CN114225027B - 基因工程化肝癌靶向细胞膜仿生纳米微球及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基因工程化肝癌靶向细胞膜仿生纳米微球及其制备方法。为核壳结构，外层壳为基因工程化过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜，内层核为包载吲哚菁绿分子的聚乳酸‑羟基乙酸共聚物纳米微球；构建过表达靶向跨膜蛋白的慢病毒，构建过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞株，慢病毒转染使肝癌细胞株表面出现靶向跨膜蛋白，分离和纯化过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜外壳，包载吲哚菁绿分子的聚乳酸‑羟基乙酸共聚物纳米微球制备，基因工程化过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜仿生纳米微球制备。本发明产物有对肝癌组织大量精准递送具有多模态成像和近红外光热效应的吲哚菁绿分子，能够实现肝癌诊疗一体化的功能。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物医用材料，尤其是涉及一种具有肝癌靶向的基因工程化过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜仿生纳米微球及其制备方法，属于仿生纳米载体的制备及其荧光成像和光热治疗应用的技术领域。
背景技术
肝癌是一种肝脏原发性恶性肿瘤，是致死率仅次于胰腺癌的第二大恶性肿瘤。肝癌起病症状不明显，许多患者确诊时已失去手术治愈机会。目前对于不可切除性肝癌的治疗效果有限，急需发展创新高效的肝癌诊断和治疗方式。基于纳米体系的光热治疗近些年正在成为纳米药物肿瘤治疗研究领域的热门方向，具有治疗精准性高，对正常组织损伤小，生物安全性高的特点。目前光热治疗对肝癌等深部肿瘤的治疗效果有限，现有技术缺少利用高效靶向肝癌组织的纳米载体携带光热分子大量富集到肝癌中以提高治疗效果的技术。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供了一种具有肝癌靶向的基因工程化过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜仿生纳米微球及其制备方法，纳米微球具有对肝癌组织大量精准递送具有多模态成像和近红外光热效应的吲哚菁绿(ICG)分子。能够将肝细胞膜仿生纳米体系的同源归巢靶向作用和肝癌细胞靶向肽的主动亲和靶向作用相结合，实现双重靶向增强效果。同时利用对肝癌的靶向能力将具有光热治疗和肿瘤组织成像功能的纳米体系高效递送到肝癌组织当中，实现对肝癌的诊疗一体化。
本发明方法是通过细胞培养的方式获取基因工程化过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜，再通过脂质体挤出器共挤出的方式将细胞膜包裹于聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球表面，形成核壳结构的基因工程化过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜仿生纳米微球。操作简单易行，工艺参数易于控制。该仿生纳米微球能够大量富集于肝癌组织中，减少体内其他组织的非特异性蓄积，实现对肝癌组织的特异性靶向作用。同时微球具有荧光成像和光热治疗效果达到对肝癌的诊疗一体化效果。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一、一种基因工程化肝癌靶向细胞膜仿生纳米微球：
所述的纳米微球为核壳结构，直径在100纳米左右分布，核壳结构的外层壳为过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜，核壳结构的内层核为包载吲哚菁绿分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球。
所述外层壳为基因工程化过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜，靶向跨膜蛋白的构成为IL-2跨膜蛋白信号肽、肝癌靶向肽SP94、增强型绿色荧光蛋白EGFP、3×FLAG标记蛋白、糖基化磷酯酰肌醇锚定蛋白GPI中的其中一种。
所述内层核为包载吲哚菁绿分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物，其中聚乳酸：聚羟基乙酸的摩尔比例为1：1，聚乳酸-羟基乙酸共聚物与吲哚菁绿的质量比为5：1～1：5。
二、基因工程化肝癌靶向细胞膜仿生纳米微球的制备方法，所述制备方法具体包括：
步骤一：构建过表达靶向跨膜蛋白的慢病毒，所述的慢病毒用于使细胞表面过表达靶向跨膜蛋白；
步骤二：构建过表达靶向跨膜蛋白的标准肝癌细胞株，且通过慢病毒转染使标准肝癌细胞株表面出现靶向跨膜蛋白；
所述步骤二具体为：
将肝癌细胞铺到6孔板中，37℃培养箱内常规培养24小时，加入20微升/孔的过表达靶向跨膜蛋白的慢病毒，37℃培养24小时得到过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞株。
步骤三：分离和纯化过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜外壳；
所述步骤三具体为：
由上述步骤二获得的肝癌细胞膜进行培养获得肝癌细胞膜，收集肝癌细胞膜上稳定表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞，具体是用细胞刮子轻柔刮下细胞，1000转/分钟离心5分钟收集细胞；使用含有质量分数为1％苯甲基磺酰氟的低渗细胞裂解液裂解细胞，于液氮和常温下反复冻结融化细胞溶液，再使用梯度离心法获得细胞膜，具体是在4℃和700g条件下离心10分钟，收集上清的溶液，最后14000g离心30分钟，收集沉淀为过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜；
最后经超声处理后使用脂质体挤出器挤过多孔聚碳酸酯多孔膜，超声处理具体是使用超声细胞破碎仪，在20kHz频率和20W功率下将过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜超声5分钟，使用Avanti脂质体挤出器挤过200nm的聚碳酸酯多孔膜；来回重复挤过膜3～11次，获得大小分布均一的过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜外壳。
步骤四：包载吲哚菁绿分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球制备；
所述步骤四具体为：
使用超声细胞破碎仪，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乙腈溶液逐滴加入吲哚菁绿的乙醇溶液中超声处理10分钟得到混合溶液，对混合溶液使用超滤管离心去除游离吲哚菁绿分子，然后使用微米针式滤器过滤除处理获得聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球，得到大小分布均一的吲哚菁绿分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球。
所述步骤四中，使用0.22微米针式滤器过滤除去直径大于0.22微米的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球。
所述步骤四具体可以为：配制2克/升的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的80％乙腈溶液和0.75克/升的吲哚菁绿的4％乙醇溶液。在20kHz频率和40W功率的超声下，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液逐滴加入吲哚菁绿溶液中，混合比例5：1～1：5，超声处理10分钟。得到的混合溶液使用Amicon ultra-4超滤管3000转/分钟离心30分钟。取上层溶液使用0.22微米针式滤器过滤3次，得到平均直径0.22微米的包载吲哚菁绿分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球。
步骤五：基因工程化过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜仿生纳米微球制备。
所述步骤五具体为：
按照质量比1：2～2：1比例混合过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜外壳及吲哚菁绿分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球，超声处理后使用脂质体挤出器挤过200nm的聚碳酸酯多孔膜，来回重复挤过膜11次，获得大小分布均一的基因工程化过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜仿生纳米微球。
所述步骤五具体可以为：使用超声细胞破碎仪，在20kHz频率和20W功率下将过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜外壳和包载吲哚菁绿分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球按照1：2～2：1的质量比混合超声5分钟。混合后的溶液使用Avanti脂质体挤出器挤过200nm的聚碳酸酯多孔膜，来回重复3～11次，得到过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜仿生纳米微球。
本发明是通过基因工程化的方式，将肿瘤靶向肽表达于细胞膜表面从而实现肝癌靶向效果叠加，构建一种强化肝癌靶向效果的细胞膜仿生纳米微球。
本发明构建过表达靶向跨膜蛋白的慢病毒M靶向跨膜蛋白中含有肝癌靶向肽SP94。以慢病毒转染的方式在肝癌细胞表面表达靶向跨膜蛋白，构建过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞株。使用复乳法将具有光热响应和荧光成像、光声成像功能的吲哚菁绿(ICG)装载于聚乳酸-乙醇酸(PLGA)聚合物中，自组装形成聚乳酸-乙醇酸纳米微球。使用梯度离心法和脂质体挤出法制备过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞株的细胞膜外壳，包载聚乳酸-乙醇酸纳米微球，得到过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜仿生纳米微球。
本发明具体实施是以慢病毒转染的方式在肝癌细胞Huh-7表面表达肝癌靶向肽，构建肝癌靶向肽SP94过表达的Huh-7SP94+肝癌细胞系；使用复乳法将具有光热响应和荧光成像、光声成像功能的吲哚菁绿(ICG)装载于聚乳酸-乙醇酸(PLGA)聚合物中，自组装形成聚乳酸-乙醇酸纳米微球；使用梯度离心法提取Huh-7SP94+肝癌细胞系其细胞膜囊泡，包载聚乳酸-乙醇酸纳米微球，得到肝癌强化靶向的基因工程化细胞膜仿生纳米微球。
本发明具有的有益效果体现在：
1)过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜仿生纳米微球能够大量富集于肝癌组织中，减少体内其他组织的非特异性蓄积，实现对肝癌组织的特异性靶向作用。
2)过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜仿生纳米微球具有荧光成像和光热治疗效果达到对肝癌的诊疗一体化效果。
附图说明
图1是本发明的结构图，1-1是靶向跨膜蛋白，1-2是肝癌细胞膜，1-3是聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球，1-4是吲哚菁绿分子。
图2是本发明的透射电镜图。
图3是本发明的光热响应曲线。
图4是本发明的体外靶向荧光效果图。
图中，4-1是基因工程化细胞膜仿生纳米微球，4-2是普通细胞膜仿生纳米微球，4-3是聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球，4-4是对照组。
具体实施方式
下面结合实施例及其附图进一步叙述本发明。
实施例1:
本发明实施例的一种过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜仿生纳米微球制备方法，选择Huh-7肝癌细胞作为细胞模型，按照如下具体步骤进行：
步骤一：构建过表达靶向跨膜蛋白的慢病毒。
该慢病毒能够使细胞表面过表达靶向跨膜蛋白。靶向跨膜蛋白的构成包括IL-2跨膜蛋白信号肽、肝癌靶向肽SP94、增强型绿色荧光蛋白EGFP、3×FLAG标记蛋白、糖基化磷酯酰肌醇锚定蛋白GPI。
步骤二：构建过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞株Huh-7SP94+
将人肝癌细胞Huh-7按照1x105/孔的密度铺到6孔板中，37℃培养箱内常规培养24小时。用表达靶向跨膜蛋白的慢病毒转染Huh-7细胞，每孔加入20微升慢病毒，37℃培养24小时得到过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞株Huh-7SP94+。
步骤三：分离和纯化过表达靶向跨膜蛋白的Huh-7SP94+肝癌细胞膜外壳
使用直径10cm的培养皿培养Huh-7 SP94+细胞，待细胞铺满80％的培养皿，去除培养基，用磷酸盐缓冲盐溶液洗一遍，用细胞刮子轻柔刮下细胞，转移细胞到15毫升离心管中。1000转/分钟离心5分钟收集细胞，吸去上层培养基后用磷酸盐缓冲盐溶液轻轻重悬细胞，取少量细胞用于计数，剩余细胞600g离心5分钟，去掉上清。在离心管中加入1毫升含有1％苯甲基磺酰氟的细胞低渗裂解液，用移液枪吹打充分悬浮细胞，冰浴放置15分钟使细胞溶胀。随后将离心管依次放在液氮和常温下反复冻融，直到细胞破碎。随后在4℃和700g条件下离心10分钟，收集上清的溶液，最后14000g离心30分钟，收集沉淀为细胞膜。使用超声细胞破碎仪，在20kHz频率和20W功率下超声5分钟，随后使用Avanti脂质体挤出器挤过200纳米的聚碳酸酯多孔膜，来回重复11次，得到过表达靶向跨膜蛋白的Huh-7 SP94+肝癌细胞膜外壳
步骤四：包载吲哚菁绿分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球制备。
称取2毫克聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于1毫升80％乙腈溶液中，再称取0.75毫克的吲哚菁绿，溶解于1毫升的4％乙醇溶液中。使用超声细胞破碎仪，在20kHz频率和40W功率下，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液逐滴加入吲哚菁绿溶液中，得到2毫升混合溶液，超声处理10分钟。得到的混合溶液使用Amicon ultra-4超滤管3000转/分钟离心30分钟。取上层溶液使用0.22微米针式滤器过滤3次，得到平均直径0.22微米的包载吲哚菁绿分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球。
步骤五：基因工程化过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜仿生纳米微球制备。
取吲哚菁绿质量为0.2毫克的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液与0.1毫克的细胞膜溶液混合并定容至1毫升。使用超声细胞破碎仪，在20kHz频率和20W功率下超声5分钟充分混合。混合后的溶液使用Avanti脂质体挤出器挤过200纳米的聚碳酸酯多孔膜，来回重复11次，确保细胞膜能充分包被在聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球表面，形成直径约200纳米的基因工程化过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜仿生纳米微球。
使用透射电子显微镜表征基因工程化过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜仿生纳米微球的形貌。吸取10μL的纳米微球溶液，轻柔滴加在透射电子显微镜碳支持膜铜网上，使用红外灯烘干铜网上的水分，滴加5μL的2％醋酸双氧铀溶液进行铜网负染色。再次红外灯烘干后将铜网放入透射电子显微镜进样孔，进行拍照，得到纳米体系的形貌如图2所示。结果表明，基因工程化细胞膜仿生纳米微球为核壳结构，直径在100纳米左右分布，细胞膜涂层厚度约7纳米。细胞膜囊泡位于纳米微球表面，纳米微球核心为包载吲哚菁绿分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物。
使用波长为808纳米的近红外激光器在0.5瓦/平方厘米、1.0瓦/平方厘米、1.5瓦/平方厘米、2.0瓦/平方厘米的功率下对0.2毫升的1克/升的基因工程化细胞膜仿生纳米微球进行光照，用红外热像仪对溶液温度进行实时检测并记录，绘制温度-时间变化曲线如图3所示。结果表明，在近红外激光照射下，基因工程化细胞膜仿生纳米微球在0.5瓦/平方厘米、1.0瓦/平方厘米、1.5瓦/平方厘米、2.0瓦/平方厘米的功率下温度分别达到30.56℃、59.47℃、70.56℃、80.13℃，具有优秀的光热转化能力。
使用肝癌细胞系Huh-7进行细胞吞噬能力的流式细胞术检测。按照1×104个/孔将细胞种于96孔板中，加入含有浓度为20微摩尔的基因工程化细胞膜仿生纳米微球200微升，培养3小时后用流式细胞仪检测平均荧光强度，如图4所示。结果表明，基因工程化细胞膜仿生纳米微球的平均荧光强度分别为58586，分别是普通细胞膜仿生纳米微球组和聚合物纳米微球平均荧光强度值的2.26倍和3.95倍，证明基因工程化细胞膜仿生纳米微球具有高效体外靶向的效果。
由此可见，本发明实例得到的基因工程化细胞膜仿生纳米微球具有对肝癌组织的特异性靶向作用和荧光成像、光热转化能力，达到对肝癌的诊疗一体化效果。
以上所述仅为本发明的实例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种基因工程化肝癌靶向细胞膜仿生纳米微球，其特征在于：
所述的纳米微球为核壳结构，核壳结构的外层壳为过表达靶向跨膜蛋白（1-1）的肝癌细胞膜（1-2），核壳结构的内层核为包载吲哚菁绿分子（1-4）的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球（1-3）；
所述外层壳为基因工程化过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜，靶向跨膜蛋白的构成包括IL-2跨膜蛋白信号肽、肝癌靶向肽SP94、增强型绿色荧光蛋白EGFP、3×FLAG标记蛋白、糖基化磷酯酰肌醇锚定蛋白GPI；
所述仿生纳米微球按照以下方法制备获得：
步骤一：构建过表达靶向跨膜蛋白的慢病毒；
步骤二：构建过表达靶向跨膜蛋白的标准肝癌细胞株，且通过慢病毒转染使标准肝癌细胞株表面出现靶向跨膜蛋白；
所述步骤二具体为：
将肝癌细胞铺到6孔板中，37℃培养箱内常规培养24小时，加入20微升/孔的过表达靶向跨膜蛋白的慢病毒，37℃培养24小时得到过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞株；
步骤三：分离和纯化过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜外壳；
所述步骤三具体为：
由上述步骤二获得的肝癌细胞膜进行培养获得肝癌细胞膜，采用用细胞刮子轻柔刮下细胞、1000转/分钟离心5分钟的方式收集肝癌细胞膜上稳定表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞，使用含有质量分数为1%苯甲基磺酰氟的细胞裂解液裂解细胞，于液氮和常温下反复冻结融化细胞溶液，再使用梯度离心法获得细胞膜，具体是在4℃和700g条件下离心10分钟，收集上清的溶液，最后14000g离心30分钟，收集沉淀为过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜；
最后经超声处理后使用脂质体挤出器挤过多孔聚碳酸酯多孔膜，超声处理具体是使用超声细胞破碎仪在20kHz频率和20W功率下将过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜超声5分钟，来回重复挤过膜3~11次，获得大小分布均一的过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜外壳；
步骤四：包载吲哚菁绿分子（1-4）的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球（1-3）制备；
所述步骤四中，使用0.22微米针式滤器过滤除去直径大于0.22微米的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球；
步骤五：基因工程化过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜仿生纳米微球制备。
2.根据权利要求1所述的一种基因工程化肝癌靶向细胞膜仿生纳米微球，其特征在于：
所述内层核为包载吲哚菁绿分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物，其中聚乳酸：聚羟基乙酸的摩尔比例为1：1，聚乳酸-羟基乙酸共聚物与吲哚菁绿的质量比为5：1~1：5。
3.根据权利要求1～2任一所述基因工程化肝癌靶向细胞膜仿生纳米微球的制备方法，其特征在于所述制备方法具体包括：
步骤一：构建过表达靶向跨膜蛋白的慢病毒；
步骤二：构建过表达靶向跨膜蛋白的标准肝癌细胞株，且通过慢病毒转染使标准肝癌细胞株表面出现靶向跨膜蛋白；
步骤三：分离和纯化过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜外壳；
步骤四：包载吲哚菁绿分子（1-4）的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球（1-3）制备；
所述步骤四中，使用0.22微米针式滤器过滤除去直径大于0.22微米的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球；
步骤五：基因工程化过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜仿生纳米微球制备。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：
所述步骤四具体为：
使用超声细胞破碎仪，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乙腈溶液逐滴加入吲哚菁绿的乙醇溶液中超声处理10分钟得到混合溶液，对混合溶液使用超滤管离心去除游离吲哚菁绿分子，然后使用微米针式滤器过滤除处理获得聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球，得到大小分布均一的吲哚菁绿分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球。
5.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：
所述步骤五具体为：
按照质量比1：2~2：1比例混合过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜外壳及吲哚菁绿分子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球，超声处理后使用脂质体挤出器挤过200nm的聚碳酸酯多孔膜，来回重复挤过膜11次，获得大小分布均一的基因工程化过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜仿生纳米微球。
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