KR101946441B1

KR101946441B1 - 특정 세포 군집 이외의 것을 고갈시켜 혈액 또는 골수 중의 특정 세포 군집을 정제하기 위한 시스템

Info

Publication number: KR101946441B1
Application number: KR1020127027057A
Authority: KR
Inventors: 필립 에이치. 코엘호
Original assignee: 세스카 쎄라퓨틱스 인코포레이티드
Priority date: 2010-03-18
Filing date: 2011-03-17
Publication date: 2019-04-22
Also published as: US20140212914A1; MX2012010744A; MX341634B; JP2013526901A; EP2547346A4; JP2015037590A; US9599545B2; SG183963A1; WO2011116221A1; EP2547346B1; JP6016867B2; US20170199106A1; EP2547346A1; MX370137B; CA2793648C; AU2011227203A1; AU2011227203B2; US20130029370A1; CN102946890A; US8747289B2

Abstract

혈액, 골수, 또는 지방 조직으로부터 분리된 기질 혈관 분획 세포를 포함하는 샘플로부터 적혈구, 과립구, 또는 혈소판 중 하나 이상을 고갈시켜 혈액 또는 골수 중의 특정 세포 군집을 정제 및 수거하기 위한 장치 및 방법을 개시한다. 본 장치는 멸균성이고, 단일 사용되는, 강성의 자가 지지 카트리지를 포함하며, 이 카트리지 안에서 표적 세포 군집의 자동화된 고갈, 정제, 및 수거가 수행되며, 모든 성분이 분포할 수 있다.

Description

특정 세포 군집 이외의 것을 고갈시켜 혈액 또는 골수 중의 특정 세포 군집을 정제하기 위한 시스템{SYSTEM FOR PURIFYING CERTAIN CELL POPULATIONS IN BLOOD OR BONE MARROW BY DEPLETING OTHERS}

관련 출원

본 출원은 2010년 3월 18일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/315,109, 및 2011년 1월 27일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/436,964를 우선권 주장한다. 상기 가출원들의 개시내용은 그 전문이 개시된 것과 마찬가지로 본원에 참고로 포함된다.

배경기술

기술 분야

본 발명은 세포 분리 시스템, 및 특히, 정상 혈액, 태반 혈액/제대혈, 골수, 또는 지방 조직으로부터 한번 분리된 기질 혈관 분획 (SVF) 세포로부터 특정 혈액 성분을 고갈시키기 위한 시스템에 관한 것이다.

본 발명의 배경 기술

정상적인 인간 혈액은 일반적으로 혈소판 ("PLT"), 혈장, 적혈구 ("RBC"), 백혈구 ("WBC")와, 극소량의 줄기 및 선조 세포 (SPC)를 포함한다. (개인차가 있으며, 시간 경과에 따라서는 같은 개체에서도 차이를 보이지만) 평균적으로 RBC는 개체의 총 혈액 세포수의 대략 99.9%를 이루고, 개체의 총 혈액 부피의 대략 45%를 차지한다. RBC는 신체 조직에 산소를 전달하는 주된 수단으로서의 생체 기능을 담당한다. 개체의 혈액 부피의 그 나머지는 거의 모두 혈장으로 구성되어 있는데, 이 혈장은 총 혈액 부피의 대략 55%를 차지하는 혈액 중의 비-세포 액체 성분으로서, 그 중에 모든 혈액 세포가 현탁되어 있는 것이다.

따라서, 정상 혈액의 99부피%를 넘는 부분이 혈장 및 RBC로 구성되어 있다. 정상 혈액의 대략 < 0.6부피%인 나머지 부분은 모든 다른 혈액 세포 유형 및 PLT로 구성되어 있다. PLT는 수적으로 WBC보다 약 10배 더 많은, 불규칙적인 형상의 작은 무핵 세포이다. PLT는 출혈을 멈추게 하고, 손상된 조직을 수복 및 재생시키는 다수의 성장 인자를 방출함으로써 상처 치료에서 기본적인 역할을 한다.

그 다음으로 가장 우세하게 존재하는 혈액 세포는 WBC로서, 이는 수적으로 단지 전형적인 혈액 샘플 중 총 세포의 약 0.1%만을 구성한다. 그러나, WBC는 신체 면역계에 중요하며, 감염성 질환 및 외래 물질로부터 신체를 방어한다. WBC는 추가로 보다 작은 하위군으로 세분화될 수 있다. 그러한 가장 큰 하위군은 과립구 (GRN)로서, 이는 전체 WBC의 대략 60%를 구성하는 것이며, 대략 40%를 차지하는 다른 나머지 하나는 단핵 세포 (MNC)이다. 본 출원 전역에 걸쳐, WBC라는 용어를 사용하는 것은 배타적으로 GRN만을, 배타적으로 MNC만을, 또는 일부에서는 그 둘 모두의 조합을 언급한다는 것을 나타낼 수 있다.

MNC는 추가로 림프구 및 단핵구로 세분될 수 있지만, 각 세포 안에 단일의 둥근 핵이 존재하기 때문에 이는 총칭하여 MNC로 언급할 수 있다. MNC는 면역계의 중요 요소로서, T 세포, B 세포 및 NK 세포를 포함하는데, 이는 신체 조직내 감염 부위로 이동한 후, 분열하고 대식세포 및 수지상 세포로 분화하여 면역 반응을 유도한다. 마지막으로, MNC는 그 자체는 추가로 보다 더 작은 하위부류: 초극소량 다분화능 조혈 (혈액 형성) 줄기 및 선조 세포 및 중간엽 (골, 지방, 연골, 근육 및 피부 형성) 줄기 및 선조 세포로 세분될 있는데, 이 둘 모두 인간 건강에 중요하다. MNC의 또 다른 공급원은 지방 흡인시에 개체로부터 제거된 지방세포로부터 분리된 기질 혈관 분획 세포 (SVFC)이다.

산업계에서는 정상 혈액, 태반 혈액/제대혈 또는 골수로 이루어진 샘플이 연간 2천 5백만건 넘게 채취된다. 샘플은 일반적으로 질환 치료를 위한 연구의 일부분으로서, 또는 직접적인 임상 치료를 위해 채취되기 때문에, 가장 많이 단리되는 혈액 세포는 WBC이고, 그 다음은 MNC이다. MNC는 모든 줄기 및 선조 세포와, 매우 중요한 면역 세포의 대략 40%를 포함한다. 따라서, 가장 많이 요구되는 세포는 전형적인 샘플을 위해 채취된 세포 중 극히 작은 일부만을 나타낸다.

따라서, 본질적으로 모든 줄기 및 선조 세포 (SPC)를 함유하며, 실질적으로는 모든 RBC가 제거된, 상대적으로 정제된 세포 군집을 원한다면, WBC를 단리시키기 위해서는 상기 기술된 혈액 또는 골수의 성분을 분리시켜야 할 필요가 있으며, 또는 보다 더 큰 순도의 것을 원한다면, MNC를 분리시켜야 할 필요가 있다. 연구용으로, 임상 시험을 위해, 및 현장 진단 의료 행위를 위해 SPC에 대한 요구가 증가하고 있는 바, 상기와 같은 세포 군집을 분리하고, 표적 세포를 수거하는 일관되고 효과적인 방법이 상기와 같이 긴급하게 요구되고 있다.

SPC에 대한 관심과 그에 대해 수행되는 연구는 엄청나다. 2010년 11월까지 전세계에서 줄기 세포에 관한 연구 논문은 100,800건 넘게 발표되었다. 현재 전세계에서 7,000여명 이상의 수석 연구원들이 SPC에 관해 주목하고 있다. 단독으로 미국에만도 일부 300여 곳의 줄기 세포 연구 센터와 대략 10,000여 곳의 개인 실험실이 존재한다. 이러한 방대한 연구의 결과로서 NIH 웹사이트 clinicaltrials.gov에 따라 제대혈 줄기 세포를 사용하는 199가지의 임상 시험, 지방 조직을 사용하는 34가지의 임상 시험, 및 골수 줄기 세포를 사용하는 1,405가지의 임상 시험이 현재 진행되고 있다.

관련 분야에 관한 설명

전혈 또는 골수 흡인물 샘플로부터 특정 세포 유형을 단리시키고 수거하는 종래 방법은 일반적으로 상기 샘플을 원심분리하는 것을 포함한다. 원심분리하는 동안 본 공정시 고밀도 및 저밀도의 다른 세포 유형 및 혈장은 변위시키면서, 세포 군집은 그의 밀도에 의해 더 작은 것에서 더 큰 것으로의 가속도 축을 따라 상대적인 위치로 이동하고, 층으로 농축되는 경향이 있다.

도 1은 인간 혈액에서 발견되는 각종의 세포 유형의 밀도 및 평균 직경을 나타낸 것이다. 상이한 세포 유형 간의 물리적인 차이는 혈액을 원심분리할 때 중요하다. 혈액을 원심분리할 때, 세포는 스토크스의 법칙(Stokes Law)을 비롯한 많은 유체 역학적 계수에 따른 속도로 새 위치로 이동하기 시작한다. 모든 세포가 경미하게 음 전하를 보유한다는 사실이 세포막 대 세포막 간의 직접적인 접촉을 방해한다. 비교적 적은 세포와 함께, 주로 혈장을 포함하는 환경하에서는 세포가 크면 클수록, 세포는 더욱 빠르게 이동하게 된다. 그러나, 세포의 농도가 증가할수록 세포 전하의 효과가 실질적으로 세포 속도를 결정짓기 시작하다.

그러나, 모든 경우에 있어서, 세포가 조밀할수록, 세포는 결국 용기내에서 (즉, 추가로는 원심분리 회전축으로부터) 더 낮은 쪽으로 이동하여 가라앉게 된다. 따라서, 도 2에 제시되어 있는 바와 같이, 가장 조밀한 세포인 RBC (그의 밀도는 1.08 내지 1.12 사이이다)는 원심분리되는 용기의 바닥쪽으로 이동하게 될 것이다. RBC 층 내에서 (제대혈 및 골수, 둘 모두에는 존재하지만, 정상 혈액 중에는 존재하지 않는) 유핵 적혈구가 적혈구 분획의 상단에 위치할 것이다. RBC 상단에는 GRN (밀도 1.07-1.11)이 위치할 것이며, 이어서, 용기에서 회전축으로 보다 가깝게 이동한 순서대로 림프구 (밀도 1.05-1.09), 단핵구 (밀도 1.045-1.0750) 및 PLT (1.03-1.065)가 위치할 것이다. SPC의 밀도는 단핵구 및 림프구에 가장 가깝고, 따라서, 상기 세포가 더 많이 포획되었다면, SPC를 포획할 수 있다는 것이 공지되어 있다. 특정 조건하에서 형성되는 공지의 계층을 이용함으로써 한가지 세포 유형의 계층만을 단독으로 수거함으로써 상기 세포 유형을 원활하게 수거할 수 있다. 도 2는 또한 정상 혈액, 제대혈, 및 골수의 전형적인 샘플 중 혈액 세포 유형의 상대적인 빈도를 제시하고 있으며, 최종적으로는 하기에서 논의되는 바와 같이, 밀도에 의해 조직화된 세포 군집이 일부는 중복된다는 것을 나타내고 있다.

세포층을 계층화하는 데에는 일반적으로 설정된 시간량 동안에 걸쳐 단지 높은 관성력(G force)을 가하는 것만을 필요로 하지만, 특정 세포층을 정확하게 제거하는 데 있어서는 문제가 있다. 주어진 샘플 중 특정 세포 군집의 희귀성 및 작은 부피를 설명하기 위해, 도 3, 4, 및 5는 원심분리 및 계층화 이후의 정상 혈액 (NB), 제대혈 (CB) 및 골수 (BM) 중 각 세포 군집의 각각의 평균 부피를 설명하고 있다.

도 3, 및 4는 세포 대부분이 RBC임을 도시하고 있는 반면, 도 5는 비-RBC 세포성 혈액 성분의 부피가 너무 작기 때문에, 심지어 200 ml의 제대혈 샘플을 사용한 경우에도, GRN (상단 라인), MNC (중간 라인) 및 PLT (하단 라인) 모두의 총 부피가 약 1 mL임을 뚜렷이 나타내고 있다. 제대혈 중에서 MNC는 매 1,000개의 혈액 세포 중 1개가 안된다 (대략 총 세포의 0.08%). 10,000개의 RBC를 포함하는 제대혈 샘플 중에서는 40-200개의 PLT, 3-6개의 MNC, 및 5-10개의 과립구가 발견될 것으로 예측할 수 있다.

설명한 바와 같이, 대다수의 혈액은 세포수 및 부피, 둘 모두에 있어서 WBC 이외의 다른 세포로 구성되어 있다. 이러한 WBC는 희소할 뿐 아니라 막대한 수의 RBC가 존재하는 액상 용액 내에 있기 때문에, WBC를 단리시키는 현 방법은 (A) 노동 및 시간 집약적인 것으로, 탁월한 실험실 기법을 필요로 하며, (B) 전형적으로는 멸균 환경하에서는 달성될 수 없고, (C) 전형적으로는 WBC를 포획하는 데 있어 효율은 단지 50-75% 사이이며 (WBC의 25% 내지 50% 손실), (D) 세포 기능에 유해한 영향을 줄 수 있는 공정을 포함한다. 혈액 샘플의 크기는 전형적으로 작고, SPC가 정상 혈액 중에서는 극도로 희귀하다는 사실을 고려해 볼 때, 정상 혈액으로부터 얻은 WBC 전형적인 수거물에는 어떤 SPC도 존재하지 않을 수 있으며, 비록 SPC가 정상 혈액보다는 제대혈 중에 더 많이 존재하기는 하지만, 이는 역시 제대혈 중에서는 희귀한 것이다.

정상 혈액으로부터 WBC를 수득하는 것이 얼마나 어려운지를 추가로 설명하기 위해, 보통 종래의 수동 혈액 성분 분리 방법에서 사용되는 50 ml 시험 튜브를 도식으로 나타낸 것이 도 6에 제시되어 있다. 이 시험 튜브의 폭은 전형적으로 28 mm였다. 원심분리 후, 분리된 혈액 성분은 혈장 (상단) 및 RBC (하단) 및 그 사이에 배치되어 있으며 (도해로 나타내기 위한 목적으로 도 6에서는 그 크기를 과장하여 표시), "백혈구 연층"이라고 명명되는 거의 육안으로는 볼 수 없는 박층이 그 사이에 배치되어 있다. 이러한 "백혈구 연층"은 WBC, SPC 및 PLT를 거의 모두 함유한다.

현재 전혈로부터 WBC를 수거하는 수개의 반-자동 시스템이 시판되고 있기는 하지만, 수동 방법과 비교하였을 때 세포 회수율에 있어 그의 이점은 그리 유의적이지는 않으며, 그의 시장 침투 규모는 작다. 혈액 또는 골수 샘플내 WBC를 단리시키고, 포획하는 현재의 일반적 방법으로는 (A) 밀도 구배 과립 방법 및 (B) 밀도 구배 디스크 방법, 이 2가지 수동 프로세싱 기술을 포함한다. 진단 또는 연구 목적으로, WBC를 혈액 또는 골수로부터 단리시킬 때에는 거의 언제나 이 기술들을 사용하여 WBC를 단리시키는 것으로 예측된다. 이 둘 모두는 전형적으로는 해당 프로세스용의 원통형 튜브를 사용하고, 이 둘 모두는 밀도에 관한 긴 충고의 조작에 의존한다. 예를 들어, MNC를 단리시키는 것이 목표일 경우, 밀도가 대략 1.08인 (그 직경이 튜브의 내경보다 약간 더 작은 것인) 수천개의 작은 과립 또는 디스크가 튜브에 놓이게 된다. 이러한 비밀도 값은 GRN과 림프구의 중앙 밀도 간에 등거리에 존재하기 때문에 상기 값이 선택된다 (도 2 참조). 정확하게 기능을 수행하도록 하기 위해, 상기 두 기술들은 모두 먼저 혈액 부피의 2 내지 4배되는 양의 완충제으로 혈액 샘플을 희석시킬 것을 필요로 한다.

먼저 과립 방법을 참조하면, 완충처리된 혈액 샘플을 시험 튜브에서 과립과 함께 혼합한 후, 원심분리를 개시한다. 원심분리되는 동안 과립의 밀도를 통해 과립은 합체되고, 이로써 RBC/GRN이 MNC/PLT로부터 분리된다. 도 7은 MNC를 RBC/GRN으로부터 분리하는 피콜(Ficoll) 밀도 구배 과립을 사용한 상기 프로세스를 도시한 것이다.

밀도 구배 디스크를 사용하는 방법은 매우 유사하며, 이는 도 8에 도시되어 있다. 여기서, 밀도 1.08의 디스크는 원심분리하에 림프구와 GRN 사이의 계면으로 이동한다. 그러나, 대부분의 밀도 구배 디스크들은 상기 과립에서는 발견되지 않는 한가지 특징을 포함하는데; 상기 디스크는 상층 디스크와 하층 디스크 사이에 공동을 포함하며, 거기에 MNC가 가라앉을 것으로 예상되며, 이로써 공동과 튜브의 상단부 사이를 왕복하는 가요성 튜브를 통해 MNC를 수거하는 단계는 다소간 간소화될 수 있을 것이다.

혈액 샘플로부터 MNC를 단리시키고 포획하는 상기와 같은 수동 방법은 인내와 탁월한 손재주를 필요로 한다. 이러한 방법을 수행하는 데는 전형적으로는 1½ 내지 2시간 소요되며, 최고로 잘 수행된 경우에도 MNC의 회수율은 대개 60% 미만이다. 따라서, 혈액 샘플 내의 MNC를 단리시키고 포획하는 데 통상적으로 사용되는 수동 방법은 그 기술상에 한계가 많기 때문에 정확도와 속도면에서 최적의 것에 미치지는 못한다.

먼저, 밀도 구배 용액은 단 하나의 물리적 인자-밀도에만 의존함으로써 혈액 또는 골수로부터 WBC 군집을 단리시킬 수 있다. 일단 원심분리가 시작되면, 밀도 구배 매질은 세포 용액 중 그가 부유할 수 있는 위치로 이동하여 멈춰 선다. 전형적으로, 세포 군집은 가속도와 지속 기간, 둘 모두가 고정되어 있는 동안 그의 최종 위치로 이동하게 되는데, 따라서, 개별 혈액 샘플에 대해 최적인 경우는 드물다.

본질적으로 두 밀도 구배 기술 모두의 WBC 또는 MNC 수거율은 도 2와 관련하여 상기에서 언급된 바와 같이, 과립구와 림프구의 중앙 밀도 종형 곡선 사이의 갭 중심부 (즉, 1.08)를 겨냥해야 하는 필요성으로 인해 제한을 받는다. 도 2에서 분명히 밝혀진 바와 같이, 이러한 고정 밀도가 모든 과립구를, 또는 심지어 모든 RBC를 배제시키는 것도 아니며, 실제로는 원하는 림프구 중 일부를 폐기해 버리기도 한다.

이러한 단순 접근법은 또한 심지어 일반 건강한 사람에서도 조차 각 유형의 세포의 개수 및 밀도에 있어서 유의적인 차이가 존재하며, 샘플 간의 침강 속도도 10배 만큼의 정도차를 나타낼 수 있다는 사실을 수용하지 못한다. 추가로, 환자가 특정 질환을 앓는 경우, 상대적인 세포 군집 및 세포의 침강 속도에 있어 그 차이는 훨씬 더, 최대 100배 이상으로 클 수 있다. 결과적으로, 이러한 초기의 WBC 또는 MNC 단리 기술이 임의의 특정 혈액 샘플에 대해 최적인 경우는 드물다.

이러한 한계의 심각성을 이해하는 최상의 방법은, 원심분리 이전에 전 부피에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 혈액 샘플 중의 세포는 원심분리가 시작되면 새로운 위치로의 레이싱을 시작한다는 것을 이해하는 것이다. WBC 또는 MNC 단리 기술의 효율은 레이싱 종결시에 WBC 모두가 얼마나 정확하게 같은 계층에 놓여져 있는지, 및 세포가 용기의 아주 작은 움직임에도, 또는 피펫 팁의 아주 작은 움직임에도 재혼합되기 시작하는 표준 1 G 조건하에서 기술자가 피펫을 사용하여 그 위치로부터 WBC를 얼마나 잘 추출해 낼 수 있는지에 따라 달라진다.

과학자들은 정상 혈액으로부터 RBC가 1 G 조건하에 용기의 하단부로 이동하는 속도에 대해 장기간 동안 연구하여 왔다. 이러한 측정치를 적혈구 침강 속도, 또는 ESR이라 명명한다. 종래 MNC 단리 프로세스에서 사용된 원심분리 가속도가 침강 속도를 가속화시키기는 하지만, 상이한 세포 유형들의 침강 속도 차이 (%)는 바꾸지 않는다. 추가로, RBC가 WBC보다 수적으로 1,000배 더 많고, MNC보다는 수적으로 2,000배 더 많기 때문에, 모든 세포는 경미하게 음 전하를 유지하며, WBC 군집을 단리시키는 데 있어 가장 큰 영향을 주는 것은 RBC 이동이다.

여러 연령대의 성인에서의 ESR (시간당 밀리미터 (mm/시간)로 측정)이 도 9에 제시되어 있다. 소아의 경우, ESR의 정상 수치는 출생시에는 1 내지 2 mm/시간이고, 출생 후 8일간 4 mm/시간으로 상승한 후, 14일째까지 17 mm/시간으로 상승한다 (2주 미만의 시간 경과 후 10배 초과 변화). ESR은 가변성이 크기 때문에, 악성 질환, 예를 들어, 다발성 골수종, 각종 자가면역 질환, 예를 들어, 류마티스 관절염, 및 만성 신장 질환 (여기서, ESR은 100 mm/시간을 초과할 수 있는데, 이는 정상적인 성인이 가진 값의 5배 정도된다)을 진단하는 데 사용된다.

추가로, 하향하는 RBC로 인해 변위된 상향하는 혈장 상에서 부유하게 된 결과로서, 용기 바닥쪽에 있는 WBC는 용기의 상부쪽에서부터 하향하는 것과 함께 합류하여 단지 위쪽으로만 이동할 수 있는 것에 주목한다. 용액 중 극소수의 WBC는, RBC와 같은 수직 채널을 통해 반대 방향으로 이동하면서, 수적으로 1,000배 더 많은 RBC의 유동에 역행하여 위쪽으로 상향하는 그의 경로에 대해 타협이 이루어져야 한다는 점에 주목한다. 추가로, 원심분리의 가속도와 지속 기간은 수행 출발 시점에 프로그램화되기 때문에, RBC 대부분이 튜브의 바닥쪽에 도달하지 못할 수 있고, 이로써 표적 WBC 다수가 상향하는 혈장에 의해 "백혈구 연층" 계층에 대해 부력을 가지지 못할 수도 있다는 점에서 특정 샘플 내의 모든 세포를 이전시키는 데 만족할 만한 지속 기간이 다수의 다른 혈액 샘플에 대해서는 불충분할 수 있다. 이러한 프로세스는 고속 스피닝 로터 내의 폐쇄형 원심분리기 내에서 일어나기 때문에, 오퍼레이터는 세포의 실제 이동을 관찰할 수 없다.

따라서, 임의로, 원심분리된 각 개별 혈액 샘플 내의 세포 군집의 이동을 실시간으로 추적하는 시스템이 요구되고 있다. 상기 시스템을 통해 각 개별 혈액 샘플을 상기 혈액 샘플의 구성 세포 군집의 특정 크기 및 밀도에 따라 맞춤식으로 프로세싱할 수 있을 것이다. 이러한 개선된 해결 방안은 또한 표적 WBC 또는 MNC 세포 군집의 수거 효율을 크게 증가시켜야 한다.

밀도 구배 매질이 가진 추가의 단점은 WBC가 수거되는 혈액의 부피를 최소화시키면서, 주어진 수거 튜브의 부피 대부분을 차지하는 것인 완충제를 필요로 한다는 점이다. 완충제는 대개 전형적인 수거 튜브 부피 50 ml 중 70% 내지 90%를 차지하며, 단지 5 내지 15 ml의 혈액을 위한 공간을 남겨 둔다. 결과적으로, 추가로는 목표 달성을 위해 필요한 노동력을 증가시키면서 100 ml의 혈액으로부터 WBC를 수거해야 하는 기술자는 7 내지 20개의 시험 튜브를 사용하여야 한다. 추가로, 최종 WBC 군집 중 오염 물질로부터 적당한 순도를 얻기 위해서는 과립 밀도 구배 매질 및 완충제는 세척으로 제거되어야 하는데, 이는 필연적으로 표적 세포의 추가적인 손실을 가져온다.

따라서, 대량의 밀도 구배 매질 또는 완충제를 필요로 하지 않는, 혈액 또는 골수 샘플로부터 원치않는 세포를 제거하는 수단이 요구된다. 그러한 수단을 통해서는 임의로 보다 큰 부피의 샘플로부터 WBC를 수거할 수 있으며, 추가로는 진단 또는 임상 용도로 회수될 수 있는 구성 세포의 수를 증가시킬 수 있다.

상기 기술된 밀도 구배 기반 혈액 분리 방법이 가진 세번째 단점은 원심분리 동안 WBC가 상승하여 RBC 위쪽에 위치하게 되는 데에는 밀도 구배 수거 튜브의 평행한 수직 벽이 도움이 되지 못한다는 점이다. 종래 시스템에서 밀도 구배 수거 시험 튜브는 평행한 수직 벽을 가지는데, 이는 원심분리 동안에 모든 세포가 튜브의 축을 따라 수직으로 하강하거나, 상승한다는 것을 의미한다. 상기 기술한 바와 같이, 상향하는 각각의 WBC는 반대 방향으로 이동하는 수천 개의 RBC와의 타협이 이루어져야 한다. 수거 시험 튜브의 평행한 수직 벽은 원심분리 동안에 WBC의 상승에 도움을 줄 수 있는 어떤 횡운동도 하향하는 RBC 및 상향하는 WBC에 제공하지 않는다. 그 결과, 튜브의 바닥에서 스핀 사이클을 시작하는 WBC 상당 부분은 선택된 원심분리 방식을 수행하는 동안 수거 "백혈구 연층" 층으로 상승하지 못할 수 있다.

따라서, RBC 부피의 위쪽으로 상향하는 RBC 중 가장 가벼운 것에 의해 유도되는 와전류를 증진시키면서, 하향하는 RBC 대부분이 중앙부에 집중되도록, 바닥에서는 좁아진 깔때기 형상의 수거 챔버를 이용함으로써 시험 튜브 바닥에 WBC가 포획되는 것을 극복시키는 것이 요구되고 있다. 결국, 수적으로는 훨씬 더 적지만 더 큰 부력을 가진 WBC가 상승하는 데 상기와 같은 와전류가 도움이 된다.

밀도 구배 기반 분리 방법이 가진 네번째 단점은 MNC가 1 G에서 수동으로 수거되는 위치에서의 밀도 구배 수거 시험 튜브의 큰 단면적이 일정하다는 점이다.

표준 50 ml 밀도 구배 수거 튜브의 벽은 공간적으로 약 28 mm 떨어져 고정되어 있기 때문에, 10 ml의 말초 혈액 샘플로부터의 극소량의 MNC (약 0.028 ml)는 튜브의 전체 단면적 (약 615 ㎟)에, 거의 보이지 않는 박층 (약 0.023 mm)으로 퍼져 있다. 이와 같은 광범위한 단면적과 생성된 MNC의 박층으로 인해, 세포 군집 간의 밀도차를 계층화하는 효과는 극히 작다. 결과적으로, 1 G에서 MNC를 수거하기 위해서는 고도로 숙련된 기술자가 밀도 구배 (아래쪽)와 혈장 (위쪽) 사이에 부유되어 있는 상기와 같은 초박층의 세포 내로 피펫 팁을 천천히 주의하여 삽입한 후, 흡입을 가하여 MNC를 피펫 내로 끌어올려야 한다. 그러나, 실질적인 원심력에 의해 확대되지 않은 경우의 세포 군집 간의 극소의 밀도차, 및 튜브의 큰 단면적으로 인해 MNC/PLT가 본질적으로 모두 같은 얇은 수직 층에 놓이게 된다. 결과적으로, 이러한 수작업을 통한 흡입 프로세스 동안에 아무리 많은 주위를 기울여도 MNC/PLT 층과 밀도 구배 매질의 교란을 막을 수 없고, 이에, MNC의 손실과 밀도 구배 과립에 의한 세포의 상당한 오염이 뒤따르게 된다. 따라서, 이러한 방법을 수행하는 동안 약 25-40%의 MNC를 손실하는 것은 흔한 일이다.

따라서, 실질적인 원심분리가 세포 계층의 통합성과 순도는 유지시키고, 테이퍼형 깔때기 아래쪽으로 하향함에 따라 그를 수직 방향으로 신장시키면서, 단면적이 좁은 깔때기 출구를 통해 RBC와 대부분의 GRN을 고갈시킴으로써 MNC 수거 동안의 그의 손실을 피하고자 하는 것이 요구되고 있다.

종래 밀도 구배 과립 기반 시스템의 다섯번째 단점은 밀도 구배 과립과 세포 사이의 직접적인 접촉에 기인한다. 이들 과립과 수거하고자 하는 세포 사이의 광범위한 접촉이 독성 형태에 기인하여 세포 기능에 손상을 줄 수 있다고 보고된 바 있다. 예를 들어, 유한 창(Yuhan Chang) 등은 최근 문헌 ["The Efficiency of Per coll and Ficoll Density Gradient Media in the Isolation of Marrow Derived Human Mesenchymal Stem Cells with Osteogenic Potential" (Chang Gung Med J 2009;32:264-75)]에서 일련의 희석액 형태의 대조군 매질 및 퍼콜(Percoll) 또는 피콜의 혼합물과 함께 배양하여 이들 두 구배 매질의 성장-억제 또는 세포독성 효과를 평가함으로써 CFU-F (1 계대)에 대한 세포독성 시험을 수행하였을 때, 두 군 모두에서 구배 매질의 비가 증가함에 따라 CFU-F는 더 큰 세포 사멸을 보였다고 보고한 바 있다.

따라서, 밀도 구배 과립, 또는 세포 기능을 변경시키거나 손상시킬 수 있는 임의의 다른 외래 물질을 첨가할 필요없이, RBC, 또는 RBC 및 GRN, 또는 RBC, GRN 및 PLT, 또는 RBC, GRN 및 MNC를 고갈시키는 것이 요구되고 있다.

밀도 구배 과립을 사용하거나, 또는 사용하지 않는 종래 혈액 분리 방법의 여섯번째 단점은 기술자의 능력의 가변성, 및 1 G에서 세포의 부주의한 재혼합이 쉽게 이루어질 수 있다는 점에 기인하여 상당수의 RBC가 최종 생성물 중에 남아 있을 수 있는 가능성이 있다는 점이다. 최근 여러 연구를 통해 RBC 오염을 최소화하는 것이 중요하다는 것이 강조되었는데, 그 이유는 그러한 오염이 이들 MNC를 사용하는 의학적 치료의 효능을 감소시키기 때문이다.

RBC 오염이 가지는 상기와 같은 부작용의 예는 아주 많으며, 예를 들여, RBC 오염은 단리된 BMC의 기능에 영향을 주며, 급성 심근경색을 앓는 환자에서 관상동맥내 BMC 주입 후의 좌심실 박출율 회복 정도를 결정짓는다고 개시되어 있는 문헌 ["Red Blood Cell Contamination of the Final Cell Product Impairs the Efficacy of Autologous Bone Marrow Mononuclear Cell Therapy," Assmus et al., Journal of the American College of Cardiology, 55.13, 2010]을 참조할 수 있다. 또한, 저장된 RBC가 T-세포 증식에 대해 강력한 억제 효능을 발휘하고, 수혈 후에 생체내에서 유사한 T-세포 증식 억제가 발생할 수 있으며, 이것이 수혈과 관련된 면역조절에 대한 주된 기여자일 가능성이 있다고 개시되어 있는 문헌 ["Packed Red Blood Cells Suppress T-Cell Proliferation Through a Process Involving Cell-Cell Contact, " Bernard et al., The Journal of Trauma, Injury, Infection, and Critical Care, 69.2, Aug. 2010]을 참조할 수 있다.

SPC를 함유하는, 보다 더 정제된 용액을 회수하기 위해서는, 정상 혈액 또는 제대혈, 골수 또는 지방 조직으로부터 분리된 SVF 세포로 이루어진 수집된 샘플로부터 RBC, GRN 및 가능하게는 PLT를 더욱더 크게 예측가능하게 고갈시키는 것이 요구되고 있다.

상기 세포 분리 및 제거 프로세스를 자동화한 상업적으로 입수가능한 시스템 (예를 들어, 스위스 소재의 바이오세이프 SA(Biosafe SA)로부터 입수한 헤모네틱스 V50(Hemonetics V50), 코베 스펙트라(Cobe Spectra), 세팍스 시스템(Sepax System), 및 미국 캘리포니아 소재의 써모제네시스 코포레이션(Thermogenesis Corp.)으로부터 입수한 써모제네시스 AXP(Thermogenesis AXP))은 많지 않은데, 이들 역시 상당한 단점을 가지고 있으며, 정제된 WBC 회수에 있어서도 종래의 수동 수단과 비교하여 개선된 바도 없었다. 추가의 단점은 이들 상업적으로 입수가능한 자동화 시스템이 작동되기 위해서는 값비싼 자본 설비가 필요하다는 점이다. 이러한 자동화 장치에는 수만 달러가 소비되며, 예를 들어, 제대혈 줄기 세포 뱅크가 1일당 40 내지 200 단위를 프로세싱할 수 있는 것과 같이, 정제된 WBC 단위당 큰 생산이 요구될 경우, 상기 장치는 크고 단단한 실험실 공간을 점유하게 된다. 도 10에는 2개의 선행 기술 시스템 및 현 시스템과 함께, 혈액 4 단위를 프로세싱하는 데 드는 비용이 제시되어 있다.

현재 상업적으로 입수가능한 자동 시스템의 두번째 단점은, 도 11에 제시되어 있는 바와 같이, 세포를 프로세싱하는, 견고한 배관과 함께 연결된 단일의 1회용 백 세트를 필요로 한다는 점인데, 이는 제조하기가 복잡하고, 비용이 많이 들며, 곤란하다. 상기 백 세트는 그의 전용 장치에 정확하게 로딩되고, 혈액 또는 골수 프로세싱을 위해 시스템을 준비시키는 데 대략 5분 정도가 소요된다. 상기 선행 기술의 백 세트는 복잡하고, 제작 비용이 많이 든다. 도 11에 제시되어 있는 바와 같이, 상기 선행 기술의 백 세트는 개별적으로 형성된 점착 연결부를 20개 넘게 필요로 한다.

따라서, RBC 오염은 덜하고, 더욱더 높은 회수율로 WBC를 회수할 수도 있는, 보다 간편하고, 비용이 더 저렴하며, 더 빠르고, 사용이 보다 쉬운 자동 시스템이 요구되고 있다. 추가로, 다중 백 및 복잡한 연결 배관을 필요로 하지 않으며, 간단하고, 제작 비용이 저렴한 단일의 1회용 프로세싱 용기를 사용하는 시스템도 요구되고 있다.

도 12에는 모든 세포 프로세싱이 그 안에서 이루어지고, 세포 계층화 및 고갈과 관련된 모든 부품이 그 안에 위치되어 있는 일체형의 원통형 카트리지를 제공한다는 점에서 본 발명의 간단함을 나타낸다. 1초 또는 2초라는 단시간 이내에 상기 카트리지는 전용 원통형 제어 모듈 상단 위에 잠김 상태로 될 수 있고, 원심분리기 컵 내로 삽입될 준비 상태에 있을 수 있다. 제어 모듈은 광학 및 중력 감지 수단 뿐만 아니라, 카트리지의 활동을 제어하는 수단을 포함한다.

이러한 일체형 카트리지는 정밀한 사출 성형 제작이 이익이 되며, 전형적으로 다중 백 세트 및 그에 연결된 복잡한 연결 배관을 포함하는 선행 기술 자동 시스템용의 종래 프로세싱 1회용품보다 구성이 훨씬 간단하고 노동 효율성은 훨씬 더 크다.

따라서, 본 발명의 첫번째 목적은 임의로 각 개별 혈액 샘플에 대한 세포 군집의 이동을 추적한 후, 특정 세포 유형을 원심분리 동안 동일 카트리지 내 제2의 별개의 구획 내로 우회시킴으로써 특정 세포 유형을 고갈시키고자 하는 것이다.

본 발명의 두번째 목적은 부피를 차지하는(consuming) 밀도 구배 매질 또는 완충제를 필요로 하지 않으면서, 실질적으로 모든 원치않는 세포 유형을 선택적으로 고갈시키고자 하는 것이다.

본 발명의 세번째 목적은, 하향하는 RBC가 깔때기의 중앙부에 집중되도록 하여 적혈구 부피의 위쪽으로 상향하는 RBC 중 가장 가벼운 것에 의해 유도되는 수직 와전류를 증강시킴으로써, 이러한 와전류가 수적으로는 훨씬 더 적지만 더 큰 부력을 가진 WBC가 초기 WBC 계층화 및 농도 수준으로 상승하는 데 도움이 되도록 하는, 바닥부가 실질적으로 더 좁은 깔때기 형상의 강성 수거 챔버를 제공하는 것이다.

본 발명의 네번째 목적은, 모든 세포 프로세싱이 그 안에서 이루어지고, 세포 계층화 및 고갈과 관련된 모든 부품이 원심분리 종결시 그 안에 배치되어 있는 것인, 일체형 카트리지를 제공하는 것이다. 카트리지는 원심분리 동안에 그 안에 내장되어 있는 지지 구조체보다는 지지를 위한 그 자체의 내구력에 의존하는 제어 모듈로 쉽고, 빠르고, 분리가능하게 잠금 상태로 될 수 있다. 이러한 카트리지는 바람직하게는 하기와 같은 적어도 3가지의 강성 구획을 포함한다: (1) 대량의 RBC, 및 오퍼레이터의 임의대로, 원치않는 GRN이 그쪽으로 향하게 되는 RBC 구획; (2) 표적화된 WBC가 그쪽으로 향하게 되며, 오퍼레이터의 임의대로, GRN, 림프구, 단핵구, SPC 및/또는 혈소판을 포함할 수 있는 줄기 세포 (SC) 구획; 및 (3) 초기에는 전체 혈액 또는 골수 샘플을 함유하고 있지만, 프로세싱 이후에는 임의의 과량의 혈장을 보유하는 수거 깔때기.

본 발명의 다섯번째 목적은 원심력에 의해 하향하도록 가압되는 경우, 직경이 감소된 깔때기의 한 부분과 맞닥뜨리게 되어, 이를 통해 WBC 층의 수직 두께가 증가하게 되는, 깔때기 내 WBC 층을 형성하는 것이다.

본 발명의 여섯번째 목적은 혈액 샘플을 RBC, GRN, MNC, PLT 및 혈장으로 계층화하고, 특정 세포층들 간의 계면에서 특정 밸브를 정확하게 개폐하기 위한 수단을 제공하는 것이다.

본 발명의 일곱번째 목적은 RBC 침강용 제제, 예를 들어, 헤타스타치(hetastarch)를 필요로 하지 않으면서, 종래의 수동 또는 자동 시스템을 사용하여 수득할 수 있는 것보다 더 높은 비율로 RBC를 고갈시킴과 동시에 더 높은 비율로 WBC를 수거하기 위한 수단을 제공하는 것이다.

본 발명의 여덟번째 목적은 현재 운영 중인 종래의 수동 및 자동 시스템과 비교하여 절감된 비용으로 상기 7가지 목적을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 상기 및 다른 목적, 이점, 특징, 및 측면은 하기에서 계속 설명되면서 자명해질 것이다. 상기 및 관련 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 또한 이하 더욱 상세하게 설명되고, 특히 특허청구범위, 하기 설명 및 첨부된 도면에서 언급하는 특징을 포함하는데, 이들은 본 발명의 특정의 예시적인 실시양태를 상세하게 기술하지만, 단, 본 발명의 원리가 사용될 수 있는 각종 방식들 중 몇몇을 나타내는 것이다.

발명의 개요

본 출원은 세포 용액을 카트리지 기반 홀더 및 분리기를 통해 원심분리하는 것을 포함하는, 혈액 샘플로부터 RBC를 고갈시키기 위한, 그리고 일부 환경하에서는 GRN을 고갈시키기 위한, 및 다른 환경하에서는 PLT를 고갈시키기 위한 방법 및 장치를 제시한다. 도 13은 본원에 기술된 프로세스를 나타내는 간단한 개략도를 보여주는 것이다. 본 발명은 실질적으로는 모든 원치않는 RBC를 선택적으로 고갈시키며, 오퍼레이터의 임의대로는 또한 특정 WBC (바람직하게 GRN)를 고갈시키고, 오퍼레이터의 임의대로는 또한 정제된 MNC를 최적으로 단리 및 수거하기 위해 혈액 또는 골수 샘플로부터 PLT를 고갈시킨다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 모든 세포 프로세싱이 그 안에서 이루어지고, 원심분리 동안에 모든 세포 군집, PLT, 및 혈장이 그 안에 분포될 수 있는 것인, 1회용 경질 플라스틱 카트리지를 포함한다. 본 발명에서는 밀도 구배 과립 또는 디스크가 필요가 없다. 본 발명에서는 또한, 많은 점착 연결부에서 누출을 야기할 수 있으며, 불가피하게 MNC 및 SPC를 포획함으로써 연속적으로는 회수되지 못하게 하는, 취성 박층 필름 플라스틱 백 세트 및 그의 복잡하고 낭비적인 상호연결 배관이 필요가 없다. 본 발명은 추가로 중력장 내에서 세포의 유동을 최적화시키고, 세포 군집을 수직으로 계층화하기 위해 단면이 정밀하게 좁아지는 내부 깔때기를 포함한, 사용하기 쉬운 잠금형 카트리지를 제공한다.

도 13에 제시되어 있는 바와 같이, 높은 관성력 하에서 WBC가 먼저 말초 혈액 또는 제대혈, 골수, 또는 지방 조직으로부터 제거된 SVF 세포 용액으로부터 계층화될 수 있다. 이어서, 두번째로 보다 낮은 관성력 하에서는 본 장치 및 방법을 통해 원심력은 세포가 회전축으로부터 떨어지도록 강압할 수 있으며, RBC가 깔때기 바닥에서부터 포함된 구획으로 향하도록 유도한다. 계층화된 WBC는 이전에는 출발한 RBC가 차지하고 있던, 직경이 감소된 공간으로 진입하게 됨에 따라, 반경은 감소되고 수직 두께가 증가된 WBC 및 MNC 디스크가 형성된다.

원심분리 동안 RBC를 고갈시킴으로써 RBC 층과 혈장 층 사이의 WBC 층은 깔때기의 상기와 같은 좁은 부분으로 하향하여, WBC 및 MNC가 좁은 깔때기의 상부에 위치하는 지점까지 이동하게 한다. 이어서, 적혈구가 계속 제거되어 RBC 고갈 구획으로 향하거나, 또는 WBC보다 먼저 SC 구획 내로 포획됨에 따라, 계층화된 층은 수직 방향으로 신장되고, 이로써, 오직 원하는 세포 유형만을 원활하게 제거할 수 있게 된다.

도 14에 제시된 바와 같이, 다양한 원주 및 기하학적 구조의 깔때기 팁이 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 상기와 같은 상이한 원주 및 기하학적 구조가 유속 및 세포 밀도를 변경시킬 수 있고, 이어서, 세포가 깔때기 출구쪽으로 이동함에 따른 적외선 센서의 광학 판독치도 변경시킬 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 광학 감지 시스템은 세포 군집이 깔때기에서 배출될 때 각 유형의 세포 군집을 확인한다. 광학 감지 시스템은 특정 세포 군집이 두 위치 중 한곳으로 유동하도록 지시하고 제어하는 하나 이상의 밸브 수단과 소통한다. 예를 들어, 그리고 도 13에 도시되어 있는 바와 같이, 계층화된 WBC 층이 광학 감지 시스템을 통과할 때, WBC는 1회용 카트리지 내의 제2 SC 회수 구획으로 향하도록 지시될 수 있다. 이어서, WBC는 WBC의 뒤쪽/위쪽에 있는 유체 및 세포의 압력에 의해 초기에는 회전축에 대해 수직인 방향으로 이동하고, 이어서, 회전축쪽의 윗방향으로 이동하여 SC 회수 구획 내의 스탠드파이프 내로 이동하도록 강압될 수 있다.

본 발명은 추가로 시간 경과에 따라 중력장을 추적하고, 샘플로부터 RBC, 및 임의로, GRN 및/또는 PLT의 고갈, 둘 모두를 달성하는 데 중요한 데이터를 제공하는 수단을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 측면들 및 그에 수반되는 다수의 이점들은 하기의 상세한 설명을 참고할 경우, 보다 잘 이해되며, 첨부된 차트 및 도면과 함께 고려할 경우, 더욱 쉽게 이해될 것이다.
도 1은 인간 혈액 중에서 발견되는 각종 세포 유형의 밀도 및 평균 직경에 관한 플롯이다;
도 2는 인간 혈액 중에서 발견되는 각종 세포 유형의 상이한 밀도를 보여주는 플롯이다;
도 3은 원심분리 후 세포 군집의 비례적 부피에 관한 표이다;
도 4는 다양한 부피의 항응고된 혈액 중 세포의 부피에 관한 표이다;
도 5는 항응고된 혈액의 부피 대 원심분리된 세포 군집의 부피에 관한 플롯이다;
도 6은 표준 시험 튜브에서 원심분리 동안 인간 혈액이 분리되는 층을 보여주는 다이어그램이다;
도 7은 인간 혈액 및 피콜 첨가제의 혼합물이 원심분리 후 분리되는 층을 보여주는 다이어그램이다;
도 8은 표준 시험 튜브에서 혈액 분리 디스크를 사용하여 원심분리될 때, 인간 혈액이 어떻게 분리되는지를 보여주는 다이어그램이다;
도 9는 연령대가 상이한 남성 및 여성의 평균 ESR 값에 관한 표이다:
도 10은 수개의 선행 기술의 시스템, 및 본 발명 시스템을 사용하여 4개의 혈액 샘플을 프로세싱하였을 때 드는 상대적인 비용을 도시한 도면이다;
도 11은 선행 기술 혈액 분리 시스템 및 본 발명 시스템의 1회용 부품의 상대적인 복잡성을 보여주는 도면이다;
도 12는 본 발명의 1회용 카트리지 및 제어 모듈의 투시도이다;
도 13은 본 발명의 프로세스를 개괄하는 다이어그램이다;
도 14는 본 발명의 깔때기 팁에 관한 수개의 실시양태의 횡단면이다;
도 15는 본 발명의 1회용 카트리지, 제어 모듈, 및 제어 모듈 및 카트리지의 다양한 특징부의 부분적인 와이어프레임 투시도이다;
도 16은 본 발명의 1회용 카트리지, 제어 모듈, 및 예시적인 원심분리 컵의 분해도이다;
도 17은 본 발명의 제어 모듈의 투시도이다;
도 18a는 커트라인 A-A가 표시된 1회용 카트리지의 와이어프레임 측면도이다;
도 18b는 라인 A-A를 따라 절단된 1회용 카트리지의 투시도이다;
도 19는 깔때기의 바닥이 좁게 제시되어 있는 1회용 카트리지의 투시 단면도이다;
도 20은 원심분리 이전의 본 발명의 바람직한 실시양태의 단면도이다;
도 21은 원심분리 동안 본 발명의 바람직한 실시양태의 단면도이다;
도 22는 원심분리 동안 본 발명의 바람직한 실시양태의 밸브 시스템부의 단면도이다;
도 23은 본 발명의 대체 실시양태의 캔틸레버(cantilever) 밸브 시스템의 상세도이다;
도 24는 본 발명의 바람직한 실시양태의 캠(cam) 부분의 투시 상세도이다;
도 25는 인간 혈액 및 가요성 도관 중에 존재하는 각종 세포의 상대적인 크기를 보여주는, 본 발명의 바람직한 실시양태의 가요성 도관의 단면도이다;
도 26은 10분 동안의 원심분리 이후의 본 발명의 바람직한 실시양태의 단면도이다;
도 27은 본 발명의 바람직한 실시양태의 광학 감지부의 상세 단면도이다;
도 28은 RBC 고갈 동안의 본 발명의 바람직한 실시양태의 밸브 시스템, 스탠드파이프, RBC 수집 챔버, 및 SC 수집 챔버의 상세 단면도이다;
도 29는 RBC 및 GRN 고갈 동안의 본 발명의 바람직한 실시양태의 밸브 시스템, 스탠드파이프, RBC 수집 챔버, 및 SC 수집 챔버의 상세 단면도이다;
도 30은 RBC 및 GRN 고갈 이후의 본 발명의 바람직한 실시양태의 밸브 시스템, 스탠드파이프, RBC 수집 챔버, 및 SC 수집 챔버의 상세 단면도이다;
도 31은 MNC 고갈 동안의 본 발명의 바람직한 실시양태의 제1 위치 방사기/수신기 쌍에 의해 측정된 밸브 플롯이다;
도 32는 MNC 고갈 동안의, 혈장으로 가득 채워진 본 발명의 바람직한 실시양태의 밸브 시스템, 스탠드파이프, RBC 수집 챔버, 및 SC 수집 챔버의 상세 단면도이다;
도 33은 RBC 및 GRN 고갈 이후, 원심분리가 중단되었을 때의, 대체 실시양태의 깔때기, 밸브 시스템, 스탠드파이프, RBC 수집 챔버, 및 SC 수집 챔버의 상세 단면도이다;
도 34는 RBC 및 GRN 고갈 이후, 원심분리가 중단되고, 남아있는 혈장, MNC, 및 PLT를 혼합하기 위해 전체 카트리지를 진탕시켰을 때의, 대체 실시양태의 깔때기, 밸브 시스템, 스탠드파이프, RBC 수집 챔버, 및 SC 수집 챔버의 상세 단면도이다;
도 35는 실질적으로 모든 MNC 및 단지 소량의 PLT를 수집하기 위해 카트리지를 보다 낮은 관성력하에 보다 짧은 시간 동안 2차로 원심분리하였을 때의, 대체 실시양태의 깔때기, 밸브 시스템, 스탠드파이프, RBC 수집 챔버, 및 SC 수집 챔버의 상세 단면도이다;
도 36은 원심분리를 중단하고, MNC, 혈장, 및 소량의 PLT가 SC 수거 구획 중에 수집된 후의, 대체 실시양태의 깔때기, 밸브 시스템, 스탠드파이프, RBC 수집 챔버, 및 SC 수집 챔버의 상세 단면도이다;
도 37은 GRN이 SC 수거 구획 중 요구되는 것인, 대체 실시양태의 깔때기, 밸브 시스템, 스탠드파이프, RBC 수집 챔버, 및 SC 수집 챔버의 상세 단면도이다; 마지막으로,
도 38은 SC 수거 튜브 및 RBC/GRN 수거 튜브를 보여주는, 본 발명의 바람직한 실시양태의 카트리지의 투시도이다.

하기 설명은 당업자가 본 발명의 다양한 측면 및 일례를 제조하고 사용할 수 있도록 하기 위해 제시하는 것이다. 구체적인 물질, 기법, 및 적용에 관한 설명은 단지 일례로서 제공되는 것이다. 본원에 기술된 일례에 관한 다양한 변형은 당업자에게 쉽게 자명해질 것이며, 본 발명의 정신 및 범주를 벗어남 없이 본원에서 정의된 일반적인 원리는 다른 일례 및 적용에 응용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 기술되고 제시된 일례로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 첨부된 특허청구범위와 일치하는 범주를 가지게 되는 것으로 한다.

본 출원은 혈액 샘플로부터 RBC를 고갈시키기 위한, 그리고 일부 환경하에서는 특정 GRN을 고갈시키기 위한, 및 다른 환경하에서는 PLT를 고갈시키기 위한 방법 및 장치를 개시한다. 본 발명의 바람직한 실시양태는 실질적으로 모든 SPC를 비롯한 WBC를 최적으로 단리시킨 후, 수거하기 위해 원심분리를 통해 이러한 실질적인 고갈을 달성한다.

먼저 도 15를 보면, 바람직한 실시양태에서 본 출원인의 방법 및 장치 (1)는 최대 250 mL까지의 액체를 담을 수 있으며, 원통형이고, 1회용이며, 바람직하게는 경질 플라스틱, 및 더욱 바람직하게는 광학적으로 투명한 폴리카르보네이트로 제작된 강성 1회용 카트리지 (10)를 포함한다. 1회용 카트리지 (10)가 안치되어 있는 제어 모듈 (40)은 광학 및 중력을 감지하는, 배터리 작동식 전자 기계 장치이다. 바람직한 실시양태는 또한 사용자에게 정보를 제공하고 지원하기 위해 막 스위치 (41), 7 세그먼트 디지털 판독기 (42) 및 3개의 발광 다이오드 (43)를 포함한다. 도 15의 좌측에는 사용자에게 배터리의 충전 상태를 알려주는 범용 배터리 신호 (44)가 제시되어 있다. 중앙부에는 제어 모듈 및 LED에 대한 온-오프 스위치 (45)가 제시되어 있고, 우측에는 세포 수거 작업이 디자인된 것과 같이 실행되었는지 여부를 표시하고, 그렇지 않을 경우에는 작동 오류가 발생했을 수 있는 디지털 판독기 (42) 및 LED가 제시되어 있다.

도 16을 보면, 본 발명의 바람직한 실시양태에 따라 1회용 카트리지 (10) 및 제어 모듈 (40) 뿐만 아니라, 표준 750 ml 원심분리기 컵 (70)이 제시되어 있다. 작동시, 1회용 카트리지 (10) 및 제어 모듈 (40)은 해체가능하게 함께 잠김 상태가 된다. 1회용 카트리지는 다중 구획을 포함하는 데, 그 중 하나는 깔때기 또는 강성 챔버 (11)이다. 바람직하게, 원심분리기 컵 (70)에 제어 모듈 (40)이 내장되는데, 이는 제어 모듈 (40) 위의 멸균 1회용 카트리지 (10)와 함께, 그와 연결시켜 반복 사용하기 위함이다. 조합시 제어 모듈 (40) 및 카트리지 (10)의 중량은 대략 450 g인 것이 바람직하다. 하기에 기술하는 다른 부품들 중에서, 카트리지는 유입 액체를 위한 접근부로서 작용하는, 상부에 위치하는 입구 (12)를 포함한다. 상기 접근부는, 세포 용액에 연결시키기 위한 사혈침 또는 돌기로 이어질 수 있는 배관과 연결되어 있을 수 있고, 이는 또한 다르게는 남은 프로세싱 단계 동안 다른 시스템 부품을 움직이지 못하게 할 수 있는 임의의 응괴를 제거하는 인라인 필터에 커플링될 수 있다. 1회용 카트리지의 상부는 또한 혈액 또는 골수가 깔때기 내로 도입될 때 깔때기 내부로부터 변위된 대기가 통과하도록 하는 0.2 ㎛ 필터 (13)를 함유할 수도 있다. 카트리지의 상부는 또한 혈액, 골수, 또는 다른 유체, 예를 들어, 희석제가 깔때기 내로 도입될 때에 그를 멸균 여과시키는 수단 (제시되어 있지 않음)을 포함할 수 있다.

도 17을 보면, 하단의 제어 모듈 (40) 내부에 위치하는 모터 회로 보드 전자 장치 (47)가 제시되어 있다. 상기 장치의 전기기계부는 바람직하게 재충전이 가능한 배터리 시스템을 사용함으로써, 중력 및 광학 감지 장치를 모니터링하고, 제어하며, 1회용 카트리지에서의 활동을 지시하는 제어 모듈에 동력을 공급한다. 관성력을 측정하는 수단은 당업계에 보통 알려져 있는 것일 수 있으며, 그 예로는 원심분리기 RPM 측정을 통해, 또는 가속도 또는 힘을 직접 측정함으로써 상기 관성력을 계산할 수 있다.

도 18a는 단면 A-A가 표시된 1회용 카트리지 (10)의 다이어그램 측면도를 나타내는 것이다. 도 18b는 단면 A-A를 따라 절단된 1회용 카트리지 (10)의 투시도를 나타내는 것이다. 하기 프로세스에서 기술하는 바와 같이, 초기에는 밸브 수단 (제시되어 있지 않음)으로 폐쇄되어 있는 개방 단부를 가진 큰 깔때기 형상의 구획으로 세포, 예를 들어, 정상 혈액, 제대혈 또는 골수를 함유하는 생물학적 유체가 전달된다. 카트리지는 큰 제1 강성 저장 구획 또는 RBC 고갈 구획 (14), 및 WBC 및 실질적으로 모든 SPC가 그 안으로 전달되는 것인, 보다 작은 제2 강성 저장 구획 또는 SC 구획 (15)을 포함한다. 혈액 샘플로부터 고갈된 RBC의 부피가 수집된 WBC의 부피보다 항상 훨씬 더 크기 때문에, RBC 고갈 구획 (14)이 SC 수거 구획 (15)보다 유의적으로 더 크다. 모든 구획들은 서로 완전히 별개의 것이지만, 기류와 관련해서는 인접되어 있다. 세포 용액이 원 챔버로부터 구획들로 이동함에 따라 대기가 변위될 수 있도록 하기 위해 RBC 고갈 구획 (14) 및 SC 수거 구획 (15)은 작은 연돌 (29)에 의해 원 챔버에 연결되어 있다.

도 19를 보면, 좁은 바닥의 깔때기 (11)를 갖는 좁은 1회용 카트리지 (10)의 투시 단면도가 제시되어 있다. 깔때기 좌측에는 보다 큰 RBC 고갈 구획 (14)의 단면이 관찰된다. 하기에서 상세하게 기술되는 바와 같이, 작동시, RBC는 초기에는 장치 바닥에 있는 밸브 시스템 (16)에 도달할 때까지 원심분리기의 회전축으로부터 멀어지게 바깥쪽으로 방사상으로 움직이면서, 깔때기 형상의 제1 구획의 바닥쪽으로 이동한다. 여기서, 밸브 시스템 위쪽에 있는 유체 압력 헤드가 유체를 2개의 구획 중 하나 내로 강압한다. 유체가 어느 구획으로 향하게 되는지는 그 구획으로의 밸브 상태 (개, 폐)에 따라 달라진다. 어느 경우든, 카트리지 (10) 바닥의 밸브 시스템 (16)을 통과한 후에 유체는, 제1 구획에 남아있는 유체 (대체로 혈장)로부터의 압력에 의해 강압되면서, 일반적으로 회전축쪽으로 유동하게 된다. 이어서, 밸브 시스템을 통과한 유체는 RBC 고갈 구획 (14) 또는 SC 수거 구획 (15)에 보유된다. 밸브의 미세 조정을 통해 원치않는 세포 용액은 고갈될 수 있고, 원하는 세포 용액은 수거될 수 있다.

도 20을 보면, 사용 중에 있는 본 발명의 바람직한 실시양태가 제시되어 있다. 제시되어 있는 바와 같이, 100 ml의 제대혈이 주요 깔때기 형상의 구획 (11) 안에 놓여 있다. 이어서, 오퍼레이터는 (도 21에 제시된 바와 같이) 카트리지 (10)를 제어 모듈 (40)에 부착시킨 후, 원심분리기, 바람직하게, 진동 버킷 원심분리기, 예를 들어, 4개의 750 ml짜리 원통형 버킷을 수용하도록 구성된 써모 피셔 소르발 ST-40(Thermo Fisher Sorvall ST-40) 탁상용 원심분리기 내에 카트리지를 장착한다. 4개보다 많거나, 적은 카트리지를 동시에 원심분리하기 위해 대체 원심분리기가 사용될 수 있다.

도 21을 보면, 카트리지 (10)에 높은 관성력을 가하였을 때 일어나는 발생 현상이 대표적으로 나타나 있다. 여기서, 일례의 2,000 G 원심분리 하에서, RBC는 하향 이동하고, WBC는 깔때기의 바닥으로부터는 상향으로, 및 유체의 상부 부피로부터는 하향으로 RBC 위쪽의 위치로 이동하기 시작한다. 이어서, RBC 위쪽에는 WBC와 PLT의 초박층이 계층화되기 시작하고, 그 위쪽에는 혈장 부피가 계층화되는데, 혈장의 색상은 황색이다. 높은 관성력 하에서, RBC는 가장 무거운 RBC가 더 아래쪽에, 보다 가벼운 RBC는 RBC 부피의 상부쪽에 위치하게 되면서, 프로세싱 깔때기 (11) 바닥에 가까워질수록 점점 더 함께 압착된다. 원심분리 동안 도면에 도시되어 있는 카트리지는 제시된 카트리지에 수직 방향이고, 그 위쪽에 위치하는 축 주변을 회전하고 있기 때문에, 카트리지가 받게 되는 관성력은 회전축으로부터의 거리에 비례하여 증가하게 되고, 원심분리 컵의 바닥 값 (2,000 G)은 상부쪽 값 (1,000 G)보다 약 2배 정도 높다는 점에 주목한다.

도 22를 보면, 바람직한 실시양태의 상세 절단 측면도가 제시되어 있다. 이러한 바람직한 실시양태에서, 깔때기 (11)는 밸브 시스템 (16)에 의해 RBC 고갈 구획 (14) 및 SC 수거 구획 (15)으로부터 분리된 상태로 유지되어 있다. 많은 밸브 제어 수단이 고려되지만, 바람직한 실시양태에서는 편심 캠 (17)이, 궁극적으로는 액체의 유동을 깔때기의 바닥으로부터 세포 고갈 구획 (14) 및 세포 수거 구획 (15)으로 지시하는 튜브 핀쳐 (18)를 제어하는 것인 핀치 밸브 시스템이 사용된다. 여기서, 핀치 밸브는 핀칭 표면의 폭이 대략 0.088 인치인 2개의 대향 클램프를 포함하고, 내경이 0.062 인치이고, 외경이 0.088 인치인 우레탄 튜브 내 유압이 325 PSI일 때, 상기 튜브를 통해 통과하는 모든 유체의 통행을 차단하기 위해 대략 1.6 파운드 정도의 핀칭력을 필요로 한다. 더 큰 압력이 있을 경우에는 1.6 파운드 초과의 핀칭력이 필요할 수 있고, 보다 낮은 압력하에서는 감소된 핀칭력이 충분할 수 있다.

도 23을 보면, 이러한 핀칭 압력을 달성하기 위한 캔틸레버 시스템이 제시되어 있다. 캔틸레버 시스템 (19)은 필요에 따라 밸브를 개폐시킬 수 있다 (배관을 핀치시키고, 풀어줄 수 있다). 각 캔틸레버 (21)를 위한 스프링 (20)은 캔틸레버의 선단에 위치하는 것이 바람직하다. 액추에이터는 스프링의 저항성을 극복함으로써 레버를 이동시킨다. 일단 액추에이터가 힘을 가하는 것을 중단하고 나면, 스프링의 바이어스는 레버를 그의 제1 위치로 되돌아 가도록 강압한다.

도 24를 보면, 튜브 핀칭 또는 밸브 폐쇄 메카니즘의 캠부에 관한 상세도가 제시되어 있다. 캠은 밸브 모터의 회전 운동을 선형 운동으로 전환시키는데, 이는 튜브를 폐쇄시키거나 핀칭하는데 사용된다. 상기 논의된 바와 같이, 캔틸레버 시스템은 캠과 함께 연결되어 사용될 수 있다. 캠 (22)은 시계 방향으로 대략 90°회전하기 때문에, 전체 장치 전역에 걸쳐 일반적인 하향력을 발휘하는 높은 중력장에 기인하여 캠의 대부분은 로터 및 모터에 시계 방향으로 작용하는 연속적인 비틀림력을 가한다. 캠은 특별히 극도로 높은 중력장 내에서 작동하도록 디자인된다. 제시된 차단 장치 (23)와 캠 맞은편에 위치하는 카운터웨이트 (24)는 캠을 시계 반대 방향으로 90° 회전시켜 그의 출발 위치로 하기에 충분한 힘을 소형 모터가 제공할 수 있도록 한다. 따라서, 캠은 특별히 축에서 벗어나고, 잠재적으로 고정 중력을 받는 물질의 양은 감소시킬 뿐 아니라 상기 중력에 비추어 캠의 나머지 부분의 중량에 대응하도록 디자인된다. 즉, 캠축이 그의 중축 주변을 회전하기 때문에, 상기와 같은 디자인을 통해 캠에 작용하는 관성력의 결과로 인한 토크의 부가 또는 감소는 확실히 없어지게 된다.

도 25는 제1 구획 (11)과, RBC 고갈 구획 (14) 또는 SC 수거 구획 (15) 사이에 위치하는, 예시적인 실시양태의 연결 배관 또는 가요성 도관 (큰 외주)과 비교하여 상대적으로 나타낸, 각종 세포의 상대적인 크기를 보여주는 것이다. 예시적인 실시양태의 배관 내경은 0.062 인치 (1.575 mm)이다. 밸브 수단을 통해 모든 세포 및 액체를 완전하게 차단시킬 수 있는 한, 내경 및 외경이 다른 배관도 사용될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 이러한 가요성 도관의 길이 대 직경의 비는 20을 초과하지 않는다.

예시적인 프로세스에 관한 설명으로 돌아와서, 도 26은 2,000 G에서의 대략 10분 동안의 원심분리 이후의 예시적인 카트리지를 보여주는 것이다. 백혈구 연층 (2)은 RBC와 혈장 사이의 계면에 계층화된다. 깔때기 (11)의 맨 아래쪽의 세포는 90에 달하는 HCT (헤마토크릿, 혈액 부피 중의 적혈구가 차지하는 비율)에 도달할 수 있지만, RBC 층의 상부쪽을 향하는 세포의 HCT는 단지 60-70밖에 되지 않을 수 있는데, 그 이유는 회전축으로부터 상기 거리 만큼 떨어져 있는 위치에서는 원심분리력이 더 낮고, 그 위치에서의 깔때기의 면적은 더 넓기 때문이다.

도 27을 보면, 깔때기 (11)의 좁은 영역에 관한 상세도가 제시되어 있다. 1회용 카트리지 (10)가 제어 모듈 (40)에 부착되면, 제1 구획의 이 좁은 영역에는 프로세싱 깔때기의 상기 부분을 통해 유동하는 세포 유형을 검출하는 하나 이상의, 그러나 바람직하게는 2개 이상의 광학 또는 다른 센서 (48)가 존재한다. 제1 구획의 이 좁은 영역에는 또한 하나 이상의, 그러나 바람직하게는 2개 이상의 광학 또는 다른 방사기 (49)가 존재한다. 제시된 예시적인 실시양태에서, 4개의 적외선 방사기/검출기 쌍이 수직으로 배열되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 적외선 센서는 쌍을 이룬 적외선 방사기의 바로 맞은편에 위치한다. 제2의 바람직한 실시양태에서, 적혈구가 우선적으로 흡수하는 파장을 제공하는 송신기는 그 진동수에 감수성인 쌍을 이룬 센서의 바로 맞은편에 위치한다. 제3의 바람직한 실시양태에서, 흡수된 형광 염료를 가진 세포를 확인하는 센서가 사용된다. 제1 바람직한 실시양태에서, 세포가 존재할 경우, 방사된 적외선 광은 간섭되고, 적외선 광 검출기는 유체를 투과하는 신호의 진폭을 정량한다. 바람직한 실시양태에서, 센서는 전송 수준에 0-1,000인 값을 부과할 수 있다. 어떤 적외선 광도 차단하지 않는, 물과 유사한 순수한 혈장은 대략 1,000이라는 값으로 기록될 것이다. 압착된 RBC가 통과함에 따라, 본질적으로 모든 적외선 광은 차단되고, 검출기는 0이라는 값을 기록한다.

도 28을 보면, 본 프로세스에서의 다음 단계를 보여준다. 샘플을 설정된 시간량 (예시적인 실시양태에서 20분) 동안 원심분리한 후, 원심분리기의 속도를 저속화시켜 원심분리 버킷의 바닥 (즉, 회전축에서부터 가장 먼거리인 위치)이 100 G가 되게 할 수 있다. 탑재된 가속도계는 이 프로세스 동안 내내 관성력을 추적할 수 있다. 일단 원심분리기가 100 G에 도달하였다는 것을 가속도계가 검출하고 나면, (원심분리기가 확실하게 100 G로 안정되도록 하고, 다소 더 낮은 관성력으로 통과하지 못하도록 하기 위해 (그럴 경우, 기계는 오작동하거나, 부분적으로 동력을 손실하게 된다)) 장치는 설정된 시간량 동안 기다리고, 그 후 제1 밸브 (25)는 제1 구획 (11)을 RBC 고갈 구획 (14) 개구부와 연결시켜 고도로 농축된 RBC 및 일부 혈장이 통과할 수 있도록 한다. RBC는 처음에 (하기에서 기술하는 바와 같이, 바람직하게는 부피가 1 ml인) 스탠드파이프 (26)를 충전시킴으로써 고갈 구획 (14)으로 유입되는 것을 관찰할 수 있다. 사용하는 동안, 스탠드파이프 (26)가 가득 찰 때까지 RBC는 계속하여 고갈 구획 (14)으로 유동할 것인데, 이 시점에서 RBC는 넘치게 되고, 고갈 구획 (14)의 대부분을 충진시키게 될 것이다.

도 29는 스탠드파이프 (26)가 넘치게 되고, RBC가 보다 큰 고갈 챔버를 충진시키고 있음을 보여주는 것이다. 백혈구 연층 (2)으로 그려져 있는, RBC와 혈장 사이의 계면을 이제는 쉽게 알 수 있다. 깔때기 (11)가 좁아짐에 따라, 같은 부피의 세포는 더 좁은 수평 공간을 차지하여야 한다. 그 결과, 차지하고 있는 수직 공간은 증가하게 되고, 이로써 각각의 계층화된 세포 유형 층을 보다 쉽게 구별할 수 있다.

도 30을 보면, 깔때기 (11)의 좁은 부분으로 유입된 WBC가 제시되어 있다. WBC가 상기의 보다 좁은 부분으로 유입됨에 따라, 그의 계층화는 계속하여 이루어지고, 바닥에는 GRN이 (표시하지 않음), 중간에는 MNC (3)가, 그리고 MNC의 상부에는 PLT (4)가 위치한다. 대량의 혈장 (5)은 PLT 위쪽에 제시되어 있다.

도 27에서 제시된 바와 같이, 방사기/검출기 쌍은 제1 구획의 좁은 부분을 통해 통과하는 세포의 통행을 모니터링한다. 도 31은 제1 위치 (최상부) 방사기/검출기 쌍으로부터 100 G 통과 동안의 혈액 세포 군집의 적외선 광학 계수를 보여주는 것이다. 수평선은 무세포 혈장에서 관찰되는 광학 계수를 나타낸다. 광학 계수가 보다 낮다는 것은, 방사기/검출기 쌍에 의해 관찰되는 샘플 중에 WBC 및 PTL가 여전히 존재한다는 것을 의미한다. RBC 위에 배치된 백혈구 연층 층이 제1 위치 방사기/검출기 쌍을 통과할 때, 초기에는 그래프의 좌측 바닥인 0에서부터 상승하는 것으로 나타나 있다. 이러한 상승 값은 방사기/검출기 쌍 사이를 통과하는 용액이 점점 투명해지게 되는 것을 나타내며, 이는 보다 적은 RBC를 포함한다는 것을 의미한다. 보다 투명한 층에 도달하게 됨에 따라, 값은, 예를 들어, 50까지, 이어서, 100, 200 등으로 증가하게 된다.

일부 환경하에서는, 도 31에서 세포가 고갈되면서 상응하는 것으로 제시된 광학 계수 값이 고갈이 중단되면 하락하기 시작할 수 있는데, 이는 더 많은 세포가 감지 구역으로 유입됨을 나타낸다. 이에 대한 이유는 복잡하다. 첫째로, 직경이 감소된 깔때기의 바닥을 통해 유체가 소개(evacuate)됨에 따라 다양한 밀도의 입자들이 재조직화되기 때문에 난류 및 와상을 경험한 유체를 통해 광학값을 측정한다. RBC 및 WBC는 그 크기가 다르기 때문에 다른 속도로 하강한다. 그 결과, RBC의 소개 속도가 특정 입자 (예를 들어, 다른 것들과 비교하여 크기가 작은 PLT)에 대한 침강 속도보다 크다면, 그때 입자들은 침강 속도가 더 빠른 다른 입자에 뒤쳐지게 될 것이다. 주의 깊게 계층화된 혼합물은 소개 프로세스 동안 부분적으로 혼합될 수 있다. WBC가 다른 속도로 하강하는 반면, RBC는 한 속도로 하강할 뿐만 아니라, WBC의 운동은 수적으로 훨씬 더 많은 RBC의 운동에 의해 억제될 수 있다. 추가로, RBC의 밀도는 그의 라이프사이클 동안 내내 변한다. 그 결과, 보다 조밀한 RBC가 깔때기 바닥쪽으로 농축됨에 따라, 보다 가벼운 RBC는 변위된 혈장과 함께 상승하게 된다. 따라서, 깔때기 바닥쪽에서 시작하여 RBC/혈장 계면을 향해 상승한 WBC는 수적으로 더 많은 "보다 가벼운" RBC를 동반한다. 모든 세포는 경미하게 음 전하를 가지고 있고, 이로써 서로 반발하는 경향이 있다는 사실에 기인하여 이러한 상향하는 세포는 하향하는 조밀한 RBC 주변을 돈다.

불가피하게 고갈 동안에 발생하는 상기와 같은 혼합에 대응하기 위해, 시스템의 예시적인 실시양태는 설정된 시간 동안의 소개 이후, 세포가 통과하는 배관을 폐쇄시키고, 하향하는 세포가 재압착 및 재계층화될 수 있도록 한다. 배관을 재개방하였을 때, 깔때기 내에서는 혼합이 다시 일어나기 시작한다. 따라서, 본 발명은, 주어진 적용을 위해서는 상기와 같은 혼합이 적합하지 않는 바, 소개 프로세스를 주기적으로 중단하는 시작-정지 접근법을 사용할 수 있다.

도 32를 보면, 프로세스 중의 후반 시점이 제시되어 있다. 프로세스에서 특정 시점에는 RBC 고갈 구획 (14)으로의 튜브는 폐쇄되고, SC 수거 구획 (15)으로의 튜브는 개방된다. 도 32는 프로세스 중, SC 수거 구획 (15)으로의 경로는 개방되고, RBC 고갈 구획으로의 경로는 핀칭하여 폐쇄된 후반 시점을 도시한 것이다. RBC 고갈 구획 스탠드파이프 (26)는 RBC 고갈 구획 (15)으로 유입되는 최종 1 ml의 RBC를 담고 있기 때문에, 스탠드파이프 (26)는 조밀도가 가장 작은 RBC를 함유하고 있고, 이로써, 전체적으로 RBC 고갈 구획 (15)이 함유하는 것보다 더 큰 농도의 GRN 및 NRBC를 함유한다. 후에, 기술자는 스탠드파이프 (26)의 내용물을 회수할 수 있고, 이로써, 보다 소형의 SC 구획 (15)으로부터 SPC의 회수를 계층화할 필요없이 HLA 유형 분류를 위한 GRN 및 NRBC를 수득할 수 있다. 원심분리를 계속함에 따라 밀도가 더 큰 세포는 계속하여 회전축으로부터 멀어지도록 강압된다. 제1 구획에 남아있는 혈장 (5)은 그 아래에 있는 유체 및 세포에 압력을 가하고, MNC (3), 및 PLT (4)를 튜브 위쪽으로 유도하여 SC 수거 구획 (15)에 이르게 한다. 나타낸 바와 같이, 비록 MNC 및 PLT가 제1 구획으로부터 대략적으로 제거된 후일지라도, 이어서, 프로세스에서 연결관을 세척하고, 모든 SPC가 확실하게 수거 구획 (15)에 수집될 수 있도록 하면서, 혈장 (5)은 SC 수거 구획 (15)으로 유동될 수 있다.

밸브 시스템 (16)을 제어하여 유체 (및 세포)가 RBC 고갈 구획 (14)에 대향하는 SC 수거 구획 (15)으로 향하게 하는 타이밍은 중요하다. 밸브를 너무 이른 시점에 바꿀 경우, RBC가 SC 수거 구획 (15)으로 유입될 수 있고, 이로써 HCT는 증가하게 되고, 수집된 샘플의 순도는 감소하게 된다. 밸브를 너무 늦은 시점에 바꿀 경우, MNC 중 일부가 RBC 고갈 구획 (14)으로 이동할 수 있으며, 이로써, 수거되는 MNC 및 SPC의 회수율은 감소하게 된다.

본 발명의 예시적인 실시양태에 의해 극복되는 선행 기술에 존재하는 한가지 난점은 원심분리 동안 이송되는 예정된 최종 부피의 액체를 수집하고자 하는 도전 과제이다. 이는, 예를 들어, 본 발명으로부터 혈액 샘플이 사용될 것으로 기대되는 각종의 다른 유형의 장비는 예정된 부피, 예를 들어, 20 mL의 액체를 수용하도록 구성되어 있기 때문에 중요하다. 특정 부피의 유체가 원심분리 동안 수집되었을 때 수집된 유체의 중량을 측정하는 특수 저울을 이용하여 검출하는 것도 가능하지만, 신뢰도 목적으로는 고체 상태의 용액이 바람직하다. SC 수거 구획을 통과하는 액체의 부피를 측정하기 위해, 특정 추정 사항들이 요구된다. 첫번째로, 주요 구획의 감지 구역을 통과하는 세포 위쪽의 유체는 이들 세포에 하향 압력을 형성하여, 깔때기의 바닥을 통해 그들이 소개되도록 유도한다는 것이 공지되어 있다. 액체가 계속하여 일정한 가속도 하에 소개됨에 따라, 상기 세포 상의 혈장의 부피가 감소하기 때문에 그에 가해지는 압력이 줄어드는 바, 소개 속도는 느려진다. 비록 세포 속도는 헤마토크릿마다 및 사람마다 다를 수 있지만, 속도와 관련하여 혈장은 적절히 일관된다는 것이 또한 공지되어 있다. 결과적으로, 일단 표적 세포 모두가 통과하였고, 오직 혈장만이 배관을 통해 SC 구획으로 이송되도록 남아있게 되면, 이는 세포 위쪽의 혈장의 다이나믹 헤드에 비례하여 예측가능한 속도로 유동하게 될 것이다.

본 발명에서, 상기와 같은 사실은 소개된 세포가 통과하는 다중 방사기/검출기 쌍을 사용하는 방법과 결합된다. 예를 들어, 상기 기술된 바와 같이, 백혈구 연층이 상부 센서에 도달하게 되면, 상부 또는 제1 위치 방사기/검출기 쌍에 의해 검출되는 광학 계수는 상승하기 시작할 것이다. 임의의 광학 계수 값 (이 경우 4)은 미리 결정되며, 제1 위치 방사기/검출기 쌍이 상기 임의 값을 검출하였을 때에 타임 스탬프가 개시된다. 소개가 계속되어 감에 따라, 제2 위치 방사기/검출기 쌍 (즉, 최상부 쌍 바로 밑에 있는 쌍)이 그와 동일한 임의 값을 판독하였을 때에 제2 타임 스탬프가 설정된다. 제1 위치 및 제2 위치 방사기/검출기 쌍 사이의 거리, 및 임의 값이 제2 위치에 도달하는 데 소요되는 시간을 고려한 계산을 통해, 두 센서 쌍 사이의 혈액 성분 유동 속도를 측정할 수 있다. 같은 방법을 사용하여 임의의 임의 값이 한 센서로부터 그를 통과하여 그 아래에 위치하는 임의의 다른 센서에 이르게 되는 데 소요되는 시간량을 측정할 수 있다.

센서 사이의 혈액 부피에 관한 추가적인 이해가 있다면, 부피 고갈 속도를 계산할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 위치 센서 아래쪽 깔때이의 바닥 팁의 부피는 6 mL인 반면, 제2 위치 센서 아래쪽 것의 부피는 4 mL인 것이 알려져 있다. 따라서, 제1 타임 스탬프와 제2 타임 스탬프 사이에 2 mL의 혈액이 소개되었다는 이해에 기초하여 유속을 계산할 수 있다. 상기 속도는 제3 위치 및 제4 위치 (최저의 것) 방사기/검출기 쌍이 동일한 임의 값을 판독하였을 때에 검출함으로써 추가로 정련될 수 있다. 이러한 프로세스 동안, 상기 언급한 시작-정지 기법이 일어나며, 전체적으로 밸브를 폐쇄시키는 것이 소개 속도에 미치는 효과에 주목하는 것이 중요하다. 결론적으로 적층형 방사기/검출기 쌍을 통해 얻은 유속 관측치에 기초한 외삽을 통해, SPC를 포함하는 WBC의 용액이 원하는 부피까지 혈장으로 가득 채워지는 바, SC 수거 구획으로의 밸브의 개방 시간에 제한을 둘 수 있다. 제한은 유속에 따라 달라지는데, 이는 궁극적으로는 주로 소개점 위의 액체 헤드에 의해, 및 어느 정도까지는 줄기 세포 용액을 예정된 최종 부피까지 "가득 채우는 데" 사용되는 혈장의 점도에 의해 유발되는 압력에 의존한다.

본 발명의 대체 실시양태에서, RBC는 예를 들어, 50 내지 200 G의 중력장에서 현재 선택된 100 G보다 더 높거나 낮은 가속도에서 수집될 수 있다.

본 발명의 대체 실시양태는 MNC (5)와 함께 수집된 PLT (4)의 개수를 유의적으로 감소시키는 방법을 포함한다.

도 33에 제시된 바와 같이, 원심분리 프로세스 동안 MNC (3) 및 혈소판 (4)은 제1 구획 (11) 바닥의 좁은 부분에 농축된다. 상기 프로세스 중 이 시점에서, SC 수거 구획 (15)으로의 핀치 밸브가 개방된 상태라면, 이때 MNC는 먼저 회전축에 수직인 방향으로, 이어서 회전축을 향해 우측 튜브 위로, 및 SC 수거 구획 (15) 안으로 다량의 혈장에 의해 강압될 것이다. 추가 조치를 취할 필요없이, 이어서, 혈장의 유동이 SC 수거 구획을 가득 채우게 되는 시점인 혈장이 고갈되는 시점까지 혈장은 PLT를 SC 수거 구획 내로 강압할 것이다.

SC 수거 구획 (15)으로 유입되는 PLT의 개수를 감소시키기 위해, 기술자는 (RBC 밸브는 폐쇄시키고, MNC 밸브는 개방되지 않는 상태로 놓아 두면서) RBC/GRN 고갈 사이클 종결시 수거 프로세스를 중단하고 원심분리기가 멈추도록 제어 모듈을 프로그램화할 수 있다. 이 방법에서, 기술자는 이어서 원심분리기 버킷으로부터 카트리지를 제거하고, 카트리지를 부드럽게 좌우로 흔들어 깔때기 중의 혈장 (5) 전역에 걸쳐 MNC (3) 및 혈소판 (4)이 재분포될 수 있도록 하여, 도 34에 도시된 바와 같이, 이를 분산시킨다.

도 35에 나타난 바와 같이, 이어서, 보다 단시간 동안 더 낮은 가속도로 카트리지를 원심분리한다. 보다 단시간 및 더 낮은 가속도는 MNC (3)를 더 조밀하고 더 빠르게 이동시켜 깔때기의 바닥으로 재농축시키는 데에는 충분하지만, PLT를 상기와 같이 하는 데에는 충분하지 못하다. PLT는 밀도가 좀더 낮고 크기가 좀더 작은 바, 깔때기의 바닥으로 이동시키는 데에는 보다 긴 시간이 필요하다. 그러한 시간을 제공하지 않음으로써 MNC 대부분은 제시된 바와 같이 PLT 대부분으로부터 분리될 수 있다.

도 36을 보면, 이어서, SC 수거 구획 (15)에의 핀치 밸브가 개방되어 있을 때, MNC (3)가 먼저 유동한 후, 혈장 (5)이 유동하고, 소량의 PLT (4)가 유동하게 되고, 이어서, SC 수거 배관은 핀칭으로 폐쇄된다. 일부 PLT는 여전히 SC 수거 구획 내로 들어가는데, 그 분획은 1회용 카트리지 중 혈장 부피와 비교하여 SC 수거 구획 내로 이송된 혈장 부피에 비례한다. 예를 들어, 100 ml 부피의 혈액은 전형적으로는 약 55 ml의 혈장을 함유하게 될 것이다. 50 ml의 혈장은 제1 구획에 남겨둔 채, 5 mL의 혈장이 SC 수거 구획으로 이송될 경우, MNC와 함께 한 PLT의 비율은 총 PLT의 약 10%가 될 것이며, 이는 MNC 수거물 중 PLT의 대략 90% 감소가 된다.

도 37을 보면, 또 다른 대체 실시양태가 도시되어 있다. 본 발명의 이러한 대체 실시양태에서, SC 수거 구획 (15) 중 GRN (6)이 원하는 대상이 될 수 있다. 예를 들어, 제대혈 수집물 중, 환자에게 동일하게 매치되는 두 제대혈 중 어느 것을 선택할지에 대해서는 WBC 총 계수가 대개 결정짓는다. 따라서, MNC와 함께 다수의 GRN을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 결과를 얻기 위해서, 기술자는 다른 (상기 개시된) 실시양태에서보다 더 이른 시점에 SC 수거 구획으로의 밸브를 개방시켜 (다수의 GRN을 포함하는) RBC의 상부 층이 수거 구획 내로 유입될 수 있도록 제어 모듈을 프로그램화할 수 있다. 시간 조정을 통해 다양한 양의 GRN이 SC 수거 구획 내로 유입될 수 있다는 것이 쉽게 이해되어야 한다. 이어서, 수거 구획에서 수집된 샘플은 혈장으로 채워지고, 이로써 샘플은 상대적으로 낮게 보유된다 (대략 2-10 % 헤마토크릿).

도 38을 보면, 상기 실시양태 중 어느 것에서 RBC 구획으로 이송된 마지막 1 ml의 RBC를 함유하는 SC 수거 구획 뿐만 아니라, 스탠드파이프의 내용물을 제거하는 메카니즘이 제시되어 있다. 도 38은 수집을 위해 배치된 SC 수거 튜브 (27) 및 RBC/GRN 수거 튜브 (28), 둘 모두를 포함하는 1회용 카트리지가 제시되어 있다. RBC/GRN 수거 튜브는 당업계에 공지되어 있는 임의의 수단에 의해 카트리지 외부로 연결되고, 스탠드파이프의 바닥과의 유체 연결부를 형성하여, 샘플링을 위해, 예를 들어, 인간 백혈구 항원 (HLA) 유형 분류를 위해 마지막 1 ml의 세포 용액으로부터 NRBC 및 GRN을 회수하는 간단한 수단을 제공할 수 있으며, 이후 RBC/GRN 나머지를 필요에 따라 제거할 수 있다.

본 발명의 임의의 실시양태에서, 혈장 중에서 부력을 가지거나, 대략 RBC 만큼 조밀한 항체 비드를 수거 이전에 샘플에 도입함으로써, 특정의 연구 또는 임상적 용도에 유용하지 않은 것으로 알려져 있는 세포에 결합할 수 있게 할 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

본 발명의 임의의 실시양태에서, 특정 세포 군집에 의해 흡수될 수 있는 형광 물질을 수거 이전에 샘플에 도입함으로써, 수거 프로세스 및 그 이후에 걸쳐 상기 세포 군집이 추적될 수 있게 할 수 있다는 것을 쉽게 이해하여야 한다.

본 발명이 특정 실시양태와 관련하여 제시되고 기술되었지만, 본 명세서를 읽고 이해함으로써 등가의 변경 및 수정이 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 명백해질 것이다. 특히, 상기 기술된 부품들에 의해 실행되는 다양한 기능과 관련하여, 상기 부품을 기술하는 데 사용된 용어 ("수단"에 대한 임의의 언급 포함)는 달리 명시되지 않는 한, 비록 본 발명의 본원의 예시적인 실시양태에서 기능을 수행하는 개시된 부품과 구조상 등가는 아닐지라도, 기술된 부품의 명시된 기능을 수행하는 (즉, 기능상 등가인) 임의의 부품에 상응하는 것으로 한다. 추가로, 본 발명의 특별한 특징은 단 하나의 실시양태와 관련하여 개시될 수 있지만, 임의의 주어진 또는 특별한 적용을 위해서는 바람직할 수 있거나 이로울 수 있는 바, 그러한 특징은 다른 실시양태의 하나 이상의 다른 특징과 조합될 수 있다.

Claims

a. 초기에는 폐쇄되어 있는 밸브 시스템에 유체 연결된 단부를 가진 강성 챔버, 제1 강성 저장 구획, 및 제2 강성 저장 구획을 포함하는 강성 카트리지를 원심분리기 내에 배치하는 단계, 여기서 상기 강성 챔버의 반경은 원심분리 회전축에 가까운 위치에서 가장 크고 상기 회전축에서 먼 위치에서 가장 작고, 상기 단부는 상기 회전축에서 먼 위치에 위치함;
b. 혈액, 골수, 또는 지방 조직으로부터 분리된 기질 혈관 분획 세포를 포함하며, 혈소판, 혈장, 고밀도 세포, 및 저밀도 세포를 포함하는 샘플을 상기 강성 챔버로 이송하는 단계;
c. 상기 강성 카트리지를 원심분리하여 상기 샘플이 10 G 이상의 제1 관성력(G force)에 의해, 이어서 상기 제1 관성력보다는 낮지만 1 G 초과인 제2 관성력에 의해 상기 단부 쪽으로 향하도록 강압하는 단계;
d. 상기 고밀도 세포에 대해, 상기 단부를 통과하여 상기 제1 강성 저장 구획으로 향하는 제1 경로를 제공하는 단계;
e. 상기 단부를 통과하는 상기 고밀도 세포의 이동을 추적하는 단계; 및
f. 상기 저밀도 세포 및 일정량의 혈소판 및 혈장에 대해, 상기 단부를 통과하여 상기 제2 강성 저장 구획으로 향하는 제2 경로를 제공하는 단계
를 포함하는, 혈액, 골수, 또는 지방 조직으로부터 분리된 기질 혈관 분획 세포를 포함하는 샘플로부터 적혈구, 과립구, 또는 혈소판 중 하나 이상을 고갈시키는 방법.
◈청구항 2은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제1항에 있어서, 상기 추적하는 단계가 광학적으로 수행되는 것인 방법.
◈청구항 3은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제1항에 있어서, 상기 제공하는 단계가 상기 밸브 시스템을 이용하는 것인 방법.
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제1항에 있어서, 상기 강성 챔버가 원추형인 방법.
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제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 관성력을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 샘플로부터 하나 이상의 추가의 세포 유형을 고갈시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제6항에 있어서,
g. 상기 원심분리 이후, 상기 강성 카트리지를 1 G의 관성력으로 감속시키고, 여기서 상기 샘플의 일부분이 상기 강성 챔버 중에 남아있는 것인 단계;
h. 상기 강성 카트리지를 교반하여 상기 샘플의 일부분을 혼합시키는 단계; 및
i. 후속 프로세싱을 위해 상기 강성 카트리지를 1 G 초과의 관성력으로 원심분리하는 단계
를 추가로 포함하는 방법.
◈청구항 8은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제1항에 있어서, 복수 개의 가요성 도관이 상기 강성 챔버를 상기 제1 및 상기 제2 강성 저장 구획에 연결시키고, 여기서 상기 가요성 도관의 길이 대 직경의 비가 20을 초과하지 않는 것인 방법.
◈청구항 9은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제1항에 있어서, 밸브 시스템이 캠(cam) 및 가요성 도관을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 제공하는 단계 이전에 항체 비드가 상기 샘플에 도입되는 것인 방법.
◈청구항 11은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제10항에 있어서, 상기 항체 비드가 대략 적혈구 만큼 조밀한 것인 방법.
◈청구항 12은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제10항에 있어서, 상기 항체 비드가 혈장 중에서 부유하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 샘플이 형광성 물질을 추가로 포함하는 것인 방법.
◈청구항 14은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제13항에 있어서, 상기 형광성 물질을 추적하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서,
g. 상기 원심분리 이후, 상기 강성 카트리지를 1 G의 관성력으로 감속시키고, 여기서 상기 샘플의 일부분이 상기 강성 챔버 중에 남아있는 것인 단계;
h. 상기 강성 카트리지를 교반하여 상기 샘플의 일부분을 혼합시키는 단계; 및
i. 후속 프로세싱을 위해 상기 강성 카트리지를 1 G 초과의 관성력으로 원심분리하는 단계
를 추가로 포함하는 방법.
◈청구항 16은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제15항에 있어서, 상기 제공하는 단계 이전에 항체 비드가 상기 샘플에 도입되는 것인 방법.
◈청구항 17은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제16항에 있어서, 상기 항체 비드가 대략 적혈구 만큼 조밀한 것인 방법.
◈청구항 18은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제16항에 있어서, 상기 항체 비드가 혈장 중에서 부유하는 것인 방법.
◈청구항 19은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제15항에 있어서, 상기 샘플이 형광성 물질을 추가로 포함하는 것인 방법.
◈청구항 20은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제19항에 있어서, 상기 형광성 물질을 추적하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 적혈구 침강 촉진제를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
a. i. 회전축이 있는 원심분리기;
ii. 혈장 및 고밀도의 제1 부분 및 저밀도의 나머지 부분을 포함하는 샘플;
iii. 1. 출구 포트가 있는 내부 강성 챔버, 여기서 상기 내부 강성 챔버의 반경은 원심분리 회전축에 가까운 위치에서 가장 크고 상기 회전축에서 먼 위치에서 가장 작고, 상기 출구 포트는 상기 회전축에서 먼 위치에 위치함;
2. 제1 강성 저장 구획 및 제2 강성 저장 구획;
3. 입구 포트;
4. 상기 출구 포트와 상기 강성 저장 구획 사이에 소통이 이루어지게 하는 밸브 시스템
을 포함하는 강성 카트리지; 및
iv. 센서
를 제공하는 단계;
b. 상기 샘플을 상기 입구 포트를 통해 상기 강성 챔버 내로 이송시킴으로써 상기 샘플을 상기 강성 카트리지에 배치하는 단계;
c. 상기 강성 카트리지를 원심분리하여 상기 제1 부분이 먼저 원심력에 의해 상기 출구 포트쪽으로 향하도록 강압하고, 상기 밸브 시스템에 의해 방향을 지시받은 후, 이어서, 상기 회전축쪽으로 및 상기 제1 강성 저장 구획 내로 향하도록 강압하는 단계;
d. 상기 밸브 시스템을 사용하여 일정량의 상기 나머지 부분을 상기 회전축쪽으로 및 상기 제2 강성 저장 구획 내로 지향시키는 단계
를 포함하는, 혈액, 골수, 또는 지방 조직으로부터 분리된 기질 혈관 분획 세포를 포함하는 샘플로부터 적혈구, 과립구, 또는 혈소판 중 하나 이상을 고갈시키는 방법.
◈청구항 23은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제22항에 있어서, 상기 밸브 시스템이 캠 및 가요성 도관을 포함하는 것인 방법.
◈청구항 24은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제22항에 있어서, 상기 센서가 광학 센서인 방법.
◈청구항 25은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제22항에 있어서, 상기 센서를 사용하여 상기 출구 포트를 통과하는 상기 제1 부분의 이동을 추적하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
◈청구항 26은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제22항에 있어서, 상기 강성 챔버가 소형 단부를 추가로 포함하고, 여기서 상기 출구 포트가 상기 소형 단부에 위치하는 것인 방법.
제22항에 있어서, 상기 샘플을 계층화하여 하나 이상의 계면을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제27항에 있어서, 상기 하나 이상의 계면을 상기 센서로 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
◈청구항 29은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제27항에 있어서, 상기 계층화하는 단계에 의해 제1 및 제2 계면이 생성되는 것인 방법.
◈청구항 30은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제29항에 있어서, 상기 제1 및 제2 계면을 상기 센서로 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
◈청구항 31은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제30항에 있어서, 상기 센서가 상기 제1 계면을 검출한 후에 상기 지향시키는 단계를 수행하는 것인 방법.
◈청구항 32은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제30항에 있어서, 상기 센서가 상기 제2 계면을 검출한 후에 상기 지향시키는 단계가 수행되는 것인 방법.
◈청구항 33은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제32항에 있어서, 상기 센서를 사용하여 상기 출구 포트를 통과하는 상기 제1 부분의 이동을 추적하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
◈청구항 34은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제22항에 있어서,
e. 상기 원심분리에 후속하여, 상기 강성 카트리지를 10 G 초과의 관성력에서 1 G의 관성력으로 감속시키고, 여기서
i. 상기 제1 부분의 대부분은 상기 제1 강성 저장 구획 내에 존재하고;
ii. 상기 나머지 부분의 대부분은 상기 강성 챔버 내에 존재하는 것인 단계;
f. 상기 강성 카트리지의 교반을 통해 상기 나머지 부분을 혼합시키는 단계; 및
g. 후속 프로세싱을 위해 상기 강성 카트리지를 1 G 초과의 관성력으로 복귀시키는 단계
를 추가로 포함하는 방법.
◈청구항 35은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제34항에 있어서, 상기 센서를 사용하여 상기 출구 포트를 통과하는 상기 제1 또는 제2 부분의 이동을 추적하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
◈청구항 36은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제35항에 있어서, 상기 센서가 광학 센서인 방법.
◈청구항 37은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제36항에 있어서, 상기 광학 센서가 하나 이상의 적외선 방사기/검출기 쌍을 포함하는 것인 방법.
a. i. 강성 외부 쉘;
ii. 배출 개구부를 포함하는 소형 단부 및 유입 개구부를 포함하는 대형 단부를 가진 내부 강성 챔버, 여기서 상기 내부 강성 챔버의 반경은 원심분리 회전축에 가까운 위치에서 가장 크고 상기 회전축에서 먼 위치에서 가장 작고, 상기 소형 단부는 상기 회전축에서 먼 위치에 위치함;
iii. 초기에는 상기 소형 단부와 유체 소통하지 않는 제1 및 제2 강성 저장 구획;
iv. 상기 배출 개구부 및 상기 제1 강성 저장 구획과 소통하며, 초기에는 폐쇄되어 있는 제1 밸브; 및
v. 상기 배출 개구부 및 상기 제2 강성 저장 구획과 소통하며, 초기에는 폐쇄되어 있는 제2 밸브
를 포함하는 강성 카트리지를 제공하는 단계;
b. 상기 강성 카트리지를 수용하도록 구성된 원심분리기를 제공하는 단계;
c. 고밀도 세포, 저밀도 세포, 혈소판 및 혈장의 혼합물을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
d. 상기 샘플을 상기 유입 개구부를 통해 상기 강성 카트리지 내로 이송하는 단계;
e. 상기 강성 카트리지를 상기 원심분리기 내에 배치하는 단계;
f. 원심력을 가하여 상기 샘플이 상기 소형 단부쪽으로 향하도록 강압하는 단계;
g. 상기 샘플을 계층화하여 상기 고밀도 세포의 대다수가 고밀도 성분 층을 형성하고, 상기 저밀도 세포의 대다수가 저밀도 성분 층을 형성하도록 하는 단계;
h. 상기 제1 밸브를 개방하여 상기 성분 층이 상기 소형 단부쪽으로 이동하도록 하고, 여기서 상기 고밀도 세포의 상기 대다수가 원심력에 의해 먼저 상기 회전축으로부터 멀어진 후, 상기 회전축쪽으로 향하여 상기 제1 강성 저장 구획 내로 유동하도록 강압되는 것인 단계; 및
i. 상기 원심력을 제거하는 단계
를 포함하는, 혈액, 골수, 또는 지방 조직으로부터 분리된 기질 혈관 분획 세포를 포함하는 샘플로부터 적혈구, 과립구, 또는 혈소판 중 하나 이상을 고갈시키는 방법.
◈청구항 39은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제38항에 있어서, 제1 밸브가 캠에 의해 활성화되는 것인 방법.
◈청구항 40은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제38항에 있어서, 상기 제1 강성 저장 구획이 상기 배출 개구부보다는 상기 회전축에 더 가깝게 위치하는 제1 강성 저장 구획 입구 포트를 포함하고, 여기서 상기 고밀도 세포가 상기 제1 강성 저장 구획 입구 포트를 통해 유동하는 것인 방법.
제38항에 있어서, 센서를 사용하여 상기 소형 단부에서 상기 성분 층 중 하나 이상의 존재를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제38항에 있어서, 제1 및 제2 센서를 사용하여 상기 소형 단부를 통과하는 상기 제1 및 제2 성분 층의 존재를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
◈청구항 43은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제42항에 있어서, 상기 제1 밸브를 폐쇄하고, 상기 제2 밸브를 개방시켜 상기 저밀도 세포의 상기 대다수 및 혈장이 원심력에 의해 먼저 상기 회전축으로부터 멀어진 후, 상기 회전축쪽으로 향하여 상기 제2 강성 저장 구획 내로 유동하도록 강압하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
◈청구항 44은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제43항에 있어서, 상기 제2 밸브를 개방하기 전에 상기 제2 강성 저장 구획에 첨가되는 저밀도 세포 및 혈장의 최종 부피를 예정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제44항에 있어서,
j. 상기 제2 강성 저장 구획을 혈장으로 채워 상기 최종 부피가 상기 예정된 최종 부피와 동일하도록 하기 위해 상기 제2 성분 층의 검출 후 상기 제2 밸브가 개방된 상태로 유지되는 시간량을 계산하는 단계; 및
k. 상기 시간량이 경과한 후, 상기 제2 밸브를 폐쇄시키는 단계
를 추가로 포함하는 방법.
제45항에 있어서, 상기 계산하는 단계가 상기 제1 센서와 상기 제2 센서에 의한 상기 성분 층 중 하나에 대한 검출 사이의 경과 시간을 기초로 하는 것인 방법.
◈청구항 47은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제40항에 있어서,
l. 상기 개방하는 단계 후에 원심력을 제거하는 단계;
m. 상기 제거하는 단계 후에 상기 강성 카트리지를 교반하여 상기 저밀도 세포, 상기 혈소판 및 상기 혈장을 혼합하는 단계; 및
n. 상기 저밀도 세포, 상기 혈소판 및 상기 혈장의 추가의 프로세싱을 위해 원심력을 다시 가하는 단계
를 추가로 포함하는 방법.
◈청구항 48은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제40항에 있어서, 상기 고밀도 성분 층이 적혈구를 포함하고, 상기 저밀도 성분 층이 백혈구를 포함하는 것인 방법.
◈청구항 49은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제48항에 있어서, 상기 저밀도 성분 층이 단핵 세포를 추가로 포함하는 것인 방법.
◈청구항 50은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제48항에 있어서, 상기 저밀도 성분 층이 과립구를 추가로 포함하는 것인 방법.
◈청구항 51은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제48항에 있어서, 상기 고밀도 성분 층이 과립구를 추가로 포함하는 것인 방법.
a. i. 둘 모두 초기에는 폐쇄되어 있는 제1 및 제2 출구 포트가 있는 내부 강성 챔버, 여기서 상기 내부 강성 챔버의 반경은 원심분리 회전축에 가까운 위치에서 가장 크고 상기 회전축에서 먼 위치에서 가장 작고, 상기 제1 및 제2 출구 포트는 상기 회전축에서 먼 위치에 위치함; 및
ii. 2개 이상의 강성 저장 구획을 포함하는 강성 카트리지를 제공하는 단계;
b. 고밀도 세포, 저밀도 세포를 포함하는 생물학적 유체 샘플을 상기 강성 챔버 내에 배치하는 단계;
c. 상기 강성 카트리지를 원심분리하여 상기 고밀도 세포의 대다수가 고밀도 성분 층을 형성하고, 상기 저밀도 세포의 대다수가 저밀도 성분 층을 형성하도록 하는 단계; 및
d. 상기 원심분리 단계 동안
i. 상기 제1 출구 포트를 개방하여 상기 고밀도 성분 층 중 일부분이 통과하도록 하고;
ii. 상기 제1 출구 포트를 폐쇄하고;
iii. 상기 제2 출구 포트를 개방하여 상기 저밀도 성분 층 중 일부분이 통과하도록 하는 단계
를 포함하는, 고밀도 세포, 저밀도 세포, 혈소판 및 혈장을 포함하는 샘플로부터 하나 이상의 세포 유형을 수거하는 방법.
제52항에 있어서, 상기 성분 층 중 하나가 원심력에 의해 먼저 상기 출구 포트 중 하나를 통과하고, 회전축으로부터 멀어진 후, 상기 회전축쪽으로 향하여 상기 강성 저장 구획 내로 유동하도록 강압되는 것인 방법.
제52항에 있어서, 상기 샘플이 혈액, 골수, 또는 지방 조직으로부터 분리된 기질 혈관 분획 세포 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
a. 회전축이 있는 원심분리기를 제공하는 단계;
b. 내부 강성 챔버를 포함하는 강성 카트리지를 제공하는 단계, 여기서 상기 내부 강성 챔버의 반경은 원심분리 회전축에 가까운 위치에서 가장 크고 상기 회전축에서 먼 위치에서 가장 작고, 밸브 시스템에 유체 연결된 단부가 상기 회전축에서 먼 위치에 위치함;
c. 혈액, 골수, 또는 지방 조직으로부터 분리된 기질 혈관 분획 세포로 이루어지며, 적혈구, 과립구, 단핵 세포, 줄기 세포, 혈소판 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 생물학적 성분을 포함하는 샘플을 상기 강성 챔버 안에 배치하는 단계;
d. 상기 강성 카트리지를 상기 원심분리기 내로 삽입하는 단계;
e. 상기 원심분리기를 사용하여 상기 샘플에 원심력을 공급하며, 여기서 상기 원심력이
i. 먼저 상기 샘플 중의 상기 적혈구 대다수를 상기 회전축으로부터 멀어지도록, 상기 강성 챔버 바깥으로, 상기 회전축쪽으로 향하도록, 및 제1 강성 저장 구획 내로 변위시키고;
ii. 그 다음으로는 상기 샘플 중 상기 단핵 세포 대다수를 상기 회전축으로부터 멀어지도록, 상기 강성 챔버 바깥으로, 상기 회전축쪽으로 향하도록, 및 제2 강성 저장 구획 내로 변위시키는 것인 단계
를 포함하며, 여기서 모든 단계가 단일의 강성 카트리지 내에서 수행되는 것인, 혈액, 골수, 또는 지방 조직으로부터 분리된 기질 혈관 분획 세포로 이루어진 샘플로부터 단핵 세포를 수거하는 방법.
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제55항에 있어서, 변위 단계 ii 동안 상기 단핵 세포 대다수가 계층화된 층에 농축되어, 상기 계층화된 층이 상기 회전축으로부터 멀어지도록 이동함에 따라 그 두께가 증가하는 것인 방법.
a. 초기에는 폐쇄되어 있는 밸브 시스템에 유체 연결된 단부를 가진 강성 챔버, 및 하나 이상의 강성 저장 구획을 포함하는 강성 카트리지를 원심분리기 내에 배치하는 단계, 여기서 상기 강성 챔버의 반경은 원심분리 회전축에 가까운 위치에서 가장 크고 상기 회전축에서 먼 위치에서 가장 작고, 상기 단부는 상기 회전축에서 먼 위치에 위치함;
b. 상대적으로 고밀도 및 저밀도인 세포 및 유체를 포함하는 샘플을 상기 강성 챔버에 넣는 단계;
c. 상기 강성 카트리지를 원심분리하여 상기 샘플이 제1 관성력에 의해 상기 단부 쪽으로 향하도록 강압하는 단계;
d. 상기 강성 카트리지를 원심분리하여 상기 샘플이 상기 제1 관성력보다는 낮지만 1 G 초과인 제2 관성력에 의해 상기 단부 쪽으로 향하도록 강압하고, 상대적으로 고밀도인 상기 세포의 적어도 일부분에 대해, 상기 단부를 통과하여 상기 하나 이상의 강성 저장 구획으로 향하게 하는, 상기 밸브 시스템을 통한 개방 경로를 제공하는 단계;
e. 상기 강성 카트리지 내에서 상기 단부를 통과하는 상기 세포의 이동을 추적하는 단계; 및
f. 상기 개방 경로를 폐쇄하는 단계
를 포함하는, 샘플로부터 밀도가 상이한 세포를 선택적으로 고갈시키는 방법.
a. 회전축이 있는 원심분리기:
b. i. 입구, 및 상기 회전축에서 먼 위치에 위치하는 출구 포트가 있으며, 카트리지가 상기 원심분리기에서 원심분리되고 있을 때, 반경이 상기 회전축에 가까운 위치에서 가장 크고 상기 회전축에서 먼 위치에서 가장 작은, 강성 내부 챔버;
ii. 밸브 시스템;
iii. 상기 카트리지가 상기 원심분리기에서 원심분리되고 있을 때, 상기 출구 포트보다는 상기 회전축에 더 가깝게 위치하는 제1 강성 저장 구획; 및
iv. 상기 카트리지가 상기 원심분리기에서 원심분리되고 있을 때, 상기 출구 포트보다는 상기 회전축에 더 가깝게 위치하는 제2 강성 저장 구획
을 포함하는 강성 카트리지; 및
c. 제어 모듈
을 포함하는, 혈액, 골수, 또는 지방 조직으로부터 분리된 기질 혈관 분획 세포를 포함하는 샘플로부터 적혈구, 과립구, 또는 혈소판 중 하나 이상을 고갈시키기 위한 장치.
제59항에 있어서, 상기 카트리지가 상기 원심분리기에서 원심분리되고 있을 때, 상기 밸브 시스템 중 적어도 일부분이 상기 제1 및 제2 구획 입구보다 상기 회전축으로부터 더 먼 거리에 위치하는 것인 장치.
제59항에 있어서, 밸브와 작동가능한 관계에 있는 캠을 추가로 포함하는 장치.
a. i. 외부 쉘;
ii. 강성 챔버의 소형 단부에 위치하는 배출 개구부, 및 강성 챔버의 대형 단부에 위치하는 유입 개구부를 포함하는 강성 챔버, 여기서 상기 강성 챔버의 반경은 원심분리 회전축에 가까운 위치에서 가장 크고 상기 회전축에서 먼 위치에서 가장 작고, 상기 소형 단부는 상기 회전축에서 먼 위치에 위치함;
iii. 초기에는 상기 강성 챔버로부터 유체 단리되어 있는 2개 이상의 강성 구획;
iv. 상기 배출 개구부에 유체 연결되어 있고, 상기 강성 챔버와 상기 2개 이상의 강성 구획 사이에 위치하며, 상기 강성 챔버와 어느 강성 구획 사이에도 유체 연결이 존재하지 않는 제1 구성, 상기 강성 챔버와 제1 강성 구획 사이에만 유체 연결이 존재하는 제2 구성, 및 상기 강성 챔버와 제2 강성 구획 사이에만 유체 연결이 존재하는 제3 구성을 갖는 밸브
를 포함하는 강성 용기; 및
b. 제어 모듈
을 포함하는, 혈액, 골수, 또는 지방 조직으로부터 분리된 기질 혈관 분획 세포를 포함하는 샘플로부터 적혈구, 과립구, 또는 혈소판 중 하나 이상을 고갈시키기 위한 장치.
◈청구항 63은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제62항에 있어서, 각각의 상기 구획이 구획 입구를 포함하고, 여기서 상기 구획 입구가 상기 배출 개구부보다는 회전축에 더 가깝게 위치하는 것인 장치.
◈청구항 64은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제62항에 있어서, 광학 센서를 추가로 포함하는 장치.
◈청구항 65은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제64항에 있어서, 중력 센서, 및 배터리를 추가로 포함하는 장치.
◈청구항 66은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제64항에 있어서, 상기 광학 센서가 상기 제어 모듈 내에 위치하는 것인 장치.
◈청구항 67은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제64항에 있어서, 상기 밸브가 상기 제1, 제2, 또는 제3 구성 중 어느 구성으로 존재할지를 결정하는 밸브 제어 수단을 추가로 포함하는 장치.
◈청구항 68은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제67항에 있어서, 상기 광학 센서가 상기 밸브 제어 수단에 작동가능하게 연결되어 있는 것인 장치.
◈청구항 69은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제62항에 있어서, 상기 강성 용기를 수용하고, 원심력을 발생시키도록 구성된 원심분리기를 추가로 포함하는 장치.
제62항에 있어서, 밸브 제어기에 작동가능하게 결합되어 있는 제1 및 제2 센서를 추가로 포함하며, 여기서 상기 센서 및 밸브 제어기가 예정된 최종 부피의 액체를 상기 제2 강성 구획에 수집하도록 구성된 것인 장치.
제70항에 있어서, 상기 제어 모듈이 상기 제1 센서 및 상기 제2 센서에 의한 예정된 판독 측정 사이의 제1 경과 시간량을 측정하고, 상기 제1 경과 시간량에 기초하여 계산된 시간에 상기 밸브 제어기를 작동시켜 상기의 예정된 최종 부피의 액체를 상기 제2 강성 구획에 수집하도록 구성된 것인 장치.
제70항에 있어서, 제3 센서를 포함하고, 여기서 상기 제어 모듈이
a. 상기 제1 센서 및 상기 제2 센서에 의한 예정된 판독 측정 사이의 제1 경과 시간량을 측정하고;
b. 상기 제2 센서 및 상기 제3 센서에 의한 예정된 판독 측정 사이의 제2 경과 시간량을 측정하고;
c. 상기 제1 및 제2 시간량에 기초하여 계산된 시간에 상기 밸브 제어기를 작동시켜 상기의 예정된 최종 부피의 액체를 상기 제2 강성 구획에 수집하도록 구성된 것인 장치.
a. i. 밸브 제어 수단;
ii. 중력 센서;
iii. 광학 센서; 및
iv. 배터리
를 포함하는 제어 모듈;
b. 상기 제어 모듈에 분리가능하게 연결되어 있으며,
i. 강성 외부 쉘;
ii. 배출 개구부를 포함하는 소형 단부 및 유입 개구부를 포함하는 대형 단부를 가진 강성 챔버, 여기서 상기 강성 챔버의 반경은 원심분리 회전축에 가까운 위치에서 가장 크고 상기 회전축에서 먼 위치에서 가장 작고, 상기 소형 단부는 상기 회전축에서 먼 위치에 위치함;
iii. 초기에는 상기 배출 개구부와 유체 소통하지 않는 제1 및 제2 강성 저장 구획;
iv. 상기 배출 개구부 및 상기 제1 강성 저장 구획과 소통하며, 폐쇄된 구성 및 개방된 구성을 갖는 제1 밸브; 및
v. 상기 배출 개구부 및 상기 제2 강성 저장 구획과 소통하며, 폐쇄된 구성 및 개방된 구성을 갖는 제2 밸브
를 포함하는 강성 카트리지
를 포함하는, 생물학적 유체를 포함하는 샘플로부터 하나 이상의 세포 유형을 단리시키기 위한 장치.
제73항에 있어서, 상기 밸브 제어 수단이 캠을 포함하는 것인 장치.
제73항에 있어서, 상기 소통이 가요성 도관을 통해 이루어지는 것인 장치.
a. 강성 외부 쉘;
b. 배출 개구부를 포함하는 소형 단부 및 유입 개구부를 포함하는 대형 단부를 가진 강성 챔버, 여기서 상기 강성 챔버의 반경은 원심분리 회전축에 가까운 위치에서 가장 크고 상기 회전축에서 먼 위치에서 가장 작고, 상기 소형 단부는 상기 회전축에서 먼 위치에 위치함;
c. 초기에는 상기 배출 개구부와 유체 소통하지 않는 제1 및 제2 강성 저장 구획;
d. 상기 배출 개구부 및 상기 제1 강성 저장 구획과 소통하며, 폐쇄된 구성 및 개방된 구성을 갖는 제1 밸브; 및
a. 상기 배출 개구부 및 상기 제2 강성 저장 구획과 소통하며, 폐쇄된 구성 및 개방된 구성을 갖는 제2 밸브
를 포함하는, 생물학적 유체를 포함하는 샘플로부터 하나 이상의 세포 유형을 단리시키기 위한 강성 카트리지.
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