JPH03501847A - 抗‐レトロウィルス剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗−レトロウィルス剤 又１上里二Ωｌ及 本出願は、１９８７年１０月１３日に出願された米国特許出１１１Ｔｈ１０８、 １６０の部分継続出願である１９８８年６月６日に出願された米国特許出願阻２ ０３．２８５の部分継続出願であり、上記出願を引用により本明細書に組み入れ る。

導入 ■■ 本発明は、ウィルス蛋白質とＣＤ４との相互作用を妨害するポリペプチドを用い て、細胞表面抗原ＣＤ４を発現する感受性細胞に対するウィルスの効果をｍ節す るための方法に関する。

本発明は特に、ウィルス粒子の感染性及びＣＤ４−依存性レトロウィルスの細胞 変性効果をブロックすることに向けられる。

１里坐冑量 Ｔ細胞は「ヘルパー」及び「サプレッサー」シグナルを介して免疫応答を制御し 、そしてさらに細胞性免疫のエフェクターアームの部分を中介する。ヒトＴリン パ球は最初、ＣＤ４（さらに、Ｔ４又はＬｅｕＳとも称される）及びＣＤ８　（ さらに、Ｔ８又はＬｅｕ２とも称される）命名された相互排他的な細胞表面蛋白 質の発現に基いて２つの機能的に区別される系統に分類された。ＣＤ８を発現す るＴ細胞は主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ制限細胞毒性活性及び非−細 胞毒性抗原特異的サプレッサー機能を仲介し、他方ＣＤ４を発現するＴ細胞は、 Ｂ細胞増殖及び分化、増殖応答のためのヘルパー機能、並びにＣＤ８発現細胞毒 性細胞の分化を誘導する機能を仲介する。

ＣＤ４は５５〜５８ＫＤの糖蛋白質であり、最初に成熟Ｔ細胞のサブセット上に 見出されるＴリンパ球分化抗原として特徴付けられたが、さらに単核貧食系の細 胞上及び時折りの（ａｃｃａｔｉｏ−ｎａｌ）　８９７８球上にも見出される。

Ｔ細胞−標準細胞相互作用におけるＣＤ４分子の意義はモノクローナル抗体を用 いる研究により証明することができる。　ＣＤ４分子の特定のエピトープに対し て向けられた抗体はＭＨＣクラス■制限機能、例えば抗原により誘導されるＴｗ ｌ！胞増殖、リンホカインの放出、ヘルパー細胞機能、及びＣＤ４発現細胞毒性 Ｔ細胞の細胞毒性活性を阻害する。ＣＤ４分子または、レトロウィルス旧ｖ−１ （さらに、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ−１又はＡＲＶとも称される）、すなわち 後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原体、及び他のレトロウィルス、例えば 第二のＡＩＤＳ関連ウィルス旧ｖ−２、及び５ＩＶ（さらに、ＳＴＬシー■と称 され、これはｔｌＴＬＶ−Ｔνと称するウィルスに類似しているか又は同一であ る）のための受容体として役立つ。

ＨＩＶのエンベロープ糖蛋白質の１つ、ｇｐ１２０及びＣＤ４間の相互作用が感 受性細胞に対する感染性ＨＩＶ粒子の結合を基礎付ける。従って、ＣＤ４を発現 する細胞が旧■感染の主たる標的“であり、そして感染された個体におけるウィ ルスの主たる生体内留り場を構成する。　ｇｐ１２０とＣＤ４との間の相互作用 もまたＨＩＶにより誘導される細胞変性に必須的に関与する。

ＨＩＶ感染の臨床的現われの多くがＣＤ４を発現する細胞上のウィルス又はウィ ルス成分の効果による。従って、これらのウィルスによる感染の予防又は治療の ために、ＣＤ４とＣＤ４−依存性レトロウィルスのエンベロープ垢蛋白質との間 の相互作用をブロックすることができる薬物を開発するのが望ましい。

好ましくは、この薬物は、ＣＤ４分子の正常な機能に影響を与えることなく　Ｃ Ｄ４とウィルス蛋白質との間の相互作用をブロックするであろう。

舅１」」（」１敗 ヒトにおける２種類の主要な機能的に区別されるＴ細胞サブセットが定義されて いる。ＣＤｄ＋細胞ＭＨＣクラス■決定基を認識し、他方ＣＤＢ＋細胞はＭＨＣ クラスＩ決定基を認識する［Ｅｎｇｌｅｗａｎ　ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　（ １９８１）　１２７：２１２４−２１２６］。Ｒａｏら、Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、（１９８３）　８０：３１０−３１９は、モノクローナル抗体を 用いて、ＣＤ４抗原の５個のエピトープをＣＤｄ＋サブセットのヒトＴ細胞上で 区別することができた。ＣＤ４分子は免疫系において細胞間の種々の重要な免疫 調節的相互作用に関与する。

Ｍａｄｄｏｎら［Ｃｅ１ｌ（１９８５）　４２：９３−１０４］はＣＤ４蛋白質 をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を単離しそして得た。Ｔリンパ球に加 えて、抗−ＣＤ４モノクローナル抗体は、循環中の単球、組繊・マクロファージ 及び皮膚のランガーハンス（Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ）細胞を含めて、単球／マク ロファージ系のヒト細胞の表面に結合する。隅ｏｄら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、 　（１９８３）　１３１　：２１２−２１６゜ヒトＴリンパ球上及び単球上のＣ Ｄ４抗原は区別することができる。

Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　（１９８６）　１３６：３７７３ −３７７８゜Ｂａｎｋら　［Ｌ」ニジ１１工（１９８５）　１６２　：１２９４ −１３０３］は、幾つかの条件下でＣＤ４分子がＴ細胞活性化を阻害する負シグ ナルの独立のトランスデユーサ−として機能し得ることを開示した。ある条件下 でＣＤ４は、抗原受容体依存性細胞活性化を促進するためにＴ細胞抗原受容体と 協力して作用して役割を演することができる。　Ｓｌｅｃｋｍａｎら、Ｎａｔｕ ｒｅ（１９８７）３２８：３５１−３５３；ＲｏｓｏｆｆＮａｔ　１．Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９８７）８４：９２０９−９２１３゜）１１Ｖ−１はＣＤ ４＋Ｔ細胞に対して選択的向性（ｔｒｏｐｉｓ＋＋＋）を有する。Ｋｌａｔｚｍ ａｎｎ　ら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２５：５９−６３゜ＳＩＶ及びＨＩ Ｖ−２のＣＤ４向性も報告されている。Ｋａｎｋｉ　ら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９ ８５）２３１：９５１−９５４；Ｋｏｒｎｆｅｌｄ　ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８ ７）３２６：６１０−６１３；Ｈｉｒｓｃｈら、Ｃｅ１ｌ　（１９８７）　４９ ：３０７−３１９；Ｇｕｙａｄｅｒら、Ｎａｔａｒｅ（１９８７）譚胆：６６２ −６６９゜Ｔリンパ球上のＣＤ４分子はＨＩＶ−１ウイルスの受容体として挙動 する。Ｋ１ａｔｚｎ＋ａｎｎら、Ｎａｔａｒｅ（１９８５）３１２ニア６アー７ ６８　；　Ｄａｌｇｅｉｓｈら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１２ニア６３−７ ６７゜ＨＩＶで誘導された細胞異常の特徴的な現れである旧ソー誘導細胞融合は ウィルスエンベロープ糖蛋白質とＣＤ４との間の相互作用に依存する。Ｄａｌｇ ｌｅｉｃｈら（１９８４）前掲ＨＬｉｆｓｏｎら、５ｃｉｅｎｃｅＳｏｄｒｏｓ ｋｉら、Ｎａｔａｒｅ（１９８６）３２２：４７０−４７４゜）１１Ｖ−１がＣ Ｄ４＋Ｔ細胞に結合する場合、特異的抗−ＣＤ４抗体（ＯＫＴ４ａ）によるＣＤ ４抗原の検出がブロックされる。ＣＤ４抗原は旧Ｖ−１感染細胞の表面上で検出 され得ないが、ＣＤ４と旧Ｖエンベロープ糖蛋白質（ａｐ１２０）との細胞質内 複合体が証明されている［Ｈｏｘｉｅら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２２７： １１２３−１１２７］　、ウィルス接種の間のＣＤ４抗原へのモノクローナル抗 体の付加が旧Ｖ−１感染及び複製を阻害する。ＭｃＤｏｕｇａｌら、Ｊ、　Ｉｍ ｍｕｎｏｌ　、　（１９８５）１３５：３１５１−３１６２；ＭｃＤｏｕｇａｌ 　ら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３１：３８２−３８５゜旧Ｖ−１に感染し た対象者からの血清が試験管内で旧Ｖ−１感染を阻害する（中和する）幾らかの 活性を示した。ＭｃＤｏｕｇａｌら、Ｊ、　Ｉ＋＋ｕａｕｎｏｌ　、　Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　（１９８５）　７６　：１７１　；Ｗｅｉｓｓら、Ｎａｔｕｒｅ（１９ ８５）３１６：６９−７２；Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆ　ら、Ｎａｔｕｒｅ（ １９８５）３１６：７２−７４゜主恩Ω要封 旧ＶのごときＣＤ４−依存性レトロウィルスとの相互作用の結果として、表面抗 原ＣＤ４を発現する細胞において誘導される細胞性応答を調節するための方法及 び組成物が提供される。

この組成物はヒトＣＤ４抗原のＮ−末端に近い保存的アミノ酸配列の少なくとも 一部分と実質的に同一のアミノ酸配列を有する誘導体化されたペプチドを含んで 成る。このポリペプチドは天然ポリペプチドＣＤ４の置換誘導体であり、そして 少なくとも８６位のシスティン（Ｃ−８６）を含む７個のアミノ酸のコアー配列 を含んで成る。Ｃ−８６の硫黄原子は置換されていてもよく、そしてポリペプチ ド中のＣ−８６以外の少なくとも１個のアミノ酸が誘導体化されている。調節さ れ得る細胞性応答には、レトロウィルスに誘導された細胞融合及びウィルス粒子 の感染性並びに惑染後抗ウィルス活性が含まれる。

皿皿至囚員窪翌里 第１図は合成ＣＤ４　（７６−９４）のクロマトグラフィー分画を示す。

分画されたＵＶ−吸収種の生物活性及びマススペクトルがそれぞれ標準的旧Ｖ− 誘導細胞融合パイオアッセイ及びＦＡＢ−マススペクトル法により特徴付けられ た。

第２図は合成ＣＤ４　（８３−９４）のクロマトグラフィー分画を示す。

分画されたＵＶ−吸収種の生物活性及びマススペクトルが第１図において記載し たようにして特徴付けられた。

・なし　のｉ 本発明に従えば、ウィルス感染、ウィルスにより誘導された細胞変性効果、及び 旧ＶのごときＣＤ４−依存性レトロウィルスによる感染に続く怒染後抗ウィルス 活性のごとき細胞性応答を阻害するための組成物、及びその使用のための方法が 提供される。この組成物はポリペプチド、その誘導体、断片又は類似体、及びこ の欅な組成物を含有する製剤を包含し、ここでポリペプチドは８６位のシスティ ン（Ｃ−８６）を含む少なくとも７個のアミノ酸のコアー配列を含んで成る。Ｃ −８６の硫黄原子は置換されていてもよく、そしてポリペプチド中のＣ−８６以 外の少なくとも１個のアミノ酸、さらに普通にはポリペプチド中のＣ−８６以外 の少なくとも２個のアミノ酸が誘導体化されている、　好ましくは、誘導体化す る基（Ｓ）はベンジル又はクロロベンジルである。

注目の組成物の配列は通常、ＣＤ４分子（第１表を参照のこと）のセグメント、 特にＮ−末端に近いセグメントの配列の匹敵する。この組成物は実質的に配列Ｔ −Ｙ−１−Ｃ−Ｅ−Ｖ−Ｅを含んで成るコアー配列を含み、そして該コアー配列 のみから成ることができ、又はより普通には該コアー配列の少なくとも一端に少 なくとも１個の追加のアミノ酸を含んで成るであろう。

特に注目される組成物には次の配列：　Ｔ−Ｙ−１，Ｃ−Ｅ−Ｖ−Ｅ−Ｄ−Ｑ４ −Ｅ−Ｅ；　５−Ｄ−Ｔ−Ｙ−Ｉ−Ｃ−Ｅ−Ｖ−Ｅ−Ｄ−Ｑ−に−Ｅ−Ｅ　；及 びＬ−に−１−Ｅ−Ｄ−Ｓ−Ｄ−Ｔ−Ｙ−１−Ｃ−Ｅ−Ｖ−Ｅ−Ｄ−Ｑ−に−Ｅ −Ｅを有するもツカ含マレル。組成物ノ配列はさらに、１０個以上という多数の アミノ酸によりいずれかの末端でさらに延長されてもよく、この場合、延長アミ ノ酸はＣＤ４配列と同じでも異っていてもよい。ペプチド配列は、末端アミノア シル化、例えばアセチル化；例えばアンモニア、メチルアミン等によるカルボキ シアミド化により修飾して効力を増強し、毒性を低下させ、安定性を上昇せしめ 、薬学的特性を改善することができる。生物利用性（ｂｉｏａｖａｉ］ａｂｉｌ ｉ　ｔｙ）を改善するため、ペプチド配列をＮ−末端メチル化により、又はアル コールの付加により修飾することができる。

１　ＱＧＮＫＶＶＬＧＫＫＧＤＴＶＥＬＴＣＴＡＳＱＫＫＳ　２５２６１ＱＦ） Ｉ　圓Ｋ　Ｎ　Ｓ　Ｎ　Ｑ　Ｉ　Ｋ　Ｉ　Ｌ　Ｇ　Ｎ　Ｑ　Ｇ　Ｓ　Ｆ　Ｌ　Ｔ 　Ｋ　Ｇ　Ｐ　５０５１　５ＸＬＮＤＲＡＤＳＲＲＳＬＴＤＱＧＮＦＰＬＩＩＫ Ｎ　７５７６　Ｌ　Ｋ　Ｉ　Ｅ　Ｄ　Ｓ　Ｄ　Ｔ　Ｙ　Ｉ　ＣＥ　Ｖ　Ｅ　Ｄ　 Ｑ　Ｋ　Ｅ　Ｅ　Ｖ　Ｑ　Ｌ　Ｌ　Ｖ　Ｆ　１００１０１　Ｇ　Ｌ　Ｔ　Ａ　Ｎ 　Ｓ　Ｄ　Ｔ　Ｉｔ　Ｌ　Ｌ　Ｑ　Ｇ　Ｑ　Ｓ　Ｌ　Ｔ　Ｌ　Ｔ　Ｌ　Ｅ　Ｓ　 Ｐ　Ｐ　Ｇ　１２５１２６　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｓ　Ｖ　Ｑ　Ｓ　ＲＳ　Ｐ　ＲＧ　Ｋ 　Ｎ　Ｉ　Ｑ　Ｇ　Ｇ　Ｋ　Ｔ　Ｌ　Ｓ　Ｖ　Ｓ　Ｑ　１５０１５１　Ｌ　Ｅ　 Ｌ　Ｑ　Ｄ　Ｓ　Ｇ　Ｔ　Ｗ　Ｔ　ＣＴ　Ｖ　Ｌ　Ｑ　Ｎ　Ｑ　Ｋ　Ｋ　Ｖ　Ｅ 　Ｆ　ｌ＜　ｌ　Ｄ　１７５１７６　Ｉ　Ｖ　Ｖ　Ｌ　Ａ　Ｆ　Ｑ　Ｋ　Ａ　Ｓ 　Ｓ　Ｉ　Ｖ　Ｙ　Ｋ　Ｋ　Ｅ　Ｇ　Ｅ　Ｑ　Ｖ　Ｅ　Ｆ　Ｓ　Ｆ　２００２０ １　Ｐ　Ｌ　Ａ　Ｆ　Ｔ　Ｖ　Ｅ　Ｋ　Ｌ　Ｔ　Ｇ　Ｓ　Ｇ　Ｅ　Ｌ　Ｗ　Ｗ　 Ｑ　Ａ　Ｅ　ＲＡ　Ｓ　Ｓ　Ｓ　２２５２２６　Ｋ　Ｓ　Ｗ　Ｉ　Ｔ　Ｆ　Ｄ　 Ｌ　Ｋ　Ｎ　Ｍ　Ｅ　Ｖ　Ｓ　Ｖ　Ｋ　ＲＶ　Ｔ　Ｑ　Ｄ　Ｐ　Ｋ　Ｌ　Ｑ　２ ５０２５１　Ｍ　Ｇ　Ｋ　Ｋ　Ｌ　Ｐ　Ｌ　）ｌ　Ｌ　Ｔ　Ｌ　Ｐ　Ｑ　Ａ　Ｌ 　Ｐ　Ｑ　Ｙ　Ａ　Ｑ　Ｓ　Ｇ　Ｎ　Ｌ　Ｔ　２７５２７６　Ｌ　Ａ　Ｌ　Ｅ　 Ａ　Ｋ　Ｔ　Ｇ　Ｋ　Ｌ　）ｌ　Ｑ　Ｅ　Ｖ　Ｎ　Ｌ　Ｖ　Ｖ　Ｍ　ＲＡ　Ｔ　 Ｑ　Ｌ　Ｑ　３００３０１　Ｋ　Ｎ　Ｌ　Ｔ　ＣＥ　Ｖ　Ｔ　Ｇ　Ｐ　Ｔ　Ｓ　 Ｐ　Ｋ　Ｌ　Ｍ　Ｌ　Ｓ　Ｌ　Ｋ　Ｌ　Ｅ　Ｎ　Ｋ　Ｅ　３２５３２６　Ａ　Ｋ 　Ｖ　Ｓ　Ｋ　ＲＥ　Ｘ　Ａ　Ｖ　賀　ν　Ｌ　Ｎ　Ｐ　Ｅ　Ａ　Ｇ　Ｍ　Ｔ　 Ｑ　ＣＬ　Ｌ　Ｓ　３５０３５１　Ｄ　Ｓ　Ｇ　Ｑ　Ｖ　Ｌ　Ｌ　Ｅ　Ｓ　Ｎ　 Ｉ　Ｋ　Ｖ　Ｌ　Ｐ　Ｔ　Ｗ　Ｓ　Ｔ　Ｐ　Ｖ　Ｑ　Ｐ　Ｍ　Ａ　３７５３７６ 　Ｌ　Ｉ　Ｖ　Ｌ　Ｇ　Ｇ　Ｖ　Ａ　Ｇ　Ｌ　Ｌ　Ｌ　Ｆ　Ｉ　Ｇ　Ｌ　Ｇ　Ｉ 　Ｆ　Ｆ　ＣＶ　ＲＣＲ４００４０１ＨＲＲＲＱ　Ａ　Ｅ　ＲＭ　Ｓ　Ｑ　Ｉ　 Ｋ　ＲＬ　Ｌ　Ｓ　Ｅ　Ｋ　Ｋ　Ｔ　ＣＱ　ＣＰ　４２５４２６　ＨＲＦ　Ｑ　 Ｋ　Ｔ　ＣＳ　Ｐ　Ｉ　４３６（１）文字は慣習に従って次の意味を有する：Ａ ・アラニン；Ｒ・アルギニン；Ｎｌｌアスパラギン；Ｄ雪アスパラギン酸；Ｃ− システィン；トグルタミン；Ｅ奪グルタミン酸；　Ｇｗグリシン；Ｈ＝ヒスチジ ン；■−イソロイシン；Ｌ・ロイシン；Ｋ・リジン；ｈ・メチオニン；Ｆ・フェ ニルアラニン；Ｐ・プロリン；Ｓ・セリン；Ｔ・スレオニン；賀・トリプトファ ン；Ｙ・チロシン；及びＶ・バリン。

（２）残基の番号はＭａｄｄｏｎら、Ｃｅ１ｌ　（１９８５）４２　：　９３− １０４の慣用のものである。

アミノ酸配列は第１表に示される配列の部分に正確に対応する必要はなく、生成 物の活性に有意に影響を与えることなく除去及び挿入（通常約１個を超えないア ミノ酸が関与する）を含む１個〜４個の保存的又は非保存的置換により修飾する ことができ、この修飾はＤ−アミノ酸を含むことができる。

従って、本発明のポリペプチドを種々の変化、例えば挿入、除去及び置換にかけ ることができ、これらは保存的又は非保存的であり、この様な変化はそれらの使 用において何らかの利点をもたらすであろう。保存的置換は、Ｇ、Ａ；Ｖ、１． Ｌ、Ｄ、Ｅ、Ｎ。

Ｑ；Ｓ、Ｔ、に、Ｒ，及びＦ、　Ｙ、賀のごとき組合わせを意図する。

通常、組成物の配列はＣＤ４分子のセグメントの配列から３０％より多くは異ら ないであろうが、例外として、「アーム」を提供する目的でいずれかの末端に追 加のアミノ酸を加えることができ、このアームにより本発明のペプチドを、固定 化のために例えば免疫原として使用するためのキャリヤー蛋白質、又はアフィニ ティー基、標識等に便利に連結することができる。このアームは通常約５個以上 のアミノ酸から成り、そして５０個以上のアミノ酸から成ることもできる。

本発明の組成物の誘導体化は、１個以上の、さらに普通には２個以上の、好まし くは３個のへテロ原子（ペプチド結合を除く）の誘導体化を包含するであろう。

ヘテロ原子は、炭素を包含し；環構造及び非環構造中に位置する原子を包含し； そして有機及び非−有機化合物中の原子を包含する任意の原子を意味する。２個 以上のへテロ原子が誘導体化される組成物において、−ｉにヘテ中原子の内の１ つはＣＤ４分子の８６位のシスティン（Ｃ−８６）の硫黄である。残りの１又は 複数の置換は組成物中の他の任意のアミノ酸、好ましくはグルタミン酸、さらに 好ましくはＣＤ４分子の８７位のグルタミン酸（Ｅ−８７）のへテロ原子上に存 在することができる。置換基が結合されるヘテロ原子は、誘導体化されるアミノ 酸の化学構造にある程度依存し、そして硫黄、酸素、窒素及び炭素のいずれを含 むであろう。−個のへテロ原子が誘導体化される組成物中で、誘導体化基はＣ− ８６以外のアミノ酸、通常はグルタミン酸、さらに普通にはＥ−８７のへテロ原 子上に存在する。１個より多くのへテロ原子が誘導体化される組成物においては 、一般に、１６以下の原子番号を有する２個の隣するカルコゲンがｇＲ体化され る。１６以下の原子番号を有するカルコゲンにより酸素及び硫黄が意図される。

カルコゲンは一般に、スレオニン（Ｔ−８３）及びチロシン（Ｙ−８４）　；又 はＣ−８６及びＥ−８７、のいずれか上に存在する。好ましい組成物は、２個の 隣接するカルコゲンに加えて少なくとも１個のへテロ原子が誘導体化されている 組成物が包含される。Ｔ−８３、Ｙ−８４及びＣ−８６、又はＴ−８３、Ｃ−８ ６及びＥ−８４が誘導体化されている組成物が特に好ましい。

誘導体化基は一般に約１個〜約３６個の炭素原子を有し、そして脂肪族、脂環族 、芳香族、複素環式、又はこれらの組合せであることができる。通常、誘導体化 基は、鎖又は環原子等の上の置換基として０〜１０個のへテロ原子（最も長い鎖 中に存在するであろう）を有するであろう。はとんどの場合、誘導体化基のテテ ロ原子はハロゲン、窒素、酸素又は硫黄から選ばれる。誘導体化基の嵩（バルク ）は好ましくはナフチル基のそれより小さく、且つ直鎖低級アルカン酸のそれよ りも大であり、最も好ましくはおよそフェニル基又は類似の環状もしくは複素環 基（芳香族性又は非芳香族性）のサイズである。従って、誘導体化されたペプチ ドは、Ｘ−線結晶構造解析により決定した場合、ｇｐ１２０上のＣｌ１４結合ド メインに結合した生来のＣＤ４の三次元コンホーメーションに実質的に類似した 三次元コンホーメーションを有する。

基は場合によってはさらに置換されていてもよい。組成物の配列中の好ましいア ミノ酸への誘導体化基の結合は幾分は誘導体化基の化学構造及び該アミノ酸のそ れに依存するであろう。すなわち、誘導体化基は該誘導体化基土の炭素原子、硫 黄原子、窒素原子又は酸素原子を介してアミノ酸に結合することができる。

誘導体化基として種々の基、例えば、アリール含有置換基、又はシスティンの場 合にはシスティンのチオ基とマレイミドとの間の反応から生ずるチオエーテルを 使用することができる。アリール基は、好ましくは、環中に炭素原子及び０〜１ 個の酸素又は硫黄原子及び０〜３個の窒素原子を含有する５−員及び６−員の芳 香族環から選択される。フェニルが好まし、いアリール基であり、さらに例えば ベンジル及びナフチルである。アリール含有基は置換されていてもよく又は非置 換でもよい。置換基は、アルキル、特にメチル、ハロゲン、特に塩素、ニトロ、 ヒドロキシ等を含有することができ、ここで置換基は任意の位置に存在すること ができ、好ましくはオルト又はパラ位に存在する。アリール基は０〜３個の置換 基を含有することができ、通常は２個以下の置換基を含有し、これらの置換基は 同一でもよく又は異っていてもよい。１個より多くのへテロ原子が誘導体化され る場合、各へテロ原子上の誘導体化基は同一でもよく又は異っていてもよい。好 ましい誘導体化基にはベンジル及びクロロベンジルが包含される。

誘導体化基として使用される活性オレフィンについては、該オレフィンは不飽和 の第三位と共役するのが普通であり、例えば、カルボニル基、非環基、マレイミ ド基、共役ポリオレフィン等も使用することができる。

他の分子に連結することを可能にするブロッキング基上に存在する官能基、例え ばカルボキシ、カルボキシエステル等を有することに興味がもたれよう。次に、 カルボキシ基は、アミン又はアルコール、例えば蛋白質との反応のためにカルボ ジイミド、カルボニルジイミダゾール等により活性化され得る。

ＣＤ４分子又はその断片の誘導体製造のための反応化合物の例には下記のものが 含まれ、ここで、誘導体化が生物活性のために生ずる場合、他のアミノ酸残基又 はシスティン８６の硫黄に結合する基は次の基のいずれかであることができる。

（ａ）アルキル及び置換アルキル化合物：χ−Ｃ）ｌｘ　（ＣＢり　、、− ここで、ｎ　＝　０〜２０．そしてＸは、Ｈ，ＯＨ，０ＣＨ３１Ｓ）１．　ＳＣ ［Ｉ：＋。

Ｎｌ２．　ＮＨＣＨ３，Ｎ（Ｃ）’Ｉ３：ｈ、ＳＯＪ、５（ｈｃｔ（ｚ　、又は ハロゲンであり、ｎが０でない場合にのみへテロである。

（ｂ）　シクロアルキル及び置換シクロアルキル化合物：ここで、ｎ＝１〜１０ であり、環原子のいずれかの上にあるハロゲンが上記（ａ）に記載したようにＸ により置換されている。

（ｃ）芳香族又は置換芳香族化合物： ここで、ｎ＝１〜５、そしてＸは上記（ａ）に記載した通りである。

（ｄ）ポリ芳香族又は置換芳香族化合物：ここで、ｎ＝１−３であり、そしてＸ は上記（ａ）に記載した通りである。

（ｅ）複素環又は置換複素環化合物、例えば、（ｉ）置換ピリジル、（ｉ　ｉ） イミダゾール、又は（ｉｉｉ）キノここで、ｎ＝ｏ〜３、そしてＲは電子対、Ｈ ２炭素原子数１〜２のアルキル、又は０である。

（ｉｉ） ここで、ｎ−０〜３、そしてＲはＣＪｓ、ＣＨｓ又はＨから選択ここで、Ｒは電 子対、Ｈｌ又はＯである。

（ｆ）マレイミドアダクト、例えばｍ−マレイミドベンゾエート、Ｎ−ヒドロキ シサクシンイミドエステル；ｍ−マレイミドーベイゾイルースルホサクシンイミ ドエステル；Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミド−フェニル）ブチレー ト；Ｎ−サクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１− カルボキシレート；又はスルホサクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル ）シクロヘキサン−１−カルボキシレート；ビス−マレイミドヘキサン；ビス− マレイミドメチルメチルエーテル；又はＮ−マレイミドブチリルオキシサクシン イミド。

（ｇ）千オー含有化合物、例えば： （式中、ＸはＮｓ、　ＯＨ，ＯＲ，ＮＨｚ、　ＮＨＲ，Ｎ（ｈ、　ＳＨ，ＳＲ、 ハロゲンＣ００）ｌ、又は炭素原子数６〜１２のアリールである）；及び（式中 、Ｒはアルキル又は置換アルキルである）。

（ｈ）アミノ酸又はオリゴペプチド。

（ｉ）細胞毒性剤、例えばアルキル化剤、例えばビボブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏ ｍａｎ）、チオーＴＥＰＡ、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、シ クロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ニトロゲンマスター ド、メツアラン（ｍｅｐｈａｌａｎ）、又はウラシルマスタード。

（ｊ）膜攪乱剤、例えばアドリアマイシン、イオノホール（ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ ｓ）、例えばパリノマイシン（ｖａｌ　ｉｎｏｍｙｃｉｎ）又は界面活性剤、例 えば洗剤。

＜ｋ）抗−レトロウィルス剤、例えば５−アジドチミジン（ＡＺＴ）　、ジデオ キシシチジン（ＤＤＣ）　、ジデオキシアデノシン（ＯＤＡ）　、又はジデオキ シイノシン（ＣＤＩ）。

ある場合、特定の誘導体が生体内使用において細胞毒性であることが見出される 。従って、生理的に許容される生成物をもたらす誘導体化基を用いることにより 薬理学的活性レベルにおいて細胞毒性を低下させるか又は実質的に除去するよう に誘導体を修飾することが必要である。使用し得る修飾には、１９７９年１２月 １８日に発行された米国特許出願Ｎユ４．１７９，３３７に記載されているよう に、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールのごときポリマーと のカップリングが含まれる。

本発明のペプチドは幾つかの用途のために可溶性巨大分子キャリヤーと連結して 用いることができる。便利には、キャリヤーは天然又は合成のポリペプチド、ヒ ト血清中で高レベルで遭遇しないであろう抗体であることができる。ポリペプチ ドの例には、ポリーＬ−リジン、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペット・ ヘモシアニン、ウシγ−グロブリン等が含まれる。選択は主として便利さ及び入 手可能性のいずれかにより行われる。連結方法は常法通りであり、ｐ−マレイミ ド安息香酸、ｐ−メチルジチオ安息香酸、無水マイン酸、無水コハク酸、グルタ ルアルデヒド等のごとき試薬を用いて行われる。連結はＮ−末端、Ｃ−末端、又 は分子の両末端の中間部位において生ずることができる。本発明のペプチドは連 結のために誘導体化することができ、結合したまま支持体等に連結することがで きる。接合体を調製するために組換ＤＮＡ法及び常用の化学的カップリングを含 めて任意の便利な技法を用いることができる。

並虹誘星生生星製 種々の方法でペプチドを調製することができる。これらの製造方法には下記のも のが含まれる。ペプチドは、そのサイズが比較的短いため、溶液中で又は個体支 持体上で合成することができる。さらに、これらは組換ＤＮＡ技法を用いて製造 することができる。

固相合成のために種々の自動合成機が市販されており、そして既知の方法に従っ て用いることができる。例えば、５ｔｅ−Ｐｉｅｃｅ　Ｃｈｅｏ＋１ｃａｌ　Ｃ ｏｍｐａｎｙ、１９８４；及びＴａｌｌ１ら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ。

（１９８３）　１０５：６４４２を参照のこと、前駆体アミノ酸中の潜在的に活 性な部位をブロックするために種々の側鎖保護基を用いることができる。特定の 保護基の選択は、予想される開裂条件及び目的生成物に依存するであろう。

組成物の製造のためにフルオレニルメトキシカルボニルＣＦ−ｗｏｅ）を用いる 場合、側鎖保護基として次のものを用いることができる：ｔ、ブチル（Ｄ、Ｅ、 Ｓ、Ｔ、Ｙ）；ｔ−Ｂｏｃ（Ｋ）；　）リチル（Ｈ）；Ｐ−トルエンスルホニル （Ｒ）：ベンジル（Ｃ）。多くの場合、保護基、例エバベンジル、クロロベンジ ル、置換ベンジル、ベンジルアミド、クロロベンズアミドをＥ、Ｃ，Ｔ及びその ために用いることができる。ｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）法を用いる 場合、合成中に用いられる側鎖保護基にはＴｏｓ　（Ｒ＋　Ｈ）、０、ベンジル ＣＤ、Ｅ）　、ベンジル（Ｓ、　Ｔ、ある場合にはＣ）、Ｂｒ−Ｚ（Ｙ）、ＣＩ ！、−Ｚ（Ｋ）　、４−ＭｅＯ−ベンジル（Ｃ）、又はホルミル（Ｘ）が含まれ 得る。Ｚはベンジルオキシカルボニル基を示す。

側鎖保護基の除去方法及び固相支持体樹脂からの合成ペプチドの開裂方法は保護 基の種類及び目的生成物の種類に依存するであろう。Ｆ−ｍｏｃ法を用いる場合 、ペプチド上の目的のアリールアルキル置換基を除去する激しい条件に避けるべ きである。一般にジクロロメタン（ＤＣＭ）中５０〜８０％、好ましくは７０％ のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）が使用される。他の有機酸、’？ｄえば７０％ト リフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）、及びＴＦＡ中臭中水化水素Ｂｒ） 　、並びにＴＦ？ＩＳＡとＴＦＡとＤＣＭとの混合物を使用することもできる。

ＴＦＡはさらにアニソール、チオアニソール、ジメチルスルフィドのごときキャ ベンジャー、及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯＳ）のごとき洗剤を含有するこ とができる。開裂及び脱保護の後、樹脂及びペプチドをエチルエーテルですすぎ 、そしてペプチドを樹脂から、炭酸アンモニウム中での溶解及び濾過により分離 する。次に、得られた樹脂後の混合物を凍結乾燥する。

ｔ−Ｂｏｃ法を使用する場合、例えば、アニソール又はチオアニソール、ｐ−チ オクレゾール、及びジメチルスルホキシドのごときスキャベンジャ−を含有して いてもよい約−２０°Ｃ〜０℃の弗化水素（ＨＦ）の添加により、合成ペプチド の側鎖保護基が除去されそして同時にペプチドが樹脂から開裂される。

）ＩＰ及び他の揮発性成分を真空下で除去した後、樹脂及びペプチドをエチルチ ーチルのごとき有機溶剤ですすぎ、ペプチドを樹脂から、炭酸塩含有緩衝液、好 ましくは炭酸アンモニウム、又はＤＭＦ及びＨｚＯ（２：Ｉ　Ｖ／Ｖ）中に溶解 する。あるいは、工チルエーテル段階を省略し、そしてすべての残留スキャベン ジャ−１例えばアニソール及びジメチルスルフィドをセファデックスＧ−１０又 はＧ−２５上でのクロマトグラフィーにより除去する。

Ｆ−ｍｏｃ法又はｔ−Ｂａｃ法により製造された、旧Ｖにより誘導される細胞融 合を阻害する能力（「抗シンシチウム活性」）を有するペプチド組成物を樹脂後 混合物中の不活性ペプチドから、高圧液体クロマトグラフィー（ｌ（ＰＬＣ）を 含めての常用手段により分離する。

抗シンシチウム活性を有するペプチドはまた、ｔ−Ｂｏｃ法を用いて固相合成か ら得られた樹脂後混合物から単離することができ、ここでコアー配列中のＣ−８ ６は、前駆体アミノ酸としてのｔ−Ｂｏｃ−Ｓ−ベンジル−システィンとｔ−Ｂ ｏｃ−Ｓ−バラ−メチルベンジルシスティンとの置換によりＳ−ベンジルＣｙｓ により置き換えられる。

抗シンシチウム活性を有する組成物はまた、コアー配列ＣＤ４　（８３−８９） を含有するＣＤ４の精製された未誘導体化領域、又はコアー配列のＣ−８６が７ 〜１２個の炭素原子及び０〜２個のへテロ原子を有するアラルキル置換基、例え ばベンジルもしくはクロロベンジル基、又は他の置換されたベンジル基により部 分的に誘導体化されている。誘導体化された、及び誘導体化されていない出発物 質源は、未誘導体化配列の固相合成から得られる後樹脂混合物であり、これから ペプチドが例えばＨＰＬＣにより単離される。

目的とする置換の種類及び位置に依存して、誘導体化された出発物質はまた、精 製された誘導体化されているか又は誘導体化されたペプチドを穏和な条件下で親 核性基と反応することが知られている試薬、例えばメルカプタン、活性ハラ゛イ ド、シュードハライド、活性オレフィン、例えばα・β−エノン、例えばマレイ ミド、ジスルフィド等と反応させることによっても製造することができる。これ らの出発物質から製造されたペプチドは一般に、少なくとも２個の誘導体化基を 含んで成り、１個の誘導体化基はＣ−８６に結合するであろう。

２個以上の誘導体化基を含む誘導体化されたペプチドはまた、Ｆ−ｍｏｃ法及び 耐酸性側鎖保護基を用いて合成することができる。例えば、Ｃ−８６及びＥ−８ ７上にベンジル基質基を有するペプチドは前駆体としてＮ−Ｆ−ｍｏｃ−Ｓ−ベ ンジル−し−システィン及ヒＮ　−Ｆ　−ｒａ　ｏ　ｃ　−Ｌ−グルタミン酸− α−ベンジルエステルを用いて合成することができる。残りの前駆体アミノ酸、 並びに開裂、抽出及びペプチドの精製の方法は前記のもとに類似している。

あるいは、本発明の組成物の製造のためにバイブリドＤＮＡ技法を用いることが でき、ここで合成遺伝子をポリペプチドをコードする単鎖又はそれに実質的に相 補的な鎖を用いて製造することができ、これらの単鎖はオーバラップしておりそ してアニーリング培地中で一緒にしてハイブリダイズせしめることができる。次 に、ハイブリダイズした鎖を連結して完全な遺伝子を形成することができ、そし て適切な末端の選択により遺伝子を容易に入手できる発現ベクターに挿入するこ とができる。　Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　、　 Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒＭａｎｕａｌ、ＣＳＨ，Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２を参照のこと。あるいは、ペプチド をコードするゲノムの領域を常用の組換えＤＮＡ技法によりクローン化しそして 発現させることができる（Ｍａ−ｎｉａｔｉｓら、前掲を参照のこと）。

ＣＤ４の既知の配列に基＜　ＤＮＡコード配列を用いることができる。これらの 配列からの断片をペプチド断片の発現のために用いることができ、保存的塩基変 化を行うことができ、ここで変更されたコドンが同じアミノ酸をコードしており 、あるいはコード配列中の非保存的変更を行うことができ、ここ注目の領域を維 持しながら、ペプチドを延長するために５′−末端もしくは３′−末端又は両末 端においてコード配列を延長することができる。この延長は、連結のため、抗原 活性を与えるため等のためにアームを提供することができる。

発現のため、コード配列に開始及び終止コドン、プロモーター及びターミネータ −領域、並びに通常は、細胞性宿主、例えば原核もしくは真核性宿主、細胞、酵 母、哺乳類等での発現を発現ベクターに付与するための複製系を有するであろう 。

ペプチドが組換ＤＮＡ法により発現され、そして適当な程度に精製された後、シ スティンのメルカプタンの水素を置換する任意の常用の試薬によりチオ基をブロ ックすることができる。

前記のように、千オニーチル、チオエステル、チオアミド、活性ハロゲン、活性 シュードハロゲン、又は活性オレフィンを用いることができる。反応温度は一般 に穏和で０〜５０°Ｃ１通常１０〜３０°Ｃであり、反応時間は約０．５〜２４ 時間である。極性溶剤、特に水性溶剤を用いることができ、を機溶剤が約６０容 量％まで存在することができる。有機溶剤にはアセトニトリル、アセトン、ジエ チルエーテル、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン等が包含される。活性ハ ライドを用いる場合、穏和な塩基性の酸受容体、便利には炭酸塩、炭酸水素塩等 が存在するであろう。通常、過剰のブロッキング剤が使用されるであろう。

チオ基をブロックするため、ジスルフィド、例えばメチルジチオ、Ｐ−ニトロフ ェニルジチオ、２−ピリジルジチオ等を使用することができ、他の硫黄はメチル カルボキシエステル、アリール又は他の便利な基に結合させることができる。

除去の条件はよく知られており、ここで記載する必要はない。

反応が完了した後、常法に従って生成物を単離し、そして精製することができる 。

健ｔ１１１１１吏里 本発明の化合物及び組成物は多くの用途を有し、そして試験管内及び生体内で用 いることができる。試験管内では、本発明の化合物及び組成物はウィルス感染に おけるＣＤ４の役割を検出し、旧Ｖに感受性のＴ−細胞及びマクロファージを含 めてのＣＤ４−担持細胞の感染を防止、ＣＤ４−依存性ウィルス細胞変性効果を 阻害する等のために用いることができる。生体内において、本発明の化合物及び 組成物は、ウィルス疾患の臨床的現われに関連するＨＩＶエンベロープ垢蛋白質 −ＣＤ４相互作用を阻害することにより、ＨＩＶのごときＣＤ４−依存性レトロ ウィルスの感染の予防又は増殖の阻害並びに他のＴ細胞又は他のＣＤ４−担持細 胞の感染又はそれに対する細胞変性効果の予防又は治療のために用いることがで きる。「細胞」なる語は多数の細胞及び単一細胞を包含することが意図される。

単離された細胞には、単離された細胞及び細胞のより大きな組織体、例えば器官 の部分を構成する細胞が包含され、そして生体内にあってもよく試験管内にあっ てもよい。イし合物はさらに、例えば、妊娠中に、又はＣＤ４−依存性レトロウ ィルスの母−子感染を防止するための投与の際に使用することができる。

本発明の化合物及び組成物は一般に血流に入るように投与され、非経口的に、例 えば筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、鼻内に、局所に、又は他の方法で投与され る。任意の生理的に許容される媒体、例えば脱イオン水、塩溶液、リン酸緩衝液 、水性エタノール等が使用される。本発明の組成物の活性成分の濃度は、溶解性 、用途、投与の頻度等に依存して異ることができる。使用量は多くの因子に依存 し、これらの因子には組成物の投与経路、処置の数及び頻度、組成物の活性成分 の分子量、並びに用いられる製剤の相対的生物活性（例えば、抗−シンシチウム 活性又は抗−感染活性）が含まれる。

生物学的に化性な成分が約１６００の分子量を有する場合、７０ｋｇのヒトに処 置当たり投与される組成物の生物学的に活性な成分の量は一般に約１ｇを超えず 、さらに普通には、約２００■〜約５００■の範囲にあり、そして高い相体生物 活性を有する化合物、例えば、約１−〜約１０−の濃度で旧Ｖ−誘導細胞融合を 試験管内でブロックすることができる組成物については約２００■〜約５００ｍ ｇの範囲にある。

本発明の組成物はまた、生体内及び試験管内の両方での）ＩＩＶエンベロープ糖 蛋白質とＣＤ４との結合相互作用の結合相互作用の競阻害剤として使用すること ができる。ＨＩＶのエンベロープ糟蛋白質（ｇｐ１２０）上にＣＤ４結合ドメイ ンが存在し、これは保存された領域のようである。本発明の組成物はＣＤ４とａ ｐ１２０との間の結合を阻害することにより機能することができる。従って、本 発明の誘導体化されたペプチドはまた、精製されたｇｐ１２０との結合研究及び これに続く、ｇｐ１２０上のＣＤ４結合ドメインの位置決定のための生化学的研 究及び架橋において用いることができる。

本発明の組成物はまた、旧Ｖの感染に対して保護するためのワクチンの設計及び 開発のために用いることができ、例えば、ｇｐ１２０上のＣＤ４結合ドメインの 配列についての知識を用いてＨＩＶの感染に対して保護するためのワクチンを設 計することができる。ｇｐ１２０又は少なくとも結合ドメインを含んで成るその 断片を適当な稀釈で免疫原として用いることができ、又はそれ自体免疫原性でな ければ、キャリヤーに結合させて蛋白質を免疫原性にすることができる。キャリ ヤーにはウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等が含まれる 。適当な稀釈剤は水、塩水、緩衝液、完全アジュバント、不完全アジュバント等 である。免疫原は抗体生産のための標準的技法を用いて投与される。

ＣＤ４のＮ−末端に近いアミノ酸の１より多くの配列が、旧■の感染及び感染の 細胞毒性結果のために必須たＣＤ４とｇｐ１２０との間の相互作用に関与してい るようである。これらの配列を有するペプチド及びその誘導体はＣＤ４とｇｐ１ ２０との間の結合の競争阻害剤又は拮抗剤として特徴付けることができる。ＨＩ Ｖと相互作用するＣＤＡ上のこれらの配列の少なくとも１つはＭＢＣ部位から区 別されるようであり、そして少なくとも１つのＣＤ４−依存性免疫機能、すなわ ち混合白血球反応に関与しないようである。従って、この天然アミノ酸配列又は 前記のその誘導体による免疫化はＣＤ４の生理学的機能を損うことなく　ＨＩＶ による感染に対して保護することができる。今後使用する「結合配列」は、生来 の配列及び実質的に生来の配列を有するペプチド、特に本発明に従って誘導体化 されたペプチドを包含することが意図される。

ワクチンとしての使用に加えて、組成物は、ＣＤ４−担持細胞とＨＩＶとの間の 相互作用に関連するＣＤ４及びｇｐ１２０上の結合配列に対する抗体を製造する ために用いることができる。この抗体は抗ウィルス剤として直接使用することが できる。抗体を製造するため、宿主動物を、結合配列それ自体により、又は適当 であればそれを前記のようなキャリヤーと結合させて用いて免疫することができ る。適当な時間の後宿主の血清又は血漿を集めて、関連する配列と反応する抗体 を含んで成る組成物を得ることができる。飽和硫酸アンモニウムもしくはＤＥＡ Ｅセファデックス、又は当業者により知られている他の技法を用いてγグロブリ ン画分又はＩｇＧ抗体を得ることができる。抗−結合配列抗体組成物の特異性を 増強するため、注目の結合配列を欠＜　ｇｐ１２０断片又はＣＤ４　（適当であ れば）に調製物を吸着させることにより組成物を精製することができる。

抗体は、薬物など他の抗−ウィルス剤に付随する不都合な副作用の多くを実質上 含有しない。

潜在的な不都合な免疫系応答を最小にすることにより抗体組成物を宿主系に対し て一層適合性にすることができる。このことは、異種抗体のＦｃ部分のすべて又 はその一部を除去することにより、あるいは宿主動物と同じ種の抗体を用いるこ とにより、例えばヒト／ヒトハイプリドーマからの抗−結合配列接体の使用（下 記参照のこと）により達成される。

抗−結合配列抗体はまた、免疫応答を増強するための手段として用いることもで きる。抗体−ウィルス複合体がマクロファージにより認識されるからである。抗 体は、抗体の他の療法投与のために使用されるのと同様の量で投与することがで きる。例えば、プールされたγグロブリンを０．０２〜０．１ｉ／ｌｂ体重で他 のウィルス性疾患、例えば狂犬病、風疹及び肝炎の初期潜伏期の間に投与して細 胞へのウィルスの侵入を妨害する。従うて、ＣＤ４／ｇｐ１２０相互作用配列と 反応性の抗体を単独で又は他の抗ウィルス剤と組合わせて、ＣＤ４−依存性レト ロウィルスにより感染された宿主に受動的（ｐａｓｓｉｖｅｌｙ）投与して免疫 応答及び／又は抗ウィルス剤の有効性を増強することができる。

あるいは、免疫原として抗イデオタイブ抗体を投与することにより抗−結合配列 抗体を誘導することができる。便利には、前記のようにして調製された精製され た抗−結合配列抗体を用いて宿主細胞中に抗イデオタイプ抗体を導入する。組織 物を適当な稀釈で宿主動物り投与する。投与、通常は反復投与の後、宿主は抗− イデオタイプ抗体を生産する。Ｆｃ領域に対する免疫原応答を除去するため、宿 主動物と同じ種で生産された抗体を用いることができ、又は投与される抗体のＦ ｃ領域を除去することができる。宿主動物での抗−イデオタイブ抗体の誘導の後 、血清又は血漿を除去して抗体組成物を得る。組成物は前記のようにして抗−配 列抗塊について精製することができ、又はアフィニティーマトリクスに結合した 抗−結合配列を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することが できる。生産される抗イデオタイブ抗体はＣＤ４との相互作用に関与するｇｐ１ ２０の領域に対して特異的である。

患者において抗−結合配列抗体を誘導する手段として使用する場合、抗体を注射 する方法はワクチン目的のためと同じである。すなわち、筋肉内に、腹腔内に、 皮下に、又はこれらに類する方法で、生理的に許容される稀釈剤中で有効濃度で アジュバントと共に又はこれを用いないで投与する。１回又は複数回の追加注射 が望ましい場合がある。抗−結合配列抗体の誘導は、抗−結合配列抗体の受動投 与により惹起され得る問題点、例えば不都合な免疫応答、及び血液製剤の投与に 伴う問題点、例えば感染を緩和する。

抗カイルス剤として有用であることに加えて、結合配列を含んで成る蛍白質に対 する抗体、及び抗イデオタイプ抗体は診断においても使用することができる。

生体内使用及び診断における使用の両方のため、モノクローナル抗体を用いるの が好ましいであろう。モノクローナル抗−結合配列抗体又は抗イデオタイブ抗体 は次の様にして製造することができる。免疫された動物から＊２又はリンパ球を 取り出し、そして不滅化し、又は当業者により知られている方法によりハイプリ ドーマを調製するために用いる。ヒト−ヒトハイブリドーマを作るため、ヒトリ ンパ球提供者が選択される。ＣＤ４−依存性レトロウィルスにより感染している ことが知られている提供者（例えば、血中のウィルス抗体の存在又はウィルス培 養により感染が示されている場合）を適当なリンパ球提供者として役立てること ができる。末梢血サンプルからリンパ球を単離し、又は提供者がＮＥｉ摘出術に かけられる場合には肺臓細胞を用いることができる。エプスタイン−バールウィ ルス（ＥＢＶ）を用いてヒトリンパ球を不滅化することができ、又はヒト融合パ ートナ−を用いてヒト−ヒトハイブリドーマを作ることができる。ヒトモノクロ ーナル抗体の生成においてペプチドによる一次試験管内免疫感作を用いることが できる。

不滅化細胞により分泌される抗体をスクリーニングして目的とする特異性を有す る抗体を分泌するクローンを決定する。

モノクローナル抗−結合配列抗体については、抗体がｇｐ１２０に結合してＣＤ ４へのｇｐ１２０の結合を阻害しなければならない。

モノクローナル抗−イデオクイブ抗体については、抗体が、抗−結合配列抗体の 結合部位領域に結合しなければならない。

目的とする特異性を有する抗体を生産する細胞を選択する。

次に実施例を例示のために記載するが、これにより本発明の範囲を限定するもの ではない。

１−脹 １施±上 ｔ−Ｂａｃ法によ　ＵされるＡＣＤ４（７９−９４）ペプチド　びその断　の　 曇ム　びバイオアッセイ Ａ、■ （ａ）基本合成 Ｎ−末端に遠位のＣＤ４分子の細胞外部分の配列に由来する一連の置換されたペ プチドを、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（Ｇ、Ｂａｒａｎｙ及びＲ，Ｂ、Ｍｅｒｒｉｆ ｉｅｌｄ、Ｔｈｅ　Ｐｅ　ｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌ　ｓｉｓ　Ｓ　ｎｔｈｅｓｉｓ 、Ｂｉｏｌｏ　＋Ｖｏ１．５　、Ｅ、Ｇｒａｓｓ及びＪ、Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ　 ５集、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

ニューヨーク、１−２８４頁、１９７９）の原理に従って自動固相ペプチド合成 法（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ＋＋＋ｓ＋Ｉｎｃ、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ ｔｙ＋ＣＡ＋　モデル４３Ａベブチドシスササイザー）も用いて合成した。ｔ− Ｂｏｃ法における側鎖の保護は；Ｔｏｓ　（Ｒ，Ｉ（）　；　０−ベンジル（Ｄ 、Ｅ）：ベンジル（Ｓ、Ｔ、幾つかの場合Ｃ）　；Ｂｒ−Ｚ（Ｙ）　；Ｃ１−Ｙ （Ｋ）　；又は４−ＭｅＯ−ベンジルＣＣ）であった。

合成の終りにおけるペプチドの側鎖の脱保護及び樹脂からのペプチドの開裂は、 約３００■のペプチドを含有する樹脂に１−のアニソール又はチオアニソール、 Ｐ−チオクレゾール、及び２００ｍのジメチルスルフィドを含有する２０ｍの） ＩＰを添加することにより行った。樹脂からのペプチドの開裂の後に得られた物 質（樹脂後混合物）は約６５〜９５％の不活性な誘導体化されていないペプチド 及び抗シンシチウム活性を有する他のペプチド種を含んでいる。

）ＩＦ及び他の揮発性成分を真空下で除去した後、樹脂及びペプチドをエチルエ ーテルですすぎ、そして０．１Ｍ炭酸アンモニウム中での溶解、フリツタ−付フ ィルターディスク上での濾過、及びこれに続く凍結乾燥により樹脂からペプチド を分離した。あるいは、エチルエーテル段階を省略し、そしてすべての残留スカ ベンジャー、例えばアニソール及びジメチルスルフィドをセファデックスＧ−１ ０クロマトグラフイーにより除去した。凍結乾燥した樹脂後混合物を１０％酢酸 又は酢酸アンモニウム中に溶解し、そしてそれぞれＧ−１０セフアデツクス又は Ｇ−２５セフアデツクス上でクロマトグラフィー処理して低分子量種を除去した 。記載する場合、調製物を）ＩＰＬＣによりさらに精製した。樹脂後混合物はＨ ＰＬＣで評価した場合不均一であった。

（ｂ）　Ｓ−ベンジル化類似体の合成 Ｃ−８６がＳ−ベンジルシスティンにより置き換えられているＣＤ４　（７６− ９４）の誘導体を、実施例ＩＡにおいて概略記載した方法においてｔ−Ｂｏｃ− ５−ベンジル−システィンとｔ−Ｂａｃ−Ｓ−メチル−ベンジル−システィンと を置き換えることにより合成した。　ＨＦ開裂の後、１０ｍ？！酢酸アンモニウ ム（ｐ）１７．０）中に溶解した１０■のＳ−ベンジルＣＤ４をＶｙｄａｃ　Ｃ ８（１０Ｘ２５０ｍｍ）結合相半分取用カラム上で、２０％酢酸アンモニウム緩 衝液中１０〜８０％アセトニトリルの直線グラジェントからなる移動相を用いる ＨＰＬＣによりクロマトグラフ処理した。ＦＡＢマススペクトル分析及び抗−細 胞融合活性の両方のためにアリコートを取った。

「ピーク４」として単離された物質（第２図を参照のこと）がアミノ酸分析及び ＦＡＢ−ＭＳ分分析上す構造ＴＹＩＣｂｘｔＥＶＥＤＱＭＥＥを有する純粋なポ リペプチドであると確認された。この物質は、試験した最も高い濃度である！＜ 　５０Ｍにおいて抗細胞融合活性を有しなかった。

Ｂ４　ペプチドのバイオアッセイ （ａ）　ＨＩＶで誘導されるＣＤ４−依存性細胞の融合実施例ＡＩ（ａ）に記載 したようにして合成された組成物の、ＣＤ４−依存性ＨＩＶエンベロープ誘導細 胞融合をブロックする能力を次の様にして評価した。細胞融合アッセイを、Ｌｉ ｆ−ｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２３ニア２５−７２８に記載されて いるのと実質的に同様にして行った。要約すれば、５Ｘ１０’個のＢ９．ＨＩＶ Ｈｘｍ−ｚ細胞を、実施例１に記載したようにして得られた種々の濃度の不均一 なペプチド組成物と、平底９６−ウェルマイクロタイタープレートのウェル中で ３７°Ｃにて３０分関インキュベートした。次に、５Ｘ１０’個のＣＤ４＋ＶＢ 細胞を加えた。全容量は１００Ｉであった。３７゛Ｃにて２〜２４時間培養した 後、融合体（ｓｙｎｃｙｔｉａ）（共通の細胞膜中に４個以上の核が存在するも のとして定義すｈル）　ヲＬｉｆｓｏｎら、前掲により記載されているようにし て異相差顕微鏡（ｘ　１００）によりスコアーした。結果を第２表に示す。この 表中、タイターは、標準的アッセイにおいて一夜インキュベーションの後のＨＩ Ｖ−エンベロープ誘導ＣＤ４−依存性細胞融合の完全なブロックのために必要な 名目ペプチド濃度を示す。名目ペプチド濃度は主たる合成生成物、すなわち示さ れる配残を有するがｃ−８６のみが誘導体化されているペプチドについて分子量 に基いて計算される。配列ＬＫＩＥＤＳＤＴＹＩＣＥＶＥＤＱＫＥＥを有する精 製された誘導体化されていないＣＤ４　（７６−９４）はＨＩＶ誘導細胞融合を 阻害する能力により測定された場合、試験した最も高い濃度である≦ｓｏｏｍに おいて不活性であり、抗細胞融合活性のために誘導体化が必須であることが示さ れた。非誘導体化ペプチドの純度はＦＡＢ−？！Ａ及び配列決定により確認され た。

ＣＤ４　（７６−９４）のＮ−末端の７残基が除去されているペプチドの合成か らの樹脂後混合物は旧Ｖ−誘導細胞融合をブロックするわずかに低下した能力を 有していた。　ＣＤ４（７６−９４）のＮ−末端の８残基が除去された誘導体化 ペプチドの合成からの樹脂後混合物は≦５００．ｍにおいて融合阻害活性を有し なかった。

カルボキシ末端の６アミノ酸が除去されたペプチドの合成からの樹脂後混合物も ≦５００岸において融合阻害活性を有しなかった。これらの結果は、組成物中の アミノ酸の少なくとも１個が誘導体化されているアミノ酸のコアー配列Ｔ−Ｙ− Ｉ−Ｃ−Ｅ−Ｖ−Ｈの最小要件を示した。

男−」し−表 ＣＤ４由来合成ペプチド組成物に よるＨＩＶ−誘導細胞融合の阻害 ペプチド配列（１）・（３）　タイター（２）ＬＫＩＥＤＳＤＴＹＩＣｂｔｔＥ ＶＥＤＱＫＥＥ　（４’　６０ｍＫＩＥＤＳＤＴＹＩＣｂ−ｔＥＶＥＤＱＫＥＥ 　１２５ｍＥＤＳＤＴＹＩＣｂ−ｔＥＶＥＤＱＫＥＥ　”’　１２５ｍＳＤＴＹ ＩＣｂｇｔ　ＥＶＥＤＱＫＥＥ　１２５ｍＴＹＩＣｂ、ＬＥＶＥＤＱＫＥＥ　（ ４’　１２５洲Ｙ）Ｃｂ−ｔＥＶＥＤＱＫＥＥ　不活性Ｌｌ！［ＩＥＤＳＤＴＹ ＩＣｂｓｔＥＶＥＤＱＫＥ　１２５ｍＴＹＩＣｂ−ｔＥＶＥＤＱＫＥ　１２５ｍ ＴＹＩＣｂ−ｔＥＶＥＤＱＫ　２５０ＪＩＭＴＹＩＣｂ−ｔＥＶＥＤＱ　２５０ ｍ ＴＹＩＣｂ−ｔＥＶＥ　ｓｏｏｍ ＹＩＣｂ−ｔＥＶＥ　不活性 （１）試験された調製物はｔ−Ｂｏｃ　’＋去により調製された樹脂後ペプチド 混合物であり、ＨＰＬＣにより均一でなかった。

（２）「不活性」は試験した最も高い濃度である５００−において抗−細胞融合 活性が存在しなかったことを示す。

（３）　Ｃｂ−ｔの標示は、側鎖保護基としてバラ−メチルベンジルではなくベ ンジルを用いて行われた合成を示す。示される配列は主たる合成生成物について 予想される名目ペプチド配列を示す。

（４）　ＨＰＬＣ分画された樹脂後混合物のＦＡＢ、ＭＳ分析は、示される混合 物がＣ−８６及び他の少なくとも１個のアミノ酸残基が誘導体化されていること を示した。

ＣＤ４　（７６−９４）のカルボキシ末端の６アミノ酸がペプチドのカルボキシ 末端から除去されそして生来のＣＤ４中に見出されるのとは異る順予て分子のア ミノ酸末端に加えられた誘導体化ペプチドの合成からの樹脂後混合物は活性を有 さす、ＨＩＶ−誘導細胞融合の粗害を得るためのペプチドの配列特異性の要件が さらに示された。さらに、Ｃ−８６がアラニン、セリン又はフェニルアラニンで 置換えられたＣＤ４　（７６−９４）の合成からの樹脂後混合物は活性がなく、 同様にＣ−８６がアラニン、メチオニン又はセリンで置換えられたＣＤ４　（８ ３−９４）の合成からの樹脂後混合物も不活性であった。

融合アッセイにおけるＣＤ４−発現成分として形質転換されたＴ−細胞及び及び 末梢血単核細胞を用いての、ＣＤ４　（８３−９４）（Ｓ−ベンジル保護システ ィンを用いてのｔ−Ｂｏｃ合成）の合成からの樹脂後混合物の１（ＩＶ−誘導細 胞融合を阻害する能力も評価した。細胞をＢ９−旧Ｖ　（Ｈｘ　Ｂ２）及び示さ れた名目濃度の樹脂後ペプチド混合物と共に３７℃にて３０分間プレーインキュ ベートした０次に、フィトヘマグルチニン（１，ｑ／ａｄ２、Ｂｕｒｒｏｕｇｈ ｓ＋Ｂｅｃｋｅｎｈａｒｎ、イングランド）により刺激されたＶＢ細胞又は末梢 血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＢ９−旧ｖ　（Ｈｘ　Ｂ２）細胞及びペプチドニ４８ 時間加え、そして３７°Ｃにて２４時間培養し、この時点で融合細胞（ｓｙｎｃ ｙｔｉａ）をスコアーした。第２表の結果が示すところによれば、ペプチドは一 次ＣＤ４−発現細胞及び形質転換されたＣＤ４−発現細胞の両者のＣＤ４依存融 合をブロックした。

ＰＨＡ活性化新鮮ヒト末梢血単核細胞と比較したＶＢ指示細胞のＨＩＶ−誘導細 胞融合を阻害するＣＤ４　（８３−９４）樹脂後混合物の比較量　ＰＨＡ　ＰＢ ＭＣｓ　ＶＢ ３２オ　３４ １６　ｍ　４　４ 他の旧Ｖ単離体及びＳＩＶにより誘導される細胞融合をブロックするペプチドの 能力を評価するため、ウィルス単離体）１１Ｖ−ＩＴ３、ＨＩＶ−１ｏｖ、ＨＩ Ｖ−ＩＨｘｍｚ又は５ＩＶｕｃＤａｖ＝ｓを感染させたＨ９細胞（５０，０００ ）を９６−ウェルマイクロタイタープレート中でＣＤ４　（８３−９４）　ＢＺ Ｌと共に３７°Ｃにて１時間ブレインキュベートした。各感染された細胞系にお けるウィルス発現のレベルは、熱失活したウシ胎児血清を１０％補充された５０ Ｊ容のＲＰＭ１１６４０中テ５０．００中細５０Ｂ細胞（ＨＩＶ−１惑染細胞） 又は５０，０００個（７）ＨｔｌＴ−７８ｍ胞（ＳＩＶｉ染細胞）との同時培養 の隙に、すでに報告されているようにしてスコアーされた参照単離体）ＩＸＢ２ についてすでに報告されているちとと類似の速度及び頻度での融合細胞の形成を 可能にするのに十分であった。示された結果は同時培養の開始後２４時間目の結 果である。−二２個のウェル中で観察可能な融合細胞又は前−融合集合体なし； ４：ペプチド処理熱しで観察される数に比べて最大数の融合細胞。下記の第４表 に示すように、ＣＤ４　（８３−９４）の合成（ｔ−Ｂｏｃ合成、Ｓ−ベンジル 保護システィン）からの樹脂後混合物も６３〜２５０−の主たる合成生成物の名 目ペプチド濃度でのＳＩＶ及び２種類の他の旧■単離体により誘導される融合を 完全に阻害したが、しかし、ＣＤ４−非依存性ヒトレトロウィルスであるＨＴＬ Ｖ−Ｉにより誘導された細胞融合を阻害をなんら示さなかった（示してな）１１ Ｖの幾つかの単離体及びＳＩＶにより誘導される融合を阻害するＣＤ４　（８３ −９４）の樹脂後混合物の能力３２＄　４　４　４　４ １６ｄ　４　４　４　４ （１）カリホルニア、デービス、カリホルニア地方霊長類センター、Ｐｒｅｓｔ ｏｎ　Ｍａｒｘ博士から入手。

（ｂ）混合白血球反応に対する効果 抗細胞融合活性を有する樹脂後混合物を分析して、これらがＣＤ４抗原に関連す る正常な機能に影響を与えるか否かを混合リンパ球反応アッセイを用いて決定し た。

末梢血単核細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ上での密度遠心により、スタン ホード大学血液銀行で健康な志願者から得たヘパリン処理した全血から単離した 。細胞を、１０％（ν／Ｖ）熱失活ヒト男性ＡＢ血清１−グルタミン及び抗生物 質を補充したＲＰＭＩ−１６４０中に懸濁した。一方行混合白血球培養を、丸底 ９６−ウェルマイクロタイター中で、全容量２０Ｏｄ中５Ｘ１０’　レスボンダ ー細胞及び同数の照射された（３０００Ｒ）刺激細胞／ウェルを用いて３連で行 った。測定は、１２５−の名目濃度（主たる合成生成物について）にて樹脂後混 合物を用いて行った。細胞を空気中加湿５％ＣＯ□中３７°Ｃにて６日間培養し 、次に〔３Ｈ〕−チミジン（１μＣｉ／ウェル）によりパルスし、そして７日目 にガラス繊維フィルター上に回収した。次に、ＤＮＡ中に取り込まれた標識され たチミジンを、同種抗原−誘導細胞増殖の指標としてシンチレーション計数によ り測定した。

旧■−誘導細胞融合を完全にブロックしたＣＤ４（７６−９４）の合成からの樹 脂後混合物を含めて試験した樹脂後ペプチド混合物はいずれも、混合白血球反応 に対する有意な阻害効果を有しなかった。

（ｃ）ウィルス感染性に対する効果 無細胞ＨＩＶピリオンの感染性を阻害する樹脂後ペプチド混合物の能力を、Ｎａ ｒａら、ＡＩＤＳ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　ＨｕｍａｎＲｅｔｒｏｖｉｒｕ ｓｅｓ（１９８７）　３　：２８３のアッセイを用いて評価した。

１００〜２００融合細胞形成ユニットの［（ＴＬシーＩＩＩＢ又は）ＩＩＶ−２ （感染したＨ９細胞からのあらかじめタイター測定した凍結ストック）をリン酸 緩衝液中で２５°Ｃにて６０分間、示された濃度の樹脂後混合物又はＩ（ＰＬＣ 分画された樹脂後混合物と共にプレーインキュベートした。次に、ウィルス−ペ プチド混合物又はウィルスのみをＣＥＭ−ＳＳ細胞と共に３７°Ｃにて６０分間 インキュベートして細胞へのウィルス吸着を可能にした。培地を除去し、そして 追加のペプチドを含むか又は含まないＲＰＭ１１６４０／１０％ウシ胎児血清で 置換して所望の濃度を維持した。３日目に細胞に新鮮な培地を再供給し、そして ５〜６日後に細胞のコンフルエンシーが達成された後に融合細胞を計数した。こ れらのデーターを第５表に示す。

ＣＤ４　（７６−９４）樹脂後ペプチド混合物によるＣＥＭ−５Ｓ細胞ノＨＩＶ −１及び旧Ｖ−２感染の阻害２５０−　〇、００３　０．１０ １２５　ＡＩＭ　Ｏ，００３０，３４ ６３オ　０．００３　０．６０ ３２オ　０．００３　（イ）、７１ １６禮　０．１５　０．７９ ８オ　０．３３　０．８０ ４オ　０．４７　０．９５ ２−　〇、７８　＞　１．００ （１）アッセイのウィルス接種期及びこれに続く、融合細胞の計数までの培養期 の両方においてペプチドが示された濃度で存在した。

（２）　（Ｖｎ／Ｖｏ）　：ペプチドの存在下でのコンフルエンス（ウィルス感 染後５〜６日）でのウェル当り融合細胞数（Ｖｎ）をペプチドの非存在下でのコ ンフルエンスにおけるウェル当り融合細胞数（ｖＯ）により除したもの。

樹脂後ペプチドＣＤ４　（７６−９４）混合物がＣＥＭ−ＳＳ細胞の感染及び融 合細胞の形成を阻害することを確認するため、ＨＩＶ−１ウイルス抗原ｐ２４を 、感染後６日目の培養上滑中で、細胞が観察されそして融合細胞について定量し た時点で測定した［Ａｒｔｈｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ　（１９８７）８４：８５８３により記載されているようにして］。ウィ ルスの非存在下でＨＴＬシーＩＩＩＢを接種した二連の培養物は平均濃度６８ｎ ｇ／Ｉｄのｐ２４を含有していた。５０Ｍ　ＣＤ４（７６−９４）ペプチド混合 物の存在下（ペプチドへの更なる暴露はなし）でＨＴＬＶ−ＩＩＩＢを接種した 二連の培養物は、接種後６日目に上清を分析した場合、平均４．６　ｎｇ／　ｒ ｎｆｌのｐ２４を含有していた。

Ｃ０旨′°ム　の活　ゝの　−び６ （ａ）生物活性画分の分画及び同定 （１）　ＣＤ４　（７６−９４） Ｖｙｄａｃ　Ｃ８（１０Ｘ２５０　ｍｍ）結合相半分取用カラム上での１．８　 ｍｇのＣＤ４　（７６−９４）　（ｔ−Ｂｏｃ合成；Ｓ−メチル−ベンジル保護 システィン）の代表的クロマトグラムを第１図に示す。

材料は、１０１酢酸アンモニウム（ｐＨ７，０）に溶解した樹脂後ＣＤ４　（７ ６−９４）であった。移動相は（Ａ）酢酸アンモニウム緩衝液及び（Ｂ）　２０ ％酢酸アンモニウム緩衝液及び８０％アセトニトリルであった。移動相中のＢの ％は示されているように（破線）変化させた。保持時間２〜３分、３〜４．５分 、４５〜５分、及び５〜８．５分で溶出する材料を幾つかの半分取試行からプー ルし、凍結乾燥し、秤量し、そして前記の融合アッセイにおいて５００〜３０岸 の名目濃度でバイオアッセイにかけた。生物活性（斜面の棒）を抗細胞融合活性 のドーズ／両分として示す。（１ドーズは、標準的アッセイ条件下で２４時間に わたり、５０，０００個（７）ＨＴＬＶ−１１１Ｂ／ｌ（９細胞と５０．０００ 個（７）ＶＢ指示細胞との間の融合を完全に阻害するのに必要な特質の最少量で ある）。

（ｉ　ｉ）　ＣＤ４　（８３−９４） Ｓ−ベンジル保護システィンを用いてｔ−Ｂｏｃ法により調製されそして１０１ 酢酸アンモニウム（ｐ）１７．０）に？’４Ｍした１０■のＣＤ４　（８３−９ ４）を、Ｖｙｄａｃ（ＩＯＸ　２５０ｍｍ）結合相半分取用カラム上でクロマト グラフ処理した。代表面なりロマトグラムを第２図に示す。移動相は（Ａ）酢酸 アンモニウム緩衝液及び（Ｂ）２０％酢酸アンモニウム緩衝液／８０％アセトニ トリルであった。移動相中のＢの％は示されているように（破線）変化させた。

生物活性（斜線の棒）を細胞融合活性のドーズ／画分として表わす。（１ドーズ は、標準的アッセイ条件下で２４時間にわたり５０．０００個のＨＴＬＶ−ＩＩ ＩＢ／Ｈ９細胞と５０．０００個のＶＢ指示細胞との間の融合を完全に阻害する ために必要な物質の最少量である。） （ｂ）　ＦＡＢ−ＭＳによる生物活性ピークの分析（ｉ）　ＣＤ４（７６−９４ ） 第１図に示すように、樹脂後混合物中に存在するすべての生物活性（抗細胞融合 活性）は、保持時間５〜８．５分を有する一連のピーク（斜線領域）中に溶出し た。主ピーク（３〜４．５分間の保持時間）及び生物活性物質が溶出したクロマ トグラムの斜線領域のアリコートを、５ＫＶ加速電圧及び３００の名目分離能で 作動する通常の形状のダブルフォーカシングマグネチックセクターを有するＪＯ ＥＬ　Ｈχ−１００ＨＦを用いて、Ｌｅｅ（ｒペプチド及び蛋白質のファスト・ アトム・ボンバードメント及び二次イオン質料分析法、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　 Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍｉｃ−ｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ、　Ｊ、Ｅ、 ５ｈｉｖｅｌｙ　’ｆ５集、Ｔｈｅ　Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｃ１１ｆ　ｔｏｎ、　＋＋　ニーシャーシー、４０３−４４１頁、１９８６）に より記載されているようにして、ファスト・アトム・ボンバードメント−質量分 析にかけた。主ピークは、目的のペプチドＬＫＩＥＤＳＤＴＹＩＣＥＶＥＤＱＫ ＥＥの質量に一致する親フラグメント質量（Ｍ　＋　Ｈ・２２８７）　、及び親 フラグメントの質量からＨ２Ｏ（１８原子質量単位）を引いた質量２２６９のフ ラグメントを与えた。主ピークは測定可能な抗細胞融合活性を有していた。斜線 領域中の物質は親Ｍ　＋　Ｈ（２２８７）及び親ペプチドの大規模な誘導体化に 相当する多数のより高い分子量ピークを含む複雑なマススペクトルを第２図に示 すように、生物学的に活性なペプチドは８〜１０分間の保持時間を存するピーク ７中に溶出した。主査白質ビーク（４，５〜６．０分間の保持時間）及びピーク ７のアリコートをＬｅｅ　（前記参照のこと）に記載されているようにしてＦＡ Ｂ−ＭＳにかけた。測定可能な抗細胞融合活性を有しない主ピークは、配列ＴＹ ＩＣＥＶＥＤＱＫＥＥ　（ここで、Ｃ残基はベンジル置換基を有する）を有する ペプチドの質量に一致する親フラグメント質料（Ｍ＋Ｈ・１５７６）を与える。

８〜１１分間の保持時間において溶出する生物学的に活性な物質は親Ｍ　＋　Ｈ （１５７６）及び親ペプチドの大規模な誘導体化に一致する多数の高分子量ピー クを含む複雑なマススペクトルを示した。

（ｃ）異種８１ν単離体のウィルス感染性に対する生物活性断片の効果 多数定義される異種旧■単離体の感染性を阻害するペプチド調製物の能力も評価 した。ＣＤ４　（８３−９４）の自動固相合成（ｔ−Ｂｏｃ合成；Ｓ−ベンジル 保護システィン）からの証明された抗細胞融合活性を有する樹脂後混合物のＨＰ ＬＣ分画された調製物（ビーク７；第２図を参照のこと）を、多数ＨＩν単離体 の感染性に対するその効果について試験した。

種々のＨＩＶ単離体の感染の動態をＤＥＡＥ−デキストラン前処理ＣＥＭ−ＳＳ 細胞を用いて標準化した。ＣＤ４　（７６−９４）　ＢＺＬの抗−ウィルス効力 に対するＤＥＡＥ−デキストランの添加の効果を決定するため、ウィルスのイン プットとしてのＨＴＬＶ−ＩＩＩＢの単一ストック及びプロトタイプ抗−ウイル ス化合物としてのＣＤ４（７６−９４）樹脂後ペプチド混合物を用いて、ＤＥＡ Ｅ−デキストランの存在下及び非存在下で平行実験を行った。ＤＥＡＥ−デキス トランの非存在下で、ウィルスストックの１＝２稀釈物は１５８±３８（標準誤 差）融合細胞／エウル、並びにペプチドの名目濃度５．５０及び５００オにおい てそれぞれ０．７７　、０．１０及び０．００３のＶｎ／Ｖｏ値（二連測定の平 均）をもたらした。ＤＥＡＥ−デキストランの存在下で、ウィルスストックの１ ＝２稀釈物は２７０±１６（標準誤差）融合細胞／ウェル、並びにペプチドの名 目濃度５，５０及び５００−においてそれぞれ０．９３　、０．１９及び０．０ ０６のＶｎ／Ｖｏ値（二連測定の平均値）をもたらした。

ＨＴＶ−１（７）株）ＩＴＬＶ−ＩＩＩＢ、　ＲＦ４１．　ＭＮ及びｃｃのウィ ルスストックを、ＨＩＶ感染Ｈ９細胞からの新鮮な又は凍結された細胞上清とし て調製した。ＰＢＳ又は完全培地中興る名目濃度のペプチドにより前処理された ウィルス接種々をＤＥＡＥ−デキストランで前処理されたＣ１ｕｂ−３Ｓ細胞と 共に３７°Ｃにて１時間インキュベートした。接種物を培養物から吸引により除 去し、そして新鮮な培地又は示される名目濃度のＣＤ４　（８３−９４）　ＢＸ Ｌを含有する培地で置換した。結果（第６表に示す）は、類似の結果をもって少 なくとも１回反復された単一実際の二連の測定の平均（すべて３０％以内の平均 値）である。

旧Ｖ−１（１）の多数の単離体によるＣＥＭ−５Ｓ細胞の感染に対するＣＤ４　 （８３−９４）ピーク７の相体抗−ウイルスカ１２５禮　ｏ、ｏｏｓ　Ｏ，００ ３０，００３ｏ：ｏｏ３６３禮　０．００５　０．４３　０．５４　０．０５３ ２オ　０．００５　０．６９　１．０３　１．０１１６オ　０．０４　０．８４ 　≧１．００　＞１．００８岸　０．３１　≧１．００　２１．００　２１．０ ０４　ｄ　１．０６　、？：１．ＯＯ、Ｔｈ１．００　〉１．００（１）第５表 の肛Ｐ注を参照のこと。

ベンジル　びその　の　２　の　９ ＾、ベンジル　悸　の−１１ 下記の方法の１つを用いて第７表（下記）に示す臭化ベンジル及び他の反応化合 物を用いてＣＤ４　（７６−９４）の一連のベンジル化誘導体及び他のＩＭ（１ ２体を合成した。

１灰上 １．５■の）ＩＰＬｃ−精製したＣＤ４　（７６−９４）を１２０Ｉのアセトニ トリル＋１５０Ｉの脱イオン水及び６０ｐ１の炭酸水素ナトリウム（０，５Ｎ） に溶解した。２００Ｉのアセトニトリルを加え、次に４０モル過剰の臭化ベンジ ル又は他の反応化合物（第７表を参照のこと）を加えた。この混合物を室温（約 ２０〜２５°Ｃ）にて１時間インキュベートし、次に２４のトリエチルアミンを この反応混合物に加え、これをさらに室温にて１時間反応せしめた。４０ｍの炭 酸水素アンモニウム（ＩＭ）を加え、次に１時間後に反応混合物を遠心真空濃縮 器中で濃縮乾固した。粉末をＰＢＳに再溶解し、そして細胞融合アッセイ（実施 例１．Ｂ。

に記載されている）において直接使用した。

１塁１ 反応中にトリエチルアミンの添加を回避した点を除き、この方法は方法１と同じ である。乾燥粉末をＰＢＳ＋１０％テトラヒドロフラン及び等量のクロロホルム に溶解した。この混合物を過流攪拌し、次に水相及び界面を集め、そしてバイオ アッセイのために使用した。

去塁１ １■のＨＰＬＣ精製したＣＤ４　（７６−９４）を４０１１！０６０％アセトニ トリル及び４０〜８０ｍの炭酸水素ナトリウム（０，０５Ｍ）に溶解した。次に 、８モル過剰の臭化ベンジル又は他の反応化合物（第７表を参照のこと）をＣＤ ４　（７６−９４）溶液に加え、そして室温にて６時間反応せしめた。反応の完 了の後、生成物を遠心真空濃縮により乾燥し、そして次に５１炭酸水素ナトリウ ムに溶解した。次に、１容量のＰＢＳを加えた。次に、この溶液を同容量のクロ ロホルムと混合し、混合の後に分配させた。

クロロホルム相を除去し、そして水相をバイオアッセイのために使用した。

去叛玉 実施例１．Ａに記載したようにして調製された精製されそして誘導体化されてい ないＣＤ４　（７６−９４）を、Ｅｒ１ｃｋｓｏｎら、Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅ＋ ａ、　Ｓｏｃ、（１９７３）９５：１１の方法に従ってα−ブロモトルエン又は α−ブロモキシレンと共にインキュベートすることによりベンジル化した。要約 すれば、５■（２，２μｍｏｌ）のＣＤ４　（８３−９４）を１．４　ｍのトリ エチルアミン（ｌｌｍｍｏｌ）に溶解し、そして１．２２■の４−メチルベンジ ルプロミド（７，１μｍ０１）を加えた。この混合物を攪拌しなから２５°Ｃに て６時間反応せしめた。生ずる生成物を１．５時間真空蒸発せしめ、０．０１ｍ Ｍ酢酸アンモニウム中に再懸濁し、そして凍結乾燥した。凍結乾燥した物質をリ ン酸緩衝液に再溶解し、そして融合阻害活性について試験した。

Ｂ、Ｓ−ベンジル憬　のη゛告 ＣＤ４　（８３−９４）のＳ−ベンジル誘導体を次の方法の１つにより１１Ｌｋ ７．１μモルのα−プロモキシレンヲ、実施例２Ａ（ｂ）ニ記載したようにして 調製しそしてＨＰＬＣにより精製した２、２ｈモルのＣＤ４　（８３−９４）　 （ピーク４、第２図を参照のこと）に加え、１、５　ｍのトリエチルアミンに溶 解し、次に室温にて１６時間攪拌した。揮発物質を真空下で除去し、そして残渣 を１０＋ｏＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ７，０）に溶解し、１容量のクロロホルム で抽出し、そして得られた水相を反復して凍結乾燥した。

方叛ｌ 実施例１．Ｃに記載したようにしてＨＰＬＣにより精製した５■のＣＤ４　（８ ３−９４）　（第２図、ピーク４）を、実施例２、方法１に記載したようにして 化学的誘導体化にかけた。生ずるペプチド誘導体を蒸発乾燥し、水中に再熔解し 、１容量のクロロホルムで抽出し、そして水相を凍結乾燥し、実施例１に記載し たようにして抗細胞融合活性について試験した。力価を、ＨＩＶＭＸＩ！〜によ り誘導される細胞融合を完全に阻害することができるペプチド混合物の低低濃度 （インプット・ペプチドの質量及び親ペプチドＴＹＩＣＥＶＥＤＱＫＥＥの分子 量に基く名目濃度）として表現する。

Ｃ３Ｓ−ベンジル　゛　の　１八に・　る六　の　ゞ（ａ）　ＣＤ４（７６−９ ４） 固相合成（ｔ−Ｂｏｃ合成；Ｓ−バラメチル−ベンジル保護システィン）により 調製されそしてベンジル化又はキシリル化により合成後に誘導体化されたＣＤ４ 　（７６−９４）の誘導体の抗細胞融合活性を比較した（第７表を参照のこと） 。

ベンジル又はキシリル誘導体としての ＣＤ４　（７６−９４）抗−細胞融合活性の比較調　製　物　活性（１） ＣＤ４（７６−９４）　Ｌ２）　不活性キリシルＣＤ４　（７６−９４）　１２ ５団ベンジルＣＤ４（７６−９４）　６３　ｍ（１）不活性＝抗細胞融合活性が り５００−において無し。

（２）　ＨＰＬＣ，ＦＡＢ−ＭＣ及びアミノ酸配列により確認された純度及び構 造を有するＨＰＬＣ精製された真正なＣＤ４　（７６−９４）従って、これらの 合成後誘導体化ペプチドの両者は活性であった。該導体化されていない精製され たペプチドは不活性であった。

（ｂ）　ＣＤ４　（８３−９４） 誘導体化ＣＤ４　（８３−９４）の３種類の調製物の抗−細胞融合活性も比較し た。３種類の調製物は、（Ａ）　Ｓ−ベンジル保護システィンと共にｔ−Ｂｏｃ 法を用いてＴＹＩＣＥＶＥＤＱＫＥＥの固相合成により実施例１．Ｃに記載した ようにして得られたペプチド混合物、ＴＹＩＣｂ、ＥＶＥＤＱＫＥＥ　ｉ　（Ｂ ）前記（Ａ）　ニ記載シタベフチト混合物のＨＰＬＣ画分（第２図、ピーク４） により得られた精製されたＳ−ベンジル−ＣＤ４　（８３−９４）　；及び（Ｃ ）前記実施例２Ｂの方法２を用いて（Ｂ）の合成後誘導体化により得られたペプ チド混合物であった。これらの結果を下の第８表に示す。

ＣＤ４　（８３−９４）の固相合成類似体及び合成後類似体の抗−細胞融合活性 の比較 測定される物質　調製方法　名　目力価Ａ、ＣＤ４（８３−９４）　固相、樹脂 　２５〇−Ｂ、ＣＤ４（８３−９４）の　固相、ＨＰＬＣ後　、　不活性ピーク ４ Ｃ，ＣＤ４　（８３−９４）の　ＩＩＰＬｃ後ピーク４２５０オ［ピーク４］　 ＢＺＬ　の合成後類似 体されるように、樹脂後ペプチド混合物及び合成後ベンジル化ＣＤ４　（８３− ９４）のみが生物学的に活性であった。Ｓ−ベンジル保護システィンを用いてｔ −Ｂｏｃ法により調製されたＨＰＬＣ−精ＣＤ４　（７６−９４）（１）の誘導 体反　応　化　合　物　調製法　タイター（２）１、臭化ベンジル　１．２，３ 　６０〜１２０國２、臭化キシリル　１　細胞毒性 ３．２−クロロプロミド　３　６０〜１２０オ６、　な　し　不活性 （１）試験された調製物はＨＰＬＣにより均一ではなかった。

（２）　５０Ｍは試験した最高濃度であった。すべての濃度は反応中に使用した ペプチドの量に基く名目濃度である。示されたタイターは、−夜インキュベーシ ョンの後における、旧Ｖにより誘導される細胞融合の完全なブロックのために必 要な濃度を示す。

前記のようにして合成された誘導体を、実施例１．８　（ａ）に記載した細胞融 合アッセイを用いて、融合細胞の形成を阻害するそれらの能力について評価した ０次の結果が得られた。

第９表（前記）に示すように、ＢＩＶにより誘導される細胞融合を阻害するＣＤ ４　（７６−９４）の誘導体には、臭化ベンジル、臭化２−クロロベンジル、４ −（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシサ クシンイミド゛エステル又は３−（２−ピリジルチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロ キシサクシンイミドエステルを用いて調製されたものが含まれる。ナフチル反応 化合物を用いて調製された２種類の誘導体は試験した濃度において無効であった 。「Ｎ−末端」−ｔ−Ｂｏｃ−ブロックベンジルシスティン及びＣＢＺ−ブロッ ク「Ｎ−末端」−ブロックベンジルシスティンは試験したすべての濃度（５０Ｍ まで）においてＨＩＶにより誘導される細胞融合に対して効果を有しなかった。

裏施１゜ Ｆ−ｍｏｃ法による’ａＬＵ　Ｏム 一連のＣＤ４−由来合成ペプチド誘導体も、Ｆ−ｍｏｃ法を用いて合成した。Ｆ −ｍｏｃ法の側鎖保護は、ｔ−ブチル（Ｄ、　Ｅ、　Ｓ、　Ｔ、　Ｙ）、ｔ−Ｂ ｏｃ（Ｘ）、トリチル（Ｈ）　、ＤＭＴＲ（Ｒ）　、ベンジル（Ｃ）、幾つかの 場合にはベンジル（Ｅ、Ｃ，Ｙ、Ｔ）　、及びクロロベンジルアミド（Ｅ、Ｃ， Ｙ、Ｔ）であった。合成の終りで、アニソールを伴う又は伴わない３０％ジメチ ルスルフィドを含存する７０％トリフルオロ酢酸（０，１容量のＴＦＡ）の添加 により、ペプチドを側鎖脱保護しそして樹脂から開裂せしめた。方法の残りはｔ −Ｂｏｃ法について実施例１．Ａに記載したのと類似していた。

第１０表に示す配列を有する誘導体化されたペプチドを調製した。

ＣＤ４−由来合成ペプチド組成物 による旧Ｖ誘導細胞融合の阻害 番号　化　合　物　力価（犀）　純度 （１）略号は次の通りである。Ｂｚｌ・ベンジル；　Ｃｆ−Ｂｚｌ・クロロベン ジル、　ＡＣ？＋−アセトアミド。

自動合成から得られた樹脂後混合物をファスト・アトム・ボンバードメント−マ ススペクトル法（ＦＡＢ−？ＩＳ）により分析して成分ペプチドの同一性を決定 した。樹脂後混合物をＣ８逆相カラムを用いるＦＰＬＣにより成分ペプチドに分 離し、そして次にＶｙｄａｃ　Ｃ１８逆相カラムにより精製した。前記の細胞融 合アッセイを用いて活性画分を同定した。次に、こうして同定された両分をＦＡ Ｂ−ＭＳ（Ｌｅｅ、前掲）により分析した。サンプルを異るマトリクスを用いて ６　Ｋｅｖキセノンによりイオン化した。樟脳硫酸中ジチオスレイトール：ジチ オエリスリトール（５：１）のマトリクスを用いて陽イオンスペクルを得た。

陰イオンスペクトルについてはグリセロールマトリクスを用いた。ＴＥＯＬ　Ｄ Ａ５００データー系をいてコンピューター制御のもとにスペクトルをスキャンニ ングしそして集めた。構造的解釈は、陽及び陰フラグメントイオン系の両者を基 礎にした。

抗細胞融合活性を有する断片においては、ペプチドのシスティン及びグルタミン 酸又はアスパラギン酸残基を、示されるようにベンジル又はクロロベンジルによ り修飾した。これらのデーターを下記の第１１表に要約する。

抗−細胞融合活性を有する組成物のＦＡＢ−ＭＳ分析Ｎａｒａらの標準的ＣＥＭ −ＳＳを基礎とするアッセイ系を、ウイルスのライフサイクルの種々の段階での 誘導体化されたペプチド調製物の抗−ＨＩＶ活性を決定するために改変した。標 準的アッセイにおいて、ペプチド調製物をウィルス接種物と混合し、次にこのウ ィルス／ペプチド混合物を用いてＣＥＭ−ＳＳ細胞単層に３７°Ｃにて１時間接 種した。この１時間のインキュベーションの後、ウィルス／ペプチド混合物を吸 引し、そして培養の残りの６日間にわたり、所望の濃度においてペプチドを含む か又は含まない新鮮な場合で置換した。ペプチドの種々の抗ウイルス効果を区別 するため改変アッセイを開発した。

異る動態期へのアッセイの分割がウィルスのライフサイクルの異る時期における ペプチドの効果の試験を可能にする。例えば、最初の１時間のウィルス吸着の間 にのみ存在し培養の他の期間には存在しないペプチドを有することにより、ウィ ルス結合／吸着過程のみに対するペプチドの効果の特異的評価が可能となる。同 様に、吸着期間にペプチドが存在せず、そしてウィルス接種物の除去の後に添加 されれば（１時間結合／吸着期の終点）、吸着後過程に対するペプチドの効果を 検討することができる。ウィルス感染及び複製の早い時期に対するペプチドの効 果は、播種期から培養の４８時間目にまでのみ存在するペプチドを有することに より検討することができ、そして培養の４８〜１４８時間に存在するペプチドの 効果を試験することにより感染／ウィルス複製の後段階に対するペプチドの効果 と比較することができる。最後に、所与の培養の接種の後に得られる感染した細 胞の実際の数の減小に対するペプチドの効果を、二次ＩＣＣ培養において得られ た感染中心を定量することにより評価することができる。

改変ヱヱ立ヱ抜 ペプチドを本明細書に記載するようにして調製し、そしてＬｉｆｓｏｎら（１９ ８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１ニア１２−７１６に記載されているようにして精製 した。ＨＩＶ感染についてのＣＥｌ’１−ＳＳ融合細胞形成マイクロアッセイ［ ＣＥＭ−ＳＳ／ＳＦＡ／ＨＩＶＩを木質的にＮａｒａ３（１９８７）　ＡＩＤＳ Ｒｅｓ、Ｈｏｍ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　３：２８３−３０２に記載されて いるようにして、下記の変更を加えて行った。。要約すると、慢性感染したＨ９ ヒトリンパ芽球細胞の上清から得た旧Ｖ−ＩＨＴＬＶ−１１１□又は旧Ｖ−ＩＲ Ｆ−１□の凍結ウィルスストック室温にて解凍し、抗生物質を含有するＲＰＭＩ −１６４０／１０％ＦＢＳに稀釈し、そして０．１〜１４０酵炭酸水素ナトリウ ムを含有するＲＰＭＩ−１６４０ＰＢＳ又はＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ に、あるいはさらに種々の濃度のペプチドを含有する同じ溶液に１　：　１　（ Ｖ／Ｖ）で加えた。これらの混合物を２５°Ｃにて６０分間インキュベートした 。ペプチドの存在下又は非存在下ののウィルス接種物５０ｍを、５０，０００個 の細胞を含み培地がピペットで吸い取られた９６−ウェルプレート・ポリーＬ− リジンコートウェルに加えた。３７°Ｃにて１時間ウィルスを細胞に吸着させた 後、ウィルス接種々を含有する培地を除去し、そしてペプチドを含むか又は含ま ない２００ＩのＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳで置換した。細胞を３７°Ｃ にて加湿雰囲気中５％Ｃ（ｈ／９５％空気中でインキュベートした。４８時間後 、ペプチドを含むか又は含まない新鮮な培地で置換した。７２〜９６時間後（細 胞の単層がマンスルエンシーに増殖した後）、このウェルを倒立顕微鏡下で観察 し、そして融合細胞の数をカウントした。Ｖｎ／Ｖｏを、処理ウェル中で計数さ れた融合細胞の数を多数対照（完全なインキュベーションの間のみのウィルス） ウェル中で計数された融合細胞の平均数で除したものである。統計的比較が行わ れる場合、−実験における３個以上の処理ウェルの平均及び３個以上の対照ウェ ルの平均であり、処理群の平均の標準誤差は個々のｒＶｎ／Ｖｏ」値を計算する ことにより得られる。この値において、分母は対照ウェル中の融合細胞の平均の 値であり、そして分子は個々の対照ウェル中の融合細胞の数である。

融合細胞をスコアーした後、各ウェルから培地を除去し、遠心してすべてのＯＥ Ｍ−ＳＳ細胞を取るために遠心し、そしてＢｅ５ｓらにより記載されたラジオイ ムノアッセイによりウィルスル２４抗原レベルを決定するために可溶化緩衝液に 入れた。

ＨＩＶ細胞感染性についてのＣＥＭ−ＳＳ感染細胞センターアッセイ（ＩＣＣ） 　［ＣＥＭ−ＳＳ／ＩＣＣ／ＨＩＶＩ　を次の様にして行った。ＳＦＡ中のウィ ルス接種の５〜６日後に、培地（ＨＩＶ−１が接種され、そして上記のように先 行する５〜６日間種々の時間にわたりペプチドの存在下又は非存在下でインキュ ベートした、約１．ＯＯＯ，０００個の細胞を含有する）をｐ２４　ＲＩＡのた めに個々のウェルから取り出し、そしてウェル中の細胞をＲＰＭＩ−１６４０中 に再懸濁し、遠心して残留ペプチドを除去し、そしてＲＰＭＩ−１６４０／１０ ％ＦＢＳ中に５００〜ｓｏ、ｏｏｏ細胞１５０ｐ１で再懸濁した。これらの細胞 懸濁液を、前記のようにしてポリーＬ−リジン被覆９６−ウェルプレートのウェ ル上にプレートされた５０Ｊ１１の培地中の５０．０００個の新鮮なＣＥＭ−Ｓ Ｓ細胞に添加した。細胞を３７°Ｃにて４８時間、加湿したＣ０２／空気中で同 時インキュベートし、そして各ウェル中で計数された融合細胞を、前のＳＦＡに 由来する細胞集団の細胞関連感染性の指標とした。

ＣＥＭ−ＳＳ　）ＩＩＶの感染性アッセイの異る動的時期に対するＣＤ４ペプチ ドの効果対照Ｖｏは１２１．３±１６．９（Ｓ、Ｃ，Ｍ、　、Ｎ、１０）　、対 照ＩＣＣは２８２±４．７（ｓ、ｅ、ｗ、、ｎ＝６）　；対照ｐ２４は１７５． ８±５６ｎｇ／ＩＩｄｌ（ｓ、ｅ、＋ａ、、ｒ＋＝１０）。

ＣＥＭ−ＳＳ　ＨＩＶ感染性アッセイの異る時期に対するＣＤ４ペプチドの効果 坦Ｖ−１−近±Ｌ里級生 対照Ｖｏは２２０．５±８４　（Ｓ、Ｃ，Ｍ、　、　Ｎ＝８）　；対照ＩＣＣは １０２±２６（ｓ、ｅ、ｍ、　ｎｓ＋５）；対照ｐ２４は２．３±０．３５ｎｇ ／　ａｆｆｉ（ｓ、ｅ、ｍ、、ｎ＝８）。

第１２表及び第１３表に示すように、異る時期に分けたこれらの測定法を用いる ペプチドの研究は、＜１）　Ｔ２ＯＴＥ−Ｂｚｌ；（２）Ｔ４ＤＴＥ−３−Ｂｚ ｌ　（ｒピーク７」）；及び（３）　Ｔ（Ｂｚｌ）ＹＩＣ（Ｂｚｌ）Ｅ（Ｂｚｌ ）ＶＥＤＱＫＥＥがウィルスのライフサイクルの多数の異る時期にわたって活性 を示すことを示した。

さらに、ＬＫＩＥＤＳＤＴＹＩＣＥＥＤＱ）［ＥＥＳＢｚｌ及びＴＹＩＣ（Ｂｚ ｌ）Ｅ（Ｂｚｌ）ＶＥＤＱＫＥＥもウィルスのライフサイクルの多数の異る時期 にわたり活性を示した（データーは示してない）。従って、ウィルスの吸着期に のみ存在するペプチドは読み出しにおけるＶｎ／Ｖ。

値の濃度依存的阻害を示した。ペプチドが培養の全期間にわたって存在する場合 、より大きな阻害が観察された。興味あることには、ウィルス吸着期が完了した かなり後である、培養の４８時間目におけるペプチドの添加が読み出しにおいて Ｖｎ／Ｖｏ値の実質的な濃度依存的阻害をもたらし、ウィルスのライフサイクル の結合／吸着期後に対するペプチドの静ウィルス効果が示されることである。

このような処理された培養物において得られた感染した細胞の数の減少はまた、 二次ＩＣＣアッセイにおいて見られる細胞融合センターの数の減少に基いて示さ れる。

以上の記載から、ＣＤ４依存性レトロウイルスにより誘導される細胞融合及びこ のようなウィルスの感染を阻害する新規な組成物が提供されたことが明らかであ る。この組成物はＨＩＶ−１及び旧Ｖ−２の両方の多くの単離体を含む不均一な 多くの異る単離体に対して効果的である。従って、本発明の組成物はＡＩＤＳ関 連コンプレックスに関連する症状及びＡＩＤＳの感染及び進行に対する保護を提 供することができる。

本明細書中に記載したすべての公表及び特許出願は当業者のレベルを示すもので ある。すべての公表及び特許出願は、個々の公表又は特許出願が具体的に且つ個 々に引用により示されるのと同程度に、引用によりこの明細書に組み込まれる。

本発明は今や十分に記載されており、添付された請求の範囲及び本質から逸脱す ることなく多くの変化及び変更を行うことができることが当業者に明らかであろ う。

手続補正書（方式） 平成３年２月　２日。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒトＣＤ４の少なくとも７個の連続するアミノ酸の配列を含んで成るポリペ プチドであって、該配列中の少なくとも１個のアミノ酸のペプチド結合以外の少 なくとも１個のヘテロ原子が誘導体化基に結合しており、そして該ポリペプチド が少なくとも１種のＣＤ４−依存性ウイルスー誘導細胞性応答を調節することが できる、前記ポリペプチド。 ２．少なくとも１個のヘテロ原子がカルコゲンである請求項１に記載のポリペプ チド。 ３．前記カルコゲンが、ヒトＣＤ４の８６位のシステイン（Ｃ−８６）、８７位 のグルタミン酸（Ｅ−８７）、８３位のスレオニン（Ｔ−８３）、及び８４位の チロシン（Ｙ−８４）の少なくとも１つの上にある、請求項２に記載のポリペプ チド。 ４．少なくとも２個の隣接するカルコゲンが誘導体化基に結合している、請求項 ２に記載のポリペプチド。 ５．前記隣接するカルコゲンが、ヒトＣＤ４の８６位のシステイン（Ｃ−８６） と８７位のグルタミン酸（Ｅ−８７）、又は８３位のスレオニン（Ｔ−８３）と ８４位のチロシン（Ｙ−８４）である、請求項４に記載のポリペプチド。 ６．第三のヘテロ原子が誘導体化基に連結している、請求項４又は５に記載のポ リペプチド。 ７．少なくとも１個の誘導体化基が７〜１２個の炭素原子及び０〜２個のヘテロ 原子を有するアラルキル基である、請求項１に記載のポリペプチド。 ８．前記アラルキル基がベンジル基又はクロロベンジル基である、請求項７に記 載のポリペプチド。 ９．前記配列が、 【配列があります】 （式中、８６及び８７は前記ヒトＣＤ４におけるアミノ酸位置を意味する） を含んで成るコアーを含有している、請求項１に記載のポリペプチド。 １０．前記配列がＴ−Ｙ−Ｉ−Ｃ−Ｅ−Ｖ−Ｅである、請求項９に記載のポリペ プチド。 １１．ヒトＣＤ４の少なくとも１０個の連続するアミノ酸の配列を含んで成る化 合物であって該配列が、【配列があります】 （式中、８６及び８７は前記ヒトＣＤ４中のアミノ酸位置を意味し、そして８７ 位のグルタミン酸の酸素原子が第一誘導体化基の脂肪族炭素原子に結合している ） を含んでおり、前記化合物がＣＤ４−依存性ウイルスー誘導融合細胞形成を阻害 することができることにより特徴付けられる、該化合物。 １２．８６位のシステインの硫黄原子が第二誘導体化基の脂肪族炭素原子又は硫 黄原子に結合している、請求項１１に記載の化合物。 １３．前記第一誘導体化基及び前記第二誘導体化基の少なくとも１つがべンジル 基又はクロロベンジル基である、請求項１２に記載の化合物。 １４．次の方法により製造される組成物：ヒトＣＤ４の少なくとも８個の連続す るアミノ酸の配列を有するポリペプチドを固体支持体上で合成し、該配列は次の 構造： 【配列があります】 （式中、数字８６及び８７は前記ヒトＣＤ４中のアミノ酸位置を意味する） を含んで成るコアーを含有し、ここで前記合成はシステインの側鎖の保護のため にベンジル又は４−メトキシベンジル基を使用しそしてグルタミン酸の側鎖の保 護のためにオキシベンジル基を使用するｔ−Ｂｏｃ法によるものであり；前記ポ リペプチドを前記固体支持体から開裂せしめ、こうして樹脂後混合物を得、そし て ＣＤ４−依存性ウイルスー誘導細胞融合を阻害するものとして特徴付けられる少 なくとも１種のポリペプチドを前記混合物から単離し、こうして前記組成物を得 る。 １５．前記開裂が、前記固体支持体と弗化水素酸とを約−２０℃〜約０℃の温度 において接触せしめることを含んで成る、請求項１４に記載の組成物。 １６．次の方法により製造される組成物：ヒトＣＤ４の少なくとも７個の連続す るアミノ酸の配列を有するポリペプチドを固体支持体上で合成し、該配列は次の 構造： 【配列があります】 （式中、数字８６及び８７は前記ヒトＣＤ４中のアミノ酸位置を意味する） を含んで成るコアーを含有し、ここで前記合成はシステインの置換体としてＳ− ベンジルシステイン又はクロロベンジルシステインを使用し、そして該システイ ン置換体の側鎖保護のためにベンジル基を使用しそしてグルタミン酸の側鎖保護 のためのｔ−ブチル基を使用し； 前記ポリペプチドを前記固体支持体から開裂せしめこれによって樹脂後混合物を 得；そして ＣＤ４−依存性ウイルスー誘導細胞融合を阻害するものとして特徴付けられる少 なくとも１種のポリペプチドを前記混合物から単離し、これによって前記組成物 を得る。 １７．前記開裂が、前記固体支持体と約５０％〜約８０％のトリフルオロ酢酸と を接触せしめることを含んで成る、請求項１６に記載の組成物。 １８．前記組成物が置換されたポリペプチドから本質上成り、ここで８６位のシ ステインの硫黄原子及びペプチド結合以外のヘテロ原子の内の少なくとも１つが アラルキル基の脂肪族炭素原子に連結されている、請求項１４〜１７のいずれか １項に記載の組成物。 １８．ＣＤ４−依存性ウイルスー誘導細胞融合を障害するために使用するための 組成物であって、ポリペプチドから本質上成り、該ポリペプチドはヒトＣＤ４の 少なくとも７個の連続するアミノ酸の配列を有し、該配列は次の構造：【配列が あります】 （式中、８６及び８７は前記ヒトＣＤ４中のアミノ酸位置を意味する） を含んで成るコアーを含有し、ここでＣＤ４の８６位のシステインの硫黄原子は ベンジル基又はクロロベンジル基の脂肪族炭素原子に連結されており、そして前 記配列中の少なくとも１個の他のアミノ酸の酸素原子はベンジル基又はクロロベ ンジル基の脂肪族炭素原子に連結されており、そして前記組成物はＣＤ４−依存 性ウイルスー誘導細胞融合を阻害することができるものとして特徴付けられる、 前記組成物。 ２０．ＣＤ４−依存性レトロウイルスとＣＤ４表面抗原を含んでなる細胞との間 の相互作用から生ずる少なくとも１種の細胞性応答を妨害する方法であって、こ の方法は前記細胞をポリペプチドを含んで成る化合物と接触せしめることを含ん で成り、該ポリペプチドはヒトＣＤ４の少なくとも７個の連続するアミノ酸の配 列を有し、該配列は次の構造：【配列があります】 （式中、８６及び８７は前記ヒトＣＤ４中のアミノ酸位置を意味する） を含んで成るコアーを含有し、ここで８６位のシステインの硫黄原子はベンジル 基又はクロロベンジル基の脂肪族炭素原子に連結されており、そして８７位のグ ルタミン酸の酸素原子はベンジル基又はクロロベンジル基の脂肪族炭素原子に連 結されており、前記化合物を前記細胞性応答を妨害するのに十分な量で用いる、 ことを特徴とする前記方法。 ２１．前記ＣＤ４−依存性レトロウイルスがＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２である、 請求項２０に記載の方法。 ２２．前記細胞性応答がＣＤ４−担持細胞の融合又はビリオン感染である、請求 項２０に記載の方法。 ２３．ＣＤ４−依存性ウイルスー誘導細胞性の応答を妨害するのに有用な医薬組 成物であって、ポリペプチドから本質上成り、該ポリペプチドはヒトＣＤ４の少 なくとも７個の連続するアミノ酸の配列を有し、該配列は次の構造：【配列があ ります】 （式中、８６及び８７は前記ヒトＣＤ４中のアミノ酸位置を意味する） を含んで成るコアーを含有し、ここで８６位のシステインの硫黄原子はベンジル 基又はクロロベンジル基の脂肪族炭素原子に連結されており、そして前記配列中 の少なくとも１個の他のアミノ酸の酸素原子はベンジル基又はクロロベンジル基 の脂肪族炭素原子に連結されており、そして該組成物は前記ＣＤ４−依存性、ウ イルス誘導細胞性応答を妨害することができるものとして特徴付けられる、前記 医薬組成物。 ２４．前記ＣＤ４−依存性ウイルスがＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２である、請求項 ２３に記載の医薬組成物。 ２５．ポリペプチドを含んで成る物質の組成物であって、該ポリペプチドはヒト ＣＤ４の少なくとも７個の連続するアミノ酸の配列を有し、該配列は次の構造： 【配列があります】 （式中、８６及び８７は前記ヒトＣＤ４中のアミノ酸位置を意味する） を含んで成るコアーを含有し、ここで８６位のシステインの硫黄原子はベンジル 基又はクロロベンジル基の脂肪族炭素原子に連結されており、そして８７位のグ ルタミン酸の酸素原子にベンジル基又はクロロベンジル基の脂肪族炭素原子に連 結されており、そして該組成物が次の方法、すなわち、水性媒体中で、前記ポリ ペプチドを少なくとも化学量論的量の硫黄ブロッキング基含有化合物と一緒にし 、該化合物は活性ハロゲン又は活性オレフィン官能基を含んで成り、上記の操作 を約０℃〜５０℃の範囲の温度において、該硫黄ブロッキング基含有化合物が前 記システインに共有結合するのに十分な時間にわたって行い； 形成されるすべての酸を中和し；そして前記物質の組成物を単離する； により製造されるものである、前記組成物。 ２６．ＣＤ４−依存性レトロウイルスによる感染の治療のための医薬組成物の製 造のためのポリペプチドの使用であって、該ポリペプチドはヒトＣＤ４の少なく とも７個の連続するアミノ酸の配列を有し、該配列は次の構造： 【配列があります】 を含んで成るコアーを含有し、ここで８６位のシステインの硫黄原子が誘導体化 基に連結されている、前記使用。 ２７．前記誘導体化基がベンジル基又はクロロベンジル基である、請求項２５に 記載の使用。 ２８．前記ＣＤ４−依存性レトロウイルスがＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２である請 求項２５に記載の使用。