CN116606797A - 枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本实发明涉及细胞生物学技术领域，尤其涉及一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法及应用。本发明通过对枸杞子干果进行清洗然后PBS缓冲液浸泡、破壁机研磨、高速离心、超速离心、蔗糖梯度离心纯化和PBS缓冲液清洗去糖的步骤制备得到枸杞子干果来源的细胞外囊泡。本发明制备得到的枸杞子干果来源的细胞外囊泡可以应用于促进诱导巨噬细胞M1的极化，从而促进适应性免疫应答。
Description
技术领域
本实发明涉及细胞生物学技术领域，尤其涉及一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法及应用。
背景技术
细胞外囊泡主要包括外泌体和微囊泡，是一种由活细胞分泌的直径位于30nm～1000nm之间的微小囊泡，包含细胞来源的核酸和蛋白等活性分子，具有介导细胞间通讯等功能，也是理想的液体活检标志物和治疗载体。中草药细胞外囊泡的研究和应用符合国家对促进中医药传承创新发展和中医药科技战略发展目标的要求，同时也是对中医药现代化事业的追求。
作为中草药领域的研究新星，植物EVs具有天然纳米载体的独特形态和组成特征，富含生物活性脂质，蛋白质，RNA和其他药理活性分子。这些特性使植物EVs在免疫调节，抗肿瘤，再生和抗炎等疾病治疗过程中都能发挥重要作用，并能够穿过多种严格的如肿瘤包膜和血脑屏障的生物屏障，向各种靶向器官输送药物。
枸杞子属茄科植物枸杞的成熟果实，其被列为“药食同源”的品种，枸杞子可以增强人体免疫力、抗衰老，对男性的生殖系统也有很好的保护作用；另外还可以滋润皮肤，也深受女性人群的喜爱；在日常生活中很是常见，人们经常会用枸杞泡茶饮用，对机体的健康起到很大的作用。传统中医认为枸杞子具有滋补肝肾之阴，可治疗由于肝肾阴虚引起的视力障碍、消渴等症。现代医学认为枸杞子具有提高免疫力和抗肿瘤的重要作用，尤其作为宁夏地区的特产，同时也具有更加重要的经济价值。细胞外囊泡包含许多蛋白质、脂质和核酸等活性物质，提取枸杞子干果来源的细胞外囊泡的意义尤为重要。枸杞子干果来源的细胞外囊泡可以促进巨噬细胞M1的极化作用，从而促进适应性免疫应答。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法及应用，通过分离纯化制备得到枸杞子干果来源的细胞外囊泡，制备得到的枸杞子干果来源的细胞外囊泡可以应用于促进诱导巨噬细胞M1的极化，从而促进适应性免疫应答。
为解决上述技术问题，本发明提供一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法，包括以下步骤：
S1、将枸杞子干果于PBS缓冲液中浸泡，然后破壁研磨，得到枸杞子干果的研磨液；
S2、对S1中得到的枸杞子干果研磨液进行差速离心，离心得到的沉淀重悬于PBS缓冲液中，得到枸杞子干果来源的细胞外囊泡重悬液；
S3、将S2中得到的枸杞子干果来源的细胞外囊泡重悬液加入蔗糖浓度梯度溶液的上层，然后进行离心，得到位于30～45％条带的蔗糖溶液，然后加入PBS缓冲液进行混合，混合均匀后二次离心，得到枸杞子干果来源的细胞外囊泡。
根据本发明提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法：S1中所述枸杞子干果和PBS缓冲液的质量体积比为60g：120mL，所述PBS缓冲液的温度为4℃，所述浸泡的时间为8h。
根据本发明提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法：S2中所述差速离心包括以下步骤：
S201、将S1中得到的枸杞子干果研磨液在温度为4℃且离心力为2000g的条件下离心20min，取上清液得到第一离心液；
S202、将S201中得到的第一离心液在温度为4℃且离心力为4000g的条件下离心20min，取上清液得到第二离心液；
S203、将S202中得到的第二离心液在温度为4℃且离心力为4000g的条件下离心20min，取上清液得到第三离心液；
S204、将S203中得到的第三离心液在温度为4℃且离心力为10000g的条件下离心40min，取上清液得到第四离心液；
S205、将S204中得到的第四离心液在温度为4℃且离心力为100000g的条件下离心120min，得到沉淀。
根据本发明提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法：S205中所述离心时用到的离心管为超速离心管。
根据本发明提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法：S2中所述PBS缓冲液的体积为1mL且温度条件为4℃。
根据本发明提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法：S3中所述蔗糖浓度梯度溶液的浓度分别为60％、45％、30％和8％。
根据本发明提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法：S3中所述在蔗糖浓度梯度溶液中离心的条件为：在温度为4℃且离心力为150000g的条件下，在超速离心管中离心120min。
根据本发明提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法：S3中所述二次离心的条件为：在温度为4℃且离心力为100000g的条件下，在超速离心管中离心120min；
S3中所述用于混合的PBS缓冲液的体积为3mL且温度条件为4℃。
根据本发明提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法：S3中所述枸杞子干果来源的细胞外囊泡于体积为500μL且温度条件为4℃的PBS缓冲液中重悬，得到枸杞子干果来源的细胞外囊泡悬液，于-80℃的温度条件下冷冻保存。
本发明还提供一种上述枸杞子干果来源的细胞外囊泡的应用，所述枸杞子干果来源的细胞外囊泡通过诱导巨噬细胞M1极化而发挥适应性免疫应答。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明提供一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法及其应用，通过对枸杞子干果清洗然后进行PBS缓冲液浸泡、破壁机研磨、高速离心、超速离心、蔗糖梯度离心纯化和PBS缓冲液清洗去糖的步骤制备得到枸杞子干果来源的细胞外囊泡。本发明制备得到的枸杞子干果来源的细胞外囊泡可以应用于促进诱导巨噬细胞M1的极化，从而促进适应性免疫应答。
附图说明
图1是本发明提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法的流程图；
图2是本发明提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的TEM照片；
图3是本发明提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的NTA图；
图4是本发明提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的SDS-PAGE蛋白表征图；
图5是本发明提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡促使巨噬细胞M1极化的INOS流式散点图；
图6是本发明提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡促使巨噬细胞M1极化的INOS流式差异性分析图；
图7是本发明提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡促使巨噬细胞M1极化的q-PCR INOS差异性分析图；
图8是本发明提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡促使巨噬细胞M1极化的IL-6差异性分析图。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法，包括以下步骤：
S1、将60g的枸杞子干果用超纯水洗净后放入干净的破壁机内，然后在破壁机的容器内加入体积为120mL且温度条件为4℃的PBS缓冲液，充分浸泡8小时后开启破壁机充分研磨3分钟，得到枸杞子干果研磨液；PBS缓冲液为经过过滤除菌的成品Servicebio PBS缓冲液；
S2、对S1中得到的枸杞子干果研磨液进行差速离心，差速离心包括以下步骤：
S201、将S1中得到的枸杞子干果研磨液在温度为4℃且离心力为2000g的条件下离心20min，取上清液得到第一离心液；
S202、将S201中得到的第一离心液在温度为4℃且离心力为4000g的条件下离心20min，取上清液得到第二离心液；
S203、将S202中得到的第二离心液在温度为4℃且离心力为4000g的条件下离心20min，取上清液得到第三离心液；
S204、将S203中得到的第三离心液在温度为4℃且离心力为10000g的条件下离心40min，取上清液得到第四离心液；
S205、将S204中得到的第四离心液在温度为4℃且离心力为100000g的条件下，在超速离心管中离心120min，得到沉淀；
将离心得到的沉淀重悬于体积为1mL且温度条件为4℃的PBS缓冲液中，得到枸杞子干果来源的细胞外囊泡重悬液；
S3、将S2中得到的枸杞子干果来源的细胞外囊泡重悬液，加入自上而下浓度分别为60％、45％、30％和8％的蔗糖浓度梯度溶液的上层，然后在温度为4℃且离心力为150000g的条件下，在超速离心管中离心120min，得到位于30～45％条带的蔗糖溶液，然后加入体积为3mL且温度条件为4℃的PBS缓冲液进行混合，混合均匀在温度为4℃且离心力为100000g的条件下，在超速离心管中二次离心120min，得到枸杞子干果来源的细胞外囊泡。
上述制备方法的流程图如图1所示。
将步骤S3中二次离心后得到的枸杞子干果来源的细胞外囊泡于体积为500μL且温度条件为4℃的PBS缓冲液中重悬，得到枸杞子干果来源的细胞外囊泡悬液。
取出体积为30μL的枸杞子干果来源的细胞外囊泡悬液，进行TEM检测，检测结果如图2所示，从图2中可以观察到，本实施例制备得到的枸杞子干果来源的细胞外囊泡的直径位于100～250nm之间。
取出体积为30μL的枸杞子干果来源的细胞外囊泡悬液，进行纳米粒子追踪分析NTA检测，检测结果如图3所示，从图3中可以观察到，本实施例制备得到的枸杞子干果来源的细胞外囊泡的直径主要分布在100～200nm之间，其中，直径为110nm左右的粒子数量最多，每毫升的粒子数量有3300000左右。
取出体积为50μL纯化后的枸杞子干果来源的细胞外囊泡悬液和体积为50μL未纯化的枸杞子干果来源的细胞外囊泡重悬液，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE蛋白质表征，表征结果如图4所示，从图4中可以观察到，与标准蛋白marker对比，可知纯化后的蛋白杂带明显减少，说明经过蔗糖梯度纯化后可有效去除杂质。
剩余的枸杞子干果来源的细胞外囊泡悬液于-80℃的温度条件下冷冻保存。
实施例2
本实施例提供一种实施例1中制备得到的枸杞子干果来源的细胞外囊泡的应用。
本实施例中使用到的枸杞子干果来源的细胞外囊泡悬液为实施例1中制备得到的。
小鼠单核巨噬细胞白血病细胞即RAW264.7细胞是最常见的炎症细胞模型之一，RAW264.7细胞一般为圆形或椭圆形，颜色较深，贴壁牢固。RAW264.7细胞具有较强的吞噬能力，在吞噬抗原后，细胞会释放出趋化因子，促使分化，细胞伸出伪足，攀爬能力增强。在细胞培养过程中，细胞吞噬抗原过多、培养条件恶劣或传代后细胞稀疏等情况，都会使细胞呈现出梭形、长梭形的形态，消化难度增加。
将RAW264.7细胞在含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行培养，在其对数生长期时进行试验；
所述含10％FBS的DMEM培养基由以下质量分数的原料组成：90mLDMEM基础培养基和10mL胎牛血清(FBS)。
将上述在含10％FBS的DMEM培养基中进行培养的RAW264.7细胞分为四个组：Control对照组、加入终浓度为30μg/mL枸杞子干果来源的细胞外囊泡悬液的LBDEVs组、加入终浓度为100ng/mL脂多糖(LPS)的LPS组、加入终浓度为100ng/mL的LPS和终浓度为30μg/mL枸杞子干果来源的细胞外囊泡悬液的LBDEVs组，每组培养皿上设置3个孔，每个孔中细胞量为106个，构建容积共2mL的培养体系。
由于巨噬细胞M1可以高表达诱导型一氧化氮合酶INOS和白细胞介素IL-6，因此，在温度条件为37℃且含有5％CO2的含10％FBS的DMEM培养基中培养RAW264.7巨噬细胞，设置与上述分组相同的四个组分别培养48h后，一半细胞进行流式细胞术INOS染色并上机检测；另一半细胞用来提取RNA、反转录RT-PCR和荧光定量q-PCR，用来检测INOS和IL-6的mRNA相对表达量。
通过软件FlowJo10.8.1分析流式细胞术检测得到的数据，通过软件GraphpadPrism 9.0.0绘图并进行差异性分析；分析结果如图6-图8所示，图中“ns”表示P＞0.05，“*”表示P＜0.05以及“**”表示P＜0.01，从图中可以看出，RAW264.7细胞在枸杞子干果来源的细胞外囊泡干预后，其向M1极化，高表达INOS和IL-6，差异有统计学意义。LPS与LPS+LBDEVs组虽无统计学意义，但有进一步增强巨噬细胞M1极化的趋势，受极化极限影响。
本发明制备得到的枸杞子干果来源的细胞外囊泡可以应用于促进诱导巨噬细胞M1的极化，从而促进适应性免疫应答。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
Claims (10)
1.一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将枸杞子干果于PBS缓冲液中浸泡，然后破壁研磨，得到枸杞子干果研磨液；
S2、对S1中得到的枸杞子干果研磨液进行差速离心，离心得到的沉淀重悬于PBS缓冲液中，得到枸杞子干果来源的细胞外囊泡重悬液；
S3、将S2中得到的枸杞子干果来源的细胞外囊泡重悬液加入蔗糖浓度梯度溶液的上层，然后进行离心，得到位于30～45％条带的蔗糖溶液，然后加入PBS缓冲液进行混合，混合均匀后二次离心，得到枸杞子干果来源的细胞外囊泡。
2.根据权利要求1所述的枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，S1中所述枸杞子干果和PBS缓冲液的质量体积比为60g：120mL，所述PBS缓冲液的温度为4℃，所述浸泡的时间为8h。
3.根据权利要求2所述的枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，S2中所述差速离心包括以下步骤：
S201、将S1中得到的枸杞子干果研磨液在温度为4℃且离心力为2000g的条件下离心20min，取上清液得到第一离心液；
S202、将S201中得到的第一离心液在温度为4℃且离心力为4000g的条件下离心20min，取上清液得到第二离心液；
S203、将S202中得到的第二离心液在温度为4℃且离心力为4000g的条件下离心20min，取上清液得到第三离心液；
S204、将S203中得到的第三离心液在温度为4℃且离心力为10000g的条件下离心40min，取上清液得到第四离心液；
S205、将S204中得到的第四离心液在温度为4℃且离心力为100000g的条件下离心120min，得到沉淀。
4.根据权利要求3所述的枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，S205中所述离心时用到的离心管为超速离心管。
5.根据权利要求4所述的枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，S2中所述PBS缓冲液的体积为1mL且温度条件为4℃。
6.根据权利要求5所述的枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，S3中所述蔗糖浓度梯度溶液的浓度分别为60％、45％、30％和8％。
7.根据权利要求6所述的枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，S3中所述在蔗糖浓度梯度溶液中离心的条件为：在温度为4℃且离心力为150000g的条件下，在超速离心管中离心120min。
8.根据权利要求7所述的枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，S3中所述二次离心的条件为：在温度为4℃且离心力为100000g的条件下，在超速离心管中离心120min；
S3中所述用于混合的PBS缓冲液的体积为3mL且温度条件为4℃。
9.根据权利要求8所述的枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，S3中所述枸杞子干果来源的细胞外囊泡于体积为500μL且温度条件为4℃的PBS缓冲液中重悬，得到枸杞子干果来源的细胞外囊泡悬液，于-80℃的温度条件下冷冻保存。
10.一种如权利要求1-9所述的枸杞子干果来源的细胞外囊泡的应用，其特征在于，所述枸杞子干果来源的细胞外囊泡通过诱导巨噬细胞M1极化而发挥适应性免疫应答。
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