KR20240095008A

KR20240095008A - 신경염증성 질환 치료효과를 나타내는 신규 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20240095008A
Application number: KR1020230163415A
Authority: KR
Inventors: 석경호; 김재홍
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2022-11-22
Filing date: 2023-11-22
Publication date: 2024-06-25

Abstract

신경염증성 질환 치료 효과를 나타내는 신규 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신경 염증에 밀접한 관련을 나타내는 리포칼린 2(Lipocalin-2, LCN2) 억제 활성을 나타내는 신규 펩타이드 및 이를 포함하는 신경염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신규 펩타이드는 신경염증의 핵심 조절자로 역할하는 리포칼린 2를 억제함으로써 신경 염증을 완화하고, 운동 및 인지기능을 향상하는 활성이 매우 뛰어나 신경염증성 질환 예방 또는 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 관련 중추신경계 장애 또는 질환 예방 또는 치료제개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

신경염증성 질환 치료효과를 나타내는 신규 펩타이드 및 이의 용도{Novel peptides comprising effect of treating neuroinflammatory diseases}

신경염증성 질환 치료 효과를 나타내는 신규 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신경 염증에 밀접한 관련을 나타내는 리포칼린 2 (lipocalin-2, LCN2) 억제 활성을 나타내는 신규 펩타이드 및 이를 포함하는 신경염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

중추신경계는 신경세포와 신경교세포로 이루어져 있다. 신경교세포(glia cell)는 전체 뇌세포의 약 90%를 차지하며, 부피로는 뇌 전체의 약 50%를 차지하고 있다. 신경교세포는 크게 세 종류로 분류할 수 있으며 이는, 성상세포(astrocytes), 미세아교세포(microglia) 및 희소돌기아교세포(oligodendrocytes)이다. 이 중, 성상세포는 뇌에서 가장 풍부한 신경교세포 유형이다. 성상세포는 신경세포(neuron)에 대사 및 영양적 지원을 제공하고, 시냅스의 활성을 조정한다. 이들은 신경보호를 위한 혈액뇌장벽(blood-brain barrier)의 형성과 유지, 항산화제 방어, 이온과 pH 항상성 및 신경세포-아교세포(neuron-glia cell)의 네트워크에 관여한다. 이와 같은 손상되지 않은 중추신경계(central nervous system, CNS)에서 성상세포의 생리적인 역할에 더하여, 성상세포는 손상, 허혈, 감염 및 신경퇴행과 같은 다양한 생리학적 조건하에 있는 CNS의 손상에 대한 주요 반응자이다. 성상세포는 모든 형태의 CNS 손상에 반응하여, 반응성 성상세포증 (reactive astrocytosis)이라고 하는 과정을 진행하게 된다. 이 과정에서 성상세포는 증식하여 갭(gap)을 메우고, 세포질의 양이 커지고, 돌기가 길어지고 분지되며, 신경교섬유산단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP), 네스틴(nestin) 및 비멘틴(vimentin)과 같은 중간미세섬유의 발현이 증가되는 것과 같은 통상의 형태학적 변화를 수행한다. 반응성 성상세포증은 신경 손상에 대한 보호와 혈관뇌장벽 복구의 촉진과 관련이 있다. 이러한 이로운 역할과는 반대로, 반응성 성상세포증은 장벽으로서 작용하는 축삭의 재생성을 억제하고, 전염증 및 신경독성 매개자의 분비를 증가시키는 것과 같은 해로운 효과와도 연관이 있다.

리포칼린-2 (lipocalin-2; LCN2)은 세포 분화, 세포 사멸, 철의 세포 흡수와 같은 다양한 세포 과정의 조절에 관여되어 있다는 것이 알려져있다. 뇌 글리아세포가 주로 LCN2를 발현하며, 이는 글리아세포의 활성화를 자체적으로 조절할 수 있음이 보고되었다. 신경염증과 병리학적 상태에서 LCN2는 케모카인(chemokine)을 증가시키는 역할과 신경세포 독성에 관여하며 중요한 역할을 한다. LCN2는 다발성 경화증 및 이에 대한 실험적 자가면역 뇌척수염 마우스 모델, 만성 염증성 통증, 신경통, 알츠하이머병, 파킨슨병, 혈관성 치매, 허혈성 뇌졸중, 뇌출혈, 그리고 외상성 뇌손상 이후 뇌에서 발현이 증가되며, LCN2 수준의 증가가 다양한 형태의 뇌손상과 관련이 있다는 것이 보고되었다.

신경염증은 신경계의 면역 반응의 일종으로, 알츠하이머, 파킨슨병, 다발성경화증, 외상성 뇌손상을 포함하는 많은 중추신경계 질환과 매우 밀접하게 연관되어 있으며, 현재 중추신경계 질환의 전형적 특징으로 생각되고 있다. 신경염증 반응은 선천성 면역 세포인 글리아세포의 활성화, 염증 매개체 예컨대 산화질소(nitric oxide; NO), 사이토카인 및 케모카인의 방출, 대식세포 침윤을 포함하며, 이는 신경 세포 사멸을 유도한다. 성상세포 및 미세아교세포 염증 활성화는 병리학적 마커 및 퇴행성 신경 질환의 진행에 있어 중요한 메커니즘으로 생각되어진다. 따라서 글리아세포 활성의 엄격한 조절은 뇌 항상성을 유지하고 감염 및 염증 질환을 예방하는 데 필수적이다.

관련하여, 뇌의 인지장애는 임상적으로는 기억력, 인지력, 추리력, 실행 능력(executive functioning), 계획력, 판단력 및 감성적 안정성의 점차적인 손상을 특징으로 하고, 이러한 장애는 점차적으로 깊은 지능의 악화로 이어지게 되며, 광범위한 질환들이 인지 장애로 이어질 수 있다. 그 중 경도인지장애(Mild Cognitive Impairment: MCI)는 동일 연령대에 비해 인지기능, 특히 기억력이 저하되어 있지만, 일상생활을 수행하는 능력은 유지하고 있는 치매의 전단계를 지칭한다. 경도인지장애가 나타나는 사람의 경우 알츠하이머병으로의 진행 가능성이 매우 높은 고위험군으로 지목되고 있다.

한편, 외상성 뇌손상(traumatic brain injury, TBI)은 뇌에 가해지는 외력으로 인해 뇌 기능이 손상되는 것을 말한다(Control and Prevention, 2015). TBI는 전 세계적으로 신체적 부상 중 사망 및 장애의 주요 원인이며 매년 6,900만 명이 손상을 입는다(Rubiano et al., 2015; Dewan et al., 2019). 그러나 긴급한 처치의 필요에도 불구하고 아직 미국 식품의약국(FDA)의 승인을 받은 치료제는 없다.

뇌에 대한 기계적 손상을 나타내는 1차 손상에 이어 복잡한 생화학적 사건과 관련된 2차 손상이 뒤따른다. 2차 손상에서 흥분독성(excitotoxicity)은 미토콘드리아 기능 장애와 산화 스트레스의 증가로 이어져 세포 사멸을 초래한다(Robertson, 2004). 산화 스트레스와 죽은 세포에서 방출된 분자는 신경 염증 반응을 유발하여 사이토카인을 방출하고 염증 세포를 모은다(Corps et al., 2015). 이러한 복잡한 손상 메커니즘은 치료제 개발을 어렵게 하고, 다중 표적 치료제의 필요성을 증가시킨다(Loane and Faden, 2010; Maas et al., 2010). 이러한 다양한 손상 반응 중에서 신경염증은 TBI 후 만성 신경퇴화 및 신경학적 기능 감소에 중요한 역할을 한다(Kumar and Loane, 2012). 최근 연구에서는 TBI 후 장기 인지 장애와 글리아세포(glia cell) 활성화 및 염증성 사이토카인의 상승을 포함한 만성 신경염증 사이의 연관성을 보고하였다(Simon et al., 2017). 따라서 TBI 후 만성 신경퇴화를 예방하기 위해서는 신경염증을 억제하는 것이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 신경 염증을 완화하는 효과를 나타내어 중추신경계 질환을 예방하거나 치료할 수 있는 신규한 물질을 발굴하기 위하여 연구를 거듭한 결과, 본 발명에서 청구하는 신규한 펩타이드가 이와 같은 효과를 나타낸다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 23 내지 36번째 아미노산, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 83 내지 97번째 아미노산, 서열번호 2의 아미노산 서열 중 134 내지 141번째 아미노산 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 중 199 내지 205번째 아미노산 서열을 포함하면서, 이의 N-말단 또는 C-말단 방향으로 각각 연속되는 1 내지 10개의 아미노산을 포함하거나 포함하지 않는 펩타이드; 또는 상기 펩타이드와 80% 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 상기 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 23 내지 36번째 아미노산, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 83 내지 97번째 아미노산, 서열번호 2의 아미노산 서열 중 134 내지 141번째 아미노산 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 중 199 내지 205번째 아미노산 서열을 포함하면서, 이의 N-말단 또는 C-말단 방향으로 각각 연속되는 1 내지 10개의 아미노산을 포함하거나 포함하지 않는 펩타이드; 또는 상기 펩타이드와 80% 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 상기 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 23 내지 36번째 아미노산, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 83 내지 97번째 아미노산, 서열번호 2의 아미노산 서열 중 134 내지 141번째 아미노산 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 중 199 내지 205번째 아미노산 서열을 포함하면서, 이의 N-말단 또는 C-말단 방향으로 각각 연속되는 1 내지 10개의 아미노산을 포함하거나 포함하지 않는 펩타이드; 또는 상기 펩타이드와 80% 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "폴리펩타이드(polypeptide)", "펩타이드(peptide)" 및 "단백질"은 상호 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.

본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자(삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다: A(Ala): 알라닌; C(Cys): 시스테인; D(Asp): 아스파르트산; E(Glu): 글루탐산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글라이신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 라이신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라진; O(Ply): 피롤라이신; P(Pro): 프롤린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg): 아르지닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 쓰레오닌; U(Sec):셀레노시스테인, V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 타이로신.

본 발명에서 상기 서열번호 1은 마우스 solute carrier family 22 member 17 isoform a (Slc22a17) 단백질(GenBank: AAH62878.1)이며, 서열번호 2는 이와 대응되는 인간 solute carrier family 22 member 17 isoform a 단백질(GenBank: NP_065105.3)이다.

본 발명의 펩타이드, 즉 서열번호 1의 아미노산 서열 중 23 내지 36번째 아미노산, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 83 내지 97번째 아미노산, 서열번호 2의 아미노산 서열 중 134 내지 141번째 아미노산 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 중 199 내지 205번째 아미노산 서열을 포함하면서, 이의 N-말단 또는 C-말단 방향으로 각각 연속되는 1 내지 10개의 아미노산을 포함하거나 포함하지 않는 펩타이드는 이의 기능적 동등물을 포함한다. 기능적 동등물이란, 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성(또는, 동일성)을 갖는 폴리펩타이드를 말한다. 예를 들면, 70％, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 것으로, 본 발명의 폴리펩타이드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩타이드를 말한다. 여기서, 용어 "실질적으로"는 특정 성질의 전체 또는 거의 동일한 정도의 성질을 나타내는 상태를 의미한다. 따라서, 본원에서 "실질적으로 동질의 생리활성"이란, 리포칼린 2(Lipocalin-2, LCN2)를 억제하여 신경 염증을 완화하는 생리활성을 의미할 수 있다.

본원에서 "상동성(homology) 또는 동일성 (identity)"은, 폴리펩타이드 분자와 같은 중합체 분자간의 전체적인 관련성 (relatedness)을 의미한다. 예를 들면, 2개 폴리펩타이드 서열간의 상동성/동일성(%)의 계산은, 최적의 비교를 위해 2개의 서열을 배열하여 수행할 수 있다. 바람직하게는, 비교 목적으로 배열된 서열의 길이는, 기준 서열 (reference sequence)의 길이의 적어도 30% 이상, 적어도 40% 이상, 적어도 50% 이상, 적어도 60% 이상, 적어도 70% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 90% 이상, 또는 실질적으로 100%일 수 있다. 그리고 나서, 상응하는 아미노산 부위의 아미노산을 서로 비교한다. 제1 서열의 부위에 위치한 아미노산이 제2 서열의 상응하는 부위의 아미노산과 동일한 경우, 2개의 서열은 당해 부위에서는 동일성을 가지는 것이다. 2개 서열의 동일성 (%)은, 2개 서열간의 최적 배열 (optimal alignment)을 위해 도입해야 하는 갭 (gap)의 숫자와 길이를 고려한, 2개 서열에서 공통되는 아미노산을 가지는 부위의 숫자의 함수이다. 2개 서열간의 비교 및 동일성(%)의 결정은 수학적인 알고리즘을 통해 수행할 수 있다. 예를 들면, ClustalW (Thompson 외, 1994)를 사용하여 다음의 파라미터를 사용하여 서열 동일성 수치를 측정할 수 있다.

본원에서 용어 "실질적으로"는 특정 성질의 전체 또는 거의 동일한 정도의 성질을 나타내는 상태를 의미한다. 본원에서 용어 "실질적으로 동일한"은, 아미노산 또는 핵산 서열간의 비교와 관련하여 사용되고 있다. 본원 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는, 상응하는 부위에 동일한 잔기를 가지는 경우에 2개의 서열은 "실질적으로 동일한" 것으로 이해될 것이다. 당업계에서 잘 알려져 있는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 다양한 종류의 알고리즘을 사용하여 비교할 수 있는 데, 예를 들면 핵산 서열 비교를 위해서는 BLASTN을, 아미노산 서열 비교를 위해서는 BLASTP, 갭(gapped) BLAST, PSI-BLAST와 같은 컴퓨터 프로그램을 사용할 수 있다. 상기한 컴퓨터 프로그램의 예는 아래 문헌에 기재되어 있다: Altschul 외, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul 외, Methods in Enzymology; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis 외, Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; 및 Misener 외, (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. 동일한 서열을 검색하는 것 이외에, 상기한 컴퓨터 프로그램에서는 통상적으로 서열 동일성의 정도(degree of identity)를 제공해준다. 2개의 서열에 있어서, 일정 길이의 잔기에 걸쳐 상응하는 부위의 잔기(residue) 중 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 적어도 91% 이상, 적어도 92% 이상, 적어도 93% 이상, 적어도 94% 이상, 적어도 95% 이상, 적어도 96% 이상, 적어도 97% 이상, 적어도 98% 이상, 적어도 99% 이상이 동일한 경우에 "실질적으로 동일한" 서열인 것으로 간주된다. 바람직하게는, 상기한 "일정 길이의 잔기"는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300 또는 그 이상의 잔기일 수 있다.

본원에서 상기 용어 "상응하는"은 소정의 폴리펩타이드의 아미노산 잔기의 위치(position)/정체(identity)를 결정하는 데에 종종 사용된다. 통상의 기술자라면, 폴리펩타이드 내의 잔기는 기준 펩타이드 (reference-related polypeptide)에 기초한 원형 숫자 시스템 (canonical numbering system)을 사용하여 종종 지정된다. 따라서, 예를 들어 제190번째 위치의 잔기에 "상응하는" 아미노산은 특정 아미노산 쇄에서 반드시 제190번째 위치에 있을 필요는 없으며, 통상의 기술자라면 "상응하는" 아미노산을 확인하는 방법에 대해서 쉽게 이해할 수 있다.

상기 "기능적 동등물"은 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과로 생성된 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다: 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황 함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 기능적 동등물에는 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 또한, 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 아울러 상기 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한, 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 단백질의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 단백질의 일부 화학 구조가 변형된 단백질 또는 폴리펩타이드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.

본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 후보 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 대한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 또한, 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한, 상기 서열 동질성은 두 개의 단백질 또는 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 이와 같은 컴퓨터 프로그램은 두 개의 단백질 또는 폴리펩타이드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장 서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디폴트 오프닝 페널티(default opening penalty) 및 디폴트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250 (표준 스코링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다. 일치하는 서열(identical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(matched span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열 내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.

본 발명의 폴리펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 작제될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 작제한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들면, 인간 AIMP1 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 주형으로 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기 (Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 염기서열을 합성할 수도 있다. 작제된 폴리뉴클레오티드 서열은 이 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 폴리뉴클레오티드 염기 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 단백질을 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다.

상기에서 "실질적으로 순수한 폴리펩타이드 또는 단백질"'이라 함은 본 발명에 따른 단백질 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 단백질 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., supra; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.

또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 해당분야에 공지된 기술로 화학적으로 합성할 수 있다(Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., NY (1983)). 즉, 본 발명의 폴리펩타이드는 통상의 단계적인 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법을 이용하여 제조할 수 있다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, (1997); A Practical Approach, Atherton ＆ Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, (1989)). 바람직한 제조방법은 고체상 합성방법(solid phase synthesis)을 이용하는 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 보호된 아미노산간의 응축반응 (condensation reaction)에 의하여 통상의 고체상 방법으로, C-말단으로부터 시작하여 규명된 아미노산 서열에 따라 순차적으로 진행하면서 합성할 수 있다. 응축 반응 후 보호기 및 C-말단 아미노산이 연결된 담체를 산분해 (acid decomposition) 또는 아미놀리시스 (aminolysis)와 같은 공지의 방법에 의해 제거할 수 있다. 상기 언급된 펩타이드 합성법은 관련 서적에 상세히 기술되어 있다(Gross and Meienhofer's, The Peptides, vol 2., Academic Press, 1980).

유전공학적 방법에 의해 제조된 단백질 또는 화학적으로 합성된 단백질은 예를 들면 추출법, 재결정법, 다양한 크로마토크래피(겔 여과법, 이온 교환, 침전, 흡착, 역전상), 전기영동, 역류 분배법 등 당업계에 공지된 방법으로 분리 및 정제할 수 있다.

서열번호 1로 표시되는 마우스 Slc22a17 단백질의 아미노산 서열 중 23 내지 36번째 아미노산은 서열번호 2로 표시되는 인간 Slc22a17 단백질의 아미노산 서열 중 134 내지 141번째 아미노산에 상응하며, 서열번호 1로 표시되는 마우스 Slc22a17 단백질의 아미노산 서열 중 83 내지 97번째 아미노산은 서열번호 2로 표시되는 인간 Slc22a17 단백질의 아미노산 서열 중 199 내지 205번째 아미노산에 상응한다.

상기 마우스와 인간의 상응하는 Slc22a17의 아미노산 서열은 구조적 98.8%의 동일성을 나타내며 및 생리학적 유사성이 인정된다.

본 발명에서 상기 연속되는 1 내지 10개의 아미노산 서열이란,

(1) 서열번호 1의 23 내지 36번째 아미노산 서열을 포함하면서, 상기 서열의 N-말단(즉, 23번째 아미노산) 및/또는 C-말단(즉, 36번째 아미노산) 각각에서 연속되는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산이 추가로 포함되는 것,

(2) 서열번호 1의 83 내지 97번째 아미노산 서열을 포함하면서, 상기 서열의 N-말단(즉, 83번째 아미노산) 및/또는 C-말단(즉, 97번째 아미노산) 각각에서 연속되는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산이 추가로 포함되는 것,

(3) 서열번호 2의 134 내지 141번째 아미노산 서열을 포함하면서, 상기 서열의 N-말단(즉, 134번째 아미노산) 및/또는 C-말단(즉, 141번째 아미노산) 각각에서 연속되는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산이 추가로 포함되는 것, 또는

(4) 서열번호 2의 199 내지 205번째 아미노산 서열을 포함하면서, 상기 서열의 N-말단(즉, 199번째 아미노산) 및/또는 C-말단(즉, 205번째 아미노산) 각각에서 연속되는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산이 추가로 포함되는 것을 의미할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 양태에서, 상기 펩타이드는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 또는 이와 80%의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 펩타이드는 생체 내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위하여 이의 N-말단 또는/및 C-말단 등이 화학적으로 수식되거나 유기단으로 보호되거나, 또는 펩타이드 말단 등에 아미노산이 추가되어 변형된 형태일 수 있다. 특히, 화학적으로 합성한 펩타이드의 경우, N- 및 C-말단이 전하를 띠고 있기 때문에, 이러한 전하를 제거하기 위하여 N-말단을 아세틸화(acetylation), N-말단을 메틸화(methylation) 및/또는 C- 말단을 아미드화(amidation) 할 수 있고, 또는 D-아미노산 도입, CH2-NH, CH2-S, CH2S=O, CH2-CH2와 같은 펩타이드 결합 변형, 백본 변형, 측쇄 변형을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 펩타이드 모방체 화합물을 제조하는 방법은 기술분야에 공지된 것으로, 예를 들면, Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Choplin Pergamon Press (1992)에 기재된 내용을 참조할 수 있다.

본 발명의 용어 "백본 변형"이란, 펩타이드를 구성하는 아미노산의 주가 되는 사슬 모양 또는 고리 모양의 골격을 백본(주사슬: backbone)이라 하며, 이들 펩타이드 백본을 구성하는 아미노산을 아미노산 유사체로 직접 변형하는 것을 백본 변형이라 한다. 아미노산 유사체란, 아미노산 백본의 질소 또는 α-탄소에서 수소원자를 치환작용에 의해 변형시킨 아미노산을 말한다.

본 발명의 용어 "측쇄 변형"이란, 펩타이드를 구성하는 아미노산의 주가 되는 사슬 모양 또는 고리 모양의 골격으로부터 가지처럼 갈라져 나간 원자단을 아미노산의 측쇄(곁사슬: side-chains)라 하며, 이들 측쇄를 화학물질을 이용하여 변형하는 것을 측쇄 변형이라 한다. 펩타이드 측쇄 변형의 예로, 환원 알킬화 반응; 메틸아세티미데이트에 의한 아미디화; 아세틱 언하이드라이에 의한 알킬화; 시아네이트에 의한 아미노 그룹의 카르바모릴레이션; 2,4,6-트리니트로벤젠 술포닉산(TNBS)에 의한 아미노산의 트리니트로벤질레이션; 숙신 언하이드라이드에 의한 아미노 그룹의 알킬화; 또는 피리독살-5포스페이트 처리 후 NaBH4로 환원된 피리도실레이션과 같은 아미노그룹의 변형 등을 포함한다.

본 발명의 바람직한 일 양태에서, 상기 펩타이드는 N-말단이 아세틸화 되고/되거나 C-말단이 아미드화 된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 펩타이드는 하나 이상의 아미노산 잔기가 D-아미노산인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 양태에서, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 27 및 28번째 아미노산, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 88 및 89번째 아미노산, 서열번호 2의 아미노산 서열 중 138 및 139번째 아미노산, 서열번호 2의 아미노산 서열 중 201 및 202번째 아미노산이 D-아미노산일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 펩타이드는 N-말단이 아세틸화 되고/되거나 C-말단이 아미드화 되고, 하나 이상의 아미노산 잔기가 D-아미노산인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 명세서에서 "폴리뉴클레오티드", “핵산”은 단일-가닥 또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다

상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 것이면 제한 없이 사용될 수 있으며, DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 천연에서 분리되거나 당업계에 공지된 유전공학적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 벡터는 발현벡터로서, 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 등을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 본 발명의 벡터는 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 핵산을 숙주 세포에 전달하는데 사용되는 모든 수단으로 바람직한 벡터는 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노관련 바이러스와 같은 바이러스 벡터이다. 따라서, 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 유전자는 바이러스 벡터를 사용하여 또는 직접적인 DNA 도입을 통해 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 도입시킨다. 표적 조직내에서의 발현은 돌연변이 벡터를 바이러스 벡터 또는 수용체 리간드 등을 이용하여 특정 세포에 대해 표적화하거나 또는 조직 특이적 프로모터를 사용하거나, 또는 그 두 방법 모두를 사용하여 실시할 수 있다.

한편, 본 발명에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음 문헌에 기재되어 있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, T. J.,Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987)).

본 발명은 또한 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

숙주 세포는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 또는 바람직한 특정 방식으로 유전자 생성물을 진행시키는 것을 선택할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질의 해독 및 해독 후 프로세싱과 변형에 대한 특징적이고 특이적인 기작을 갖고 있다. 적합한 세포주 또는 숙주 시스템으로는 발현된 이종 단백질의 바람직한 변형 및 프로세싱을 제공하는 것을 선택할 수 있다. 효모에서의 발현은 생물학적 활성 생성물을 생산할 수 있다. 진핵 세포에서의 발현은 " 천연" 폴딩의 가능성을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21DE, E. coli DH5, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110 등이 사용될 수 있으며, 또한 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있다.

벡터를 숙주세포 내로 전달하여 숙주세포를 형질전환 시키는 방법은 공지의 방법이면 어떠한 것이든 가능하며 특별히 제한되지 아니한다. 예를 들어, 인산칼슘침전법(calcium phosphate precipitation), DEAE-dextran법, 전기천공법(electroporation), 직접 미세주입법(direct microinjection), DNA-로딩 리포좀(DNAloaded liposome)법, 리포펙타민-DNA복합체(liofectamine-DNA complex)법, 세포 음파분쇄법(cell sonication), 고속미세분사(high velocity microprojectile)를 이용한 유전자 폭격법(gene bombardment), 다양이온(polycation)법 및 수용체 매개 형질전이법(receptor-mediated transfection)에 의하여 형질전환 할 수 있다. 이 기술들 중 일부는 생체 내 또는 생체 외 사용을 위해 개량될 수 있다.

숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 대량의 재조합 펩타이드 또는 단백질을 얻게 된다. 예를 들어, 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.

본 발명의 방법에서, 형질전환된 숙주세포의 배양은 당업계에서 통상적으로 이용되는 배지를 이용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 숙주세포가 원핵세포(예컨대, E. coli)인 경우, LB(Luria-Bertani) 배지를 이용하여 숙주세포를 배양할 수 있다. 숙주세포가 동물세포인 경우에는, 예컨대, Eagles's MEM(Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959))을 이용하여 형질전환체를 배양할 수 있다. 숙주세포의 다양한 배양방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있고, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명은 또한, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 상기 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환은 신경염증, 신경변성, 인지 및 운동 기능 저하, 행동장애 또는 이와 관련된 질환인 것을 특징으로 할 수 있고, 구체적으로는 외상성 뇌손상, 인지 및 운동 장애, 치매, 알츠하이머병, 혈관성 치매, 루게릭병, 레비 소체 치매, 전측두엽 치매(FTD), 파킨슨병, 파킨슨 유사 질환, 파킨슨증, 헌팅턴병, 프리온병, HIV 감염으로 인한 치매, 노화로 인한 치매, 타우병증, 다발성 경화증, 주요우울장애, 외상후 스트레스장애, 양극성 정동장애, 주의력결핍 과다행동장애, 자폐 스펙트럼 장애, 조현병, 불안장애, 뇌전증으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 염증에 의해 증상이 악화 될수 있는 장애 및 질환을 포함 할 수 있고, 구체적으로는 주요우울장애(major depressive disorder; J Am Acad Child Adolesc Psychiatry. 2014 Mar;53(3):274-96.; Psychosom Med. 2009 Feb;71(2):171-86.; Biol Psychiatry. 2015 Jul 1;78(1):28-37.; Acta Psychiatr Scand. 2017 May;135(5):373-387.; Biol Psychiatry. 2010 Mar 1;67(5):446-57.; Sci Rep. 2018 Aug 13;8(1):12050.; Brain Behav Immun. 2015 Oct:49:206-15.; Int J Mol Sci. 2016 Dec 2;17(12):2022.; Mol Psychiatry. 2016 Dec;21(12):1696-1709.; J Affect Disord. 2013 Sep 25;150(3):736-44.; Brain Behav Immun. 2012 Oct;26(7):1180-8.; J Affect Disord. 2012 Aug;139(3):230-9.), 외상후 스트레스장애(PTSD, post-traumatic stress disorder; Lancet Psychiatry. 2015 Nov;2(11):1002-12.; Depress Anxiety. 2018 Nov;35(11):1081-1094.; Psychiatr Danub. 2017 Dec;29(4):407-420.), 양극성 정동장애(bipolar disorder; Mol Psychiatry. 2016 Dec;21(12):1696-1709.; J Psychiatr Res. 2013 Sep;47(9):1119-33.; Biol Psychiatry. 2013 Jul 1;74(1):15-25.; J Affect Disord. 2013 Jan 10;144(1-2):16-27.), 주의력결핍 과다행동장애(ADHD, attention deficit hyperactivity disorder; Front Psychiatry. 2017 Nov 9:8:228.; Neuroimmunomodulation. 2018;25(5-6):328-333.), 자폐 스펙트럼 장애(Autism spectrum disorder; J Am Acad Child Adolesc Psychiatry. 2014 Mar;53(3):274-96.; Mol Psychiatry. 2015 Apr;20(4):440-6.), 조현병(schizophrenia; Biol Psychiatry. 2011 Oct 1;70(7):663-71.; Schizophr Res. 2018 Jul:197:19-33.; Mol Psychiatry. 2016 Dec;21(12):1696-1709.; Schizophr Res. 2014 May;155(1-3):101-8.; Biol Psychiatry. 2008 Apr 15;63(8):801-8.; Brain Behav Immun. 2018 Jul:71:28-36.; Neurosci Biobehav Rev. 2014 May:42:93-115.)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 비만 및 당뇨 (Front Pharmacol. 2022 Jun 20:13:921612.; Front Neurosci. 2018 Dec 11:12:930.; Bone. 2023 Nov:176:116861.; Front Endocrinol (Lausanne). 2019 Jan 30;10:25.; Curr Pharm Des. 2016;22(6):738-57.; J Biol Chem. 2016 Mar 11;291(11):6011-6025.; Nat Commun. 2020 Nov 20;11(1):5906.; Microbiome. 2023 Feb 21;11(1):30.)와 같은 대사성 질환군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 펩타이드는 그 자체 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 부여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말하여, 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산 (free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산은 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한, 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 펩타이드를 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드, 마이크로좀, 및 지질나노입자 등 포함된다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 두개내, 뇌실내, 척수강내, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈,메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 신경염증성 질환의 예방 및 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

본 발명에 따른 신규 펩타이드는 신경염증의 핵심 조절자로 역할하는 리포칼린 2를 억제함으로써 신경 염증을 완화하고, 운동 및 인지기능을 향상하는 활성이 매우 뛰어나 신경염증성 질환 예방 또는 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있으며, 관련 중추신경계 장애 또는 질환에도 활용될 가능성이 있다.

도 1. LCN2 단백질과 수용체의 결합 부위 서열 확인 및 경쟁적 억제를 위한 후보 서열 및 결합도 예측. A. LCN2 수용체 (SLC22A17)에서 LCN2에 결합 위치 서열 확인 및 경쟁적 억제를 위한 4가지 후보 특정 (peptide-1, NASGWEQPPNSSGV; peptide-2, LAASAASGVVTSTDPS; peptide-3, HCLKDWDYNGLPVL; peptide-4, TTNAIGQWDLVCDLG). 인간과 마우스에서 동일 위치에 대한 서열 비교 (굵은 글씨, 인간 및 마우스에서 다른 서열; peptide-1, peptide-2, peptide-3, 및 peptide-4 서열). B. Alphafold2 프로그램을 이용한 LCN2 단백질에서 4가지 후보 펩타이드의 결합 위치 예측도.
도 2. 배양된 성상세포에서 LCN2 단백질 처리에 의해 유도되는 CXCL10 생산에 펩타이드 효과 확인. A. 실험 디자인. B. 농도별 펩타이드 (peptide-1, peptide-2, peptide-3, 및 peptide-4) 처리 및 LCN2 단백질 + 펩타이드 처리에 의한 세포독성 확인 (MTT assay). C. LCN2 단백질 처리에 의한 CXCL10 생산 및 후보 4종 펩타이드 처리에 의한 억제 효과 확인 (ELISA assay).
도 3. 배양된 마우스 유래 성상세포에서 펩타이드 억제제에 의한 LCN2의 세포막 결합 저해 검사. A. 배양된 성상세포에서 면역염색 기법을 이용한 LCN2 수용체 발현 및 위치 확인. B. 농도별 펩타이드 (1 그리고 4) 처리 및 His-tagged 재조합 LCN2 단백질 + 펩타이드 (peptide-1 또는 peptide-4) 처리에 의한 세포막 결합 LCN2 단백질의 감소 검사. C. 유세포 분석 (FACS analysis)을 이용한 LCN2 단백질의 경합된 세포 분리 분석 및 정량.
도 4. LCN2와 SLC22A17 수용체의 상호작용 저해 후보 펩타이드와 LCN2의 직접적 상호작용 확인. A. SLC22A17 수용체의 세포막 투과 모형. 빨간색으로 표시된 부분을 모사하여 peptide-4 디자인. B. Peptide-4의 단백질 구조상에서의 위치. Alphafold2 프로그램으로 예측한 LCN2 단백의 수용체의 구조를 이용하여 위치 표시. C. Peptide-4와 LCN2의 상호작용 확인. (위) BLI 실험의 과정 및 결과, (아래) 상호작용 분석 데이터.
도 5. LPS로 유도된 신경염증 마우스 모델에서 펩타이드-4의 뇌실내 처리에 의한 효과 검증. A. 실험 디자인. B. LPS 유도 신경염증 모델에서 손상된 공간 기억 능력 손상에 펩타이드 주입에 의한 완화. C. 펩타이드-4 주입에 의한 LPS 유도성 신경염증물질 유전자(Tnf, Il1b, 및 Il6 mRNA) 발현 억제. D. 펩타이드-4에 의한 신경염증성 단백질(TNF 및 IL-1B 단백질) 생산 억제.
도 6. LPS로 유도된 신경염증 마우스 모델에서 펩타이드-4의 뇌실내 처리에 의한 효과 검증. 뇌내 염증 매개 세포인 성상세포 (GFAP) 및 미세아교세포 (Iba-1) 활성화에 펩타이드-4 주입에 의한 완화를 면역염색 분석에서 확인.
도 7. CCI 모델에서 펩타이드-4의 뇌실내 처리에 의한 효과 검증. A. 실험 디자인. B. 운동능력 시험을 위한 원통기둥 내려오기 행동시험 (pole test). C. 감각능력 시험을 위한 접착 테이프 제거 행동시험 (adhesive removal test). D. 공간인지능력 시험을 위한 Y자 미로 시험 (Y-maze test). E. 인지능력 시험을 위한 수동회피능력 행동시험 (passive avoidance test). F. 유전자 증폭 기술을 (quantitative PCR, qPCR) 이용하여 신경염증 물질 유전자 발현 (Tnf, Il1b, 그리고 Il6 mRNA) 확인.
도 8. CCI 모델에서 펩타이드-4의 뇌실내 처리에 의한 효과 검증. 면역염색을 이용하여 성상세포 (GFAP) 및 미세아교세포 (Iba-1)의 활성 확인 (왼쪽, 저배율 사진; 오른쪽, 고배율 사진; 각 세포 표지자를 이용한 면역반응성 정량 (아래).
도 9. CCI 모델에서 Peptide-1 및 Peptide-4 정맥 주사에 의한 운동 및 인지기능 손상 억제 효과. A. 실험 디자인. B. 운동능력 시험을 위한 원통기둥 내려오기 행동시험 (pole test). C. 공간인지능력 시험을 위한 Y자 미로 시험 (Y-maze test). D. 감각능력 시험을 위한 접착 테이프 제거 행동시험 (adhesive removal test). E. 인지능력 시험을 위한 수동회피능력 행동시험 (passive avoidance test). F. 유전자 증폭 기술을 (quantitative PCR, qPCR) 이용하여 신경염증 물질 유전자 발현 (Tnf, Il1b, 그리고 Il6 mRNA) 확인.
도 10. CCI 모델에서 Peptide-1 및 Peptide-4 정맥 주사에 의한 운동 및 인지기능 손상 억제 효과. 면역염색을 이용하여 성상세포 (GFAP) 및 미세아교세포 (Iba-1)의 활성 확인; 각 세포 표지자를 이용한 면역반응성 정량 (아래).
도 11. Peptide 억제제의 뇌내 전달을 효율적으로 하기 위한 서열 단순/단편화 (mouse astrocytes, in vitro). Alphafold2 프로그램을 이용하여 확인된 핵심 서열 (그림 5)을 보존하며 전체 펩타이드의 길이를 작게 디자인. 변형된 서열 정보는 다음과 같음. Peptide-1, NASGWEQPPNSSGV (핵심서열 굵은 글씨) -> Peptide-1-1, NASGWEQP; Peptide-4, TTNAIGQWDLVCDLG (핵심서열 굵은 글씨) -> Peptide-4-1, GQWDLVCDLG; Peptide-4-2, GQWDLVC). Peptide-1-1의 경우 원본서열인 Peptide-1에서 확인된 핵심서열로 합성된 8 mer 길이의 짧은 펩타이드 형태. Peptide-4-1의 경우 원본서열인 Peptide-4에서 확인된 핵심서열을 포함하여 합성된 10 mer 길이의 짧은 펩타이드 형태. Peptide-4-2의 경우 원본서열인 Peptide-4에서 확인된 핵심서열을 포함하여 합성된 6 mer 길이의 짧은 펩타이드 형태. A. 배양된 마우스 성상세포에서 PBS+Peptide (1-1, 4-1, or 4-2) 또는 LCN2+Peptide (1-1, 4-1, or 4-2) 처리후 24시간에 세포 생존률 확인 (MTT assay). B. 배양된 마우스 성상세포에서 LCN2+Peptide (1-1, 4-1, or 4-2) 처리후 24시간 세포배양액에서 Peptide의 농도 의존적 CXCL10 생산 억제 효과 확인 (ELISA assay).
도 12. 펩타이드 서열 단순/단편화 (mouse astrocytes, in vitro)에 의한 효과 검증. A. 배양된 마우스 유래 성상세포에서 PBS+Peptide (1-1, 4-1, or 4-2) 또는 LCN2+Peptide (1-1, 4-1, or 4-2) 처리후 24시간에 세포 생존률 확인 (MTT assay). 단순화된 Peptide (1-1, 4-1, 4-2) 100 ㎍/ml 처리에서 독성은 보이지 않음. B. 배양된 인간유래 성상세포에서 LCN2+Peptide (1-1, 4-1, or 4-2; 100 ㎍/ml) 처리후 24시간 세포배양액에서 IL-1B 생산 억제 효과 확인 (ELISA assay).
도 13. CCI 모델에서 Peptide-1-1, Peptide-4-1, 및 Peptide-4-2 정맥 주사에 의한 효과 검증. A. 실험 디자인. B. 운동능력 시험을 위한 원통기둥 내려오기 행동시험 (pole test). C. 공간인지능력 시험을 위한 Y자 미로 시험 (Y-maze test). D. 감각능력 시험을 위한 접착 테이프 제거 행동시험 (adhesive removal test). E. 인지능력 시험을 위한 수동회피능력 행동시험 (passive avoidance test). F. 유전자 증폭 기술을 (quantitative PCR, qPCR) 이용하여 신경염증 물질 유전자 발현 (Tnf, Il1b, 그리고 Il6 mRNA) 확인. G. 면역염색을 이용하여 성상세포 (GFAP) 및 미세아교세포 (Iba-1)의 활성 확인; 각 세포 표지자를 이용한 면역반응성 정량 (아래).
도 14. 펩타이드 서열 단순/단편화 (human astrocytes, in vitro)에 의한 효과 검증. A. 배양된 인간유래 성상세포에서 PBS+Peptide (1-1, 4-1, or 4-2) 또는 LCN2+Peptide (1-1, 4-1, or 4-2) 처리후 24시간에 세포 생존률 확인 (MTT assay). 단순화된 Peptide (1-1, 4-1, 4-2) 100 ㎍/ml 처리에서 독성은 보이지 않음. B. 배양된 인간유래 성상세포에서 LCN2+Peptide (1-1, 4-1, or 4-2; 100 ㎍/ml) 처리후 24시간 세포배양액에서 IL-1B 생산 억제 효과 확인 (ELISA assay).
도 15. 펩타이드 체내 안정성 향상을 위한 서열 수정. A-E. PeptideCutter 도구를 사용하여 체내 여러 분해효소에 취약한 서열 확인 (노란색 강조 표시). F. PeptideCutter 도구를 사용하여 체내 여러 분해효소에 취약한 서열 수정 (Peptide-1, NASGWEQPPNSSGV -> Peptide-1M, Ac-NASG _WE QPPNSSGV-NH ₂ ; Peptide-1-1, NASGWEQP -> Peptide-1-1M, Ac-NASG _WE QP-NH ₂ ; Peptide-4, TTNAIGQWDLVCDLG -> Peptide-4M, Ac-TTNAIGQ _WD LVCDLG-NH ₂ ; Peptide-4-1, GQWDLVCDLG -> Peptide-4-1M, Ac-GQ _WD LVCDLG-NH ₂ . Peptide-4-2, GQWDLVC -> Peptide-4-2M, Ac-GQ _WD LVC-NH ₂ . (L-form (붉은색) 에서 -> D-form amino acid (푸른색)로 치환된 서열을 나타냄; N-terminal Acetylation (Ac) 및 C-terminal Amidation (NH₂) 추가됨).
도 16. 배양된 마우스 유래 성상세포를 이용한 단백질 분해효소의 저항성을 높인 서열에 대한 검증. A. 실험 디자인. B. 농도별 수정된 서열의 펩타이드 (Peptide-1M, Peptide-1-1M, Peptide-4M, Peptide-4-1M, 및 Peptide-4-2M) 처리 및 LCN2 단백질 + 펩타이드 처리에 의한 세포독성 확인 (MTT assay). C. LCN2 단백질 (1 ㎍/ml) 처리에 의한 CXCL10 생산 및 서열 수정된 5종 펩타이드 (Peptide-1M, Peptide-1-1M, Peptide-4M, Peptide-4-1M, 및 Peptide-4-2M; 100 ㎍/ml) 처리에 의한 억제 효과 확인 (ELISA assay).
도 17. 배양된 마우스 유래 성상세포를 이용한 단백질 분해효소의 저항성을 높인 서열에 대한 검증. A. 실험 디자인. B. 농도별 수정된 서열의 펩타이드 (Peptide-1M, Peptide-1-1M, Peptide-4M, Peptide-4-1M, 및 Peptide-4-2M) 처리 및 LCN2 단백질 + 펩타이드 처리에 의한 세포독성 확인 (MTT assay). C. LCN2 단백질 (1 ㎍/ml) 처리에 의한 CXCL10 생산 및 서열 수정된 5종 펩타이드 (Peptide-1M, Peptide-1-1M, Peptide-4M, Peptide-4-1M, 및 Peptide-4-2M; 100 ㎍/ml) 처리에 의한 억제 효과 확인 (ELISA assay).

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실험방법

1. Alphafold 알고리즘을 이용한 결합부위 예측

AlphaFold의 특정 버전인 AlphaFold-Multimer 도구를 이용하여 SLC22A17및 LCN2와의 결합 구조 및 위치를 예측하였다. 이 버전은 단백질:단백질 도킹을 위해 특별히 훈련된 인공지능 도구이다 (인공지능). AlphaFold-Multimer는 대상 단백질의 교형체에서 관찰된 사슬 간 잔기 공변화를 활용하여 인터페이스 접촉을 만드는 아미노산 쌍을 식별합니다. 상호 작용하는 파트너들의 전체 서열을 입력하여 제공하였다. 이 모델에서 SLC22A17:LCN2 복합체에 대한 비중복 세트에서 높은 품질의 후보 펩타이드 서열 예측을 생성할 수 있었다.

2. 펩타이드 합성

펩타이드는 Peptron에서 자동 펩타이드 합성 (www.peptron.com)을 통해 합성되었다. RP-HPLC에 의한 펩타이드 순도는 제조업체의 표시에 따르면 98% 이상으로 추정되었다.

2. 개방형 뇌손상 동물모델(Controlled cortical impact model)

마우스를 2-5% isoflurane으로 마취하고 정위 프레임에 넣었다. 4mm 직경의 개두술 창 (두개골 절재술)은 정중선에서 측면으로 1.5mm 중앙에 있는 오른쪽 반구 위에 만들어졌다. 두개골을 제거하여 경질막을 노출시켰고, 원통형 2.5mm 크기의 전자기 구동 임팩터(CCI용 Impact One Stereotaxic Impactor, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)를 사용하여 TBI 그룹의 동물에게 CCI 손상을 전달했다. 직경 팁 및 충격 매개변수는 다음과 같다: 충격 속도, 2m/s; 침투 깊이, 2.5mm; 체류 시간, 300ms. 가짜 동물은 동일한 마취와 개두술을 받았다. 그러나 부상은 유발되지 않았다. 임팩트 또는 모의 시술이 완료된 후 절단하였던 두개골을 개두술 창 위로 접합하고 두피를 봉합했다. 뇌에서 CCI로 유도된 mRNA 발현은 충격 후 7일에 RT-PCR로 측정되었다. Immunohistochemistry 분석은 충격 후 7일에 수행되었다. 행동 테스트는 CCI 손상 후 6-7일 후에 수행되었다.

3. RT-PCR

제조업체의 프로토콜에 따라 QIAzol 시약(QIAGEN)을 사용하여 반대측 및 동측 뇌 조직 또는 배양된 세포에서 총 RNA를 추출했다. 기존 RT-PCR의 경우 Superscript II(Invitrogen) 및 oligo(dT) 프라이머를 사용하여 역전사를 수행했다. 특정 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭은 20-30 주기 동안 55-60°C의 어닐링 온도에서 수행되었다. PCR은 C1000 Touch Thermal Cycler(Bio-Rad, Foster City, CA)를 사용하여 수행되었다. PCR 산물 분석을 위해 각 PCR 10 μl를 1% 아가로스 젤에 전기영동하고 UV 광에서 검출했다. 정량적 RT-PCR(qPCR) 분석은 제조업체의 지침에 따라 one-step SYBR^® PrimeScript™ RT-PCR 키트(Perfect Real Time; Takara Bio Inc., Tokyo, Japan)를 사용하여 수행한 후 ABI Prism^®을 사용하여 검출했다. 7000 서열 검출 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA). qPCR에 의해 결정된 유전자 발현의 상대적인 변화는 2-^ΔΔCT 방법을 사용하여 계산되었다. 마우스 Lcn2, Tnf, Il1b, Il6 및 Gapdh의 RT-PCR 분석에 사용된 프라이머는 다음과 같다: Lcn2, 5'-ATG TCA CCT CCA TCC TGG TC-3'(정방향), 5'-CAC ACT CAC CAC CCA TTC AG-3'(역); Tnf, 5'-CAT CTT CTC AAA ATT CGA GTG ACA A-3'(정방향), 5'-ACT TGG GCA GAT TGA CCT CAG-3'(역방향); Il1b, 5'-AGT TGC CTT CTT GGG ACT GA-3'(정방향), 5'-TCC ACG ATT TCC CAG AGA AC-3'(역방향); Il6, 5'-AGT TGC CTT CTT GGG ACT GA-3' (정방향), 5'-TCC ACG ATT TCC CAG AGA AC-3' (역방향); Gapdh, 5'-TGG GCT ACA CTG AGG ACC AG-3'(정방향), 5'-GGG AGT TGC TGT TGA AGT CG-3'(역방향).

4. 면역형광염색

동물을 디에틸에테르를 사용하여 마취시키고 먼저 식염수로 경심 관류시킨 다음 100mM PBS에 희석된 4% 파라포름알데히드로 관류시켰다. 뇌를 3일 동안 4% 파라포름알데히드에 고정한 다음 추가 3일 동안 30% 수크로오스 용액을 사용하여 동결 보호했다. 고정된 뇌는 OCT 화합물 (Tissue-Tek, Sakura Finetek, Tokyo, Japan)에 도포하여 얼려진 뒤 미세 절편 제작기를 이용하여 20μm 두께의 조각으로 절단되었다. 이중 면역형광 분석을 위해 조직 절편을 항체와 함께 인큐베이션하고, 형광 또는 공초점 현미경으로 관찰했다. 형광 강도는 ImageJ 소프트웨어 버전 1.44(National Institutes of Health(NIH))를 사용하여 정량화되었다. 정량적 분석을 위해 동측 뇌 영역 내에서 겹치지 않는 세 개의 필드에서 이미지를 얻었다.

5. 행동실험

폴 테스트: 표면이 거친 나무 기둥(직경 10mm, 높이 50cm)의 꼭대기 부근에서 마우스를 머리가 아래로 향하도록 위치시키고 마우스가 바닥에 도달하는 데 걸리는 시간을 기록했다. 테스트는 30초 간격으로 3회 반복하였으며, 3회 하강 시간의 평균으로 행동 변화를 평가하였다.

접착제 제거 테스트: 두 개의 접착 테이프(0.3 × 0.4cm²)를 각 동물의 발에 동일한 압력으로 부착되었다. 그런 다음 마우스를 플라스틱 케이지에 넣고 각 접착 테이프에 접촉하고 제거하는 시간을 최대 120초로 기록했다.

Y-미로 테스트: 공간 인지는 Y-미로 장치에서 자발적 교대 작업을 사용하여 평가되었다. Y-maze는 팔이 서로 120° 각도에 있는 3개의 팔이 있는 수평 미로(길이 40cm, 너비 3cm, 벽 높이 12cm)이다. 동물은 처음에 중앙에 배치되었고 팔 항목의 순서와 수는 7분 동안 각 동물에 대해 수동으로 기록되었다. 자발적 교체는 연속(순차적)으로 세 가지 모두에 진입하는 것으로 정의되었다. 잔류 냄새를 제거하기 위해 동물을 연속적으로 배치하는 사이와 이후에 미로 팔을 물로 철저히 세척했다. 팔 항목의 총 수는 이동 활동의 지표로 사용되었다.

수동 회피 테스트: 이 테스트는 마우스를 밝은 빛이 비춰지는 챔버에 배치하는 훈련으로 시작되었다. 마우스가 어두운 방으로 넘어갔을 때 발에 약한(0.25mA/초) 전기 충격을 받았다. 어두운(충격) 구획에 들어가기 위한 초기 잠복기를 기준선 측정으로 사용했다. 훈련 후 24시간이 지난 탐침 시험 동안 마우스를 다시 밝은 구획에 놓고 어두운 구획으로 돌아가는 대기 시간을 수동적 공포 회피 지수로 측정했다.

실험결과

도 1에 나타낸 바와 같이, 알파폴드2(Alphafold-2) 도구를 이용한 LCN2-SLC22A17 상호작용 서열 예측 및 상호작용 억제를 위한후보 서열 모델링. LCN2와 상호작용하는 수용체 SLC22A17의 아미노산 서열에서 LCN2-SLC22A17 상호작용을 유발하는 서열을 알파폴드2 프로그램을 이용하여 예측하여 4가지 후보 서열을 도출되었으며, 이는 인간 서열 (human) 및 마우스 서열(mouse)의 비교에서 높은 유사도를 나타내었다 (도 1A). SLC22A17에서 LCN2 단백질이 결합 가능한 부위의 구조 및 결합 부위 서열 (peptide-1, 붉은색; peptide-2, 주황색; peptide-3, 녹색; peptide-4, 보라색) 입체/시각화하여 나타내었다(도 1B).

도 2에 나타낸 바와 같이, 4가지 펩타이드 억제제의 LCN2 억제 여부를 조사하기위해, 초대 배양된 성상세포에서 재조합 LCN2 단백질 또는 펩타이드 억제제를 함께 처리하고 24시간 뒤 새포배양액 (conditioned media)를 이용하여 ELSIA assay를 통하여 케모카인인 CXCL10 생산량을 측정 하는 방식으로 펩타이드 억제제의 효과 여부를 검증하였다(도 2A). 자세하게는, 초대 배양된 마우스 성상세포에서 재조합 LCN2 단백질의 처리에 의해서 세포액(conditioned media) CXCL10 단백질 생산의 증가를 유도할수있다. 이러한 조건에서 알파폴드2에 의해 도출된 4가지 펩타이드 억제제를 다양한 농도를 배양된 성상세포에 처리하여 독성 유발 여부를 확인하였을때, 최대 100 mg/ml까지 독성 유발은 관찰되지 않았다(도 2B). 재조합 LCN2 단백질과 함께 처리할 경우 CXCL10 단백질 생산이 감소됨을 확인하였다. 4가지 펩타이드 억제제 후보에서 Peptide-1 및 Peptide-4에서 가장 높은 억제 효과를 나타냈다(도 2C).

도 3에 나타낸 바와 같이, 4가지 펩타이드 억제제 후보중 효과가 높은 Peptide-1 및 Peptide-4를 이용하여 성상세포 표면에 LCN2의 결합 억제 여부를 시험하였다. 이를 위해 배양된 성상세포의 면역 염색을 통하여 LCN2의 수용체인 SLC22A17(붉은색)이 배양된 성상세포(GFAP 양성 성상세포; 녹색)에 발현하고 있음을 확인하였다(도 3A). 다음으로, 재조합 LCN2 단백질에 결합된 His tag을 이용하여 LCN2(Anti-His Tag; 녹색)의 세포표면에 결합함을 확인하였다(도 3B). 재조합 LCN2 단백질 및 Peptide-1 또는 Peptide-4와 함께 처리된 경우 세포 표면에 결합하는 재조합 LCN2 단백질의 수준이 크게 감소됨을 확인하였다(도 3B). 다음으로 유세포 분석(FACS)을 이용하여 LCN2 단백질이 결합된 성상세포 수를 분석하였으며, 면역 염색결과와 유사하게 LCN2 단백질 결합된 성상세포의 수가 감소되었음을 확인하였다(도 3C).

도 4에 나타낸 바와 같이, 세포막에 위치하는 SCL22A17의 구조에서 Peptide-4의 해당 서열 위치(붉은색)는 세포외부로 돌출되어 있으며 LCN2와의 결합시 작용 할 수 있음을 알수있다(도 4A 및 4B). 단백질-단백질 결합도를 측정 할 수 있는 BLI assay를 진행하여 LCN2와 Peptide-4가 서로 결합을 유발 할 수 있음을 확인하였다(도 4C).

도 5에 나타낸 바와 같이, LPS로 유도된 신경염증 마우스 모델(도 5A)에서 Peptide-4의 뇌실내 주사(i.c.v. injection)에 의하여 신경염증 마우스 모델에서 나타나는 손상된 인지기능이 Peptide-4 처리에 의해서 완화됨을 확인하였다(도 5B). 다음으로, 마우스의 뇌조직에서 염증성물질인 TNF, IL-1b, 및 IL-6 level이 유전자(mRNA; 도 5C) 및 단백질(protein; 도 5D) 수준 모두에서 억제됨을 확인하였다.

도 6에 나타낸 바와 같이, LPS로 유도된 신경염증 마우스 모델(도 5A)에서 마우스 뇌에서 면역 염색을 통하여 글리아세포(GFAP 양성 성상세포 및 Iba-1 양성 미세아교세포) 활성 또한 Peptide-4 처리군에서 억제됨을 확인하였다(도 6).

도 7에 나타낸 바와 같이, 외상성 뇌손상 모델인 제어된 피질충격 (CCI) 마우스 모델(도 7A)에서 Peptide-4의 뇌실내 주사(시스터나마그나, i.c. injection)에 의해 폴 테스트(운동 기능; 도 7B), 접착 스트립 제거 테스트(감각 운동 기능; 도 7C), Y-미로 테스트(공간 기억 기능; 도 7D) 및 수동적 회피 테스트(학습 및 기억 기능; 도 7E)를 포함한 일련의 행동 테스트에 의해 평가된 바와 같이 Peptide-4 처리는 외상성 뇌손상이가 유발된 마우스에서 행동 기능 장애를 완화시켰다. 또한, 외상성 뇌손상후 얻어진 마우스의 뇌에서 염증성 물질의 유전자 발현 수준이 감소됨을 확인하였다(도 7F).

도 8에 나타낸 바와 같이, 외상성 뇌손상 모델인 제어된 피질충격 (CCI) 마우스 모델에서 면역염색 결과에서 글리아세포(GFAP 양성 성상세포 및 Iba-1 양성 미세아교세포)활성이 Peptide-1 및 Peptide-4의 꼬리정맥 주사(i.v. injection)에 의해 억제됨을 확인하였다(도 8).

도 9에 나타낸 바와 같이, 외상성 뇌손상 모델인 제어된 피질충격 (CCI) 마우스 모델(도 9A)에서 Peptide-1 및 Peptide-4의 꼬리정맥 주사(i.v. injection)에 의해 폴 테스트(운동 기능; 도 9B), 접착 스트립 제거 테스트(감각 운동 기능; 도 9C), Y-미로 테스트(공간 기억 기능; 도 9D) 및 수동적 회피 테스트(학습 및 기억 기능; 도 9E)를 포함한 일련의 행동 테스트에 의해 평가된 바와 같이 Peptide-4 처리는 외상성 뇌손상이 유발된 마우스에서 행동 기능 장애를 완화시켰다. 외상성 뇌손상후 얻어진 마우스의 뇌에서 염증성 물질의 유전자 발현 수준이 감소됨을 확인하였다(도 9F).

도 10에 나타낸 바와 같이, 외상성 뇌손상 모델인 제어된 피질충격 (CCI) 마우스 모델에서 면역염색 결과에서 글리아세포(GFAP 양성 성상세포 및 Iba-1 양성 미세아교세포) 활성이 Peptide-1 및 Peptide-4의 꼬리정맥 주사(i.v. injection)에 의해 억제됨을 확인하였다(도 10).

도 11에 나타낸 바와 같이, 이를 위해 Alphafold2-advance(알파폴드2-어드밴스) 도구를 이용하여 LCN2와 SCL22A17의 결합에서 핵심이 되는 서열의 위치를 예측/파악하였고 해당 부분의 위치를 입체/시각화 하였다(도 11A; 붉은색). 예측된 서열의 위치가 Peptide-1 및 Peptide-4에서 일치하는 것을 확인하였다. 해당 결과를 이용하여 Peptide-1 및 Peptide-4의 뇌내 전달 효율을 높이기 위하여 핵심서열(붉은색)을 기준으로 N-terminal 및 C-terminal 방향의 펩타이드를 제거하여 Peptide-1 및 Peptide-4의 크기 간소화에 활용하였다. 이를 기반으로 아미노산 서열이 짧은 형태 Peptide-1-1, Peptide-4-1, 및 Peptide-4-2를 제작하였다 (도 11B).

도 12에 나타낸 바와 같이, 초대 배양된 성상세포에서 Peptide-1-1, Peptide-4-1, 및 Peptide-4-2를 다양한농도로 처리하여 독성유발 여부를 확인하였다. 최대 100 mg/ml 농도에서 독성은 나타나지 않았다(도 12A). 재조합 LCN2 단백질 처리에 의해 세포배양액에서 증가되는 CXCL10 생산이 Peptide-1-1, Peptide-4-1, 및 Peptide-4-2 처리에 의해서 억제되는 것을 확인하였다(도 12B).

도 13에 나타낸 바와 같이, 외상성 뇌손상후 얻어진 마우스의 뇌에서 Peptide-1-1, Peptide-4-1, 및 Peptide-4-2의 꼬리정맥 주사(i.v. injection)에 의해서 염증성 물질의 유전자 발현 수준이 감소됨을 확인하였다(도 13A 및 13B). 폴 테스트(운동 기능; 도 10C), Y-미로 테스트(공간 기억 기능; 도 10D), 및 수동적 회피 테스트(학습 및 기억 기능; 도 13E)를 포함한 일련의 행동 테스트에 의해 평가된 바와 같이 Peptide-1-1, Peptide-4-1, 및 Peptide-4-2 처리는 외상성 뇌손상이 유발된 마우스에서 행동 기능 장애를 완화시켰다.

도 14에 나타낸 바와 같이, 배양된 인간 유래 성상세포에서 Peptide-1-1, Peptide-4-1, 및 Peptide-4-2를 다양한농도로 처리하여 독성유발 여부를 확인하였다. 최대 100 mg/ml 농도에서 독성은 없었다(도 14A 및 14B, 왼쪽). 재조합 LCN2 단백질 처리에 의해 세포배양액에서 증가되는 IL-1b 생산이 Peptide-1-1, Peptide-4-1, 및 Peptide-4-2 처리에 의해서 억제되는 것을 확인하였다(도 14B, 오른쪽).

도 15에 나타낸 바와 같이, Expasy PeptideCutter 도구는 28개 효소와 화학물질을 통해 펩타이드 서열의 절단 부위를 예측하는 데 사용되었다(http://www.expasy.org/tools). 펩타이드 억제제의 효과 및 체내 안정성 향상을 위해 PeptideCutter 도구를 이용하여 단백질분해효소에 취약한 서열부위를 예측하였다(도 15). Peptide-1(도 15A), Peptide-1-1(도 15B), Peptide-4(도 15C), Peptide-4-1(도 15D), 및 Peptide-4-2(도 15E)에서 다양한 분해효소에 취약한 서열을 확인하였다(노란색 강조표시). 각각의 펩타이드 서열에서 가장 많은 수의 단백질 분해효소가 작용하는 동일한 위치를 도출하였으며, 해당 부분의 서열을 L-형태의 아미노산 서열을 D-형태의 아미노산으로 치환하였고, 안정성 효율을 높이기 위하여 N-말단 부분 아세틸화 및 C-말단 아미드화를 추가하였다. 안정성을 높이기 위해 아미노산 서열의 치환이 이루어진 서열은 각각 Peptide-1M, Peptide-1-1M, Peptide-4M, Peptide-4-1M, 및 Peptide-4-2M으로 명명하고 제작되었다 (도 15F).

도 16에 나타낸 바와 같이, 배양된 마우스 성상세포에서 Peptide-1M, Peptide-1-1M, Peptide-4M, Peptide-4-1M, 및 Peptide-4-2M를 다양한농도로 처리하여 독성유발 여부를 확인하였다. 최대 100 mg/ml 농도에서 독성이 나타났으며 않았다(도 16A 및 16B). 재조합 LCN2 단백질 처리에 의해 세포배양액에서 증가되는 CXCL10 생산이 Peptide-1M, Peptide-1-1M, Peptide-4M, Peptide-4-1M, 및 Peptide-4-2M 처리에 의해서 억제되는 것을 확인하였다(도 16C).

도 17에 나타낸 바와 같이, 외상성 뇌손상후 얻어진 마우스의 뇌에서 Peptide-1M, Peptide-1-1M, Peptide-4M, Peptide-4-1M, 및 Peptide-4-2M의 꼬리정맥 주사(i.v. injection)에 의해서 염증성 물질(Tnf, Il1b, 및 Il6 mRNA)의 유전자 발현 수준이 감소됨을 확인하였다(도 17A 및 17B). 폴 테스트(운동 기능; 도 17C), Y-미로 테스트(공간 기억 기능; 도 17D), 및 수동적 회피 테스트(학습 및 기억 기능; 도 17E)를 포함한 일련의 행동 테스트에 의해 평가된 바와 같이 Peptide-1M, Peptide-1-1M, Peptide-4M, Peptide-4-1M, 및 Peptide-4-2M 처리는 외상성 뇌손상이 유발된 마우스에서 행동 기능 장애를 완화시켰다.

본 발명에 따른 신규 펩타이드는 신경염증의 핵심 조절자로 역할하는 리포칼린 2를 억제함으로써 신경 염증을 완화하고, 운동 및 인지기능을 향상하는 활성이 매우 뛰어나 신경염증성 질환 예방 또는 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열 중 23 내지 36번째 아미노산, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 83 내지 97번째 아미노산, 서열번호 2의 아미노산 서열 중 134 내지 141번째 아미노산 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 중 199 내지 205번째 아미노산 서열을 포함하면서, 이의 N-말단 또는 C-말단 방향으로 각각 연속되는 1 내지 10개의 아미노산을 포함하거나 포함하지 않는 펩타이드; 또는 상기 펩타이드와 80% 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12 또는 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단 아미노산은 아세틸화, 아미드화 또는 메틸화된 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 하나 이상의 아미노산 잔기가 D-아미노산인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제6항의 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 숙주세포.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제8항에 있어서, 상기 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환은 신경염증, 신경변성, 인지 및 운동 기능 저하, 행동장애 또는 이와 관련된 질환인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제8항에 있어서, 상기 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환은 외상성 뇌손상, 인지 및 운동 장애, 치매, 알츠하이머병, 혈관성 치매, 루게릭병, 레비 소체 치매, 전측두엽 치매(FTD), 파킨슨병, 파킨슨 유사 질환, 파킨슨증, 헌팅턴병, 프리온병, HIV 감염으로 인한 치매, 노화로 인한 치매, 타우병증, 다발성 경화증, 주요우울장애, 외상후 스트레스장애, 양극성 정동장애, 주의력결핍 과다행동장애, 자폐 스펙트럼 장애, 조현병, 불안장애, 뇌전증으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.