003, 57, 192-198; J. A. Gonzalo, J. Immunol., 2000, 165, 499- 508; S. Hatse et al., FEBS Letters, 2002, 527, 255-262 e referências citadas, A. T. Weeraratna, S. Kalehua, I. DeLeon, D. Bertak, G. Maher, M.S. Wade, A. Lustig, K. G. Becker, W. Wood, D. G. Walker, T. G. Beach, D.D. Taub, Exp. Cell Res. 2007, 313, 450; M. Shimoji, F. Pagan, E. B. Healton, I. Mocchetti, Neurotox. Res., 2009, 16, 318; A. Zernecke, E. Shagdarsuren, C. Weber, Técnicarioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2008, 28, 1897; R. Lima e Silva, J. Shen, S. F. Hackett, S. Kachi, H. Akiyama et al., FASEB 2007, 21, 3219). A mediação do recrutamento de células imunes em sítios de inflamação dever ser interrompida por meio de um inibidor de CXCR4.

[13] Até o momento, as terapias disponíveis para o tratamento de infecções por HIV têm conduzido a uma melhora notável nos sintomas e na recuperação da doença nas pessoas infectadas. Embora a terapia antirretroviral altamente ativa (HAART), que envolve uma combinação de transcriptase reversa/inibidor de protease tenha melhorado, de um modo dramático, o tratamento clínico de indivíduos com AIDS ou com infecção por HIV, permanecem ainda vários problemas sérios, que incluem a resistência a várias drogas, efeitos adversos significativos e ainda custos elevados. São particularmente desejados os agentes anti-HIV, que bloqueiam a infecção por HIV em um estágio precoce da infecção, tal como na entrada viral. Foi recentemente reconhecido que, para uma entrada eficiente no interior das células objetivas, os vírus de imunodeficiência humanos requerem os receptores de quimioquina CCR5 e CXCR4, assim como o receptor primário CD4 (N. Levy, Engl. J. Med. 1996, 335, 1528-1530). Deste modo, um agente que pudesse bloquear os receptores de quimioquina CXCR4 deveria ainda evitar infecções em indivíduos saudáveis e retardar ou deter a progressão viral em pacientes infectados (J.Cohen, Science 1997, 275, 1261-1264).

[14] Dentre os diferentes tipos de inibidores de CXCR4 (M. Schwarz, T.N.C. Wells, A.E.I. Proudfoot, Receptors and Channels 2001, 7, 417- 428; Y. Lavrovsky, Y.A Ivanenkov, K.V. Balakin, D. A. Medvedewa, P.V. Ivachtchenko, Mini Rev. Med. Chem. 2008, 11, 1075-1087), uma classe emergente é baseada em análogos de peptídeo catiônicos de ocorrência natural, derivados a partir de Polyphenusin II, que possuem uma estrutura em folha β, e uma β-hairpin, que é mantida por duas pontes dissulfeto (H. Nakashima, M. Masuda, T. Murakani, Y. Koyanagi, A. Matsumoto, N. Fujii, N. Yamamato, Antimicrobial Agents and Chemoth. 1992, 36, 1249-1255; H. Tamamura, M. Kuroda, M. Masuda, A. Otaka, S Funakoshi, H. Nakashima, N. Yamamoto, M. Waki, A. Matsumotu, J. M. Lancelin, D. Kohda, S. Tate, F. Inagaki, N. Fujii, Biochim. Biphys. Acta, 1993, 209, 1163; WO95/10534 A1).

[15] A síntese de análogos estruturais e de estudos estruturais através de espectroscopia de ressonância magnética nuclear demonstraram que os peptídeos catiônicos adotam configurações de β-hairpin bem definidas, devido ao efeito de restrição de uma ou duas pontes dissulfeto (H. Tamamura, M. Sugioka, Y. Odagaki, Y. Kahn, S. Oishi, H. Nakashima, N. Yamamoto, S.C. Peiper, N. Hamanaka, A. Otaka, N. Fujii, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 359- 362). Os resultados demonstram que a estrutura de β-Hairpin desempenha uma função importante na atividade antagonizante de CXCR4.

[16] Estudos estruturais adicionais indicaram que a atividade antagonizante pode ser também influenciada pela modulação da estrutura anfifílica e pelo fármacoforo (H. Tamamura, A. Omagari, K. Hiramatsu, K. Gotoh, T. Kanamoto, Y. Xu, E. Kodama, M. Matsuoka, T. Hattori, N. Yamamoto, H. Nakashima, A. Otaka, N. Fujii, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 11, 1897-1902; H. Tamamura, A. Omagari, K. Hiramatsu, S. Oishi, H. Habashita, T. Kanamoto, K. Gotoh, N. Yamamoto, H. Nakashima, A. Otaka, N. Fujii, Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 1417-1426; H. Tamamura, K. Hiramatsu, K. Miyamoto, A. Omagari, S.Oishi, H. Nakashima, N.Yamamoto, Y. Kuroda, T. Nakagawa, A. Otaki, N. Fujii, Bioorg. Med.Chem. Letters 2002, 12, 923-928).

[17] Os compostos ciclo(-Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5-Ala6-Xaa7- 8 9 10 11 12 13 14 D 15 16 Xaa -Arg -Tyr -Cys -Tyr -Xaa -Xaa - Pro -Pro -), ligação dissulfeto entre Cys4 e Cys11, da invenção são peptídeomiméticos de β-hairpin cíclicos, que exibem uma alta atividade antagonizante de CXCR4, sendo úteis para as coletas de aferese eficiente de células-tronco sanguíneas periféricas mobilizadas e/ou usando estas células mobilizadas para regular o reparo do tecido, e/ou tendo atividade anticâncer, atividade anti-inflamatória e/ou atividade anti-HIV.

[18] A conformação de β-hairpin cíclica é induzida pelo resíduo de D-aminoácido Xaa7 e pelo resíduo de D-aminoácido Dpro15. A estabilização adicional da conformação de hairpin é alcançada por meio dos resíduos de aminoácido Cys nas posições 4 e 11, os quais, tomados em conjunto, formam uma ponte dissulfeto.

[19] De um modo surpreendente, foi ainda verificado que a introdução do resíduo de aminoácido básico Lys(iPr) na posição 14, suportado pela introdução opcional de Orn(iPr) na posição 8 de ciclo(-Tyr1- 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 His - Xaa -Cys -Ser -Ala -Xaa -Xaa -Arg -Tyr -Cys -Tyr -Xaa -Xaa - DPro15-Pro16-), ligação dissulfeto entre Cys4 e Cys11, resultam em peptídeomiméticos de β-hairpin, que possuem propriedades farmacológicas favoráveis. Estas propriedades, combinadas com a ligação de uma proteína do plasma adequada e com taxas de eliminação apropriadas, formam um perfil farmacológico, que permite com que estes compostos sejam então usados como ingredientes ativos, em baixas quantidades, para todos os tipos de formulações de droga, e de um modo particular para formulações de droga de liberação estendida.

[20] Os peptídeomiméticos de β-hairpin da presente invenção são os compostos da fórmula geral: 12 3 456 7 8 ciclo(-Tyr -His -Xaa -Cys -Ser -Ala -Xaa -Xaa - 9 10 11 12 13 14 D 15 16 Arg -Tyr -Cys -Tyr -Xaa -Xaa - Pro -Pro -) (I), ligação dissulfeto entre Cys4 e Cys11, e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, em que, Xaa3 á Ala, Tyr ou Tyr(Me), o último sendo o ácido (2S)-2- amino-(4-metoxifenil)-3-propiônico, Xaa7 é DTyr, D Tyr(Me), isto é (2R)-2-amino- (4-metoxifenil)- 3-propiônico, ou D Pro, Xaa8 é Dab, isto é, ácido (2S)-2,4-diaminobutírico, ou Orn(iPr), isto é o ácido (2S)-Nro-isopropil-2,5-diaminopentanóico, Xaa13 é Gln ou Glu, Xaa14 é Lys (iPr), isto é o ácido (2S)-Nro-isopropil-2,6-diamino hexanóico.

[21] Em ainda uma modalidade particular da presente invenção, os peptídeomiméticos são compostos da fórmula geral I, na qual XaaH é Gln, e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

[22] Em ainda uma outra modalidade particular da presente invenção, os peptídeomiméticos de β-hairpin são os compostos da fórmula geral I, nos quais Xaa3 é Tyr; ou Tyr(Me), Xaa7 ou Dpro, Xaa8 é Orn(iPr) e Xaa13 é Gln, e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

[23] Em ainda uma modalidade preferida da presente invenção, o 4 5 6 D 7 8 9 10 composto é ciclo(-Tyr -His -Ala -Cys -Ser -Ala - Tyr -Dab -Arg -Tyr - 11 12 13 14 D 15 16 4 Cys -Tyr -Gln -Lys(iPr) - Pro -Pro -), ligação dissulfeto entre Cys e Cys11, e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

[24] Em ainda uma outra modalidade preferida da presente 4 5 6D 7 invenção, o composto é ciclo(-Tyr - His -Tyr -Cys -Ser -Ala - Pro - 8 9 10 11 12 13 14 D 15 16 Orn(iPr) -Arg -Tyr -Cys -Tyr -Gln -Lys(iPr) - Pro -Pro -), ligação dissulfeto entre Cys4 e Cys11, e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

[25] Em ainda uma outra modalidade preferida da presente 4 5 6D 7 invenção, o composto é ciclo (-Tyr -His - Tyr(Me) -Cys -Ser -Ala - Pro - 8 9 10 11 12 13 14 D 15 16 Orn(iPr) -Arg -Tyr -Cys -Tyr -Gln -Lys(iPr) - Pro -Pro -), ligação dissulfeto entre Cys4 e Cys11, e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

[26] Em ainda uma outra modalidade preferida da presente 4 5 6D 7 invenção, o composto é ciclo (-Tyr -His -Ala -Cys -Ser -Ala - Tyr(Me) - 8 9 10 11 12 13 14 D 15 16 Orn(iPr) -Arg -Tyr -Cys -Tyr -Gln -Lys(iPr) - Pro -Pro -), ligação dissulfeto entre Cys4 e Cys11, e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

[27] Em ainda uma outra modalidade preferida da presente 4 5 6D 7 invenção, o composto é ciclo (-Tyr -His -Tyr -Cys -Ser -Ala - Tyr - 8 9 10 11 12 13 14 D 15 16 Orn(iPr) -Arg -Tyr -Cys -Tyr -Gln -Lys(iPr) - Pro -Pro -), ligação dissulfeto entre Cys4 e Cys11, e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

[28] Em ainda uma outra modalidade preferida da presente invenção, o composto é ciclo (-Tyri-His2-Tyr(Me)3-Cys4-Ser5-Ala6- D 7 8 9 10 11 12 13 14 D 15 16 Tyr(Me) -Orn(iPr) -Arg -Tyr -Cys -Tyr -Gln -Lys(iPr) - Pro -Pro -), ligação dissulfeto entre Cys4 e Cys11, e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

[29] De acordo com a presente invenção, estes peptídeomiméticos podem ser preparados através de um processo, que compreende: (a) copular um suporte sólido apropriadamente funcionalizado com um derivado apropriadamente N-protegido de Pro, que esta no produto final desejado na posição 16; (b) remover o grupo N- protetor a partir do produto assim obtido; (c) copular o produto assim obtido com um derivado N-protegido de DPro, que é o produto final desejado na posição 15; (d) remover o grupo N-protetor a partir do produto obtido no estágio (c); (e) efetuar os estágios correspondendo substancialmente aos estágios (c) e (d) usando derivados apropriadamente N-protegidos de aminoácidos, os quais, no produto final desejado, estão nas posições 14 a 1, e quaisquer grupo(s) funcional(ais), que possam estar presentes nos referidos derivados de aminoácido N- protegido, sendo igualmente apropriadamente protegidos; (f) se desejado, formar uma ponte dissulfeto entre as cadeias laterais dos resíduos Cys na posição 4 e na posição 11; ou, de um modo alternativo, formar a referida ligação antes mencionada subsequentemente ao estágio (i), tal como aqui abaixo descrito; (g) destacar o produto assim obtido a partir do suporte sólido; (h) ciclar o produto clivado a partir do suporte sólido; (i) remover quaisquer grupos protetores presentes nos grupos funcionais de quaisquer membros da cadeia do resíduo de aminoácido; e (j) se desejado, ligar um ou vários grupos isopropila; (k) se requerido, remover quaisquer grupos de proteção presentes nos grupos funcionais de quaisquer membros da cadeia do aminoácido, e (l) se desejado, converter o produto assim obtido em um sal farmaceuticamente aceitável ou converter um sal farmaceuticamente aceitável, ou inaceitável, assim obtido, no composto livre correspondente, ou em um sal diferente, farmaceuticamente aceitável.

[30] Os peptídeomiméticos de β-hairpin desta invenção podem ser produzidos, por exemplo, através do seguimento de um procedimento, que compreende a síntese do peptídeo linear na resina, enquanto que o resíduo(s) de aminoácido contendo um grupo isopropila Orn(iPr) ou Lys(iPr) deverá ser incorporado como um bloco(s) de construção de aminoácido, que está comercialmente disponível ou que foi anteriormente sintetizado; ou um procedimento, que compreende a síntese de um peptídeo linear ou resina através da aplicação de uma estratégia de grupo de proteção ortogonal, enquanto que, por exemplo, todas as cadeias laterais contendo grupo amino de resíduos de aminoácido, que não são considerados como sendo modificados, deverão ser protegidas pelo ivDde, ou os similares, de um modo a que as cadeias laterais contendo o grupo amino de resíduos de aminoácido, protegidas pelos grupos de proteção instáveis a ácido adequados para a estratégia de síntese de peptídeo de fase sólida à base de Fmoc, possam ser derivadas através da copulação de grupos isopropila, em solução, em um estágio muito tardio da cascata de síntese; ou seguindo um procedimento, que compreende uma combinação adequada dos procedimentos antes descritos.

[31] A escolha apropriada do sólido-suporte funcionalizado (isto é, o suporte sólido acrescido da molécula de ligação) e o sítio de ciclação podem desempenhar funções no processo de síntese dos peptídeomiméticos de β- hairpin da invenção.

[32] O suporte sólido funcionalizado é derivado, de um modo conveniente, a partir de poliestireno reticulado com preferivelmente de 1-5%, de divinil benzeno; poliestireno revestido com espaçadores de polietileno glicol (Tentagel®); e resinas de poliacrilamida (D. Obrecht, J. M. Villalgordo, “Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis os Small-Molecular- Weight Compound Libraries”, Tetrahedron Organic Chemistry Series, Vol. 17, Pergamon, Elsevier Science, 1998).

[33] O suporte sólido é funcionalizado por meio de um ligante, isto é, uma molécula espaçadora bifuncional, que contém, em uma extremidade, um grupo de ancoragem para a ligação ao suporte sólido, e do outro lado, um grupo funcional seletivamente clivável, usado para as transformações químicas subsequentes e para procedimentos de clivagem. Para os propósitos da presente invenção, dois tipos de ligações são usadas:

[34] Os ligantes do tipo 1 são designados para liberar o grupo amida sob condições ácidas (H.Rink, Tetrahedron Lett., 1987, 28, 3783-3790). As ligações deste tipo formam amidas do grupo carboxila dos aminoácidos; exemplos de resinas funcionalizadas por meio de tais estruturas de ligante incluem a resina PS 4- [(((2,4-dimetóxi-fenil)Fmoc- aminometil)fenoxiacetamido) aminometil], a resina PS 4- [(((2,4- dimetoxifenil)Fmoc-aminometil)fenóxi-acetamido)aminometil]-4-metil- benzidrilamina (Resina PS MBHA amida Rink), e a resina PS 4- [(((2,4- dimetóxi-fenil) Fmoc-aminometil) fenoxiacetamido) aminometil] benzidrilamina (resina PS BHA amida Rink). De um modo preferido, o suporte é derivado a partir de poliestireno reticulado com, de um modo ainda mais preferido de 1-5%, de divinil benzeno e funcionalizado por meio do ligante 4-(((2,4-dimetoxifenil)Fmoc-aminometil) fenoxiacetamido).

[35] Os ligantes do tipo 2 são designados para liberar eventualmente o grupo carboxila sob condições ácidas. As ligações deste tipo formam ésteres instáveis a ácido com o grupo carboxila dos aminoácidos, de um modo usual benzila instável a ácido, benzidrila e os ésteres tritila; exemplos de tais estruturas de ligante incluem 2-metóxi-4-hidroximetilfenóxi (ligante SasrinR), 4-(2,4-dimetoxifenil-hidroximetil)-fenóxi (ligante Rink), ácido 4-(4-hidroximetil-3-metoxifenóxi) butírico (ligante HMPB), tritila e 2- clorotritila. De um modo preferido, o suporte é derivado a partir de poliestireno reticulado com, de um modo ainda mais preferido 1-5%, de divinil-benzeno e funcionalizado por meio do ligante 2-clorotritila.

[36] Quando executados como sínteses conjuntas paralelas, os processos da invenção podem ser executados, de um modo vantajoso, tal como aqui abaixo descrito, mas deverá ser imediatamente evidente para aqueles versados na técnica como estes produtos terão que ser modificados, no caso em que seja desejado sintetizar um único composto da invenção.

[37] Um número de vasos de reação, igual ao número total de compostos a serem sintetizados através do método paralelo são carregados com de 25 a 1000 mg, preferivelmente 60 mg, do suporte sólido funcionalizado apropriado, de um modo preferido de 1 a 3% de poliestireno reticulado ou de resina Tentagel.

[38] O solvente a ser usado precisa ser capaz de intumescer a resina e inclui, mas não está limitado a, diclorometano (DCM), dimetil formamida (DMF), N-metil pirrolidona (NMP), dioxano, tolueno, tetraidrofurano (THF), etanol (EtOH), trifluoroetanol (TFE), álcool isopropílico e os similares. As misturas de solvente contendo pelo menos um componente solvente polar (por exemplo, 20% de TFE/DCM, 35% de THF/NMP)) são benéficos para assegurar uma alta reatividade e solvação das cadeias de peptídeo ligadas por resina (G. B. Fields, C.G. Fields, J. Am. Chem. Soc., 1991, 113, 4202 - 4207).

[39] Com o desenvolvimento de vários ligantes, que liberam o grupo de ácido carboxílico C-terminal sob condições ácidas brandas, não afetando os grupos funcionais que protegem os grupos instáveis a ácido na(s) cadeia(s) lateral(ais), progressos consideráveis foram efetuados na síntese de fragmentos de peptídeo protegidos. O ligante derivado de 2-metóxi-4-álcool hidroxi benzílico (ligante Sasrin®, Mergler et al., Tetrahedron Lett. 1988, 29 4005 - 4008) é clivável com o ácido trifluoroacético diluído (0,5- 1 % de TFA em DCM) e é estável às condições de desproteção de Fmoc durante a síntese de peptídeo, os grupos de proteção adicionais à base de Boc/tBu sendo compatíveis com este esquema de proteção. Outros ligantes, que são adequados para o processo desta invenção, incluem o ligante 4-(2,4- dimetoxifenil- hidroximetil)- fenóxi instável a super ácido (ligante Rink, H. Rink, Tetrahedron Letters, 1987, 28, 3787-3790), em que a remoção do peptídeo requer 10% de ácido acético em DCM ou 0,2 % de ácido trifluoroacético em DCM; o ligante derivado do ácido 4-(4-hidroximetil-3- metoxifenóxi) butírico (ligante HMPB, Florsheimer & Riniker, Peptides 1991, 1990, 131), que é também clivado com 1 % de TFA/DCM, de um modo a fornecer um fragmento de peptídeo contendo todos os grupos de proteção de cadeia lateral instáveis a ácido; e, em adição, o ligante cloreto de 2-clorotritila (Barlos et al., Tetrahedron Lett. 1989, 30, 3943-3946), que permite o destacamento do peptídeo usando uma mistura do ácido acético glacial/trifluoroetanol/DCM (1:2:7) durante 30 minutos.

[40] Os grupos de proteção adequados para aminoácidos e, respectivamente, para os seus resíduos, são, por exemplo, para o grupo amino (tal como está presente, por exemplo, também na cadeia lateral de lisina ou ornitina). Cbz benziloxicarbonila Boc terc-butiloxicarbonila Fmoc 9-fluorenilmetoxicarbonila Alloc aliloxicarbonila Teoc trimetilililetoxicarbonila Tcc tricloroetoxicarbonila Nps o-nitrofenilsulfonila; Trt trifenilmetila ou tritila ivDde (4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-ilideno)-3-metilbutila - para o grupo carboxila (tal como está presente, por exemplo, na cadeia lateral do ácido glutâmico) através de conversão em ésteres com os componentes do álcool, tBu terc-butila Bn benzila Me metila Ph fenila Pac fenacila alila Tse trimetilsiletila Tce tricloroetila; ivDde (4,4-dimetil-2,6-dioxocicloex-1-ilideno)-3-metilbutila para o grupo guanidino (tal como está presente, por exemplo, na cadeia lateral de arginina) Pmc 2,2,5,7,8-pentametilcromn-6-sulfonila Ts tosila (isto é, p-toluenossulfonila) Cbz benziloxicarbonila Pbf pentametildiidrobenzofuran-5-sulfonila - para o grupo hidróxi (tal como está presente, por exemplo, na cadeia lateral de serina) tBu terc-butila Bn benzila Trt tritila Alloc aliloxicarbonila - e para o grupo mercapto (tal como está presente, por exemplo, na cadeia lateral de cisteína) Acm acetamidometila tBu terc-butila Bn benzila Trt tritila Mtr 4-metoxitritila.

[41] Os derivados do aminoácido protegido com 9-fluorenil metoxicarbonila (Fmoc) são, de um modo preferido, usados como os blocos de construção para a construção de miméticos da alça β-hairpin da invenção. Para a desproteção, isto é, a clivagem do grupo Fmoc, 20% de piperidina em DMF ou 2 % de DBU/2 % de piperidina em DMF podem ser usados.

[42] A ligação dos grupos isopropila às cadeias laterais contendo o grupo amino dos derivados de aminoácido protegidos com 9-fluorenil metoxi carbonila (Fmoc) para formar as cadeias laterais contendo o grupo amino isopropilado dos derivados de aminoácido protegidos com (Fmoc) é conhecida na técnica. O procedimento para a introdução de um grupo isopropila pode ser então efetuado, por exemplo, através da alquilação redutiva, por exemplo, pelo tratamento do grupo amino da cadeia lateral contendo o grupo amino de um bloco de construção de aminoácido, por exemplo, Orn, com acetona, na presença de um agente de redução adequado, tal que, por exemplo, triacetóxi boroidreto de sódio. Os grupos de proteção, tais que, por exemplo, Boc, adequados para as cadeias laterais contendo grupo amino isopropilado dos derivados de aminoácido protegidos com (Fmoc) podem ser introduzidos, por meio de reação subsequente com o dicarbonato de di-terc-butila, na presença de uma base, tal que o bicarbonato de sódio.

[43] A quantidade do reagente, isto é, do derivado de aminoácido, é, de um modo usual, de 1 a 20 equivalentes, com base nos miliequivalentes por grama de carga (meq/g) do suporte sólido funcionalizado (tipicamente de 0,1 a 2, 85 meq/g para resinas de poliestireno) originalmente pesadas no tubo de reação. Equivalentes adicionais de reagentes podem ainda ser usados, se requerido, de um modo a que a reação seja conduzida ao completamente em um período de tempo razoável. As estações de trabalho preferidas (sem, no entanto, estar limitadas a estas) são a estação Combi-chem de Labsource's, Protein Technologies ' Symphony e sintetizador MultiSyn Tech's Syro, o último adicionalmente equipado com uma unidade de transferência e uma caixa de reservatório durante o processo de destacamento do peptídeo linear inteiramente protegido a partir do suporte sólido. Todos os sintetizadores são capazes de prover um ambiente controlado, por exemplo, as reações podem ser executadas em temperaturas diferentes das temperaturas ambientes, assim como sob uma atmosfera de gás inerte, se desejado.

[44] A formação da ligação amida requer a ativação do grupo α- carboxila para o estágio de acilação. Quando esta ativação está sendo executada por meio das carbodiimidas comumente usadas, tais que a dicicloexil carbodiimida (DCC, Sheehan & Hess, J. Am. Chem. Soc., 1955, 77, 1067- 1068) ou diisopropil carbodiimida (DIC, Sarantakis et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1976, 73, 336-342), a dicicloexiluréia resultante e, respectivamente, a diisopropiluréia é insolúvel e, respectivamente, solúvel nos solventes de um modo geral usados. Em ainda uma variação do método de carbodiimida 1-hidroxibenzotriazol (HOBt, Konig & Geiger, Chem Ber., 1970, 103, 788- 798) está incluído como um aditivo à mistura de copulação. O HOBt evita a desidratação, suprime a racemização dos aminoácidos ativados e atua como um catalisador, de um modo a melhorar as reações de copulação morosas. Certos reagentes de fosfônio foram ainda usados como reagentes de copulação diretos, tais que o hexafluorofosfato de benzotriazol- 1-il-oxi-tris (dimetil-amino)-fosfônio (BOP, Castro et al., Tetrahedron Lett., 1975, 14, 1219-1222; Synthesis 1976, 751- 752), ou o hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfônio (Py-BOP, Coste et al., Tetrahedron Lett., 1990, 31, 205-208), ou o tetrafluoroborato de 2-(1H- benzotriazol-1-il-)1,1,3,3-tetrametil urônio (TBTU), ou o hexafluorofosfato (HBTU, Knorr et al., Tetrahedron Lett., 1989, 30, 1927- 1930); estes reagentes de fosfônio são também adequados para a formação in situ de ésteres de HOBt com os derivados de aminoácido protegidos. Mais recentemente, difenoxifosforil azida (DPPA) ou tetrafluoroborato de O-(7-aza-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametilurônio (TATU) ou o hexafluorofosfato de O-(7-aza-benzotriazol-1-il)- N,N, N',N'-tetrametil usrônio (HATU)/7-aza-1-hidroxi benzotriazol (HOAt, Carpino et al., Tetrahedron Lett. 1994, 35, 2279 - 2281) ou tetrafluoroborato de -(6-cloro- 1H-benzotriazol-1-il)-N,N, N',N'-1,1,3,3-tetrametil-urônio (TCTU), ou hexafluorofosfato (HCTU, Marder, Shivo e Albericio: HCTU e TCTU: New Coupling Reagents: Development and Industrial Application, Poster Presentation, Gordon Conference Fevereiro, 2002) foram também usados como reagentes de copulação, assim como o hexafluoro-fosfato de 1,1,3,3-bis (tetrametileno) clorourônio (PyClU, especialmente para a copulação de aminoácidos N-Metilados, J. Coste, E. Frérot, P. Jouin, B. Castro, Tetrahedron Lett. 1991, 32, 1967) ou pentafluorofenil difenil-fosafinato (S. Chen, J. Xu, Tetrahedron Lett., 1991, 32, 6711).

[45] Devido ao fato de que as reações de copulação quase quantitativas são essenciais, é desejável que haja uma evidência experimental quanto ao completamento das reações. O teste de ninidrina (kaiser et al., Anal. Biochemistry, 1970, 34, 595), em que uma resposta colorimétrica positiva a uma alíquota de peptídeo ligado por resina indica qualitativamente a presença da amina primária, pode ser efetuado de um modo fácil e rápido após cada estágio de copulação. A química de Fmoc permite a detecção espectofotométrica do cromóforo Fmoc quando ele é liberado com a base (Meienhofer et al., Int. J. Peptide Protein Res., 1979, 13, 35-42).

[46] O intermediário ligado por resina dentro de cada vaso de reação é lavado livre de excesso de reagentes retidos, de solventes, e de subprodutos, através da exposição repetitiva a solvente (s) puro(s) por um ou dois dos métodos que se seguem: 1) Os vasos de reação são enchidos com solvente (preferivelmente 5 ml), agitados durante de 5 a 300 minutos, e de um modo preferido durante 15 minutos, e então drenados para que o solvente seja expelido; 2) Os vasos da reação são então enchidos com solvente (preferivelmente 5 ml) e drenados ao interior de um vaso receptor, tal que um tubo ou frasco de teste.

[47] Ambos os procedimentos de lavagem acima são repetidos até cerca de 50 vezes (preferivelmente cerca de 10 vezes), monitorando a eficiência do reagente, solvente, e a remoção de subproduto através de métodos, tais que TLG, CG, ou inspeção das lavagens.

[48] O procedimento acima descrito de reação do composto ligado por resina com reagentes dentro dos tubos de reação, seguido pela remoção de reagentes em excesso, subprodutos e solventes, é então repetido com cada transformação sucessiva, até que o peptídeo linear inteiramente protegido ligado por resina tenha sido obtido.

[49] Antes que este peptídeo linear inteiramente protegido tenha sido destacado a partir do suporte sólido, uma ponte de dissulfeto entre Cys4 e Cys11 pode ser formada.

[50] Para a formação de uma ponte dissulfeto, de um modo preferido, uma solução de 10 equivalentes de solução de iodo é aplicada em DMF ou em uma mistura de CH2Cl2 /MeOH durante 1,5 horas, o que é então repetido durante outro período de 3 horas com uma solução de iodo fresca, após a filtração da solução de iodo, ou em uma mistura de DMSO e de solução de ácido acético, tamponada com 5% de NaHCO3 a um pH de 5-6 durante 4 horas, ou em água, após o ajuste para o pH 8 com solução de hidróxido de amônio, através de agitação durante 24 horas, ou ainda em uma solução de NMP e de tri-n-butil fosfina (preferivelmente 50 eq.).

[51] De um modo alternativo, a formação da ponte dissulfeto entre Cys4 e Cys11 pode ser então executada subsequentemente ao método de elaboração 2), tal como aqui abaixo descrito, através de agitação do peptídeo bruto inteiramente desprotegido e ciclado, durante 24 horas, em água contendo DMSO em até 15%, em volume, tamponado com 5% de NaHCO3 a um pH de 5-6, ou tamponado com acetato de amônio a um pH de 7-8, ou ajustado com hidróxido de amônio a um pH de 8. Seguindo-se à evaporação 4 5 6 7 8 9 10 até a secura, ciclo (-Tyr - His -Xaa -Cys -Ser -Ala -Xaa -Xaa -Arg -Tyr - 11 12 13 14 D 15 16 4 Cys -Tyr -Xaa -Xaa - pro -Pro -), a ligação dissulfeto entre Cys e Cys11 é então obtida como o produto final.

[52] O destacamento do peptídeo linear inteiramente protegido a partir do suporte sólido é então alcançado através da exposição da resina carregada com uma solução do reagente usado para a clivagem (de um modo preferido de 3 a 5 ml). O controle da temperatura, agitação, e monitoração da reação são então implementados, tal como acima descrito. Através de uma unidade de transferência, os vasos da reação são então conectados com uma caixa de reservatório contendo tubos de reservatório, de um modo a coletar eficientemente as soluções do produto clivadas. As resinas remanescentes nos vasos de reação são então lavadas de 2 a 5 vezes, tal como acima, com de 3 a 5 ml de um solvente apropriado, de um modo a extrair (eliminar) tanto dos produtos destacados quanto possível. As soluções do produto assim obtidas são então combinadas, tendo-se cuidado para que seja evitada a misturação cruzada. As soluções/extratos individuais são então manipulados, tal como necessário, de um modo a que os produtos finais sejam então isolados. As manipulações incluem, mas não estão limitadas à, evaporação, concentração, extração de líquido/líquido, acidificação, basificação, neutralização ou reações adicionais em solução.

[53] As soluções contendo os derivados de peptídeo inteiramente protegidos lineares, que foram clivados a partir do suporte sólido e neutralizados com uma base, são então evaporadas. A ciclação é então efetuada em solução, usando solventes, tais que DCM, DMF, dioxano, THF e os similares. Vários agentes de copulação, que foram precedentemente mencionados, podem ainda ser usados para a ciclação. A duração da ciclação é de cerca de 6-48 horas, de um modo preferido de cerca de 16 horas. O progresso da reação é seguido, por exemplo, por RP-HPLC (Cromatografia Líquida de Alto Desempenho de Fase Reversa). Então o solvente é removido por meio de evaporação, o derivado de peptídeo cíclico inteiramente protegido é dissolvido em um solvente, que não é miscível com a água, tal que DCM, e a solução é extraída com água ou com uma mistura de solventes miscíveis em água, de um modo a que seja removido qualquer excesso do reagente de copulação.

[54] Finalmente, o derivado de peptídeo inteiramente protegido é tratado com 95% de TFA, 2,5% de H2O, 2,5% de TIS ou ainda uma outra combinação de agentes de varredura, de um modo a que seja efetuada a clivagem dos grupos de proteção. O período de tempo da reação de clivagem é comumente de 30 minutos a 12 horas, e de um modo preferido de cerca de 2,5 horas.

[55] De um modo alternativo, o destacamento e a completa desproteção do peptídeo inteiramente protegido a partir do suporte sólido pode ser alcançada manualmente em vasos de vidro.

[56] Após a desproteção completa, por exemplo, os métodos que se seguem podem ser usados para a elaboração adicional: 1) As substâncias voláteis são evaporadas até a secura e o peptídeo bruto é dissolvido em 20% de AcOH em água e extraído com éter isopropílico ou ainda com outros solventes, que sejam adequados para isto. A camada aquosa é então coletada e evaporada até a secura, e o peptídeo 456 7 8 inteiramente desprotegido, ciclo(-Tyr -His -Xaa -Cys -Ser -Ala -Xaa -Xaa - dietílico a preferivelmente 0°C, o sólido é lavado em até cerca de 10 vezes, de um modo preferido 3 vezes, secado, e o peptídeo inteiramente desprotegido, 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ciclo(-Tyr -His -Xaa -Cys -Ser -Ala -Xaa -Xaa -Arg -Tyr -Cys -Tyr - 13 14 D 15 16 4 11 Xaa -Xaa - Pro -Pro -), ligação dissulfeto entre Cys e Cys , é obtido como o produto final, se uma ligação dissulfeto entre Cys4 e Cys11 tiver sido formada sobre o suporte sólido, tal como aqui acima descrito.

[57] Se a estratégia do grupo de proteção ortogonal acima mencionado para a introdução de um ou mais grupos isopropila em solução tiver sido seguida, então todos os grupos amino das cadeias de resíduos de aminoácido estão ainda protegidas por grupos de proteção instáveis a não ácido, enquanto que os grupos amino de resíduos de aminoácido primeiramente protegidos por grupos de proteção instáveis a ácido terão sido liberados neste estágio da cascata de síntese. Deste modo, é possível, de desejado, copular um grupo isopropila. De um modo preferido o ivDde ou os similares são grupos de proteção estáveis a ácido para cadeias laterais contendo grupo amino, que devem ser mantidas não modificadas durante a copulação de grupos isopropila a grupos amino liberados. Esta copulação pode ser então efetuada através da aplicação, por exemplo, de uma alquilação redutiva usando acetona, na presença de um agente de redução adequado, tal que, por exemplo, o ciano boroidreto de sódio. Deste modo, por exemplo, o peptídeo é dissolvido em MeOH (4,4 mM) contendo ácido acético (0,2 M). Após a adição de um excesso de acetona (780 eq.), a mistura da reação é então completada com uma solução de ciano boroidreto de sódio em MeOH (0,6 M; 1,3 eq. por grupo isopropila desejado a ser introduzido) e vigorosamente agitada em temperatura ambiente. Seguindo-se ao completamento da conversão monitorada através de LC-MS, a água é adicionada e os solventes são então evaporados. O sólido residual contendo o peptídeo é dissolvido em DMF (0,01 M) e uma solução de 5% de hidrazina em DMF é então utilizada para finalmente remover os grupos de proteção de ivDde.

[58] Tal como precedentemente mencionado, é deste modo possível, se desejado, converter o produto cíclico inteiramente desprotegido assim obtido em um sal farmaceuticamente aceitável ou converter um sal farmaceuticamente aceitável ou inaceitável, obtido deste modo, no composto livre correspondente ou em um sal diferente, farmaceuticamente aceitável. Qualquer uma destas operações pode ser ainda executada através dos métodos bem conhecidos na técnica.

[59] Os peptídeomiméticos de β-hairpin da invenção podem ser ainda usados em uma ampla faixa de aplicações, de um modo a que sejam evitadas as infecções por HIV em indivíduos saudáveis e de um modo a retardar ou a deter a progressão viral em pacientes infectados, ou em que o câncer é mediado ou resultante a partir da atividade do receptor de CXCR4, ou em que as doenças imunológicas são mediadas ou resultantes a partir da atividade do receptor de CXCR4; ou ainda estes peptídeomiméticos de β- hairpin podem ser usados para tratar a imunossupressão, ou eles podem ser ainda usados durante as coletas de aferese de células-tronco sanguíneas periféricas e/ou como agentes, de um modo a induzir a mobilização de células-tronco para regular o reparo do tecido.

[60] Os peptídeos de β-hairpin da invenção podem ser administrados per se ou podem ainda ser aplicados como uma formulação apropriada, junto com veículos, diluentes ou excipientes bem conhecidos na técnica.

[61] Quando usados para tratar ou para evitar infecções de HIV ou câncer, tais que o câncer de mama, câncer cerebral, câncer de próstata, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer pulmonar, câncer renal, neuroblastoma, câncer ovariano, câncer endometrial, tumor da célula germinal, câncer ocular, mieloma múltiplo, câncer pancreático, câncer gástrico, rabdomio-sarcoma, melanoma, leucemia lifomfocítica crônica, leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda, mieloma múltiplo e linfoma Não Hodgkin's; metástase, angiogênese, e tecidos hematopoiéticos; ou distúrbios inflamatórios, tais que a asma, rinite alérgica, doenças de hipersensibilidade pulmonar, pneumonite de hipersensibilidade, penumonias eosinofílicas, hipersensibilidade do tipo retardado, doença pulmonar intersticial (ILD), fibrose pulmonar idiopática, ILD associada com a artrite reumatoide, lupus eritematoso sistêmico, espondilite anquilosante, esclerose sistêmica, síndrome de Sjogren, anafilaxia sistêmica ou respostas de hipersensibilidade, alergias à droga, artrite reumatoide, artrite psoriática, esclerose múltipla, mal de Alzheimer, mal de Parkinson, aterosclerose, miastenia grave, diabetes de início juvenil, glomerulonefrite, tioridite autoimune, rejeição de enxerto, que inclui a rejeição de aloenxerto ou a doença de enxerto-contra-hospedeiro, doenças intestinais inflamatórias e dermatoses inflamatórias; ou para tratar doenças oculares, tais que o glaucoma, retinopatia diabética, e a degeneração macular relacionada à idade ; ou para tratar o derrame isquêmico focal, isquemia cerebral global, enfarte do miocárdio, isquemia do membro posterior ou isquemia periférica; ou para tratar o dano ao fígado, rins ou pulmões; ou para tratar a imunossupressão, incluindo a imunossupressão induzida pela quimioterapia, terapia por radiação ou rejeição de enxerto/transplante, os peptídeomiméticos de β- hairpin de acordo com a invenção podem ser ainda administrados de um modo isolado, ou como misturas de vários peptídeomiméticos, em combinação com outros agentes anti-HIV, ou com agentes antimicrobianos ou com agentes anticâncer, ou com agentes anti-inflamatórios, ou em combinação com outros agentes farmaceuticamente ativos. Os peptídeomiméticos de β-hairpin de acordo com a invenção podem ainda ser administrados per se ou como composições farmacêuticas.

[62] As composições farmacêuticas, que compreendem os peptídeomiméticos de β-hairpin de acordo com a invenção podem ainda ser manufaturados por meio de misturação convencional, dissolução, granulação, produção de comprimido revestido, levigação, emulsificação, encapsulação, retenção ou processos de liofilização. As composições farmacêuticas podem ainda ser formuladas de um modo convencional usando um ou mais veículos fisiologicamente aceitáveis, diluentes, excipientes ou auxiliares, que facilitam o processamento dos peptídeomiméticos de β-hairpin ativos sob a forma de preparações, que podem ser usadas farmaceuticamente. A formulação apropriada depende do método de administração selecionado.

[63] Para a administração tópica, os peptídeomiméticos de β- hairpin da invenção podem ser ainda formulados como soluções, géis, unguentos, cremes, suspensões, pós, etc., tal como é bem conhecido na técnica.

[64] As formulações sistêmicas incluem aquelas designadas para a administração por meio de injeção, por exemplo, de injeção subcutânea, intravenosa, intramuscular, intratecal ou intraperitonial, do mesmo modo que aquelas designadas para a administração transdérmica, transmucosal, oral ou pulmonar.

[65] Para as injeções, os peptídeomiméticos de β-hairpin da invenção podem ainda ser formulados em soluções adequadas, de um modo preferido em tampões fisiologicamente compatíveis, tais que a solução de Hink, solução de Ringer, ou solução salina fisiológica tamponada. As soluções podem ainda conter agentes inflamatórios, tais que os agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão. De um modo alternativo, os peptídeomiméticos de β-hairpin da invenção podem estar ainda em forma de pó para a combinação com um veículo adequado, por exemplo água isenta de pirogênio estéril, antes do uso.

[66] Para a administração através da mucosa, os agentes de penetração apropriados para a barreira a ser permeada são usados na formulação, tal como é conhecido na técnica.

[67] Para a administração oral, os compostos podem ser prontamente formulados através da combinação dos peptídeomiméticos de β- hairpin ativos da invenção com veículos farmaceuticamente aceitáveis, bem conhecidos na técnica. Tais veículos permitem ainda com que os peptídeomiméticos de β-hairpin da invenção sejam formulados como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões, pós, etc. Para a ingestão oral por um paciente a ser tratado. Para as formulações orais, tais que, por exemplo, pós, cápsulas e comprimidos, os excipientes adequados incluem cargas, tais que açúcares, tais que lactose, sacarose, manitol e sorbitol; preparações de celulose, tais que o amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanto, metil celulose, hidroxipropilmetil celulose, carboximetil celulose de sódio, e/ou polivinil pirrolidona (PVP); agentes de granulação; e agentes de ligação. Se desejado, agentes de desintegração podem ser ainda adicionados, tais que as polivinil pirrolidonas reticuladas, ágar, ou ácido algínico ou um sal do mesmo, tal que o alginato de sódio. Se desejado, as formas de dosagem sólidas podem ser ainda revestidas com açúcar ou revestidas entericamente por meio do uso de técnicas convencionais.

[68] Para as preparações líquidas orais, tais que, por exemplo, suspensões, elixires e soluções, veículos adequadas, os excipientes ou diluentes incluem água, glicóis, óleos, alcoóis, etc.. Em adição, agentes aromatizantes, conservantes, agentes de coloração e os similares podem ser ainda adicionados.

[69] Para a administração bucal, a composição pode ainda assumir a forma de comprimidos, pastilhas, etc., formuladas de um modo usual.

[70] Os compostos podem ser ainda formulados sob a forma de composições retais ou vaginais, tais que os supositórios, junto com as bases de supositório apropriadas, tais que a manteiga de cacau ou ainda outros glicerídeos.

[71] Em adição às formulações acima descritas, os peptídeomiméticos de β-hairpin da invenção podem ser ainda formulados como preparações de depósito. Tais formulações de longa duração podem ser ainda administradas através da implantação (por exemplo, por via subcutânea ou intramuscular) ou através de injeção intramuscular. Para a manufatura de tais preparações de depósito, os peptídeomiméticos de β-hairpin de acordo com a invenção podem ser ainda formulados com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou como resinas de troca iônica, ou como sais fracamente solúveis.

[72] Em adição, outros sistemas de distribuição farmacêutica podem ser empregados, tais que os lipossomas e emulsões bem conhecidos na técnica. Certos solventes orgânicos, tais que o sulfóxido de dimetila, podem ser também empregados. De um modo adicional, os peptídeomiméticos de β- hairpin da invenção podem ser fornecidos por meio do uso de um sistema de liberação sustentada, tais que as matrizes semipermeáveis de polímeros sólidos contendo o agente terapêutico (por exemplo, para pontes revestidas). Vários materiais de liberação sustentada estão bem estabelecidos e são bem conhecidos daqueles versados na técnica. As cápsulas de liberação sustentada podem, dependendo de sua natureza química, liberar os compostos durante algumas poucas semanas a até mais do que 100 dias. Dependendo da natureza química e da estabilidade biológica do agente terapêutico, podem ser ainda empregadas estratégias adicionais para a estabilização da proteína.

[73] Como os peptídeomiméticos de β-hairpin da invenção contêm resíduos carregados, eles podem ser ainda incluídos em qualquer uma das formulações acima descritas, como tais, ou como sais farmaceuticamente aceitáveis. Os sais farmaceuticamente aceitáveis tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos e outros solventes próticos, do que as formas livres correspondentes. Os sais farmaceuticamente aceitáveis particularmente adequados incluem os sais com ácidos carboxílico, fosfônico, sulfônicos e sulfâmicos, por exemplo, o ácido acético, ácido propiônico, ácido octanóico, ácido decanóico, ácido dodecanóico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido adípico, ácido pimélico, ácido subértico, ácido azelaico, ácidomálico, ácido tartárico, ácido cítrico, aminoácidos, tais que o ácido glutâmico ou o ácido aspártico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido metil maleico, ácido cicloexano carboxílico, ácido adamantano carboxílico, ácido benzóico, ácido salicílico, ácido 4-aminbo salicílico, ácido ftálico, ácido fenil acético, ácido mandélico, ácido cinâmico, ácido metano- ou etano- sulfônico, ácido 2-hidroxietano sulfônico, ácido etano-1,2-dissulfônico, ácido benzeno sulfônico, ácido 2-naftaleno sulfônico, ácido 1,5-naftaleno dissulfônico, ácido 2-, 3- ou 4-metil- benzeno sulfônico, ácido metil sulfúrico, ácido etil sulfúrico, ácido dodecil sulfúrico, ácido N- cicloexil sulfâmico, ácido N-metil-, N-etil- ou N-propil- sulfâmico, e ainda outros ácidos protônicos orgânicos, tais que o ácido ascórbico. Os ácidos inorgânicos adequados são, por exemplo, os ácidos hidroálicos, tais que o ácido clorídrico, o ácido sulfúrico e o ácido fosfórico.

[74] Os peptídeomiméticos da invenção, ou composições dos mesmos, serão usados, de um modo geral, em uma quantidade efetiva para que seja alcançado o propósito intencionado. Deve ser ainda entendido que a quantidade usada irá depender de uma aplicação particular.

[75] Para a administração tópica para tratar ou evitar as infecções de HIV, uma dose terapeuticamente efetiva pode ser determinada por meio do uso, por exemplo, de ensaios in vitro providos nos exemplos. O tratamento pode ser aplicado enquanto a infecção de HIV está visível, ou até mesmo quando ela não está visível. Um perito versado na técnica ordinário será capaz de determinar as quantidades terapeuticamente efetivas para tratar infecções de HIV tópicas, sem a experimentação indevida.

[76] Para a administração sistêmica, uma dose terapeuticamente efetiva pode ser inicialmente estimada a partir de ensaios in vitro. Por exemplo, uma dose pode ser formulada em modelos animais, de um modo a que seja alcançada uma faixa de concentração peptídeomimética de β-hairpin circulante, que inclui a IC50, tal como determinado na cultura celular. Uma tal informação pode ser ainda usada, de um modo a determinar, de um modo ainda mais acurado, as doses úteis em seres humanos.

[77] As doses iniciais podem ser determinadas a partir de dados in vivo, por exemplo, a partir de modelos de animais, através do uso de técnicas que são bem conhecidas na técnica. Aquele de habilidade ordinária na técnica poderia prontamente otimizar a administração a seres humanos, com base em dados de animais.

[78] As quantidades de dosagem para aplicações como agentes anti-HIV podem ser ajustadas de um modo individual para prover os níveis de plasma dos peptídeomiméticos de β-hairpin da invenção, que são suficientes para que seja mantido o efeito terapêutico. Os níveis de soro terapeuticamente ativos podem ser alcançados através da administração de múltiplas doses a cada dia.

[79] Em casos de administração local ou de absorção seletiva, a concentração local efetiva dos peptídeomiméticos de β-hairpin da invenção pode não estar relacionada à concentração de plasma. Aquele de habilidade ordinária na técnica será capaz de otimizar as dosagens locais terapeuticamente efetivas, sem a experimentação indevida.

[80] A quantidade de peptídeomiméticos de β-hairpin administrada irá, de fato, depender do paciente sendo tratado, do peso do paciente, da severidade da aflição, do modo de administração e do julgamento do médico clínico.

[81] A terapia anti-HIV pode ser repetida, de um modo intermitente, enquanto as infecções são detectáveis, ou até mesmo quando elas não são detectáveis. A terapia pode ser ainda provida de um modo isolado ou em combinação com outras drogas, tais que, por exemplo, outros agentes anti-HIV ou agentes anticâncer, ou ainda outros agentes antimicrobianos.

[82] Normalmente, uma dose terapeuticamente efetiva dos peptídeomiméticos de β-hairpin aqui descritos irá prover um benefício terapêutico, sem causar uma toxicidade substancial.

[83] A toxicidade dos peptídeomiméticos de β-hairpin da invenção pode ser ainda determinada por meio de procedimentos farmacêuticos convencionais, em culturas celulares de animais experimentais, por exemplo, através da determinação da LD50 (a dose letal para 50% da população) ou a LD100 (a dose letal para 100% da população). A razão da dose entre o efeito tóxico e terapêutico é o índice terapêutico. Os compostos, que exibem altos índices terapêuticos são preferidos. Os dados obtidos a partir destes ensaios de cultura celular e de estudos de animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem, que não seja tóxica para o uso em seres humanos. A dosagem dos peptídeomiméticos de β-hairpin da invenção está situada, de um modo preferido, dentro de uma faixa de concentrações circulantes, que incluem a dose efetiva com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode ainda variar dentro de uma faixa, que depende da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. A formulação exata, a via de administração e a dose podem ser então selecionadas pelo médico individual, tendo em vista a condição do paciente (vide, por exemplo, Fingl et al., 1975, Em : The Pharmacological Basis of Therapeutics, Cap. 1, pág. 1).

[84] A presente invenção pode também incluir compostos, que são idênticos aos compostos da fórmula geral ciclo(-Tyr1-His2-Xaa3-Cys4-Ser5- 6 7 8 9 10 11 12 13 14 D 15 16 Ala -Xaa -Xaa -Arg -Tyr -Cys -Tyr -Xaa -Xaa - Pro -Pro -), ligação dissulfeto entre Cys4 e Cys11, exceto pelo fato de que um ou mais átomos são substituídos por um átomo tendo um número de massa atômica ou massa diferente do número de massa atômica ou massa usualmente encontrado na natureza, por exemplo os compostos enriquecidos em 2H (D), 3H, 11c, 14c, 129I, etc. Estes análogos isotópicos e os seus sais e formulações farmacêuticos são considerados agentes úteis na terapia e/ou diagnóstico, por exemplo, mas não limitados a, enquanto que um ajuste fino do período de tempo de meia vida in vivo conduz a um regime de dosagem otimizado.

[85] Os Exemplos que se seguem ilustram a presente invenção, mas não devem ser construídos de um modo a que o seu escopo seja limitado, de modo algum. Exemplos 1. Síntese de Peptídeo Copulação do primeiro resíduo de aminoácido protegido à resina

[86] 1 g (1,4 mMOl) de resina de cloreto de 2-clorotritila (1,4 mMOl/g; malha 100- 200, matriz de polímero de copoli(estireno- 1 % de DVB); Barlos et al. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 3943- 3946) foi enchida ao interior de um frasco seco. A resina foi suspensa em CH2Cl2 (5 ml) e deixada intumescer em temperatura ambiente, sob agitação constante, durante 30 minutos. Uma solução de 0,98 mMol (0, 7 eq.) do primeiro resíduo de aminoácido adequadamente protegido (vide abaixo) em CH2Cl2 (5 ml), misturada com 960 μl (4 eq.) de di-isopropiletil amina (DIEA) foi então adicionada. Após a agitação da mistura da reação durante 4 horas a 25°C, a resina foi filtrada e lavada sucessivamente com CH2Cl2 (1x), DMF (1x) e CH2Cl2 (1 x). Uma solução de CH2Cl2/MeOH/DIEA (17/2/1, 10 ml) foi então adicionada à resina e a suspensão foi então agitada durante 30 minutos. Após a filtração, a resina foi então lavada, na ordem que se segue, com CH2Cl2 (1x), DMF (1 x), CH2Cl2 (1x), MeOH (1 x), CH2Cl2 (1 x), MeOH (1 x), CH2Cl2 (2x), Et2O (2 x) e secada, sob vácuo, durante 6 horas.

[87] A carga foi, de um modo típico, de 0,6-0,7 mMol/g.

[88] A seguinte resina pré-carregada foi preparada: Resina Fmoc-Pro-2-clorotritila

[89] A síntese foi executada com o emprego de um sintetizador de peptídeo Syro (MultiSyn Tech) por meio do uso de 24-96 vasos de reação. Em cada vaso, 0,04 mMol da resina acima foram colocados e a resina foi intumescida em CH2Cl2 e DMF durante 15 minutos, respectivamente. Os ciclos de reação que se seguem foram então programados e executados.

[90] O estágio 4 foi repetido uma vez.

[91] A não ser que indicado de um outro modo, a copulação final de um aminoácido foi seguida pela desproteção de Fmoc através da aplicação dos estágios 1-3 do ciclo de reação acima descrito. Sínteses de bloco de construção de aminoácidos Síntese de Fmoc-Orn (iPr, Boc)-OH

[92] A síntese do ácido (2S)-Nα-fluorenilmetoxilcarbonil-Nro,Nro- terc-butiloxicarbonil- isopropil-2,5-diamino pentanóico foi efetuada através da suspensão de 15,2 g de Fmoc-Orn-OH*HCl em 150 ml de THF (0,26 M), seguido pela adição de 375 ml de acetona (132 eq.) e 20,6 g de boroidreto de sódio (2,5 eq.). A mistura da reação foi então agitada durante 2 horas e subsequentemente ao completamento da reação (monitorada por LC-MS), foram então adicionados 120 ml de solução de Na2CO3 sat. e 10,2 g de Boc2O (1,2 eq.). Após a agitação durante a noite, a solução de Na2CO3 saturada e de Boc2O foram novamente adicionadas, duas vezes, em porções de acordo com o material de partida remanescente. Seguindo-se ao completamento da introdução de Boc, o hexano foi então adicionado duas vezes, separado e a camada aquosa foi acidificada com Hclaq 5 N (pH = 1) e extraída depois disso, três vezes com acetato de etila. Finalmente, as camadas orgânicas combinadas foram secadas com Na2SO4 e então evaporadas para que o produto fosse obtido como uma espuma branca.

[93] O bloco de construção do aminoácido Fmoc-Lys (iPr, Boc)- OH pode ser correspondentemente sintetizado ou está comercialmente disponível.

[94] Os blocos de construção do aminoácido Fmoc-Tyr(me)-OH e Fmoc-DTyr(Me)-OH estão igualmente comercialmente disponíveis. Ciclação e elaboração de peptídeos ciclados de estrutura principal Clivagem do fragmento de peptídeo inteiramente protegido

[95] Após a síntese ter sido completada, a resina (0,04 mMol) foi suspensa em 1 ml (0,13 mMol, 3,4 eq.) de 1 % de TFA em CH2Cl2 (v/v) durante 3 minutos, filtrada, e o filtrado foi então neutralizado com 1 ml (0,58 mMol, 14, 6 eq.) de 10% de DIEA em CH2Cl2 (v/v). Este procedimento foi então repetido, três vezes, para assegurar que a clivagem fosse completada. O filtrado foi então evaporado até a secura e uma amostra do produto foi inteiramente desprotegida por meio do uso de uma mistura de clivagem contendo 95% de ácido trifluoroacético (TFA), 2,5% de água e 2,5% de tri- isopropil silano (TIS) a ser analisada por HPLC de fase reversa (coluna C18) e ESI-MS, de um modo a que a eficiência de síntese de peptídeo linear fosse monitorada. Ciclação do peptídeo linear

[96] O peptídeo linear inteiramente protegido (0,04 mMol) foi dissolvido em DMF (4 μMol/ml). Então, 30,4 mg (0,08 mMol, 2 eq.) de HATU, 10,9 mg (0,08 mMol, 2 eq.) de HOAt e 28 μl (0,16 mMol, 4 eq.) de DIEA foram adicionados, e a mistura foi então turbilhonada a 25°C durante 16 horas e então subsequentemente concentrada sob alto vácuo. O resíduo foi dividido entre CH2Cl2 e H2O/CH3CN (90/10: v/v). A fase de CH2Cl2 foi então evaporada para fornecer o peptídeo cíclico inteiramente protegido. Desproteção total do peptídeo cíclico

[97] 3 ml da mistura de clivagem contendo 82,5% de ácido trifluoroacético (TFA), 5% de água, 5% de tioanisol, 5% de fenol e 2,5% de etanoditiol (EDT). A mistura foi então deixada em repouso a 25°C, durante 2,5 horas, e depois disso concentrada sob vácuo. Após a precipitação do peptídeo cíclico inteiramente desprotegido em éter dietílico (Et2O) a 0°C, o sólido foi lavado, duas vezes, com Et2O e secado. Formação de ligação de cepa β de dissulfeto e purificação

[98] Após a purificação total, o peptídeo bruto foi dissolvido em tampão de acetato de amônio 0,1 M (1 mg/1 ml, pH = 7-8). DMSO (até 5% em volume) foi adicionado e a solução foi então agitada durante a noite. Seguindo-se à evaporação, o resíduo foi purificado por HPLC de fase reversa preparativo.

[99] Após a liofilização, os produtos foram obtidos como pós brancos e analisados pelo método analítico que se segue: Os períodos de tempo de retenção de HPLC analítico (RT, em minutos) foram então determinados usando uma coluna C18 Ascentis Express, de 50 x 3,0 mm (cod. 53811 U-Supelco) com os seguintes solventes A (H2O + 0,1 % de TFA) e B (CH3CN + 0,1 % de TFA) e o gradiente : 0 -0,05 minutos: 97% de A, 3 % de B; 3,4 minutos: 33% de A, 67 % de B; 3,41- 3,65 minutos: 3 % de A, 97 % de B; 3,66- 3,7 minutos: 97% de A, 3 % de B. Taxa de Fluxo = 1,3 ml/minuto; UV-Vis = 220 nm. Exemplo 1

[100] A resina de partida foi a resina Fmoc-Pro-O-2-clorotritila, que foi preparada como acima descrito. Àquela resina, DP ro, finalmente na posição 15, foi enxertado. O peptídeo linear foi então sintetizado sobre um suporte sólido de acordo com o procedimento acima descrito, na sequência 16 D 15 14 13 12 11 10 9 que se segue: Resina-Pro - Pro - Lys(iPr) -Gln -Tyr -Cys -Tyr -Arg - 8D 7 6 5 4 3 2 1 Orn(iPr) - Pro -Ala -Ser -Cys -Tyr -His -Tyr . Seguindo-se a uma desproteção de Fmoc final, tal como acima descrito, o peptídeo foi então clivado a partir da resina, ciclado, desprotegido e, após a formação da ligação da cepa β de dissulfeto, como acima descrito, purificado como acima indicado.

[101] O período de tempo de retenção de HPLC (minutos) foi então determinado usando o método analítico, tal como acima descrito (pureza de UV [após HPLC preparativo]: 95%; RT: 1,56; [ M + 3 H]/3 = 685, 7). Exemplo 2: A resina de partida foi a resina Fmoc-Pro-O-2, que foi preparada tal como acima descrito. Àquela resina, DPro, finalmente na posição 15, foi enxertado. O peptídeo linear foi sintetizado sobre um suporte sólido, de acordo com o procedimento acima descrito, na sequência que se 16 D 15 14 13 12 11 10 9 segue: Resina-Pro - Pro -Lys (iPr) -Gln -Tyr -Cys -Tyr -Arg - 8D 7 6 5 4 3 2 1 Orn(iPr) - Pro -Ala -Ser -Cys -Tyr(Me) -His -Tyr . Seguindo-se a uma desproteção de Fmoc final, tal como acima descrito, o peptídeo foi então clivado a partir da resina, ciclado, desprotegido e, após a formação da ligação da cepa β de dissulfeto como acima descrito, purificado como acima indicado.

[102] O período de tempo de retenção de HPLC (minutos) foi determinado por meio do uso do método analítico, tal como acima descrito (pureza UV [ após HPLC preparativo]: 95%; RT: 1,7; [ M + 3 H] /3 = 690,4). Exemplo 3: A resina de partida foi a resina Fmoc-Pro-O-2- clorotritila, que foi preparada como acima descrito. Àquela resina, DPro, finalmente na posição 15, foi enxertado. O peptídeo linear foi então sintetizado sobre um suporte sólido, de acordo com o procedimento acima 16 D 15 14 13 descrito, na sequência que se segue: Resina-Pro - Pro -Lys(iPr) -Gln - 12 11 10 9 8 D 7 6 5 4 3 2 1 Tyr -Cys -Tyr -Arg -Dab - Tyr -Ala -Ser -Cys -Ala -His -Tyr . Seguindo- se a uma desproteção de Fmoc final, tal como acima descrito, o peptídeo foi então clivado a partir da resina, ciclado, desprotegido e, após a formação da ligação da cepa β de dissulfeto, como acima descrito, purificado como acima indicado.

[103] O período de tempo de retenção de HPLC minutos) foi determinado por meio do uso de um método analítico, tal como acima descrito (Pureza UV [após HPLC preparativo]: 95%; RT: 1,57; [ M + 3 H]/3 = 658,3). Exemplo 4: A resina de partida foi a resina Fmoc-Pro-O-2- clorotritila, que foi preparada como acima descrito. Àquela resina, DPro, finalmente na posição 15, foi enxertado. O peptídeo linear foi então sintetizado sobre um suporte sólido, de acordo com o procedimento acima 16 D 15 14 13 descrito, na sequência que se segue: Resina-Pro - Pro -Lys(iPr) -Gln - 12 11 10 9 8 D 7 6 5 4 3 2 1 Tyr -Cys -Tyr -Arg -Orn(iPr) - Tyr(Me) -Ala -Ser -Cys -Ala -His -Tyr . Seguindo-se a uma desproteção de Fmoc final, tal como acima descrito, o peptídeo foi então clivado a partir da resina, ciclado, desprotegido e, após a formação da ligação da cepa β de dissulfeto, como acima descrito, purificado como acima indicado.

[104] O período de tempo de retenção de HPLC (minutos) foi determinado por meio do uso de um método analítico, tal como acima descrito (Pureza UV [após HPLC preparativo]: 95%; RT: 1,70; [M + 3 H]/3 = 651,7). Exemplo 5: A resina de partida foi a resina Fmoc-Pro-O-2- clorotritila, que foi preparada como acima descrito. Aquela resina, DPro, finalmente na posição 15, foi enxertado. O peptídeo linear foi então sintetizado sobre um suporte sólido, de acordo com o procedimento acima 16 D 15 14 13 descrito, na sequência que se segue: Resina-Pro - Pro -Lys(iPr) -Gln - 12 11 10 9 8 D 7 6 5 4 3 2 1 I X7T*1 I WQ 1 1 I Vf1V Δ t*(V I IT*T11 1 MT* IO I U1* Δ Qu Pr I VC^ I X7T*-' I—11C^ I X7T*1 Tyr -Cys -Tyr -Arg -Orn(iPr) - Tyr -Ala -Ser -Cys -Tyr -His -Tyr . Seguindo-se a uma desproteção de Fmoc final, tal como acima descrito, o peptídeo foi então clivado a partir da resina, ciclado, desprotegido e, após a formação da ligação da cepa β de dissulfeto, como acima descrito, purificado como acima indicado.

[105] O período de tempo de retenção de HPLC (minutos) foi determinado por meio do uso de um método analítico, tal como acima descrito (Pureza UV [após HPLC preparativo]: 95%; RT: 1,60; [M + 3 H]/3 = 707,4). Exemplo 6: A resina de partida foi a resina Fmoc-Pro-O-2- clorotritila, que foi preparada como acima descrito. Àquela resina, DPro, finalmente na posição 15, foi enxertado. O peptídeo linear foi então sintetizado sobre um suporte sólido, de acordo com o procedimento acima 16 D 15 14 13 descrito, na sequência que se segue: Resina-Pro - Pro -Lys(iPr) -Gln - 12 11 10 9 8 D 7 6 5 4 3 2 Tyr -Cys -Tyr -Arg -Orn(iPr) - Tyr(Me) -Ala -Ser -Cys -Tyr(me) -His - Tyr1. Seguindo-se a uma desproteção de Fmoc final, tal como acima descrito, o peptídeo foi então clivado a partir da resina, ciclado, desprotegido e, após a formação da ligação da cepa β de dissulfeto, como acima descrito, purificado como acima indicado.

[106] O período de tempo de retenção de HPLC (minutos) foi determinado por meio do uso de um método analítico, tal como acima descrito (Pureza UV [após HPLC preparativo]: 95%; RT: 1,83; [M + 3 H]/3 = 717,0). 2. Métodos Biológicos 2.1. Preparação dos peptídeos

[107] Peptídeos liofilizados foram pesados sobre uma Microbalança (Mettler MT5) e dissolvidos em DMSO em uma concentração final de 10 mM . As soluções de material foram então mantidas a + 4°C, protegidas contra a luz. Os ensaios biológicos foram executados sob condições de ensaio tendo menos do que 1 % de DMSO, a não ser que indicado de um outro modo. 2.2. Cultura celular

[108] Células Namalwa (células não aderentes que expressam nativamente CXCR4, ATCC CRL-1432) foram cultivadas em RPMI 1640 acrescido de 10% de FBWS, e pen/estrep. Células HELA foram mantidas em RPMI 1640 acrescido de 10% de FBS, pen/estrep. e L-glutamina 2 mM. Células Cos-7 foram desenvolvidas em um meio DMEM com 4500 mg/ml de glicose suplementada com 10% de FCS, pen/estrep. e L-glutamina 2 mM. Todas as linhagens celulares foram desenvolvidas a 37°C em 5% de CO2. Os meios celulares, suplementos dos meios, PBS-tampão, HEPES, antibiótico/antimicótico, pen/estrep., aminoácido não essencial, L-glutamina, β-mercaptoetano e soro foram adquiridos de Gibco (Pailsey, UK). Todas as substâncias químicas finas foram supridas por Meck (Darmstadt, Alemanha). 2.3. Ensaio quimiotáctico (Ensaio de migração celular)

[109] A resposta quimiotáctica de células Namalwa (ATCC CRL- 1432) a um gradiente de fator derivado de célula estromal 1α (SDF-1) foi medida usando um sistema de quimiotaxia de câmara de Boyden (ChemoTx; Neuroprobe). Neste sistema, a câmara superior de cada reservatório é então separada a partir da câmara inferior contendo o quimioatraente SDF-1 por uma membrana de policarbonato (tamanho de poro de 5 μm). Uma área circular daquela membrana na região que cobre cada reservatório inferior é encerrada por uma máscara hidrofóbica, de um modo a reter a suspensão celular dentro desta área. O sistema foi preparado pela carga dos reservatórios de fundo com alíquotas de 30 μl de meio de quimiotaxia (RPMI 1640 sem vermelho de Fenol + 0,5% de BSA) compreendendo ou diluições seriais apropriadas de peptídeos ou nenhum peptídeo, em combinação com o SDF-1 (0,9 nM) ou sem o quimioatraente. A membrana foi então colocada sobre os reservatórios de fundo, e alíquotas de 50 μl de uma suspensão de células Namalwa (3,6 x 106 células/ml) em um meio de quimiotaxia, previamente misturado com o meio de quimiotaxia que compreende ou diluições seriais apropriadas de peptídeos ou nenhum peptídeo, foi distribuído sobre cada uma das regiões hidrofobicamente limitadas da superfície superior da membrana. As células foram deixadas migrar ao interior da câmara de fundo, durante 5 horas, a 37°C, em 5% de CO2. Após este período, a membrana foi então removida e o seu lado de topo foi cuidadosamente enxugado e lavado com PBS, de um modo a eliminar as células não migradas. As células migradas foram então transferidas usando um adaptador de “funil” a uma placa de 96 reservatórios receptora e o número de células foi determinado através do uso do ensaio de proliferação celular CyQuantTM NF (Invitrogen), com base na medição do conteúdo de DNA celular, por meio de ligação de corante fluorescente. Seguindo as orientações do fabricante, 50 μl de tampão de reagente de corante/HBSS CyQuantTM (1/500 [ [v/v] foram então adicionados a cada reservatório da placa de 96 reservatórios receptora acima mencionada. Após a incubação durante 0,5 h, em temperatura ambiente, a placa foi vedada e a intensidade de fluorescência de cada amostra foi então medida através do uso de uma leitora de plana Wallac 1420 VICTOR2TM (Perkin Elmer) com excitação a 485 nm e detecção de emissão a 535 nm. Finalmente, os dados foram normalizados por meio do uso de controles e os valores de IC50 foram então determinado por meio do uso de GraphPad PrismTM (GraphPad) através do ajuste de uma curva logarítmica aos pontos de dados médios. 2.4. Ensaio de citotoxidade

[110] A citotoxicidade dos peptídeos a células HELA (Acc 57) e a células COS-7 (CRL - 1651) foi então determinada por meio do uso de um ensio de redução de MTT (Mossman, J. Immunol. Meth., 1983, 65, 55-63; M. V. Berridge, A. S. Tan, Arch. Biochem. Biophys., 1993, 303, 474-482). Em resumo, o método foi tal como se segue: 4000 células HELA/reservatório e 3400 células COS-7 foram semeadas e desenvolvidas em placas de microtitulação de 96 reservatórios, durante 24 horas, a 37°C, em 5% de CO2. Depois disso, o tempo zero (Tz) foi então determinado por meio de redução de MTT (vide abaixo). O sobrenadante dos reservatórios remanescentes foi então descarregado, e o meio fresco e os compostos em diluições seriais (12,5, 25 e 50 μM, triplicatas; 0 μM, neutro) foram pipetados ao interior dos reservatórios. Após a incubação das células durante 48 horas a 37°C em 5% de CO2, o sobrenadante foi novamente descarregado e 100 μl de reagente MTT (0,5 mg/ml em RPMI 1640 e DMEM, respectivamente/reservatório foram adicionados. Seguindo-se à incubação a 37°C durante 2-4 horas, os meios foram então aspirados e as células foram borrifadas (100 μl de isopropanol/reservatório). A absorção do formazano solubilizado foi então medida a 595 nm (OD595peptídeo). Para cada concentração, as médias foram calculadas a partir de triplicatas. O percentual de crescimento foi então calculado como se segue : (OD595peptídeo-OD595Tz)/(OD595neutro-OD595Tz) x 100%. As concentrações de GI50 (inibição de crescimento) foram então calculadas para cada peptídeo por meio do uso de uma função de linha de tendência para as concentrações (50, 25, 12, 5 e 0 μM), os percentuais correspondentes e o valor 50, (= TREND (C50: C0, %50: %0, 50). 2.5. Hemólise

[111] Os peptídeos foram testados quanto à sua atividade hemolítica contra células de sangue vermelho humano (hRBC). As hRBC frescas foram então lavadas, quatro vezes, com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e centrifugadas, durante 10 minutos, em 3000 x g. Os compostos (100 μM) foram então incubados com 20 % de hRBC (v/v) durante 1 hora, a 37°C, e sob agitação a 300 rpm. A concentração de eritrócito final foi de aproximadamente 0,9 x 109 células/ml. Um valor de 0% e de 100% de lise celular, respectivamente, foi determinado através da incubação de hRBC, na presença de PBS contendo 0,001% de ácido acético e 2,5% de Triton X-100 em H2O,, respectivamente. As amostras foram então centrifugadas, os sobrenadantes foram então diluídos 8 vezes em tampão de Pbs e as densidades ópticas (OD) foram então medidas a 540 nm. O valor de 100% de lises (OD540H2O) forneceu uma OD540 de aproximadamente 0,5- 1,0. A hemólise percentual foi calculada como se segue: (OD540peptídeo/OD540H2O) x 100%. 2.6. Estabilidade do Plasma

[112] A estabilidade dos peptídeos nos plasmas de humanos e de ratos foi determinada pela aplicação do seguinte método: 346.5 μl/ reservatório profundo de plasma humano recém-descongelado (Basler Blutspende-dienst) e plasma de rato (Harlan Sera-Lab, UK), foram, respectivamente, misturadas com 3,5 μl/reservat0rio de uma composto dissolvido em DMSO/ H2O (90/10 [v/v], 1mM, triplicado) e incubado a 37° C em t = 0, 15, 30, 60, 120, 240 e 1440 minutos alíquotas de 50 μl foram transferidas para os reservatórios da placa de filtração contendo 150 μl/reservat0rio de 2% de ácido fórmico em acetonitrila. Em seguida, agitando por 2 minutos as suspensões ocorridas foram filtradas à vácuo. 100 μl de cada filtragem foram transferidas para uma placa de microtitulação de propileno e secas sob N2. Os sólidos residuais foram reconstituídos pela adição de 100 μl/reservat0rio de água/acetonitrila, 95/5 (v/v) + 0,2% de ácido fórmico e analisados por LC/MS como a seguir: Águas, XBridge C18, fases móveis: (A) água + 0.1% ácido fórmico e (B) acetonitrila/água, 95/5 (v/v) + 0,1% ácido fórmico, gradiente: 5%-100% (B) em 1,8 minutos, ionização electrosspray, MRM detecção (quadrupolo triplo). As áreas de pico foram determinadas e são calculados os valores médios dos valores triplicados. A estabilidade é expressa no percentual do valor inicial em t = 0. (tx/t0 x 100). Usando a função TENDÊNCIA do EXCEL (Microsoft Office 2003) T/2 foram determinados. 2.7 Ligação das Proteínas de Plasma

[113] Alíquotas de 495 μl de plasma humano (Basler Blutspendedienst), assim como alíquotas de 495 μl de PBS foram colocadas em reservatórios profundos individuais de uma placa de polipropileno (Greiner) e borrifadas, cada qual, com 5 μl de soluções 1 mM de peptídeos em 90% de DMSO. Após a agitação da placa durante 2 minutos a 600 rpm, alíquotas de 150 μl das misturas de plasma/peptídeo foram então transferidas, em triplicatas, para a placa de filtro de polipropileno (10 kDa, Millipore), enquanto que alíquotas de 150 μl das misturas de PBS/peptídeo foram então transferidas ou para os reservatórios individuais da placa de filtro (controles filtrados) ou diretamente ao interior dos reservatórios individuais da placa receptora (Greiner) (controles não filtrados). O sanduíche de placa, que consiste do filtro e da placa receptora, foi então incubado durante 1 hora a 37°C, e subsequentemente centrifugado a 3220 g durante 2 horas, a 15°C. Os filtrados na placa receptora foram então analisados através de lC/MS, tal como se segue: Coluna: Waters, Xbridge C18, fases móveis: (A) água + 0,1 % de ácido fórmico e (B) acetonitria/água, 95/5 (v/v) + 0,1 % de ácido fórmico, gradiente : 5% - 100% (B) em 1,8 minutos, ionização por eletropulverização, detecção de MRM (quadripolo triplo). As áreas de ico foram então determinadas e foi efetuada a média dos valores em triplicata. A ligação é expressada em percentual dos controles filtrados e não - filtrados por 100- (100 x T1h/Tctr). Finalmente, a média destes valores é calculada.

[114] Os resultados dos experimentos descritos sob 2,3- 2,7 estão indicados nas Tabelas 1, 2, 3 e 4, a seguir. [1] . Estudo Farmacocinético (PK)

[115] Para os compostos dos Ex. 1, Ex. 2, Ex. 3, Ex. 4, Ex. 5 e Ex. 6, foram efetuados estudos farmacocinéticos após a administração intravenosa (i.v).

[116] 30 gramas (± 20% de camundongos CD-1 machos, obtidos a partir de Charles River Laboratories Deutschland GmbH foram usados. O veículo, solução salina tamponada com fosfato, foi então adicionado, de um modo a fornecer uma concentração final de 0,5 mg/ml do composto. O volume foi de 2 ml/kg e o composto foi então injetado, de um modo a fornecer uma dose intravenosa final de 1 mg/kg. Aproximadamente 300- 400 μl de sangue foram então removidas sob anestesia de isoflurano leve, através de perfuração cardíaca, em intervalos de tempo predeterminados (5, 15, 30 minutos e 1, 2, 3, e 4 horas) e então adicionados a tubos heparinizados. O plasma foi removido a partir de células transformadas em pelotas, mediante centrifugação, e então congelado a - 80°C antes da análise de HPLC-MS. Preparação de amostras de estudo de plasma e de calibração de plasma

[117] Alíquotas de 50 μl de cada camundongo cada um dos plasma de camundongos dos animais não tratados (plasma de camundongo “neutro”) foram borrifados com quantidades conhecidas dos compostos dos Ex.1, Ex. 2, Ex. 3, Ex. 4, Ex. 5 e Ex. 6, de um modo a que fossem então obtidas 10 amostras de calibração de plasma para cada composto em uma faixa de 1-4000 ng/ml. Alíquotas de 50 μl de cada plasma de camundongo a partir dos animais tratados foram então usadas como as amostras de estudo Extração de amostras de estudo de plasma e de calibração de plasma

[118] Todas as amostras de plasma foram então borrifadas com um padrão interno apropriado e extraída com acetonitrila contendo 2 % de ácido fórmico. Os sobrenadantes foram então evaporados até a secura, sob nitrogênio, e os sólidos remanescentes foram reconstituídos em água/acetonitrila 95/5 (v/v) + 0,2 % de ácido fórmico. Análise de LC-MS/MS

[119] Os extratos foram analisados através de cromatografia de fase reversa (Acquity BEH C18, 100 x 2,1 mm, coluna de 1,7 μm, Waters para o Ex. 1 e Acquity HSS C18 SB, 100 x 2,1 mm, coluna de 1,8 μm, Waters para os Ex. 2, Ex. 3, Ex. 4, Ex. 5 e Ex. 6) usando as condições que se seguem: Ex. 1, fases móveis: (A) água/acetonitrila 95/5 (v/v) + 0,1 % de ácido fórmico, (B) acetonitrila/água 95/5 (v/v) + 0,1 % de ácido fórmico, gradiente: 1 % (B) 0-0,1 minuto, 15% (B) 0,1 - 2,5 minutos para o Ex. 1 e 1 % (B) 0-0,1 minuto, 40% (B) 0,1 - 2,5 minutos para o Ex. 2, Ex. 3, Ex. 4, Ex. 5 e Ex. 6. A detecção e a quantificação foram executadas por meio de espectroscopia de massa, com a interface de eletropulverização em um modo positivo e a fragmentação seletiva de analitos (espectrômetro de massa 4000 Q Trap, AB Sciex). Avaliação farmacocinética

[120] Os parâmetros de PK foram calculados pelo software WinNonLinTM, versão 5.3 (Pharsight - A CertaraTM Company, Mountain View, CA 994041 USA) usando uma análise de modelo de compartimento único. Os parâmetros de PK foram determinados através de ajuste de quadrados mínimos do modelo para os dados experimentais.

[121] Os resultados dos experimentos descritos em 2.8 estão indicados nas Tabelas 5a e 5b, a seguir. [2] . Cálculos de carga de droga através da manutenção da taxa de dose (taxa de infusão)

[122] A carga de droga para um implante, que compreende um peptídeo da invenção, foi calculada seguindo os princípios básicos em farmacocinética (vide também J. Gabrielsson, D. Weiner, “Pharmacokinetics and pharmaco-dynamics Data Analysis: Concepts and Applications”, 4 a edição, Sewdish Pharmaceutical Press, Estocolmo, Suécia, 2006), pelo que a manutenção da taxa de dose (taxa de infusão, Rin) pode ser definida como a taxa, na qual uma droga deve ser administrada, de um modo a que seja alcançado um estado estável de uma certa dose no plasma. A taxa de dose de manutenção pode ser expressada usando a correlação Rin [g/(h*kg)] = Cliv [L/(h*kg)] x Css,eff [g/L], em que Cliv é a eliminação (i.v. - admin.) e Css,eff é a concentração efetiva da droga no plasma, em um estado estável, considerando uma margem de eficácia A: Css,eff [g/L] = A x (IC50/fu) x MW [ (mol/L) * (g/mol)]. Deste modo, as quantidade total de uma droga carregada em um implante, que provê uma concentração efetiva constante daquela droga no plasma, durante um certo período de tempo em um paciente de um determinado peso corpóreo pode ser então calculada por meio da aplicação da correlação que se segue: Drogacarga [g/paciente] = Rin [ g(h*kg)] x duração [h] x BW [ kg/paciente].

[123] Os resultados dos cálculos descritos em 2.9 estão indicados na Tabela 6 a seguir e são baseados nos dados fornecidos nas Tabelas 1, 4 e 5 b. Além disso, as pré-condições são uma margem de eficácia de A= 3, uma duração do estudo de 672 h (28 dias) e um peso corpóreo de um paciente humano de 70 kg. A taxa de filtração glomerular (GFR), que influencia principalmente a eliminação dos peptídeos, é altamente dependente da espécie. De um modo geral, a GFR de humanos é estabelecida, em média, como sendo de 107 ml (h*kg), comparada à GFR de camundongos, estabelecida como sendo de 840 ml (h*kg). Deste modo, os valores de Cliv- camundongo indicados na Tabela 5b foram escalados alometricamente por 107 ml (h* kg)/840 ml (h* kg) = 0,127 antes empregados nas correlações acima descritas. 3.0. Mobilização de HSC em camundongos

[124] Para os compostos do Ex.1 e Ex. 2, um estudo de mobilização de HSC foi executado, consistindo de um estudo de tempo-resposta, de um modo a verificar o tempo de mobilização máxima após a dosagem e um estudo de dose-resposta subsequente. Estudo de tempo-resposta

[125] Camundongos C57BI/6 machos (Janvier, França ; n = 5 para o Ex. 1, n = 3 para o Ex. 2) receberam injeções i.p. de bolo do Ex. 1 e Ex.2, respectivamente, (5 mg/kg) dissolvidos em 10 μl de água por g de peso de camundongo contendo 0,9 % de NaCl. O sangue foi então extraído a partir do bolso da bochecha ao interior de tubos revestidos com EDTA para os pontos de tempo de 0, 0,5, 1, 2, 4, 6 e 8 horas após a administração. A unidade formadora de colônia nos pontos de cultura (contagens de CFU-C) foram determinados pela execução do ensaio de CFU-C, tal como descrito abaixo. Os resultados do estudo de tempo- resposta para o Ex. 1 e o Ex. 2 estão indicados nas Tabelas 7a e 7b. Estudo de dose-resposta

[126] Camundongos C57BI/6 machos (Janvier, França; n = 5 por grupo de dose para o Ex. 1, n = 3 por grupo de dose para o Ex.2) receberam injeções s i.p. De bolo do Ex. 1 e Ex. 2, respectivamente, em doses de 0,5, 1,5, 5 e 15 mg/kg (composto dissolvido em 10 μl de água por g de peso de camundongo contendo 0,9% de NaCl). O sangue foi coletado como acima descrito no tempo de mobibilização máxima para o Ex. 1 (4 h) e para o Ex. 2 (2 h), respectivamente. Os resultados do estudo de dose-resposta para o Ex. 1 e o Ex. 2 estão indicados nas Tabelas 8a e 8 b. Ensaio de CFU-C

[127] As contagens de CFU-C foram determinadas através da cultura de alíquotas de sangue periférico lisado em um meio de cultura de célula progenitora semissólido convencional. Em resumo, uma quantidade definida de sangue foi lavada com tampão de PBS (Gibco®) contendo 0,5% de albumina de soro bovino, seguido pela lise de células do sangue vermelho em tampão de NH4Cl hipotônico (Sigma) e um segundo estágio de lavagem. A pelota celular foi novamente suspensa em DMEM (Gibco®) contendo 10% de FCS, suspenso em 2 ml de um meio de metil celulose repleto de citoquina, comercialmente disponível para células de murino (Cell Systems, USA) e colocados em placas em duplicata em pratos de cultura celular de 35 mm. O CFU-C foi avaliado após 7- 8 dias de incubação sob condições convencionais (20 % de O2, umidade saturada, 5% de CO2 a 37°C). A celularidade do sangue periférico foi então analisada usando uma máquina de contagem de sangue automatizada (Drew Scientific). Curva de dose-resposta de log10 e ED50

[128] As curvas de dose-resposta de log10 do Ex. 1 e Ex. 2, com base nos valores de CFU/ml para as doses de 1,5, 5 e 15 mg/kg, tal como indicado nas Tabelas 8a e 8b, respectivamente, são apresentadas na Figura 1 e ajustadas usando a função de dose-resposta sigmoidal em GraphPad Prism, versão 5.03. Considerando as progressões de curva de ambos os compostos, as doses-respostas estão restritas a uma dose máxima de 4000 CFU/ml. Os valores de ED50 indicados na Tabela 9 estão, deste modo, correspondendo a uma resposta de 2000 CFU/ml.

Claims (5)

1. Composto peptídico ciclado de estrutura principal, construído a partir de 16 resíduos de aminoácido, caracterizado pelo fato de ter a fórmula: 456 7 8 ciclo(-Tyr -His -Xaa -Cys -Ser -Ala -Xaa -Xaa - 9 10 11 12 13 14 D 15 16 Arg -Tyr -Cys -Tyr -Xaa -Xaa - Pro -Pro -) (I), na qual, Xaa3 é Ala, Xaa7 é DTyr, Xaa8 é Dab, e Xaa13 é Gln; ou Xaa3 é Tyr, Xaa7 é D Pro, Xaa8 é Orn (iPr), e Xaa13 é Gln; ou Xaa3 é Tyr (Me), Xaa7 é DPro, Xaa8 é Orn(iPr), e Xaa13 é Gln; ou Xaa3 é Ala, Xaa7 é D Tyr (Me), Xaa8 é Orn(iPr), e Xaa13 é Gln; ou Xaa3 é Tyr, Xaa7 é DTyr, Xaa8 é Orn(iPr), e Xaa13 é Gln; ou Xaa3 é Tyr(Me), Xaa7 é Dtyr(Me), Xaa8 é Orn(iPr) e Xaa13 é Gln; Tyr(Me) é o ácido (2S)-2-amino-(4-metoxifenil)-3-propiônico, DTyr (Me) é o ácido (2R)-2-amino-(4-metoxifenil)-3- propiônico, ou Dab é o ácido (2S)-2,4-diamino butírico, Orn (iPr) é o ácido (2S)-Nro-isopropil-2,5-diamino pentanóico, e Xaa14 é Lys (iPr), Lys(iPr) é o ácido (2S)-N“- isopropil-2,6- diamino hexanóico, todos os resíduos de aminoácido, que não estão explicitamente designados como resíduos de D-aminoácido, são resíduos de L- aminoácido, e os dois grupos -SH nos dois resíduos L-cisteína Cys4 e Cys11 são substituídos por um grupo -S-S-, em forma livre ou em uma forma de sal farmaceuticamente aceitável.

2. Composto como definido na reivindicação 1 da fórmula I, em forma livre ou em forma de sal farmaceuticamente aceitável, caracterizado pelo fato de ser para o uso como uma substância ativa, de um modo particular como substâncias tendo uma atividade anticâncer, antagonizante de CXCR4 e/ou uma atividade anti-inflamatória e/ou uma atividade de mobilização da célula-tronco.

3. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 da fórmula I, em que em forma livre ou em forma de sal farmaceuticamente aceitável, e um veículo farmaceuticamente inerte, de um modo particular em uma forma adequada para a administração oral, tópica, transdérmica, injetável, bucal ou transmucosal, tal que como um comprimido, drágea, cápsula, solução, líquido, gel, emplastro, creme, unguento, xarope, pasta, suspensão, pó ou supositório.

4. Uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2 da fórmula I, em forma livre ou em forma de sal farmaceuticamente aceitável, para a manufatura de um medicamento caracterizado pelo fato de que o medicamento tem uma atividade anticâncer, antagonizante de CXCR4 e/ou uma atividade anti-inflamatória e/ou uma atividade de mobilização da célula-tronco, de um modo particular para a prevenção de infecções de HIV em indivíduos saudáveis; para retardar ou deter, a progressão viral em um paciente infectado por HIV; para tratar ou para prevenir um câncer ou uma doença imunológica, que é medida por, ou que resulta a partir da atividade do receptor de CXCR4; para o tratamento da imunossupressão; para acompanhar a coleta de aférese de células-tronco do sangue periférico; ou para induzir a mobilização das células-tronco, de modo a regular o reparo do tecido.

5. Processo para a manufatura de um composto como definido em qualquer das reivindicações 1 a 2 da fórmula I, caracterizado pelo fato de que o processo compreende os estágios de: (a) copular um suporte sólido funcionalizado com um aminoácido N- protegido Pro, cujo Pro forma a base do resíduo do aminoácido na posição 16 do composto da fórmula I; (b) remover o grupo N-protetor a partir do produto do estágio (a); (c) copular o produto do estágio (b) com um aminoácido N-protegido DPro, cuja DPro forma a base do resíduo de aminoácido na posição 15 do composto da fórmula I; (d) remover o grupo de N-proteção a partir do produto do estágio (c); (e) adicionar, de um modo análogo àquele descrito nos estágios (c) e (d), cada um dos resíduos de aminoácido desejados nas posições 14 a 1 do composto da fórmula I, um após o outro, ao grupo amino livre do resíduo de aminoácido estando, em cada caso, na extremidade livre da cadeia de peptídeo crescente copulada ao suporte sólido, o aminoácido desejado usado, em cada caso, no estágio de copulação análogo ao estágio (c) sendo N- protegido e qualquer grupo funcional, presente no referido aminoácido desejado, outro que o grupo carbóxi da porção alfa-amino, sendo também protegido; (f) substituir os dois grupos -SH nos dois resíduos Cys no produto do estágio (e) por um grupo -S-S-, a não ser que este grupo -S-S seja formado no estágio (j); (g) destacar o hexadecapeptídeo a partir do suporte sólido; (h) copular o resíduo de aminoácido na posição 1 do hexadecapeptídeo com o resíduo de aminoácido na posição 16 do hexadecapeptídeo; (i) desproteger qualquer grupo funcional protegido, presente no produto do estágio (h); (j) substituir os dois grupos -SH nos dois resíduos Cys no produto do estágio (i) por um grupo -S-S-, a não ser que este grupo -S-S- seja formado no estágio (f); (k) ligar ao produto do estágio (j) um ou mais substituintes de isopropila, se desejado; (l) desproteger quaisquer grupos funcionais protegidos, presentes no produto do estágio (k); e (m) converter um composto da fórmula I em forma livre no composto correspondente da fórmula I em forma de sal farmaceuticamente aceitável, se o produto desejado do processo for um composto da fórmula I em forma de sal farmaceuticamente aceitável, ou converter um composto da fórmula I em uma forma de sal farmaceuticamente aceitável no composto correspondente da fórmula I em forma livre, se o produto desejado do processo for um composto da fórmula I em forma livre, ou no composto correspondente da fórmula I em uma forma de sal farmaceuticamente aceitável diferente, se o produto desejado do processo for um composto da fórmula I em uma forma de sal farmaceuticamente aceitável diferente.

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