CN104946597A - 稳定表达GFP的shRNA靶向干扰YB-1基因人肺腺癌A549细胞株 - Google Patents

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顾春东
郭涛
李锦绣
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Abstract

本发明通过构建靶向干扰YB-1基因的shRNA真核表达载体，转染人肺腺癌细胞株A549，经过G418筛选获得稳定表达GFP的shRNA靶向干扰YB-1基因人肺腺癌A549细胞株A549/YBX1-homo-746和稳定表达GFP的shRNA靶向干扰YB-1基因人肺腺癌A549细胞株A549/YBX1-homo-326，保藏编号为:CCTCC C201522、CCTCC C201523。本发明为后期研究YB-1基因与肺腺癌细胞生物学行为改变的相关性研究中提供便利，有效缩短其研究周期，提高研究结果的稳定性；稳定表达绿色荧光蛋白，为后期研究诸如细胞迁移及侵袭能力等细胞生物学功能提供便利。

Description

稳定表达GFP的shRNA靶向干扰YB-1基因人肺腺癌A549细胞株
技术领域
本发明涉及一株稳定表达绿色荧光蛋白的shRNA靶向干扰YB-1人肺腺癌A549细胞株。
背景技术
肺癌的发病率近年来不断上升，其死亡率已占到恶性肿瘤的首位，全世界每年死于肺癌的患者约有110万，占到了癌症死亡人数的17.8％。其中肺腺癌的发病率上升尤为明显，已占到非小细胞肺癌(NSCLC)的40％以上，且易发生早期转移。肿瘤的侵袭与转移直接影响患者的预后生存，寻找抑制肿瘤侵袭与转移的特异性靶点成为提高患者生存率的可靠途径。人类Y盒蛋白1(Y box-binding protein-1，YB-1)是一类特异性结合目的基因启动子或增强子内部Y-box序列的重要核转录因子，并且被证实与癌细胞的侵袭与转移密切相关。前期工作中我们在肺腺癌组织中测出肺YB-1蛋白高表达阳性率为44％，并且发现YB-1蛋白的高表达与肺腺癌的转移与复发密切相关。
RNA干扰(RNAi)是一种序列特异性的转录后基因沉默现象，已成为研究基因功能的重要工具。但siRNA介导的基因沉默只能维持较短的时间且转染效率较低。通过真核表达载体介导的shRNA干扰可以实现持续稳定的干扰效果，从而克服siRNA干扰的缺点。因此，为了探索YB-1导致肺癌侵袭与转移的具体分子生物学机制，我们决定利用脂质体介导的shRNA 技术转染人肺腺癌细胞株A549，建立稳定表达绿色荧光蛋白的YB-1基因表达缺失人肺腺癌细胞株，为后期研究YB-1基因在肺癌侵袭与转移机制中的作用奠定基础。
发明内容
本发明通过构建靶向干扰YB-1基因的shRNA真核表达载体，转染人肺腺癌细胞株A549，经过G418筛选获得稳定表达GFP的shRNA靶向干扰YB-1基因人肺腺癌A549细胞株A549/YBX1-homo-746(简称A549-746)和稳定表达GFP的shRNA靶向干扰YB-1基因人肺腺癌A549细胞株A549/YBX1-homo-326(简称A549-326)。该细胞株已在中国典型培养物保藏中心保藏，其中细胞株A549-746保藏编号为:CCTCC NO： C201522，细胞株A549-326保藏编号为:CCTCC NO: C201523，保藏时间为2015年2月12日，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学。
本发明还提供了所述细胞株的制备方法，其特征在于，制备过程如下：
1)、shRNA真核表达载体构建：
shRNA真核表达载体为pGPU6/GFP/Neo，由U6启动子引导的shRNA合成，将特异性靶向YB-1mRNA不同序列的反向互补发夹序列克隆入pGP U6/GFP/Neo载体；其中特异性靶向YB-1mRNA不同序列为YBX1-homo-746：GGTTCCCACCTTACTACAT；YBX1-homo-326:AGAAGGTCATCGCAACGAA；
2)、细胞培养：转染前l天将A549细胞铺板； 
3)、表达质粒转染：将shRNA真核表达载体转染A549细胞；
4)、克隆细胞株筛选：表达质粒转染24小时后每孔加入G418，G41 8的终浓度选择由杀菌曲线确定，终浓度优选为600-800ug/ml，此浓度可以保证最大程度杀死阴性细胞(非转染细胞)的同时不损伤阳性细胞(转染细胞)；每隔2d-3d观察细胞情况，更换选择培养基；克隆环方法挑取单克隆细胞入24孔板，90％-100％融合度后转入培养皿扩增，鉴定，保种。
本发明所述细胞株的制备方法，其特征在于，表达质粒转染A549细胞：将2.5ug shRNA真核表达载体和10ul Lipofectamine 2000分别混匀于250ul培养基，再将两者混合缓慢滴入1.5ml培养基中转染A549细胞，以此保证最高的细胞转染效率。
本发明所述细胞株的制备方法，其特征在于，克隆环方法挑取单克隆细胞：在倒置荧光显微镜下观察到阳性单克隆时，以记号笔在培养板底部对应部位做标记，在无菌操作台中向标记的单克隆处滴加胰酶，以此保证完整、顺利的挑取阳性单克隆细胞。
本发明稳定沉默YB-1基因的肺腺癌细胞株绿色荧光蛋白稳定表达，可以为后期体内外示踪成像实验提供基础；RT-PCR、荧光定量PCR和Western blot法显示稳定转染组细胞株A549-746与A549-326其YB-1基因mRNA表达和蛋白表达较对照组明显降低(P<0.05)；噻唑蓝(MTT)比色法证实干扰组较对照组生长速度明显降低(P<0.05)，沉默YB-1基因抑制了肺腺癌细胞的增殖，证明了干扰YB-1基因表达可以抑制肺腺癌细胞生长。以上结果显示本研究成功建立了YB-1基因稳定沉默的人肺腺癌细胞株A549-746和A549-326。
本发明特点在于：稳定沉默人肺腺癌A549细胞株中YB-1基因表达，为后期研究YB-1基因与肺腺癌细胞生物学行为改变的相关性研究中提供 便利，有效缩短其研究周期，提高研究结果的稳定性；稳定表达绿色荧光蛋白，为后期研究诸如细胞迁移及侵袭能力等细胞生物学功能提供便利。
附图说明
图1YB-1基因稳定沉默A549细胞株绿色荧光蛋白的表达。
BF：明场成像，GFP：绿色荧光蛋白成像，shNC：非靶标干扰组，shYB-1-1：靶向干扰YBX1-homo-746组，shYB-1-2：靶向干扰YBX1-homo-326组。
图2RT-PCR检测YB-1mRNA表达结果。
A549：空白对照组，shNC：非靶标干扰组，shYB-1-1：靶向干扰YBX1-homo-746组，shYB-1-2：靶向干扰YBX1-homo-326组，**P<0.05代表与对照组具有统计学差异(n＝3)。
图3定量PCR检测YB-1mRNA表达结果。
A549：空白对照组，shNC：非靶标干扰组，shYB-1-1：靶向干扰YBX1-homo-746组，shYB-1-2：靶向干扰YBX1-homo-326组，**P<0.05代表与对照组具有统计学差异(n＝3)。
图4Western blot检测YB-1蛋白表达结果。
A549：空白对照组，shNC：非靶标干扰组，shYB-1-1：靶向干扰YBX1-homo-746组，shYB-1-2：靶向干扰YBX1-homo-326组。
图5MTT绘制细胞生长曲线。
A549：空白对照组，shNC：非靶标干扰组，shYB-1-1：靶向干扰YBX1-homo-746组，shYB-1-2：靶向干扰YBX1-homo-326组。
生物保藏
稳定表达GFP的shRNA靶向干扰YB-1基因人肺腺癌A549细胞株A549/YBX1-homo-746，于2015年2月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，保藏编号为:CCTCC NO: C201522。
稳定表达GFP的shRNA靶向干扰YB-1基因人肺腺癌A549细胞株A549/YBX1-homo-326，于2015年2月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，保藏编号为:CCTCC NO: C201523。
具体实施方式
实施例1
细胞株的建立：
1.shRNA真核表达载体构建:shRNA真核表达载体为pGPU6/GFP/Neo，由U6启动子引导的shRNA合成，并具有新霉素抗性筛选标记和绿色荧光蛋白GFP筛选标记。将特异性靶向YB-1mRNA不同序列(YBX1-homo-74:GGTTCCCACCTTACTACAT；YBX1-homo-326:AGAAGGTCATCGCAACGAA)的反向互补发夹序列克隆入pGPU6/GFP/Neo载体，测序正确，购自上海吉玛公司。
2.细胞培养:转染前l天将2x105个A549细胞铺板(6孔板)，次日细胞融合度为70％-80％。
3.表达质粒转染:参照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明将2.5ug shRNA真核表达载体与10ul Lipofectamine 2000分别混匀于250ul培养基，再将两者混合滴入1.5ml培养基中转染A549细胞。
4.克隆细胞株筛选:表达质粒转染24小时后每孔加入含终浓度为800ug/ml的G418。每隔2d-3d观察细胞情况，更换选择培养基。2周左右开始有克隆生长。克隆环方法挑取单克隆细胞入24孔板，90％-100％融合度后转入培养皿扩增，鉴定，保种(图1)，其中，克隆环方法挑取单克隆细胞：在倒置荧光显微镜下观察到阳性单克隆时，以记号笔在培养板底部对应部位做标记，在无菌操作台中向标记的单克隆处滴加胰酶。
实施例2
稳定表达GFP的shRNA靶向干扰YB-1基因人肺腺癌A549细胞株(pGPU6/GFP/Neo-YBX1-homo-746-A549；pGPU6/GFP/Neo-YBX1-homo-326-A549)中YB-1基因表达水平检测。
1.稳定表达GFP的shRNA靶向干扰YB-1基因人肺腺癌A549细胞株中YB-1基因逆转录PCR检测YB-1基因表达：参照总RNA提取试剂盒说明书提取RNA，根据逆转录试剂盒说明进行逆转录PCR。逆转录PCR YB-1引物序列：Forward：5’-ACCACAGTATTCCATCCCTCCTG-3’；Reverse：5’-ATCTTCTTCATTAGCCGTCCTCTC-3’；PCR产物长度为176bp。内参基因β-Actin引物序列：Forward：5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’；Reverse：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’；PCR产物长度为250bp。PCR扩增条件为：94℃、2min，94℃、30s，55℃、30s，72℃、10s，35个循环；72℃、7min。取PCR产物10ul进行2％琼脂糖凝胶电泳检测(图2)。
2.荧光定量PCR检测YB-1基因表达：定量PCR引物序列：Forward： 5’-GGAGTTTGATGTTGTTGAAGGA-3’；Reverse：5’-AACTGGAACACCACCAGGAC-3’，扩增长度为73bp。荧光定量PCR条件为：95℃、30s、1个循环；95℃、5s，58℃、30s，72℃、30s，40个循环；95℃、1min，55℃、30s，95℃、30s，1个循环。做融解曲线检测。2-ΔΔCT法计算基因表达差异(图3)。
3.Western blot印迹检测YB-1表达的变化：细胞用PIRP裂解液裂解后提取总蛋白，BCA法测蛋白浓度后进行SDS-PAGE电泳。100V转膜50min，抗YB-1和抗GAPDH一抗4℃孵育过夜，洗膜后二抗室温孵育1h。ECL发光液显影(图4)。
实施例3
噻唑蓝(MTT)绘制细胞生长曲线检测稳定表达GFP的shRNA靶向干扰YB-1基因人肺腺癌A549细胞株增殖能力
1.取对数生长期的正常A549细胞、稳定表达GFP的shRNA靶向干扰YB-1基因人肺腺癌A549细(pGPU6/GFP/Neo-YBX1-homo-746-A549；pGPU6/GFP/Neo-YBX1-homo-326-A549)和阴性对照组细胞，胰酶消化后吹打成单细胞悬液。
2.每孔5000个细胞接种于96孔板，每组设6孔，平行作3块板，置37℃、5％CO2培养箱中分别培养24、48、72h。
3.吸弃培养基，每孔加入20ul MTT(5mg/ml)，继续培养3h。
4.弃去培养基，每孔加入150ul的二甲基亚砜(DMSO)终止反应。 
5.将细胞置于37℃10min，酶标仪测定各孔A值(测定波长490nm)并 制作生长曲线(图5)。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种稳定表达绿色荧光蛋白的shRNA靶向干扰YB-1基因人肺腺癌A549细胞株，其特征在于：稳定表达GFP的shRNA靶向干扰YB-1基因人肺腺癌A549细胞株A549/YBX1-homo-746保藏编号为:CCTCCC201522，稳定表达GFP的shRNA靶向干扰YB-1基因人肺腺癌A549细胞株A549/YBX1-homo-326保藏编号为:CCTCC C201523。
2.一种权利要求1所述细胞株的制备方法，其特征在于，制备过程如下：
1)、shRNA真核表达载体构建：
shRNA真核表达载体为pGPU6/GFP/Neo，由U6启动子引导的shRNA合成，将特异性靶向YB-1mRNA不同序列的反向互补发夹序列克隆入pGPU6/GFP/Neo载体；其中特异性靶向YB-1mRNA不同序列为YBX1-homo-746：GGTTCCCACCTTACTACAT；YBX1-homo-326:AGAAGGTCATCGCAACGAA；
2)、细胞培养：转染前l天将A549细胞铺板；
3)、表达质粒转染：将shRNA真核表达载体转染A549细胞；
4)、克隆细胞株筛选：表达质粒转染24小时后每孔加入G418，G418的终浓度选择由杀菌曲线确定；每隔2d-3d观察细胞情况，更换选择培养基；克隆环方法挑取单克隆细胞入24孔板，90％-100％融合度后转入培养皿扩增，鉴定，保种。
3.按照权利要求2所述细胞株的制备方法，其特征在于：G418的终浓度为600-800ug/ml。
4.按照权利要求2所述细胞株的制备方法，其特征在于，表达质粒转染A549细胞：将2.5ug shRNA真核表达载体和10ul Lipofectamine 2000分别混匀于250ul培养基，再将两者混合滴入1.5ml培养基中转染A549细胞。
5.按照权利要求2所述细胞株的制备方法，其特征在于，克隆环方法挑取单克隆细胞：在倒置荧光显微镜下观察到阳性单克隆时，以记号笔在培养板底部对应部位做标记，在无菌操作台中向标记的单克隆处滴加胰酶。
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